JP2002142772A - ペルオキシダーゼの安定化方法、ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ｄｎａ、ベクター、形質転換細胞、蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ペルオキシダーゼの、過酸化水素，熱等に対
する酵素活性の安定性を向上させた変異体を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ類の立体構造における
過酸化水素結合ポケットに面する一定の構造的に不安定
なアミノ酸の一部又は全部を、好ましくは類似立体構造
の耐酸化性等に優れた安定なアミノ酸に変換し、過酸化
水素結合ポケットの変形を防止するペルオキシダーゼ安
定化方法、この方法によって得られるペルオキシダーゼ
変異体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ペルオキシダーゼ
の安定化方法、ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ＤＮ
Ａ、ベクター、形質転換細胞及び蛋白質の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素を蛋白質工学的にデザインす
ることにより、酵素の機能，安定性，基質特異性等を好
ましく改変しようとする研究がなされている。

【０００３】例えば、マンガンペルオキシダーゼやリグ
ニンペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼに関し
ては、紙パルプの製造工程における着色原因物質たるリ
グニンの分解、特開平６−２９６９４９号公報で指摘さ
れているプラスチック分解等の産業上重要な広範囲の用
途があり、優れたペルオキシダーゼ変異体の提供が特に
強く求められる。そして従来、リグニンペルオキシダー
ゼのベラトリルアルコール結合部位の付加の研究（J. E
xp. Med., 184, 831-837, 1996）、ペルオキシダーゼの
基質特異性の改変（特開平１１−１５５５７０）等に関
する報告もしくは提案がなされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、酵素活性に
ついては常に安定性が問題となるが、特にペルオキシダ
ーゼについては、酵素反応に過酸化水素を利用すること
から、過酸化水素によって容易に失活しない酵素活性の
確保が問題となる。

【０００５】例えば紙パルプの製造工程において、ペル
オキシダーゼを用いてリグニンを酵素的に分解する際に
は、活性化物質である過酸化水素を非常に低濃度に制御
しなければ酵素の失活を招くため、過酸化水素の高濃度
化による酵素反応の効率アップを図り難い現状である。

【０００６】しかし従来、ペルオキシダーゼの過酸化水
素に対する安定性や、過酸化水素の存在下におけるペル
オキシダーゼ熱安定性等を考慮したペルオキシダーゼ変
異体提供の試みは報告されていない。

【０００７】そこで本発明は、ペルオキシダーゼの優れ
た安定化変異体を創製することを解決すべき課題とす
る。本願発明者はペルオキシダーゼの安定化変異体のデ
ザインを試み、種々の試行錯誤の末に優れた安定化変異
体の創製に成功して、本願発明を完成した。

【０００８】

【課題を解決するための手段】（第１発明の構成）上記
課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の
発明）の構成は、天然型ペルオキシダーゼにおける過酸
化水素結合ポケットに面するアミノ酸を安定化すること
により、過酸化水素結合ポケットの空間構造の変形を阻
止してペルオキシダーゼの活性を安定化させる、ペルオ
キシダーゼの安定化方法である。

【０００９】（第２発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、
天然型ペルオキシダーゼにおける過酸化水素結合ポケッ
トに面するアミノ酸の内、他のアミノ酸への変換によっ
て酵素機能の阻害を起こさず、かつ立体形状が変化し易
いアミノ酸（これを、以下「変換元アミノ酸」とも言
う。）の１個又は２個以上を、立体形状の変化し難いア
ミノ酸（これを、以下「変換先アミノ酸」とも言う。）
に変換した、ペルオキシダーゼ変異体である。

【００１０】（第３発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、
前記第２発明に係る天然型ペルオキシダーゼがマンガン
ペルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシダーゼであ
る、ペルオキシダーゼ変異体である。

【００１１】（第４発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、
前記第２発明又は第３発明に係る変換元アミノ酸が、酸
化を受け易いアミノ酸であり、前記変換先アミノ酸が、
変換元アミノ酸と立体構造が類似し、かつ酸化を受け難
いアミノ酸である、ペルオキシダーゼ変異体である。

