JP2002136295A - ヒト成長ホルモン変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト成長ホルモン変異体を提供する。 【解決手段】 (a)hＧＨアミノ酸の１７２等が、(1)
Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｒ等よりなる群から選択され、(b)アミノ
酸１０等が、(1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ等よりなる群から選択
され、(c)アミノ酸の１７４がセリンであり、１７６が
チロシンであり、そしてアミノ酸の１６７等が(1)Ｎ、
Ｓ、Ｔ、Ｔ等よりなる群から選択され、(d)グルタメー
ト₁₇₄がセリン₁₇₄によって置換され、フェニルアラニン
₁₇₆がチロシン₁₇₆によって置換され、そして８個のアミ
ノ酸が置換され、(e)(d)のhＧＨ変異体において、８個
のアミノ酸Ｆ１０等が、(1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ等
よりなる群から順に選択され、(f)(e)が、アルギニン₁₅
によって置換されたロイシン₁₅およびアルギニン₁₆₈に
よって置換され、(g)(e)が、フェニルアラニン₁₇₆をさ
らに含有するヒト成長ホルモン変異体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホルモン、薬物お
よびその他の小分子（特に、成長ホルモンなどの生物学
的に活性な分子）などのタンパク質または非ペプチジル
分子を模倣する治療用または診断用化合物の製造に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】結合パートナーとは、通常は非共有性の
相互作用によって互いに特異的に結合する物質である。
結合パートナーの例には、リガンド−受容体、抗体−抗
原、薬物−標的、および酵素−基質の相互作用が含まれ
る。結合パートナーは、治療および診断の両分野で極め
て有用である。

【０００３】過去において、結合パートナーは、天然か
らの収集（例えば、抗体−抗原、およびリガンド−受容
体ペアリング）を含む種々の方法によって、および偶発
的な同定（例えば、候補分子のランダムスクリーニング
を用いる伝統的な薬物開発）によって調製されている。
ある場合には、これら２種類の方法が組合せられてい
る。例えば、結合に関与している鍵となる機能的残基を
含むタンパク質またはポリペプチドの変異体（ポリペプ
チドフラグメントなど）が調製されている。次いで、こ
れらのポリペプチドフラグメントは、伝統的な薬物開発
と同種の方法によって誘導体化されている。このような
誘導体化の例には、ポリペプチドフラグメントを立体配
座的に制約して新規な候補結合パートナーを得るための
環化などの方法が含まれるであろう。

【０００４】従来の方法を用いたときの問題は、天然の
リガンドがすべての治療学的応用に適した性質を有して
いないことがあることである。さらに、ポリペプチドリ
ガンドは一部の標的物質に対して使用できないこともあ
る。また、非天然の合成結合パートナーを製造するため
の方法は高価かつ困難であることが多く、通常はそれぞ
れの候補を得るために複雑な合成法を必要とする。候補
分子をさらに最適化するために合理的な薬物設計法を適
用することができるように、得られた候補の構造の特徴
を調べることができないことが、これらの方法の一層の
妨げとなっている。

【０００５】これらの問題を克服しようとする試みにお
いて、Geysen〔Immun.Today 6: 364-369 (1985)〕およ
びGeysenら〔Mol.Immun. 23: 709-715 (1986)〕は、体
系的な反復結合パートナーの同定および製造のための骨
組みを与えるポリペプチド合成の使用を提案した。Geys
enら（同上）によると、初めにジペプチドなどの短いポ
リペプチドを、標的分子に結合する能力についてスクリ
ーニングする。次いで、最も活性なジペプチドを次の試
験用に選択する。この試験は、出発ジペプチドに別の残
基を結合させ（または、最初の出発ジペプチドの構成成
分を内部修飾することによる）、次いでこの一組の候補
を所望の活性についてスクリーニングすることからな
る。所望の性質を有する結合パートナーが同定されるま
でこの過程を繰り返す。

【０００６】Geysenらの方法は、その方法の基礎となっ
ている化学、即ちペプチド合成が明白ではないかまたは
変化に富んだ２次および３次構造を有する分子を生成す
るという不都合が障害となっている。選択の繰り返し回
数が増えるにつれて、ランダムな相互作用がポリペプチ
ドの種々の置換基の間で加速度的に増え、再現性ある高
次構造を有する相互作用分子の真のランダム集団が得ら
れなくなる。例えば、アミノ酸の側鎖（これらは配列的
には大きく離れているが、空間的には隣接している）の
間の相互作用が任意に起こる。さらに、立体配座的に安
定な２次構造を促進しない配列は複雑なペプチド−側鎖
の相互作用を与え、これがあるアミノ酸の標的分子との
側鎖相互作用を妨げることもある。このような複雑な相
互作用は、ポリペプチド候補のポリアミド骨格の柔軟性
によって促進される。また、候補は多数の立体配座にお
いて存在することができ、最大の親和性または特異性を
有する標的と相互作用するかまたはそれに結合する配座
異性体の同定を困難にし、合理的な薬物設計を困難にす
る。

