JP2001346583A - 酸化酵素変異体、ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ｄｎａ、ベクター、形質転換細胞、蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酸化酵素の、特に活性化物質に対する安定性
を改良する。 【解決手段】 天然型酸化酵素の活性型立体構造におけ
る活性中心近傍に位置する易酸化性アミノ酸（例えば、
含Ｓアミノ酸）の一部又は全部を、類似立体構造の耐酸
化性アミノ酸に変換した酸化酵素変異体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化酵素変異体、
ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ＤＮＡ、ベクター、
形質転換細胞及び蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、酵素を蛋白質工学的にデザインす
ることにより、酵素の機能，安定性，基質特異性等を好
ましく改変しようとする研究がなされている。

【０００３】例えば酸化酵素、とりわけマンガンペルオ
キシダーゼやリグニンペルオキシダーゼのようなペルオ
キシダーゼに関しては、紙パルプの製造工程における着
色原因物質たるリグニンの分解、特開平６−２９６９４
９号公報で指摘されているプラスチック分解等の産業上
重要な広範囲の用途があり、優れた酸化酵素変異体の提
供が特に強く求められる。そして従来、リグニンペルオ
キシダーゼのベラトリルアルコール結合部位の付加の研
究（J. Exp. Med., 184, 831-837, 1996）、ペルオキシ
ダーゼの基質特異性の改変（特開平１１−１５５５７
０）等に関する報告もしくは提案がなされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、酵素活性に
ついては常に安定性が問題となるが、特に酸化酵素につ
いては、酵素反応に酸素，過酸化水素等の活性化物質を
利用することから、活性化物質によって容易に失活しな
い酵素活性の確保が問題となる。

【０００５】例えば紙パルプの製造工程において、ペル
オキシダーゼを用いてリグニンを酵素的に分解する際に
は、活性化物質である過酸化水素を非常に低濃度に制御
しなければ酵素の失活を招くため、活性化物質の高濃度
化による酵素反応の効率アップを図り難い現状である。

【０００６】しかし従来、ペルオキシダーゼの過酸化水
素に対する安定性（より一般化して言えば、酸化酵素の
活性化物質に対する安定性）や、活性化物質の存在下に
おける酵素の熱安定性等を考慮した酵素変異体提供の試
みは報告されていない。

【０００７】そこで本発明は、酸化酵素又はペルオキシ
ダーゼの優れた安定化変異体を創製することを、解決す
べき課題とする。本願発明者は、代表的な酸化酵素であ
るペルオキシダーゼの安定化変異体のデザインを試み、
種々の試行錯誤の末に優れた安定化変異体の創製に成功
して、本願発明を完成した。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用・効果】（第１発
明の構成及び作用・効果）上記課題を解決するための本
願第１発明（請求項１に記載の発明）の構成は、天然型
酸化酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１
５Å以内の範囲に位置する易酸化性アミノ酸の一部又は
全部を、類似立体構造の耐酸化性アミノ酸に変換した、
酸化酵素変異体である。

【０００９】本願発明者は、活性化物質に対する酸化酵
素の安定性を向上させるに当たり、酵素を構成するポリ
ペプチドのアミノ酸配列の内、特に易酸化性アミノ酸、
即ち酸化され易いアミノ酸に注目した。しかも活性中心
近傍の易酸化性アミノ酸に注目した。そして、活性中心
から一定の範囲内（例えば、半径１５Å以内の範囲）に
あるこれらの易酸化性アミノ酸の一部又は全部を、類似
立体構造の耐酸化性アミノ酸に変換することで、酵素活
性の安定性が著しく向上することを知った。