【００１２】（第５発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、
前記第２発明〜第４発明に係る変換元アミノ酸がアスパ
ラギン，グルタミン又はトリプトファンであり、前記変
換先アミノ酸がセリン，アラニン，ロイシン，バリン又
はグリシンである、ペルオキシダーゼ変異体である。

【００１３】（第６発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、
前記第２発明〜第５発明に係る天然型ペルオキシダーゼ
が白色腐朽菌由来の天然型マンガンペルオキシダーゼで
あり、前記変換元アミノ酸が前記天然型マンガンペルオ
キシダーゼのアミノ酸配列における第８１位のアスパラ
ギンであり、前記変換先アミノ酸がセリンである、ペル
オキシダーゼ変異体である。

【００１４】（第７発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、
前記第２発明〜第６発明に係るペルオキシダーゼ変異体
であって、過酸化水素に対する酵素活性の安定性が、過
酸化水素０．３ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後
の残存活性が９０％以上を示すものである、ペルオキシ
ダーゼ変異体である。

【００１５】（第８発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、
配列番号１に示すアミノ酸配列における第８１位のアス
パラギンがセリン，アラニン，ロイシン，バリン又はグ
リシンに置換されている、蛋白質である。

【００１６】（第９発明の構成）上記課題を解決するた
めの本願第９発明（請求項９に記載の発明）の構成は、
配列番号１に示すアミノ酸配列における第８１位のアス
パラギンがセリン，アラニン，ロイシン，バリン又はグ
リシンに置換され、かつ、これら以外のアミノ酸のうち
１又は２以上のアミノ酸が置換，欠失又は付加されたア
ミノ酸配列を有すると共に、ペルオキシダーゼ活性を示
す、蛋白質である。

【００１７】（第１０発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１０発明（請求項１０に記載の発明）の構
成は、第８発明又は第９発明に係る蛋白質をコードする
塩基配列を有する、ＤＮＡである。

【００１８】（第１１発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１１発明（請求項１１に記載の発明）の構
成は、第１０発明に係るＤＮＡを含む、ベクターであ
る。

【００１９】（第１２発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１２発明（請求項１２に記載の発明）の構
成は、第１０発明に係るＤＮＡを、その遺伝子機能が発
現可能な状態で含む、形質転換細胞である。

【００２０】（第１３発明の構成）上記課題を解決する
ための本願第１３発明（請求項１３に記載の発明）の構
成は、第１２発明に係る形質転換細胞を培養する工程を
含む、蛋白質の製造方法である。

【００２１】

【発明の作用・効果】（第１発明の作用・効果）本願発
明者は、過酸化水素に対するペルオキシダーゼの安定性
を向上させるに当たり、ペルオキシダーゼの立体構造に
特有の構造部分である過酸化水素結合ポケットに注目し
た。周知のように、この「過酸化水素結合ポケット」と
は、ペルオキシダーゼのいわゆる「活性中心」とは別個
に観念されるポケット様の空洞状構造であり、過酸化水
素の結合により活性中心の鉄分子を酸化してラジカルを
生じさせると言う機能を担っている。

【００２２】そして本願発明者は、この過酸化水素結合
ポケットに空間構造の変形が起きると、上記の機能に関
連して活性中心の鉄分子が酸化されないと言う不具合を
生じ、ペルオキシダーゼの酵素活性が低下する、と考え
た。そして上記空間構造の変形を来す最も一般的な原因
は、過酸化水素結合ポケットに面するアミノ酸の、例え
ば酸化に基づく立体構造の変化である。従って、上記原
因に合致したリースナブルな対策（例えば、他のアミノ
酸への変換によって酵素機能の阻害を起こさず、かつ立
体形状が変化し易いアミノ酸を、立体形状の変化し難い
アミノ酸に変換すること）によって、ペルオキシダーゼ
の酵素活性の安定性を向上させることができる筈であ
る。

【００２３】第１発明はこのような対策を具体化したも
のであり、熱，酸，アルカリ等に対するペルオキシダー
ゼの酵素活性の安定性を顕著に向上させることができ
る。

【００２４】（第２発明の作用・効果）第１発明のペル
オキシダーゼの安定化方法の結果として得られる第２発
明のペルオキシダーゼ変異体においては、上記第１発明
の作用・効果が確保される。