【０００７】Geysenの反復ポリペプチド法を用いたとき
の最後の問題は、現在のところ、多様性の高い別種ペプ
チドを製造、スクリーニングおよび分析しうる実際的な
方法が存在しないことである。２０種の天然アミノ酸を
用いると、合成しなければならないヘキサペプチドのす
べての組合せの合計数は６４,０００,０００である。こ
のような多様性の高いペプチドを製造したとしても、こ
のような多様性の高いペプチドの混合物を迅速にスクリ
ーニングして標的分子に対して高い親和性を有するペプ
チドを選択することができる利用可能な方法が存在しな
い。現在のところ、それぞれの「付着」ペプチドは、タ
ンパク質の配列決定を行なうに十分な多量で回収されな
ければならない。

【０００８】Geysenの方法に固有の多くの問題を克服す
るために、生物学的な選択およびスクリーニングが代替
法として選ばれた。生物学的な選択およびスクリーニン
グは、タンパク質機能の探索および所望の性質を有する
変異タンパク質の単離のための強力な手段である〔Shor
tle, Protein Engineering, OxenderおよびFox編, A.R.
Liss,Inc., NY, pp.103-108 (1988); およびBowieら, S
cience 247: 1306-1310 (1990)〕。しかし、得られる選
択またはスクリーニングは、１つだけかまたは少数の関
連タンパク質に適用できるにすぎない。

【０００９】最近になって、Smithとその共同研究者〔S
mith, Science 228: 1315-1317 (1985); およびParmley
およびSmith, Gene 73: 305-318 (1985)〕は、短い遺伝
子フラグメントをfdファージ（「融合ファージ」）の遺
伝子III中に挿入することにより、小さなタンパク質フ
ラグメント（１０〜５０アミノ酸）を線状ファージの表
面に効率的に「表示（顕示）」させうることを示した。
遺伝子IIIの副コートタンパク質（ビリオンの一方の末
端に約５コピー存在する）は、適切なファージ組立てお
よび大腸菌の線毛への付着による感染に重要である〔Ra
schedら, Microbiol.Rev. 50: 401-427 (1986)〕。最
近、「融合ファージ」は、外性タンパク質〔Devlinら,
Science 249: 404-406 (1990)〕または抗体〔Scottら,
Science 249: 386-390 (1990); およびCwirlaら, Proc.
Natl.Acad.USA 87: 6378-6382 (1990)〕と反応しうるペ
プチドを同定するための短い突然変異ペプチド配列を表
示させるのに有用であることがわかった。

【００１０】しかし、このような「融合ファージ」を、
新規または増強された結合性を有する改変されたペプチ
ドまたはタンパク質を同定するために使用する際には、
いくつかの重要な制限が存在する。第１に、大きな挿入
体は恐らくは遺伝子IIIの機能を破壊し、従ってファー
ジの組立ておよび感染性を破壊するので、１００未満、
好ましくは５０未満のアミノ酸残基のタンパク質を表示
させるときにのみ融合ファージが有用であることが示さ
れている〔Parmleyら, Gene 73: 305-318 (1988)〕。第
２に、従来の方法は、標的分子に対して最大の結合親和
性を有するライブラリーからペプチドを選択することが
できない。例えば、ランダムペプチドライブラリーを抗
−βエンドルフィン モノクローナル抗体で徹底的に選
別した後には、Cwirlaとその共同研究者はファージに融
合させた高親和性ペプチド（Ｋd〜０.４μM）から中親
和性ペプチド（Ｋd〜１０μM）を分離することができな
かったであろう。さらに、極めて高い親和性（Ｋd〜７n
M）を有する親のβ−エンドルフィンペプチド配列は、
エピトープライブラリーから選別されなかった。

【００１１】Ladner〔WO 90/02802〕は、ウイルス粒子
および細胞の外側表面に表示された新規な結合タンパク
質を選択するための方法を開示している（異種タンパク
質は１６４個までのアミノ酸残基を有していてよいとさ
れている）。この方法は、表示されたタンパク質を単離
および増幅して標的分子に対して所望の親和性を有する
新しい群の結合タンパク質を設計することを意図してい
る。さらに具体的には、Ladnerは、Ｍ１３遺伝子IIIコ
ートタンパク質に融合させた４６残基（クラムビン）か
ら１６４残基（Ｔ４リソチーム）までの範囲の「最初の
タンパク質結合ドメイン」を有するタンパク質を表示す
る「融合ファージ」を開示している。Ladnerは、比較的
小さいアミノ酸配列に制限部位をアレンジするのは比較
的容易であるので、「必要以上に大きくない」これらタ
ンパク質の使用を教示し、５８アミノ酸残基のウシ膵臓
トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）を好んで用いてい
る。ＢＰＴＩなどの小さい融合タンパク質は標的がタン
パク質または巨大分子であるときに好ましく、一方、Ｔ
４リソチームなどの比較的大きい融合タンパク質はステ
ロイドなどの小さい標的分子に好ましいが、これはこの
ような大きいタンパク質が小さい分子を嵌め込むことが
できる裂け目および溝を有しているためである。この好
ましいタンパク質ＢＰＴＩをSmithらまたはde la Cruz
ら〔J.Biol.Chem. 263: 4318-4322 (1988)〕が開示した
遺伝子IIIの部位に、またはその末端の一方に、遺伝子I
IIの第２の合成コピーと共に融合させて、「一部」の未
改変遺伝子IIIタンパク質が存在するようにすることが
提案されている。Ladnerは、従来技術の生物学的な選択
およびスクリーニング法の障害となる、ランダムペプチ
ドライブラリーから高親和性ペプチドを成功裏に選別す
る際の問題についてはふれていない。