【００１０】従って第１発明においては、活性化物質に
対する酸化酵素の安定性又は活性化物質の存在下におけ
る酸化酵素の安定性が著しく向上する。以上の知見は実
験的に確認したものであり、上記の作用・効果を得る正
確な理由は未だ判明していない。しかし上記の知見によ
れば、次のような点が推定される。１）天然型酸化酵素
においては、活性化物質による活性中心近傍の易酸化性
アミノ酸の酸化に基づく化学変化を生じて、この変化が
酵素の失活に関与している。個々の酵素の種類に対応し
て、活性中心近傍の全ての易酸化性アミノ酸が関与する
場合と、その一部の易酸化性アミノ酸が関与する場合と
がある。活性中心から離れた易酸化性アミノ酸の同様な
酸化に基づく化学変化によっては、通常は酵素の失活を
生じない。２）活性中心近傍の易酸化性アミノ酸の一部
又は全部を耐酸化性アミノ酸に変換することにより、上
記のような酵素の失活を防止できる。その変換に当た
り、易酸化性アミノ酸をこれと類似した立体構造の耐酸
化性アミノ酸に変換するので、変換による酸化酵素の活
性型立体構造の変化が抑制される。

【００１１】（第２発明の構成及び作用・効果）上記課
題を解決するための本願第２発明（請求項２に記載の発
明）の構成は、前記第１発明に係る易酸化性アミノ酸が
含Ｓアミノ酸である、酸化酵素変異体である。

【００１２】易酸化性アミノ酸の代表的なものの一例と
して、含Ｓアミノ酸が挙げられる。含Ｓアミノ酸は特に
酸化され易く、活性中心の近傍に位置する含Ｓアミノ酸
の酸化により化学変化を生じて、この変化が酵素の失活
に関与している。従って、活性中心から一定の範囲内
（例えば、半径１５Å以内の範囲）にある含Ｓアミノ酸
の一部又は全部を、類似立体構造の耐酸化性アミノ酸に
変換することにより、酵素活性の安定性がとりわけ著し
く向上する。

【００１３】（第３発明の構成及び作用・効果）上記課
題を解決するための本願第３発明（請求項３に記載の発
明）の構成は、前記第１発明又は第２発明において、以
下（１）〜（４）の少なくとも一条件に該当する、酸化
酵素変異体である。 （１）前記天然型酸化酵素がペルオキシダーゼである。 （２）前記天然型酸化酵素がマンガンペルオキシダーゼ
又はリグニンペルオキシダーゼである。 （３）前記易酸化性アミノ酸又は含Ｓアミノ酸がメチオ
ニンであり、前記耐酸化性アミノ酸がロイシン，イソロ
イシン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンであ
る。 （４）前記易酸化性アミノ酸又は含Ｓアミノ酸がシステ
インであり、前記耐酸化性アミノ酸がセリン又はアラニ
ンである。

【００１４】以上の第３発明のように、酸化酵素が過酸
化水素等を活性化物質とするペルオキシダーゼであり、
特にマンガンペルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシ
ダーゼである場合に、酸化酵素変異体の産業上の利用価
値が特に大きい。

【００１５】又、対象とする易酸化性アミノ酸又は含Ｓ
アミノ酸として特に効果の顕著なものがメチオニンであ
るが、システインを対象とする場合にも効果を期待でき
る。メチオニンは、ロイシンに変換した場合に特に顕著
な効果を得るが、イソロイシン，バリン，アラニン，グ
リシン又はセリンに変換した場合にも有効な効果を期待
できる。システインは、セリン又はアラニンに変換した
場合に有効な効果を期待できる。

【００１６】（第４発明の構成及び作用・効果）上記課
題を解決するための本願第４発明（請求項４に記載の発
明）の構成は、天然型ペルオキシダーゼの活性中心近傍
の易酸化性アミノ酸の一部又は全部を類似立体構造の耐
酸化性アミノ酸に変換したペルオキシダーゼ変異体であ
って、活性化物質に対する酵素活性の安定性が、過酸化
水素１ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活
性が５０％以上を示すものである、ペルオキシダーゼ変
異体である。

【００１７】上記した、過酸化水素１ｍＭ存在下におけ
る２５°Ｃでの５分後の残存活性は、天然型ペルオキシ
ダーゼにおいては１０〜２０％程度まで低下する。即
ち、実質的には完全な失活に近い状態となる。従って、
このような条件下で５０％以上の残存活性を示すこと
は、産業上非常に有効である。