【００２５】（第３発明の作用・効果）上記第２発明の
ペルオキシダーゼ変異体としては、マンガンペルオキシ
ダーゼ変異体又はリグニンペルオキシダーゼ変異体が、
特に実用的価値が大きい。

【００２６】（第４発明の作用・効果）変換元アミノ酸
として特に注目すべきは酸化を受け易いアミノ酸であ
り、変換先アミノ酸として特に有効なものが酸化を受け
難いアミノ酸である。そして変換先アミノ酸が変換元ア
ミノ酸と立体構造が類似している場合、とりわけペルオ
キシダーゼの安定化効果が著しい。

【００２７】（第５発明の作用・効果）変換元アミノ酸
としてはアスパラギン，グルタミン又はトリプトファン
が、変換先アミノ酸としてはセリン，アラニン，ロイシ
ン，バリン又はグリシンが、それぞれ好ましく例示され
る。

【００２８】（第６発明の作用・効果）天然型ペルオキ
シダーゼが白色腐朽菌由来の天然型マンガンペルオキシ
ダーゼである場合においては、そのアミノ酸配列におけ
る第８１位のアスパラギンを変換元アミノ酸とし、これ
をセリンに置換することがとりわけ有効である。

【００２９】（第７発明の作用・効果）以上の各発明に
係るペルオキシダーゼ変異体の過酸化水素に対する酵素
活性の安定性の望ましい基準の一つとして、過酸化水素
０．３ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活
性が９０％以上を示すものであることが例示される。

【００３０】（第８発明の作用・効果）第８発明によ
り、特に好ましく安定化されたペルオキシダーゼ変異体
である蛋白質が提供される。

【００３１】（第９発明の作用・効果）第９発明に係る
蛋白質においても、前記第８発明に係る蛋白質と同等な
効果を期待できる。

【００３２】（第１０発明〜第１３発明の作用・効果）
第１０発明〜第１３発明に係るＤＮＡ、ベクター、形質
転換細胞及び蛋白質の製造方法によって、前記ペルオキ
シダーゼ変異体（又は同機能の蛋白質）の遺伝子工学的
な高効率生産方法を構築することが可能となる。

【００３３】

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第１３発明の実
施の形態について説明する。以下において単に「本発
明」と言うときは、第１発明〜第１３発明を一括して指
している。

【００３４】〔ペルオキシダーゼ〕本発明が改変の対象
とする酵素の種類は、過酸化水素を活性化物質とする天
然型ペルオキシダーゼである。過酸化水素結合ポケット
に面するアミノ酸以外のアミノ酸に対して置換等を行っ
たペルオキシダーゼも、本質的に本発明の「天然型ペル
オキシダーゼ」に含まれる。特に好ましい改変の対象
が、マンガンペルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシ
ダーゼである。同種のペルオキシダーゼにおいても、由
来生物の相違等により具体的なアミノ酸配列，立体構
造，活性中心の構造，過酸化水素結合ポケットの構造、
過酸化水素結合ポケットに面するアミノ酸の種類等が必
ずしも同一ではないが、それらのいずれもが本発明の改
変の対象となる。

【００３５】〔アミノ酸の変換〕天然型ペルオキシダー
ゼにおいて変換の対象となるアミノ酸（変換元アミノ
酸）は、基本的には、過酸化水素結合ポケットに面する
アミノ酸である。ここに「面する」とは、立体構造の一
部分又は大部分が前記過酸化水素結合ポケットの空洞に
対して露出していることを言う。

【００３６】なお、他のアミノ酸への変換によって酵素
機能の阻害を起こすアミノ酸については、そのことが既
知のアミノ酸であると未知のアミノ酸であるとを問わ
ず、変換の対象とすることは好ましくない。