【００１２】ヒト成長ホルモン（hＧＨ）は、正常なヒ
トの成長および発達の調節に多大に関与している。この
２２,０００ダルトンの脳下垂体ホルモンは、特に、線
状成長（体形成）、泌乳、マクロファージの活性化、イ
ンスリン様および糖尿発生作用を含む多数の生物学的作
用を示す〔Chawla,R.K., Ann.Rev,Med. 34: 519 (198
3); Edwards,C.K.ら, Science 239: 769 (1988); Thome
r,M.O.ら, J.Clin.Invest. 81: 745 (1988)〕。子供に
おける成長ホルモンの欠損は小人症を導くが、これは１
０年以上にわたるhＧＨの外部投与によって成功裏に治
療されている。hＧＨは、胎盤ラクトゲン、プロラクチ
ン、ならびに他の遺伝的および種的変異体または成長ホ
ルモンを含む一群の相同ホルモンの一員である〔Nicol
l,C.S.ら, Endocrine Reviews 7: 169 (1986)〕。hＧＨ
はこれらの中で独特であり、広い種特異性を示し、クロ
ーン化した体形成受容体〔Leung,D.W.ら, Nature 330:
537 (1987)〕またはプロラクチン受容体〔Boutin,J.M.
ら, Ce 53: 69 (1988)〕に結合する。クローン化された
hＧＨの遺伝子は大腸菌において分泌型で発現されてお
り〔Chang,C.N.ら, Gene 55: 189 (1987)〕、そのＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列が報告されている〔Goeddelら, N
ature 281: 544 (1979); Grayら, Gene 39: 247(198
5)〕。hＧＨの３次元構造は利用することができない。
しかし、ブタ成長ホルモン（pＧＨ）の３次元折り畳み
パターンは普通の分解能および精度で報告されている
〔Abdel-Meguid,S.S.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:
6434 (1987)〕。ヒト成長ホルモンの受容体および抗体
エピトープは、ホモログ-スキャニング突然変異誘発に
よって同定されている〔Cunninghamら, Science 243: 1
330 (1989)〕。ヒスチジン１８とヒスチジン２１を含む
ヒト成長ホルモンのスプライスされた配列を含有する新
規なアミノ末端メチオニル ウシ成長ホルモンの構造が
示されている〔米国特許 No.4,880,910〕。

【００１３】ヒト成長ホルモン（hＧＨ）は、種々の動
物モデルにおいて線状骨格成長、泌乳、マクロファージ
の活性化、インスリン様および糖尿作用などを含む多種
の生理学的および代謝作用を引き起こす〔R.K.Chawla
ら, Annu.Rev.Med. 34: 519 (1983); O.G.P.Isaksson
ら, Annu.Rev.Physiol. 47: 483 (1985); C.K.Edwards
ら,Science 239: 769 (1988); M.O.ThornerおよびM.L.V
ance, J.Clin.Invest. 82:745 (1988); J.P.Hughesおよ
びH.G.Friesen, Ann.Rev.Physiol. 47: 469 (1985)〕。
これらの生物学的作用は、hＧＨと特異的な細胞受容体
の間の相互作用によって導かれる。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、成長
ホルモン受容体および結合タンパク質に対してさらに強
い親和性を示す成長ホルモン変異体の製造である。

【００１５】

【課題を解決するための手段】上記の目的は、 (a)ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子と天然
または野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一
部をコードしている第２の遺伝子を含有する複製可能な
発現ベクター（ここで、第１および第２の遺伝子は異種
であり、転写調節要素が第１および第２の遺伝子に機能
的に結合されており、従って融合タンパク質をコードし
ている遺伝子融合が得られる）を構築し； (b)該ベクターの第１の遺伝子内の１またはそれ以上の
選択した位置において突然変異を行なって一群の関連プ
ラスミドを生成させ； (c)該プラスミドで適当な宿主細胞を形質転換し； (d)該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパ
ク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージ
に感染させ； (e)該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えフ
ァージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる
条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパ
ク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように
該条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞
を培養し； (f)該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、ファ
ージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合さ
せ；そして (g)結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離
する；ことからなる新規な結合ポリペプチドを選択する
ための方法を提供することによって達成した。この方法
は、さらに、標的分子に結合する組換えファージミド粒
子で適切な宿主細胞を形質転換し、工程(d)〜(g)を１ま
たはそれ以上の回数繰り返す工程を含んでいるのが好ま
しい。