【００１８】（第５発明の構成及び作用・効果）上記課
題を解決するための本願第５発明（請求項５に記載の発
明）の構成は、配列番号１に示すアミノ酸配列における
第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの内
の少なくとも一個のメチオニンが、ロイシン，イソロイ
シン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換さ
れている、蛋白質である。

【００１９】以上の第５発明により、有効なマンガンペ
ルオキシダーゼ変異体の具体的な実施形態例が提供され
る。

【００２０】（第６発明の構成及び作用・効果）上記課
題を解決するための本願第６発明（請求項６に記載の発
明）の構成は、配列番号１に示すアミノ酸配列における
第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの内
の少なくとも一個のメチオニンがロイシン，イソロイシ
ン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換さ
れ、かつ、これら以外のアミノ酸のうち１又は２以上の
アミノ酸が置換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有
すると共に、酸化酵素活性を示す、蛋白質である。

【００２１】以上の第６発明に係る蛋白質においても、
前記第５発明に係る蛋白質と同等な効果を期待できる。

【００２２】（第７発明〜第１０発明の構成及び作用・
効果）上記課題を解決するための本願第７発明（請求項
７に記載の発明）の構成は、前記第５発明又は第６発明
に係る蛋白質をコードする塩基配列を有する、ＤＮＡで
ある。

【００２３】上記課題を解決するための本願第８発明
（請求項８に記載の発明）の構成は、前記第７発明に係
るＤＮＡを含む、ベクターである。

【００２４】上記課題を解決するための本願第９発明
（請求項９に記載の発明）の構成は、前記第７発明に係
るＤＮＡを、その遺伝子機能が発現可能な状態で含む、
形質転換細胞である。

【００２５】上記課題を解決するための本願第１０発明
（請求項１０に記載の発明）の構成は、前記第９発明に
係る形質転換細胞を培養する工程を含む、蛋白質の製造
方法である。

【００２６】以上の第７発明〜第１０発明に係るＤＮ
Ａ、ベクター、形質転換細胞及び蛋白質の製造方法によ
って、前記第５発明又は第６発明に係る蛋白質の遺伝子
工学的な高効率生産方法を構築することが可能となる。

【００２７】

【発明の実施の形態】次に、第１発明〜第１０発明の実
施の形態について説明する。以下において単に「本発
明」と言うときは、第１発明〜第１０発明を一括して指
している。

【００２８】〔酸化酵素〕本発明が改変の対象とする酸
化酵素の種類は限定されないが、過酸化水素を活性化物
質とするペルオキシダーゼ，カタラーゼ、酸素を活性化
物質とするラッカーゼ，ヘムオキシダーゼ等を例示する
ことができる。特に好ましい改変の対象が、マンガンペ
ルオキシダーゼ又はリグニンペルオキシダーゼである。

【００２９】同種の酸化酵素においても、由来生物の相
違等により具体的なアミノ酸配列や立体構造，活性中心
の構造等が必ずしも同一ではないが、それらのいずれも
が本発明の改変の対象となる。

【００３０】〔アミノ酸の変換〕天然型酸化酵素におい
て変換の対象となるアミノ酸は、基本的には、易酸化性
アミノ酸、即ち酸化され易いアミノ酸である。易酸化性
アミノ酸の代表的なものとして、メチオニン，システイ
ン等の硫黄原子を含む含Ｓアミノ酸が挙げられる。又、
トリプトファン，フリーのグルタミンやアスパラギン等
も代表的なものとして挙げられる。上記システインとし
ては、一般的には、Ｓ−Ｓ結合を形成して蛋白質の立体
構造の保持に寄与しているものを変換の対象から除き、
Ｓ−Ｓ結合を形成していないフリーのシステインを変換
の対象とする。

【００３１】天然型酸化酵素中の易酸化性アミノ酸を無
原則に変換しても、有効な効果が得られない場合があ
る。即ち、少なくとも、天然型酸化酵素の活性型立体構
造における活性中心近傍の易酸化性アミノ酸の一部又は
全部を変換する必要がある。