【００３７】好ましく対象となる変換元アミノ酸は、当
該アミノ酸を安定なアミノ酸に変換させると言うアミノ
酸安定化措置により、過酸化水素結合ポケットの空間構
造の変形を阻止すると言う効果を期待できるアミノ酸で
ある。特に、酸，アルカリ，熱等により立体形状の変化
し難いアミノ酸を、立体形状の変化し難いアミノ酸に変
換することが好ましい。とりわけ、酸化を受け易いアミ
ノ酸を酸化を受け難いアミノ酸に変換することが好まし
い。これらのアミノ酸の変換に当たり、変換元アミノ酸
と変換先アミノ酸の立体構造が類似していることが、更
に好ましい。

【００３８】以上の点を総合すると、変換元アミノ酸と
してはアスパラギン，グルタミン又はトリプトファンが
有力な候補となり、変換先アミノ酸としてはセリン，ア
ラニン，ロイシン，バリン又はグリシンが好ましい。な
お、変換元アミノ酸としては、上記以外にメチオニンや
システイン等の含Ｓアミノ酸も、それらが上記した変換
元アミノ酸の条件に合致している場合には、候補とな
る。

【００３９】又、過酸化水素結合ポケットに面する変換
元たり得るアミノ酸の内、その１個だけを変換すること
により優れた安定化効果を得る場合と、変換元たり得る
アミノ酸の２個以上ないし全てを変換することにより優
れた安定化効果を得る場合とがある。この点は、具体的
なペルオキシダーゼの種類次第で要求が異なり、一律に
は決定できない。例えば、ペルオキシダーゼの過酸化水
素結合ポケットに面する変換元候補のアミノ酸がＡ，
Ｂ，Ｃの３個あるとした場合、ペルオキシダーゼの種類
次第で、３個全ての変換が必要である場合と、Ａ，Ｂ，
Ｃのうちの特定の１個あるいは２個の変換が決定的な効
果をもたらす場合とがある。

【００４０】天然型ペルオキシダーゼが白色腐朽菌由来
の天然型マンガンペルオキシダーゼである場合、変換元
アミノ酸としては、該白色腐朽菌由来の天然型マンガン
ペルオキシダーゼのアミノ酸配列における第８１位のア
スパラギンが、特に好適である。その場合の変換先アミ
ノ酸としては、セリンが特に好適であり、アラニン，ロ
イシン，バリン又はグリシンもセリンに次いで好適であ
る。

【００４１】〔ペルオキシダーゼ変異体の好ましい特
性〕本発明のペルオキシダーゼ変異体においては、一般
的に、一定濃度の過酸化水素に対する酵素活性の相対的
安定化、又は一定濃度の過酸化水素の存在下における酵
素活性の熱安定性の相対的向上を期待できる。本発明に
よって達成される効果の基準として特に好ましいもの
が、ペルオキシダーゼ変異体の過酸化水素に対する酵素
活性の安定性が、過酸化水素０．３ｍＭ存在下における
２５°Ｃでの５分後の残存活性が９０％以上を示すもの
であること、である。更に好ましくは、過酸化水素１ｍ
Ｍ存在下における２５°Ｃ、５分後の残存活性が５０％
以上を示すものである。

【００４２】〔蛋白質、ＤＮＡ、ベクター、形質転換細
胞、蛋白質の製造方法〕配列番号１にアミノ酸配列を示
す蛋白質は、白色腐朽菌（Phanerochaete crysosporiu
m）由来の天然型マンガンペルオキシダーゼ（その塩基
配列を配列番号１に併記し、かつ、その活性型の立体構
造を図１に概念化して示す）であり、その第８１位のア
スパラギンをセリンに置換した蛋白質を、本発明に係る
ペルオキシダーゼ変異体の代表例として示すことができ
る。

【００４３】又、配列番号１に示すアミノ酸配列におけ
る第８１位のアスパラギンをセリンに置換し、かつ、発
明の効果を阻害しない限りにおいて、それ以外のアミノ
酸のうち１又は２以上のアミノ酸を置換，欠失又は付加
させたアミノ酸配列を有すると共に、有効なペルオキシ
ダーゼ活性を示す蛋白質も、本発明に係るペルオキシダ
ーゼ変異体の代表例として示すことができる。