【００１６】さらに、１を越えるサブユニットからなる
新規な結合タンパク質を選択する方法を、次のように新
規な結合ペプチドを選択することによって達成する：即
ち、この選択法は、 ・１またはそれ以上のサブユニットを含む所望のタンパ
ク質をコードしているＤＮＡに機能的に結合させた転写
調節要素を含有する複製可能な発現ベクター（ここで、
該サブユニットの少なくとも１つをコードしているＤＮ
Ａはファージコートタンパク質の少なくとも一部をコー
ドしているＤＮＡに融合している）を構築し； ・１またはそれ以上の選択した位置において該所望のタ
ンパク質をコードしているＤＮＡに突然変異を行なって
一群の関連ベクターを生成させ； ・該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換し； ・該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク
質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに
感染させ； ・該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファ
ージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる条
件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク
質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該
条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞を
培養し； ・該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、ファー
ジミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ；
そして ・結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離す
る；ことからなる。

【００１７】本発明の方法においては、プラスミドが転
写調節要素の厳格な制御下にあり、粒子の表面に融合タ
ンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド粒
子の量または数が約１％未満となるように培養条件が調
節されているのが好ましい。

【００１８】また、融合タンパク質の１を越えるコピー
を表示するファージミド粒子の量が、融合タンパク質の
単一コピーを表示するファージミド粒子の量の１０％未
満であるのが好ましい。最も好ましいのは、この量が２
０％未満である。

【００１９】通常、本発明の方法においては、発現ベク
ターはポリペプチドのそれぞれのサブユニットをコード
しているＤＮＡに融合させた分泌シグナル配列をさらに
含有し、転写調節要素はプロモーター系であろう。好ま
しいプロモーター系は、ＬacＺ、λ_PL、ＴＡＣ、Ｔ７ポ
リメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファ
ターゼプロモーターならびにこれらの組合せから選択さ
れる。

【００２０】また、第１の遺伝子は通常は哺乳動物タン
パク質をコードしているであろう。好ましいタンパク質
は次のものから選択されるであろう：ヒト成長ホルモン
（hＧＨ）、Ｎ-メチオニル ヒト成長ホルモン、ウシ成
長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリ
ンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシン
Ａ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、糖タンパク質
ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）およびロイチナイジング（Leut
inizing）ホルモン（ＬＨ）、糖タンパク質ホルモン受
容体、カルシトニン、グルカゴン、因子VIII、抗体、肺
表面活性物質、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒ
ト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ボ
ンベシン、因子IX、トロンビン、造血成長ホルモン、腫
瘍壊死因子αおよびβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清
アルブミン、ミュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン
関連ペプチド、微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマ
ーゼ、組織因子タンパク質、インヒビン、アクチビン、
血管内皮成長因子、ホルモンまたは成長因子の受容体；
インテグリン、トロンボポエチン、プロテインＡまたは
Ｄ、リウマトイド因子、神経成長因子、例えばＮＧＦ−
β、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子
（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、イン
スリン様成長因子ＩおよびII、インスリン様成長因子結
合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮアーゼ、潜在性関連ペプ
チド、エリトロポエチン、骨誘導因子、インターフェロ
ン、例えばインターフェロンα、βおよびγ、コロニー
刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ
およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、例えば
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、スーパーオ
キシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイルス抗原、Ｈ
ＩＶエンベロープタンパク質、例えばＧＰ１２０、ＧＰ
１４０、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂまたは
Ｃ、免疫グロブリン、ならびに上記タンパク質のいずれ
かのフラグメント。

【００２１】好ましくは、第１の遺伝子は約１００以上
のアミノ酸残基を含む１またはそれ以上のサブユニット
のポリペプチドをコードしており、標的と相互作用しう
る複数のアミノ酸を表示する複数の堅い２次構造を形成
するように折り畳まれているであろう。好ましくは、第
１の遺伝子は、堅い２次構造の完全性が保存されるよう
に、標的と相互作用しうるアミノ酸にのみ対応するコド
ンのところで突然変異が為されているであろう。