【００３２】上記において「近傍」とは、少なくとも活
性中心の立体構造に影響し得る程に近い空間位置にある
ことを言う。「近傍」の一つの具体的な指標が、活性中
心から半径１５Å以内の範囲に位置することである。

【００３３】又、上記において、活性中心近傍の易酸化
性アミノ酸の「一部又は全部」とするのは、具体的な酸
化酵素の種類次第で変換すべき易酸化性アミノ酸の内容
が異なり、一律には決定できないからである。例えば、
活性中心近傍の易酸化性アミノ酸がＡ，Ｂ，Ｃの３個あ
るとした場合、酸化酵素の種類次第で、３個全ての変換
が必要である場合と、Ａ，Ｂ，Ｃのうちの特定の１個あ
るいは２個の変換が決定的な効果をもたらす場合とがあ
る。

【００３４】天然型酸化酵素中の全ての易酸化性アミノ
酸を所定のアミノ酸に変換する方法は、必然的に変換が
必要な易酸化性アミノ酸も変換されると言う意味におい
て、一般的には有効である。しかし、変換が不要な易酸
化性アミノ酸まで一律の変換することにより、あるいは
酵素全体として全ての易酸化性アミノ酸を無くすること
により、却って何らかの副作用により安定化効果が損な
われる可能性もある。本発明には、このような不利な場
合は含まれない。

【００３５】上記の所定の易酸化性アミノ酸は、天然型
酸化酵素のアミノ酸配列中から単に欠失させることが有
効である場合も予想されるが、その欠失が酸化酵素の立
体構造等に不測の悪影響をもたらす場合も予想される。

【００３６】好ましくは、上記の所定の易酸化性アミノ
酸は、耐酸化性アミノ酸（酸化され難いアミノ酸、例え
ば疎水性アミノ酸）に変換することが好ましい。酸化さ
れ難く、かつ変換対象たるアミノ酸と類似した立体構造
を有するアミノ酸に変換することが特に好ましい。易酸
化性アミノ酸が含Ｓアミノ酸たるメチオニンである場
合、類似立体構造の耐酸化性アミノ酸としてロイシン，
イソロイシン，バリン，アラニン，グリシン又はセリン
を例示できる。易酸化性アミノ酸が含Ｓアミノ酸たるシ
ステインである場合、類似立体構造の耐酸化性アミノ酸
としてセリン又はアラニンを例示できる。

【００３７】〔酵素変異体の好ましい特性〕本発明の酵
素変異体においては、一般的に、一定濃度の活性化物質
に対する酵素活性の相対的安定化、又は一定濃度の活性
化物質の存在下における酵素活性の熱安定性の相対的向
上を期待できる。本発明によって達成される効果の基準
として特に好ましいものが、ペルオキシダーゼ変異体の
活性化物質に対する酵素活性の安定性が、過酸化水素１
ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活性が５
０％以上を示すものであること、である。

【００３８】〔蛋白質、ＤＮＡ、ベクター、形質転換細
胞、蛋白質の製造方法〕配列番号１にアミノ酸配列を示
す蛋白質は、白色腐朽菌（Phanerochaete crysosporiu
m）由来の天然型マンガンペルオキシダーゼ（その塩基
配列を配列番号１に併記し、かつ、その活性型の立体構
造を図１に概念化して示す）であり、その第６７位，第
２３７位及び第２７３位のメチオニンの内の少なくとも
一個のメチオニンをロイシン，イソロイシン，バリン，
アラニン，グリシン又はセリンに置換した蛋白質を、本
発明に係るペルオキシダーゼ変異体の代表例として示す
ことができる。

【００３９】又、配列番号１に示すアミノ酸配列におけ
る第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの
内の少なくとも一個のメチオニンがロイシン，イソロイ
シン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換さ
れ、かつ、これら以外のアミノ酸のうち１又は２以上の
アミノ酸が置換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有
すると共に、酸化酵素活性（ペルオキシダーゼ活性）を
示す蛋白質も、本発明に係るペルオキシダーゼ変異体の
代表例として示すことができる。