【００４４】これらの蛋白質は公知の任意の方法により
製造することができる。例えば、これらの蛋白質をコー
ディングするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、これ
を適当な宿主細胞に導入して培養し、生産されたペルオ
キシダーゼ変異体を適当なプロセスにより回収すること
により、高効率に生産することができる。上記ＤＮＡ
は、公知の任意の方法、例えば、変換したいアミノ酸を
含む部分的アミノ酸配列をコードする塩基配列のプライ
マーを準備し、これを用いて天然型ペルオキシダーゼの
遺伝子ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法を行うこと、等の任
意の手段により、効率的に増幅して調製することができ
る。

【００４５】上記において、発現ベクターの種類及び内
容、宿主細胞の種類、宿主細胞の培養条件、生産された
ペルオキシダーゼ変異体の分離・精製方法等は必要に応
じて任意に決定すれば良い。

【００４６】

【発明の有益な実施態様】本発明は、以下のような有益
な態様において実施することができる。この実施態様欄
において、「上記」とは、該当する内容の先行する実施
態様番号に係る全ての実施態様を、択一的に指してい
る。

【００４７】１）天然型ペルオキシダーゼにおける過酸
化水素結合ポケットに面するアミノ酸を安定化すること
により、過酸化水素結合ポケットの空間構造の変形を阻
止してペルオキシダーゼの活性を安定化させるペルオキ
シダーゼの安定化方法。

【００４８】２）天然型ペルオキシダーゼにおける過酸
化水素結合ポケットに面するアミノ酸の内、他のアミノ
酸への変換によって酵素機能の阻害を起こさず、かつ立
体形状が変化し易いアミノ酸の１個又は２個以上を、立
体形状の変化し難いアミノ酸に変換したペルオキシダー
ゼ変異体。

【００４９】３）上記天然型ペルオキシダーゼが、過酸
化水素結合ポケットに面するアミノ酸以外のアミノ酸に
対して置換等を行ったペルオキシダーゼを含む。

【００５０】４）上記マンガンペルオキシダーゼがマン
ガンペルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシダーゼで
ある。

【００５１】５）上記マンガンペルオキシダーゼが白色
腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼである。

【００５２】６）上記変換元アミノ酸が酸化を受け易い
アミノ酸である。

【００５３】７）上記変換先アミノ酸が、変換元アミノ
酸と立体構造が類似し、かつ酸化を受け難いアミノ酸で
ある。

【００５４】８）上記変換元アミノ酸がアスパラギン，
グルタミン又はトリプトファンである。

【００５５】９）上記変換先アミノ酸がセリン，アラニ
ン，ロイシン，バリン又はグリシンである。

【００５６】１０）上記天然型ペルオキシダーゼが白色
腐朽菌由来の天然型マンガンペルオキシダーゼであり、
変換元アミノ酸が前記天然型マンガンペルオキシダーゼ
のアミノ酸配列における第８１位のアスパラギンであ
り、変換先アミノ酸がセリンである。

【００５７】１１）上記ペルオキシダーゼ変異体の過酸
化水素に対する酵素活性の安定性が、過酸化水素０．３
ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活性が９
０％以上を示すものである。

【００５８】１２）上記ペルオキシダーゼ変異体の過酸
化水素に対する酵素活性の安定性が、過酸化水素１ｍＭ
存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活性が５０％
以上を示すものである。

【００５９】１３）配列番号１に示すアミノ酸配列にお
ける第８１位のアスパラギンがセリン，アラニン，ロイ
シン，バリン又はグリシンに置換された蛋白質。

【００６０】１４）配列番号１に示すアミノ酸配列にお
ける第８１位のアスパラギンがセリン，アラニン，ロイ
シン，バリン又はグリシンに置換され、かつ、これら以
外のアミノ酸のうち１又は２以上のアミノ酸が置換，欠
失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に、ペルオ
キシダーゼ活性を示す蛋白質。

【００６１】１５）上記した１３）又は１４）の蛋白質
をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。