【００２２】通常、本発明の方法は、Ｍ１３ＫＯ７、Ｍ
１３Ｒ４０８、Ｍ１３-ＶＣＳおよびＰhiＸ１７４から
選択されるヘルパーファージを用いるであろう。好まし
いヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７であり、好ましいコ
ートタンパク質はＭ１３ファージの遺伝子IIIコートタ
ンパク質である。好ましい宿主は大腸菌であり、大腸菌
のプロテアーゼ欠損株である。本発明の方法によって選
択される新規なhＧＨ変異体を検出した。このポリペプ
チドとファージコートタンパク質をコードしている核酸
の間に機能的に設置した抑制可能な終止コドンを含有す
るファージミド発現ベクターを構築した。

【００２３】以下の議論は、図１を参照することによっ
て最も良く理解されるであろう。最も単純な形態におい
ては、本発明の方法は、標的分子に対して所望の通常は
高い親和性を有する新規な結合ポリペプチド（タンパク
質リガンドなど）を構造的に関連した結合ポリペプチド
のライブラリーから選択する方法からなる。ファージコ
ートタンパク質に融合させた構造的に関連したポリペプ
チドのライブラリーは突然変異誘発によって調製し、好
ましくはそれぞれの関連ポリペプチドの単一コピーを、
該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有するファ
ージミド粒子の表面に表示（顕示）する。次いで、これ
らのファージミド粒子を標的分子と接触させ、標的に対
して最も高い親和性を有する粒子を低親和性の粒子から
分離する。次いで、高親和性の結合体を細菌宿主の感染
によって増幅し、競合結合工程を繰り返す。所望の親和
性のポリペプチドが得られるまでこの過程を繰り返す。

【００２４】本発明の方法によって製造される新規な結
合ポリペプチドまたはリガンドは、それ自体が生物学的
有機体の処置において用いられる診断薬または治療薬
（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）として有
用である。また、選択したポリペプチドの構造分析を用
いて合理的な薬物設計を進めることもできる。

【００２５】本明細書において用いる「結合ポリペプチ
ド」は、選択性の親和性でもって標的分子に結合するあ
らゆるポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリ
ペプチドはタンパク質であり、最も好ましくは約１００
以上のアミノ酸残基を含有するタンパク質である。通
常、このポリペプチドはホルモンもしくは抗体またはそ
れらのフラグメントであろう。

【００２６】本明細書において用いる「高親和性」は、
生理学的条件下で＜１０^-5M、好ましくは＜１０^-7Mの親
和定数（Ｋd）を意味する。

【００２７】本明細書において用いる「標的分子」は、
それに対してリガンドを製造するのが所望であるあらゆ
る分子であり、必ずしもタンパク質に限られない。しか
し、この標的はタンパク質であるのが好ましく、最も好
ましくは、この標的はホルモン受容体などの受容体であ
る。

【００２８】本明細書において用いる「ヒト化抗体」
は、マウスまたは他の非ヒト抗体の相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）がヒト抗体のフレームワーク（枠組み構造）に結
合している抗体を意味する。ヒト抗体のフレームワーク
はＣＤＲを除く全ヒト抗体を意味する。

【００２９】Ｉ．ファージの表面に表示させるためのポ
リペプチドの選択 本発明の方法における第１の工程は、ファージの表面に
表示させるためのポリペプチドの表面に露出される堅い
２次構造を有するポリペプチドを選択することである。

【００３０】本明細書において用いる「ポリペプチド」
は、特異的なＤＮＡ配列によって発現させることができ
る任意の分子を意味する。本発明のポリペプチドは１を
越えるサブユニットからなり、それぞれのサブユニット
は別個のＤＮＡ配列によってコードされている。

【００３１】本明細書において用いる「堅い２次構造」
は、例えば、α−ヘリックス、３₁₀ヘリックス、πヘリ
ックス、平行および逆平行β−シート、ならびに逆ター
ンなどにおいて見い出される規則的な反復構造を示す任
意のポリペプチドセグメントを意味する。また、認識し
うる幾何秩序を欠くある種の「非秩序」構造も、それら
が標的との相互作用が可能なアミノ酸残基のドメインま
たは「パッチ」を形成し、構造の全体形状が構造中のア
ミノ酸の置換によって破壊されない限り、堅い２次構造
の定義中に含まれる。ある種の非秩序構造は逆ターンの
組合せであると考えられている。これら堅い２次構造の
幾何は、ペプチド「骨格」のα−炭素のまわりのφおよ
びψねじれ角によって十分に定義される。

【００３２】２次構造をポリペプチド表面に露出させる
のに必要なことは、標的分子に対して露出され標的分子
と結合することができるアミノ酸残基のドメインまたは
「パッチ」を提供することである。これは基本的には突
然変異誘発によって置換されるアミノ酸残基であり、こ
の突然変異誘発によってファージの表面に表示される構
造的に関連した（突然変異体）結合ポリペプチドの「ラ
イブラリー」が得られ、これから新規なポリペプチドリ
ガンドが選択される。通常、ポリペプチドの内部に向か
うアミノ酸残基の突然変異誘発または置換は避けられ、
これにより堅い２次構造の全体構造が保存される。堅い
２次構造の内部領域のアミノ酸の、特に疎水性アミノ酸
残基による置換の一部は、これら保存性の置換がポリペ
プチドの全体構造を歪めるようには考えられないので許
容されるであろう。