【００４０】これらの蛋白質は公知の任意の方法により
製造することができる。例えば、これらの蛋白質をコー
ディングするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、これ
を適当な宿主細胞に導入して培養し、生産された酵素変
異体を適当なプロセスにより回収することにより、高効
率に生産することができる。上記ＤＮＡは、公知の任意
の方法、例えば、変換したいアミノ酸を含む部分的アミ
ノ酸配列をコードする塩基配列のプライマーを準備し、
これを用いて天然型ペルオキシダーゼの遺伝子ＤＮＡを
鋳型とするＰＣＲ法を行うこと、等の任意の手段によ
り、効率的に増幅して調製することができる。

【００４１】上記において、発現ベクターの種類及び内
容、宿主細胞の種類、宿主細胞の培養条件、生産された
酵素変異体の分離・精製方法等は必要に応じて任意に決
定すれば良い。

【００４２】

【発明の有益な実施態様】本発明は、以下のような有益
な態様において実施することができる。 １）天然型酸化酵素の活性型立体構造における活性中心
から半径１５Å以内の範囲に位置する易酸化性アミノ酸
の一部又は全部を、類似立体構造の耐酸化性アミノ酸に
変換した酸化酵素変異体。

【００４３】２）上記天然型酸化酵素がラッカーゼ又は
カタラーゼである。 ３）上記天然型酸化酵素がペルオキシダーゼである。 ４）上記天然型酸化酵素がマンガンペルオキシダーゼ又
はリグニンペルオキシダーゼである。 ５）上記天然型酸化酵素が、白色腐朽菌由来のマンガン
ペルオキシダーゼである。

【００４４】６）上記易酸化性アミノ酸が含Ｓアミノ
酸、又はトリプトファン，フリーのグルタミンやアスパ
ラギンである。 ７）上記含Ｓアミノ酸がメチオニン又はシステインであ
る。 ８）上記含Ｓアミノ酸がメチオニンである場合におい
て、上記類似立体構造の耐酸化性アミノ酸がロイシンで
ある。 ９）上記含Ｓアミノ酸がメチオニンである場合におい
て、上記類似立体構造の耐酸化性アミノ酸が、イソロイ
シン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンである。 １０）上記含Ｓアミノ酸がシステインである場合におい
て、上記類似立体構造の耐酸化性アミノ酸がセリン又は
アラニンである。

【００４５】１１）天然型ペルオキシダーゼの活性中心
近傍の易酸化性アミノ酸の一部又は全部を類似立体構造
の耐酸化性アミノ酸に変換したペルオキシダーゼ変異体
であって、活性化物質に対する酵素活性の安定性が、過
酸化水素１ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残
存活性が５０％以上を示すものである。

【００４６】１２）配列番号１に示すアミノ酸配列にお
ける第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニン
の内の少なくとも一個のメチオニンがロイシン，イソロ
イシン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換
されている蛋白質。 １３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第６７
位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの内の少な
くとも一個のメチオニンがロイシン，イソロイシン，バ
リン，アラニン，グリシン又はセリンに置換され、これ
ら以外のアミノ酸のうち１又は２以上のアミノ酸が置
換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有すると共に、
酸化酵素活性を示す蛋白質。 １４）上記１２）又は１３）において、第２７３位のメ
チオニンのみがロイシン，イソロイシン，バリン，アラ
ニン，グリシン又はセリンに置換されている。

【００４７】１５）上記１２）〜１４）のいずれかに記
載の蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。 １６）上記１５）のＤＮＡを含むベクター。 １７）上記１５）のＤＮＡを、その遺伝子機能の発現可
能に含む形質転換細胞。 １８）上記１７）の形質転換細胞を培養する工程を含む
蛋白質の製造方法。