【００６２】１６）上記ＤＮＡを含むベクター。

【００６３】１７）上記ＤＮＡをその遺伝子機能が発現
可能な状態で含む形質転換細胞。

【００６４】１８）上記形質転換細胞を培養する工程を
含む蛋白質の製造方法。

【００６５】

【実施例】（マンガンペルオキシダーゼ変異体の作成）
配列番号１にアミノ酸配列を示し、図１に活性型の立体
構造を示す白色腐朽菌由来の天然型マンガンペルオキシ
ダーゼについて、その過酸化水素結合ポケットに面する
アミノ酸である８１位のアスパラギン（図１において、
「８１」の数字で表記）をセリンに変換したマンガンペ
ルオキシダーゼ変異体を作成した。そのプロセスは、
「発明の実施形態」欄で前記した遺伝子工学的手法によ
り行い、宿主細胞としては大腸菌を用いた。

【００６６】そして大腸菌において封入体として生産さ
せた上記変異体蛋白質は、８Ｍ尿素に溶解させた後、Ｈ
ｉｓ−ｔａｇ精製カラムによって精製した。更に５μＭ
のヘミンを加えた後、１ｍＭのカルシウムを含むトリス
緩衝液に対して透析を行い、活性型のマンガンペルオキ
シダーゼ変異体を得た。

【００６７】（過酸化水素に対する安定性試験）上記の
マンガンペルオキシダーゼ変異体を用いて各種濃度の過
酸化水素溶液中での残存活性のモニター試験を行った。

【００６８】活性測定は、２５ｍＭのコハク酸緩衝液
（ｐＨ４．５）に対して０．５ｍＭの硫酸マンガン、２
ｍＭのシュウ酸及び０．５ｍＭのＡＢＴＳ〔２，２’−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォネート〕を含ませた溶液に、過酸化水素を各種濃度に
加えたものを調製した。別々の上記溶液に、上記のマン
ガンペルオキシダーゼ変異体、及び、前記白色腐朽菌か
ら精製した天然型マンガンペルオキシダーゼを、それぞ
れ５ユニット加えて２５°Ｃで５分間の反応を行った
後、４０５ｎｍでの吸光度を測定して、残存活性を算出
した。

【００６９】その結果を図２に示す。図２において、
「Ｎ８１Ｓ」と表記したものはマンガンペルオキシダー
ゼ変異体を、「天然型」と表記したものは白色腐朽菌か
ら精製した天然型マンガンペルオキシダーゼを、それぞ
れ示す。

【００７０】図２より明らかなように、本発明の実施例
であるマンガンペルオキシダーゼ変異体は、各種濃度の
過酸化水素存在下における残存活性が、「天然型」に比
較して顕著に高い。例えば、「天然型」は過酸化水素濃
度１ｍＭ以下において既に、実質的に失活状態に近い残
存活性２０％以下に低下するのに対し、「Ｎ８１Ｓ」で
は、過酸化水素１ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分
後の残存活性が５０％近い値を示す。更に「Ｎ８１Ｓ」
は、過酸化水素が３〜５ｍＭと言う高濃度の状態におい
ても、２５°Ｃでの５分後の残存活性が３０％前後、な
いしは２０％を優に超える残存活性を示す。