【００３３】「ポリペプチド」選択の繰返しサイクルを
用い、複数の選択サイクルによって選択した複数のアミ
ノ酸変化のファージミド選択によってさらに高い親和性
の結合を選択する。第１ラウンドのファージミド選択
（リガンドポリペプチド中のアミノ酸の選択または第１
領域が関係する）に続いて、リガンドポリペプチドの他
の領域またはアミノ酸において追加ラウンドのファージ
ミド選択を行なう。リガンドポリペプチドの所望の親和
性が達成されるまでこのファージミド選択サイクルを繰
り返す。この方法を説明するために、実施例VIIIのhＧ
Ｈのファージミド選択をサイクルで行なった。第１サイ
クルにおいて、hＧＨのアミノ酸１７２、１７４、１７
６および１７８に突然変異を行ない、ファージミドを選
択した。第２サイクルにおいて、hＧＨのアミノ酸１６
７、１７１、１７５および１７９をファージミド選択し
た。第３サイクルにおいて、hＧＨのアミノ酸１０、１
４、１８および２１をファージミド選択した。先のサイ
クルからの最適アミノ酸変化は、次サイクルの選択の前
にポリペプチド中に導入することができる。例えば、h
ＧＨのアミノ酸置換１７４（セリン）および１７６（チ
ロシン）を、hＧＨのアミノ酸１６７、１７１、１７５
および１７９のファージミド選択の前にhＧＨ中に導入
した。

【００３４】上記から、ポリペプチドの結合ドメインを
形成するアミノ酸残基が連続的に結合したものではな
く、ポリペプチドの異なるサブユニット上に存在してい
てよいことが理解されるであろう。即ち、結合ドメイン
は、結合部位における特定の２次構造をたどるものであ
って、１次構造をたどるものではない。従って、突然変
異はポリペプチドの内部から外側へ向かう部位の特定の
２次構造内のアミノ酸をコードしているコドンに導入し
て、それらが標的と相互作用する可能性を持つようにす
るのが普通である。説明のため、hＧＨ−結合タンパク
質への結合を強力に変調させることが知られているhＧ
Ｈ中の残基の位置を図２に示す〔Cunninghamら, Scienc
e 247: 1461-1465 (1990)〕。即ち、突然変異誘発に適
切な代表的な部位には、ヘリックス４の残基１７２、１
７４、１７６および１７８、ならびに「非秩序」２次構
造内の残基６４が含まれる。

【００３５】ある標的に対するリガンドとして選択した
ポリペプチドが該標的に正常に結合する必要はない。即
ち、例えばＴＳＨなどの糖タンパク質ホルモンをＦＳＨ
受容体のリガンドとして選択することができ、突然変異
ＴＳＨ分子のライブラリーを本発明の方法に用いて新規
な薬物候補を得る。

【００３６】即ち、本発明は標的分子に結合する任意の
ポリペプチドを意図したものであり、抗体を包含してい
る。好ましいポリペプチドは医薬用途を有しているポリ
ペプチドである。さらに好ましいポリペプチドには次の
ものが含まれる：即ち、成長ホルモン（ヒト成長ホルモ
ン、デス−Ｎ−メチオニル ヒト成長ホルモン、および
ウシ成長ホルモンを含む）；副甲状腺ホルモン；甲状腺
刺激ホルモン；チロキシン；インスリンＡ鎖；インスリ
ンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシト
ニン；ロイチナイジング ホルモン；グルカゴン；因子V
III；抗体；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化
因子〔例えば、ウロキナーゼまたはヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）〕；ボンベシン；因子
IX；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよび
β；エンケファリナーゼ；血清アルブミン（例えば、ヒ
ト血清アルブミン）；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ
鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドト
ロピン関連ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−
ラクタマーゼ）；組織因子タンパク質；インヒビン；ア
クチビン；血管内皮成長因子；ホルモンまたは成長因子
の受容体；インテグリン；トロンボポエチン；プロテイ
ンＡまたはＤ；リウマトイド因子；神経成長因子（例え
ば、ＮＧＦ−β）；血小板由来の成長因子；線維芽細胞
成長因子（例えば、aＦＧＦおよびbＦＧＦ）；表皮成長
因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例え
ば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様成長
因子ＩおよびII；インスリン様成長因子結合タンパク
質；ＣＤ−４；ＤＮアーゼ；潜在性関連ペプチド；エリ
トロポエチン；骨誘導因子；インターフェロン（例え
ば、インターフェロンα、βおよびγ）；コロニー刺激
因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦお
よびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例え
ば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４）；スー
パーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子；心房性ナト
リウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ；ウイルス抗原（例
えば、ＨＩＶエンベロープの一部）；免疫グロブリン；
ならびに上記ポリペプチドのいずれかのフラグメントで
ある。さらに、ポリペプチド上の１またはそれ以上の予
め決定したアミノ酸残基に置換、挿入または削除を行な
って、例えば改善された生物学的性質を有する生成物を
得ることができる。また、これらポリペプチドのフラグ
メント、特に生物学的に活性なフラグメントが包含され
る。本発明のさらに好ましいポリペプチドは、ヒト成長
ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、Ｂおよび
Ｃ、エンドトキシン、スブチリシン、トリプシン、なら
びに他のセリンプロテアーゼ類である。