【００４８】

【実施例】（マンガンペルオキシダーゼ変異体の作成）
配列番号１にアミノ酸配列を、図１に活性型の立体構造
を示す白色腐朽菌由来の天然型マンガンペルオキシダー
ゼについて、その活性中心であるヘム部分（図１におい
て「ヘム」と表記）の近傍、即ち活性中心から半径１５
Å以内の範囲に存在する６７位，２３７位，２７３位の
３個のメチオニン（図１において、それぞれ該当する
「６７」，「２３７」，「２７３」の数字で表記）をロ
イシンに変換したマンガンペルオキシダーゼ変異体
〔１〕を作成した。そのプロセスは、「発明の実施形
態」欄で前記した遺伝子工学的手法により行い、宿主細
胞としては大腸菌を用いた。

【００４９】そして大腸菌において封入体として生産さ
せた上記変異体蛋白質は、８Ｍ尿素に溶解させた後、Ｈ
ｉｓ−ｔａｇ精製カラムによって精製した。更に５μＭ
のヘミンを加えた後、１ｍＭのカルシウムを含むトリス
緩衝液に対して透析を行い、活性型のマンガンペルオキ
シダーゼ変異体〔１〕を得た。

【００５０】次に、上記と同様のプロセスにより、同上
の天然型マンガンペルオキシダーゼの立体構造における
外側付近に存在する９４位，２２３位，３４６位の３個
のメチオニン（図１において、それぞれ該当する「９
４」，「２２３」，「３４６」の数字で表記）をロイシ
ンに変換したマンガンペルオキシダーゼ変異体〔２〕を
作成し、かつその活性型を得た。

【００５１】（過酸化水素に対する安定性試験）上記の
マンガンペルオキシダーゼ変異体〔１〕及びマンガンペ
ルオキシダーゼ変異体〔２〕を用いて各種濃度の過酸化
水素溶液中での残存活性のモニター試験を行った。

【００５２】活性測定は、２５ｍＭのコハク酸緩衝液
（ｐＨ４．５）に対して０．５ｍＭの硫酸マンガン、２
ｍＭのシュウ酸及び０．５ｍＭのＡＢＴＳ〔２，２’−
アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフ
ォネート〕を含ませた溶液に、過酸化水素を各種濃度に
加えたものを調製した。別々の上記溶液に、上記の変異
体〔１〕、〔２〕及び天然型マンガンペルオキシダーゼ
をそれぞれ５ユニット加えて２５°Ｃで５分間の反応を
行った後、４０５ｎｍでの吸光度を測定して、残存活性
を算出した。

【００５３】その結果を図２に示す。図２において、
「メチオニン内側改変」と表記したものはマンガンペル
オキシダーゼ変異体〔１〕を、「メチオニン外側改変」
と表記したものはマンガンペルオキシダーゼ変異体
〔２〕を、「天然型」と表記したものは腐朽菌から精製
した天然型マンガンペルオキシダーゼを、「改変前」と
表記したものは改変を加えていない組換え型マンガンペ
ルオキシダーゼを、それぞれ示す。

【００５４】図２より明らかなように、本発明の実施例
であるマンガンペルオキシダーゼ変異体〔１〕は、各種
濃度の過酸化水素存在下における残存活性が、「天然
型」，「改変前」又は「メチオニン外側改変」に比較し
て顕著に高い。例えば、「メチオニン内側改変」は、過
酸化水素１ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残
存活性が５０％以上を示すが、「天然型」，「改変前」
における同残存活性は２０％以下であり、「メチオニン
外側改変」においても同残存活性は３０％に満たない。