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO <120> ペルオキシダーゼの安定化方法、ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ＤＮ Ａ、ベクター、形質転換細胞、蛋白質の製造方法 <130> POK-00-016 <160> 1 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Phanerochaete crysosporium <400> 1 gca gtc tgt cca gac ggc acc cgc gtc act aac gca gct tgt tgc gca 48 Ala Val Cys Pro Asp Gly Thr Arg Val Thr Asn Ala Ala Cys Cys Ala 5 10 15 ttt att cca ctg gct caa gac ctc cag gag acc ctc ttc cag ggc gac 96 Phe Ile Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gln Glu Thr Leu Phe Gln Gly Asp 20 25 30 tgc ggt gaa gat gcg cat gag gtc att cgt ctt acc ttc cac gac gcc 144 Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Val Ile Arg Leu Thr Phe His Asp Ala 35 40 45 att gct atc tct cag agc ctg gga ccc cag gcc ggc ggt ggt gct gac 192 Ile Ala Ile Ser Gln Ser Leu Gly Pro Gln Ala Gly Gly Gly Ala Asp 50 55 60 ggc tcc atg ctg cac ttc ccg acc atc gag ccg aat ttt tcg gcg aac 240 Gly Ser Met Leu His Phe Pro Thr Ile Glu Pro Asn Phe Ser Ala Asn 65 70 75 80 aac ggc att gac gac tcc gtg aac aac ctt atc ccc ttc atg cag aag 288 Asn Gly Ile Asp Asp Ser Val Asn Asn Leu Ile Pro Phe Met Gln Lys 85 90 95 cac aac acg atc agc gcc gct gac ctc gtc cag ttc gcg gga gcc gtt 336 His Asn Thr Ile Ser Ala Ala Asp Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Val 100 105 110 gct ctc agt aac tgc ccc ggc gcc cct cgc ctc gag ttc ctc gct ggt 384 Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Arg Leu Glu Phe Leu Ala Gly 115 120 125 cgc ccg aac acg act att ccc gca gtc gag ggc ctc atc cct gag ccg 432 Arg Pro Asn Thr Thr Ile Pro Ala Val Glu Gly Leu Ile Pro Glu Pro 130 135 140 cag gac agt gtc acc aaa att cta caa cgc ttc gag gac gca ggg aac 480 Gln Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu Gln Arg Phe Glu Asp Ala Gly Asn 145 150 155 160 ttc tcg cct ttt gag gtc gta tcc ctc ctc gcc tct cac act gtt gct 528 Phe Ser Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Leu Ala Ser His Thr Val Ala 165 170 175 cgt gca gac aag gtc gac gag acc atc gac gcc gca ccc ttc gat tcc 576 Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Thr Ile Asp Ala Ala Pro Phe Asp Ser 180 185 190 acg cct ttc act ttc gac acc cag gtc ttc ctc gag gtc ctt ctg aag 624 Thr Pro Phe Thr Phe Asp Thr Gln Val Phe Leu Glu Val Leu Leu Lys 195 200 205 ggt acc ggc ttc cct gga tcg aac aac aac acc ggt gag gtc atg tcc 672 Gly Thr Gly Phe Pro Gly Ser Asn Asn Asn Thr Gly Glu Val Met Ser 210 215 220 cca ctt ccc ctc ggc agc ggc agc gac acg ggc gag atg cgc ctg cag 720 Pro Leu Pro Leu Gly Ser Gly Ser Asp Thr Gly Glu Met Arg Leu Gln 225 230 235 240 tct gac ttt gcg ctc gcg cgc gac gag cgc acg gcg tgc ttc tgg cag 768 Ser Asp Phe Ala Leu Ala Arg Asp Glu Arg Thr Ala Cys Phe Trp Gln 245 250 255 tcg ttc gtc aac gag cag gag ttc atg gcg gcg agc ttc aag gcc gcg 816 Ser Phe Val Asn Glu Gln Glu Phe Met Ala Ala Ser Phe Lys Ala Ala 260 265 270 atg gcg aag ctc gcg atc ctc ggc cac agc cgc agc agc ctc atc gac 864 Met Ala Lys Leu Ala Ile Leu Gly His Ser Arg Ser Ser Leu Ile Asp 275 280 285 tgc agc gac gtc gtc ccc gtg ccg aag ccc gcc gtc aac aag ccc gcg 912 Cys Ser Asp Val Val Pro Val Pro Lys Pro Ala Val Asn Lys Pro Ala 290 295 300 acg ttc ccc gcg acg aag ggc ccc aag gac ctc gac aca ctc acg tgc 960 Thr Phe Pro Ala Thr Lys Gly Pro Lys Asp Leu Asp Thr Leu Thr Cys 305 310 315 320 aag gcc ctc aag ttc ccg acg ctg acc tct gac ccc ggt gct acc gag 1008 Lys Ala Leu Lys Phe Pro Thr Leu Thr Ser Asp Pro Gly Ala Thr Glu 325 330 335 acc ctc atc ccc cac tgc tcc aac ggc ggc atg tcc tgc cct ggt gtt 1056 Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asn Gly Gly Met Ser Cys Pro Gly Val 340 345 350 cag ttc gat ggc cct gcc 1074 Gln Phe Asp Gly Pro Ala 355 358