【００３７】さらに好ましいポリペプチドホルモンは、
第１の細胞において産生される任意のアミノ酸配列であ
って、同じ細胞種（自己分泌ホルモン）または第２の細
胞種（非自己分泌）上の受容体に特異的に結合し、受容
体保持細胞に特徴的な生理学的反応を引き起こすアミノ
酸配列として定義しうるポリペプチドホルモンである。
このようなポリペプチドホルモンには、サイトカイン
類、リンホカイン類、神経栄養ホルモンおよび脳下垂体
腺ポリペプチドホルモン、例えば成長ホルモン、プロラ
クチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺
激ホルモン、チロトロピン、絨毛ゴナドトロピン、コル
チコトロピン、αまたはβ−メラノサイト刺激ホルモ
ン、β−リポトロピン、γ−リポトロピンおよびエンド
ルフィン類；視床下部放出抑制ホルモン、例えばコルチ
コトロピン放出因子、成長ホルモン放出抑制ホルモン、
成長ホルモン放出因子；ならびに心房性ナトリウム利尿
ペプチドＡ、ＢおよびＣなどの他のポリペプチドホルモ
ンが含まれる。

【００３８】II．所望のポリペプチドをコードしている
第１遺伝子（遺伝子１）の入手 所望のポリペプチド（即ち、堅い２次構造を有するポリ
ペプチド）をコードしている遺伝子は、当分野で既知の
方法によって得ることができる〔一般には、Sambrook
ら, Molecular Biology: A laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York
(1989)を参照〕。この遺伝子の配列が既知である場合に
は、この遺伝子をコードしているＤＮＡを化学的に合成
してもよい〔Merrfield, J.Am.Chem.Soc. 85: 2149 (19
63)〕。この遺伝子の配列が未知である場合、またはこ
の遺伝子がそれまでに単離されていない場合には、cＤ
ＮＡライブラリー（所望の遺伝子が発現される適当な組
織から得たＲＮＡから調製する）から、または適当なゲ
ノムＤＮＡライブラリーからクローン化することができ
る。次いで、適当なプローブを用いて遺伝子を単離す
る。cＤＮＡライブラリーのための適当なプローブに
は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体（ただ
し、ｃＤＮＡライブラリー発現ライブラリーであると
き）、オリゴヌクレオチド、および相補性もしくは相同
性cＤＮＡまたはそれらのフラグメントが含まれる。ゲ
ノムＤＮＡライブラリーから所望の遺伝子を単離するの
に用いることができるプローブには、同一もしくは類似
の遺伝子をコードしているcＤＮＡもしくはそのフラグ
メント、相同なゲノムＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメン
ト、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。選択したプ
ローブによるcＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのス
クリーニングは、Sambrookら（上記）の第１０〜１２章
に記載されている標準法を用いて行なう。

【００３９】所望のタンパク質をコードしている遺伝子
を単離するための別の方法は、Sambrookら（上記）のセ
クション１４に記載されているポリメラーゼ連鎖反応法
（ＰＣＲ）を使用することである。この方法は、所望の
遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用
を必要とする。即ち、オリゴヌクレオチドを得るため
に、この遺伝子のＤＮＡ配列の少なくと一部が既知でな
ければならない。遺伝子を単離した後、これをSambrook
ら（上記）が一般的に記載しているように増幅用の適当
なベクター（好ましくは、プラスミド）中に挿入するこ
とができる。

【００４０】III．複製可能な発現ベクターの構築 いくつかの型のベクターが利用可能であり、本発明の実
施に用いることができるが、プラスミドベクターが本発
明において使用するに好ましいベクターである。これ
は、これらベクターを比較的容易に構築することがで
き、容易に増幅することができるためである。一般にプ
ラスミドベクターは、当業者には既知のように、プロモ
ーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部
位、および他の必要な成分を含む種々の構成成分を含有
している。

【００４１】原核性ベクターにおいて最も普通に用いら
れるプロモーターには、lacＺプロモーター系、アルカ
リホスファターゼphoＡプロモーター、バクテリオファ
ージλＰ_Lプロモーター（温度感受性プロモーター）、t
acプロモーター（lacリプレッサーによって調節される
ハイブリッドtrp-lacプロモーター）、トリプトファン
プロモーター、およびバクテリオファージＴ７プロモー
ターが含まれる。プロモーターの全般的な説明について
は、Sambrookら（上記）のセクション１７を参照。最も
よく用いられるプロモーターが存在するが、他の適当な
微生物プロモーターも同様に用いることができる。