【００５５】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> TOYOTA CENTRAL R&D LABS., INC. <120> 酸化酵素変異体、ペルオキシダーゼ変異体、蛋白質、ＤＮＡ、ベクター、 形質転換細胞、蛋白質の製造方法 <130> POK-00-016 <160> 1 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Phanerochaete crysosporium <400> 1 gca gtc tgt cca gac ggc acc cgc gtc act aac gca gct tgt tgc gca 48 Ala Val Cys Pro Asp Gly Thr Arg Val Thr Asn Ala Ala Cys Cys Ala 5 10 15 ttt att cca ctg gct caa gac ctc cag gag acc ctc ttc cag ggc gac 96 Phe Ile Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gln Glu Thr Leu Phe Gln Gly Asp 20 25 30 tgc ggt gaa gat gcg cat gag gtc att cgt ctt acc ttc cac gac gcc 144 Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Val Ile Arg Leu Thr Phe His Asp Ala 35 40 45 att gct atc tct cag agc ctg gga ccc cag gcc ggc ggt ggt gct gac 192 Ile Ala Ile Ser Gln Ser Leu Gly Pro Gln Ala Gly Gly Gly Ala Asp 50 55 60 ggc tcc atg ctg cac ttc ccg acc atc gag ccg aat ttt tcg gcg aac 240 Gly Ser Met Leu His Phe Pro Thr Ile Glu Pro Asn Phe Ser Ala Asn 65 70 75 80 aac ggc att gac gac tcc gtg aac aac ctt atc ccc ttc atg cag aag 288 Asn Gly Ile Asp Asp Ser Val Asn Asn Leu Ile Pro Phe Met Gln Lys 85 90 95 cac aac acg atc agc gcc gct gac ctc gtc cag ttc gcg gga gcc gtt 336 His Asn Thr Ile Ser Ala Ala Asp Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Val 100 105 110 gct ctc agt aac tgc ccc ggc gcc cct cgc ctc gag ttc ctc gct ggt 384 Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Arg Leu Glu Phe Leu Ala Gly 115 120 125 cgc ccg aac acg act att ccc gca gtc gag ggc ctc atc cct gag ccg 432 Arg Pro Asn Thr Thr Ile Pro Ala Val Glu Gly Leu Ile Pro Glu Pro 130 135 140 cag gac agt gtc acc aaa att cta caa cgc ttc gag gac gca ggg aac 480 Gln Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu Gln Arg Phe Glu Asp Ala Gly Asn 145 150 155 160 ttc tcg cct ttt gag gtc gta tcc ctc ctc gcc tct cac act gtt gct 528 Phe Ser Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Leu Ala Ser His Thr Val Ala 165 170 175 cgt gca gac aag gtc gac gag acc atc gac gcc gca ccc ttc gat tcc 576 Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Thr Ile Asp Ala Ala Pro Phe Asp Ser 180 185 190 acg cct ttc act ttc gac acc cag gtc ttc ctc gag gtc ctt ctg aag 624 Thr Pro Phe Thr Phe Asp Thr Gln Val Phe Leu Glu Val Leu Leu Lys 195 200 205 ggt acc ggc ttc cct gga tcg aac aac aac acc ggt gag gtc atg tcc 672 Gly Thr Gly Phe Pro Gly Ser Asn Asn Asn Thr Gly Glu Val Met Ser 210 215 220 cca ctt ccc ctc ggc agc ggc agc gac acg ggc gag atg cgc ctg cag 720 Pro Leu Pro Leu Gly Ser Gly Ser Asp Thr Gly Glu Met Arg Leu Gln 225 230 235 240 tct gac ttt gcg ctc gcg cgc gac gag cgc acg gcg tgc ttc tgg cag 768 Ser Asp Phe Ala Leu Ala Arg Asp Glu Arg Thr Ala Cys Phe Trp Gln 245 250 255 tcg ttc gtc aac gag cag gag ttc atg gcg gcg agc ttc aag gcc gcg 816 Ser Phe Val Asn Glu Gln Glu Phe Met Ala Ala Ser Phe Lys Ala Ala 260 265 270 atg gcg aag ctc gcg atc ctc ggc cac agc cgc agc agc ctc atc gac 864 Met Ala Lys Leu Ala Ile Leu Gly His Ser Arg Ser Ser Leu Ile Asp 275 280 285 tgc agc gac gtc gtc ccc gtg ccg aag ccc gcc gtc aac aag ccc gcg 912 Cys Ser Asp Val Val Pro Val Pro Lys Pro Ala Val Asn Lys Pro Ala 290 295 300 acg ttc ccc gcg acg aag ggc ccc aag gac ctc gac aca ctc acg tgc 960 Thr Phe Pro Ala Thr Lys Gly Pro Lys Asp Leu Asp Thr Leu Thr Cys 305 310 315 320 aag gcc ctc aag ttc ccg acg ctg acc tct gac ccc ggt gct acc gag 1008 Lys Ala Leu Lys Phe Pro Thr Leu Thr Ser Asp Pro Gly Ala Thr Glu 325 330 335 acc ctc atc ccc cac tgc tcc aac ggc ggc atg tcc tgc cct ggt gtt 1056 Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asn Gly Gly Met Ser Cys Pro Gly Val 340 345 350 cag ttc gat ggc cct gcc 1074 Gln Phe Asp Gly Pro Ala 355 358