【図面の簡単な説明】

【図１】マンガンペルオキシダーゼの立体構造を概念的
に示す図である。

【図２】酵素の安定性を示すグラフ線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA01 DA06 EA04 GA11 GA19 HA06 4B050 CC04 DD05 FF05E FF14E HH02 LL10 4B065 AA26X AA71Y AB01 BA02 BD16 BD17 CA28 CA60

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型ペルオキシダーゼにおける過酸化
   水素結合ポケットに面するアミノ酸を安定化することに
   より、前記過酸化水素結合ポケットの空間構造の変形を
   阻止してペルオキシダーゼの活性を安定化させることを
   特徴とするペルオキシダーゼの安定化方法。
2. 【請求項２】 天然型ペルオキシダーゼにおける過酸化
   水素結合ポケットに面するアミノ酸の内、他のアミノ酸
   への変換によって酵素機能の阻害を起こさず、かつ立体
   形状が変化し易いアミノ酸（変換元アミノ酸）の１個又
   は２個以上を、立体形状の変化し難いアミノ酸（変換先
   アミノ酸）に変換したことを特徴とするペルオキシダー
   ゼ変異体。
3. 【請求項３】 前記天然型ペルオキシダーゼがマンガン
   ペルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシダーゼである
   ことを特徴とする請求項２に記載のペルオキシダーゼ変
   異体。
4. 【請求項４】 前記変換元アミノ酸が、酸化を受け易い
   アミノ酸であり、前記変換先アミノ酸が、変換元アミノ
   酸と立体構造が類似し、かつ酸化を受け難いアミノ酸で
   あることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載のペ
   ルオキシダーゼ変異体。
5. 【請求項５】 前記変換元アミノ酸がアスパラギン，グ
   ルタミン又はトリプトファンであり、前記変換先アミノ
   酸がセリン，アラニン，ロイシン，バリン又はグリシン
   であることを特徴とする請求項２〜請求項４のいずれか
   に記載のペルオキシダーゼ変異体。
6. 【請求項６】 前記天然型ペルオキシダーゼが白色腐朽
   菌由来の天然型マンガンペルオキシダーゼであり、前記
   変換元アミノ酸が前記天然型マンガンペルオキシダーゼ
   のアミノ酸配列における第８１位のアスパラギンであ
   り、前記変換先アミノ酸がセリンであることを特徴とす
   る請求項２〜請求項５のいずれかに記載のペルオキシダ
   ーゼ変異体。
7. 【請求項７】 前記ペルオキシダーゼ変異体の過酸化水
   素に対する酵素活性の安定性が、過酸化水素０．３ｍＭ
   存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活性が９０％
   以上を示すものであることを特徴とする請求項２〜請求
   項６のいずれかに記載のペルオキシダーゼ変異体。
8. 【請求項８】 配列番号１に示すアミノ酸配列における
   第８１位のアスパラギンがセリン，アラニン，ロイシ
   ン，バリン又はグリシンに置換されていることを特徴と
   する蛋白質。
9. 【請求項９】 配列番号１に示すアミノ酸配列における
   第８１位のアスパラギンがセリン，アラニン，ロイシ
   ン，バリン又はグリシンに置換され、かつ、これら以外
   のアミノ酸のうち１又は２以上のアミノ酸が置換，欠失
   又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に、ペルオキ
   シダーゼ活性を示すことを特徴とする蛋白質。
10. 【請求項１０】 請求項８又は請求項９に記載の蛋白質
    をコードする塩基配列を有することを特徴をするＤＮ
    Ａ。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のＤＮＡを含むこと
    を特徴とするベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のＤＮＡを、その遺
    伝子機能が発現可能な状態で含むことを特徴とする形質
    転換細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の形質転換細胞を培
    養する工程を含むことを特徴とする蛋白質の製造方法。