【図面の簡単な説明】

【図１】マンガンペルオキシダーゼの立体構造を概念的
に示す図である。

【図２】酵素の安定性を示すグラフ線図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA08 CA03 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 CC04 DD03 LL02 LL04 4B065 AA01X AA57X AA58Y AA87X AB01 AC14 BA02 CA28 CA41 CA55

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型酸化酵素の活性型立体構造におけ
   る活性中心から半径１５Å以内の範囲に位置する易酸化
   性アミノ酸の一部又は全部を、類似立体構造の耐酸化性
   アミノ酸に変換したことを特徴とする酸化酵素変異体。
2. 【請求項２】 前記易酸化性アミノ酸が含Ｓアミノ酸で
   あることを特徴とする請求項１に記載の酸化酵素変異
   体。
3. 【請求項３】 以下（１）〜（４）の少なくとも一条件
   に該当することを特徴とする請求項１又は請求項２に記
   載の酸化酵素変異体。 （１）前記天然型酸化酵素がペルオキシダーゼである。 （２）前記天然型酸化酵素がマンガンペルオキシダーゼ
   又はリグニンペルオキシダーゼである。 （３）前記易酸化性アミノ酸又は含Ｓアミノ酸がメチオ
   ニンであり、前記耐酸化性アミノ酸がロイシン，イソロ
   イシン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンであ
   る。 （４）前記易酸化性アミノ酸又は含Ｓアミノ酸がシステ
   インであり、前記耐酸化性アミノ酸がセリン又はアラニ
   ンである。
4. 【請求項４】 天然型ペルオキシダーゼの活性中心近傍
   の易酸化性アミノ酸の一部又は全部を類似立体構造の耐
   酸化性アミノ酸に変換したペルオキシダーゼ変異体であ
   って、活性化物質に対する酵素活性の安定性が、過酸化
   水素１ｍＭ存在下における２５°Ｃでの５分後の残存活
   性が５０％以上を示すものであることを特徴とするペル
   オキシダーゼ変異体。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すアミノ酸配列における
   第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの内
   の少なくとも一個のメチオニンが、ロイシン，イソロイ
   シン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換さ
   れていることを特徴とする蛋白質。
6. 【請求項６】 配列番号１に示すアミノ酸配列における
   第６７位，第２３７位及び第２７３位のメチオニンの内
   の少なくとも一個のメチオニンがロイシン，イソロイシ
   ン，バリン，アラニン，グリシン又はセリンに置換さ
   れ、かつ、これら以外のアミノ酸のうち１又は２以上の
   アミノ酸が置換，欠失又は付加されたアミノ酸配列を有
   すると共に、酸化酵素活性を示すことを特徴とする蛋白
   質。
7. 【請求項７】 請求項５又は請求項６に記載の蛋白質を
   コードする塩基配列を有することを特徴をするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のＤＮＡを含むことを特
   徴とするベクター。
9. 【請求項９】 請求項７に記載のＤＮＡを、その遺伝子
   機能が発現可能な状態で含むことを特徴とする形質転換
   細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の形質転換細胞を培養
    する工程を含むことを特徴とする蛋白質の製造方法。