【００４２】本発明の実施に好ましいプロモーターは、
融合遺伝子の発現を制御しうるように厳格に調節するこ
とができるプロモーターである。従来技術において認識
されないままであった問題は、ファージミド粒子の表面
における融合タンパク質の複数コピーの表示がファージ
ミドと標的との複数点結合を導くことであったと考えら
れる。「キレート作用」と呼ばれるこの作用は、融合タ
ンパク質の複数コピーが互いにすぐ近接してファージミ
ド粒子上に表示されて標的が「キレート化」されたとき
に、誤った「高親和性」ポリペプチドを選択する結果を
与えると考えられる。複数点結合が起こったときには、
有効または見掛けＫdは表示された融合タンパク質のそ
れぞれのコピーに対する個々のＫdの積と同程度に高い
であろう。この作用が、Cwirlaとその共同研究者（上
記）が比較的高親和性のペプチドから中親和性のペプチ
ドを分離できなかった理由であるのかもしれない。

【００４３】少量（即ち、約１％よりも少ない）のファ
ージミド粒子だけが複数コピーの融合タンパク質を含有
するように融合タンパク質の発現を厳格に調節すること
によって、「キレート作用」が克服され、高親和性のポ
リペプチドの適切な選択が可能になることを発見した。
即ち、プロモーターに依存して、宿主の培養条件を調節
して単一コピーの融合タンパク質を含有するファージミ
ド粒子の数を最大にし、複数コピーの融合タンパク質を
含有するファージミド粒子の数を最少にする。

【００４４】本発明の実施に用いられる好ましいプロモ
ーターは、lacＺプロモーターおよびphoＡプロモーター
である。このlacＺプロモーターはlacリプレッサータン
パク質lac iによって調節され、従って融合遺伝子の転
写をlacリプレッサータンパク質の量の操作によって制
御することができる。説明のためであるが、このlacＺ
プロモーターを含有するファージミドは、lacＺプロモ
ーターのリプレッサーであるlac iリプレッサー遺伝子
のコピーを含有する細胞株中で増殖させる。laci遺伝子
を含有する細胞株の例には、ＪＭ１０１およびＸＬ１-B
lueが含まれる。別法によれば、リプレッサーlac iおよ
びlacＺプロモーターの両方を含有するプラスミドで宿
主細胞を同時トランスフェクトすることができる。とき
には上記方法の両方を同時に用いる。即ち、lacＺプロ
モーターを含有するファージミド粒子をlac i遺伝子を
含有する細胞株中で増殖させ、この細胞株をlacＺおよ
びlac i遺伝子の両方を含有するプラスミドで同時トラ
ンスフェクトする。通常、上記のトランスフェクトされ
た宿主に遺伝子を発現させたいときには、イソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）などの誘導物質を加え
る。しかし、本発明においては、この工程を割愛して、
(a)遺伝子III融合タンパク質の発現を最少にしてコピー
数を最少にし（即ち、ファージミド数に対する遺伝子II
I融合体の数）、そして、(b)低濃度であってもＩＰＴＧ
などの誘導物質によって引き起こされるファージミドの
劣るかまたは不適切なパッケージングを防止する。通
常、誘導物質を加えないときには、ファージミド粒子あ
たりの融合タンパク質の数は約０.１である（バルク融
合タンパク質の数／ファージミド粒子の数）。本発明の
実施に用いられる最も好ましいプロモーターはphoＡで
ある。このプロモーターは細胞中の無機リン酸の量によ
って調節されると考えられており、このリン酸がプロモ
ーターの活性を下方調節する。即ち、細胞のリン酸を減
少させることによって、プロモーターの活性を高めるこ
とができる。所望の結果は、２ＹＴまたはＬＢなどのリ
ン酸に富む培地で細胞を増殖させ、遺伝子III融合体の
発現を制御することによって達成される。

【００４５】本発明の実施に用いられるベクターの他の
有用な成分はシグナル配列である。通常、この配列は融
合タンパク質をコードしている遺伝子のすぐ５′側に位
置しており、従って融合タンパク質のアミノ末端に転写
される。しかし、ある種の場合には、このシグナル配列
は、分泌させようとするタンパク質をコードしている遺
伝子の他の５′の位置に存在することが示されている。
この配列は、細菌細胞の内部膜を越えてこの配列が結合
しているタンパク質を標的とする。このシグナル配列を
コードしているＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパ
ク質をコードしている任意の遺伝子から制限エンドヌク
レアーゼフラグメントとして得ることができる。適当な
原核性シグナル配列は、例えば、ＬamＢもしくはＯmpＦ
〔Wongら, Gene 68: 193 (1983)〕、ＭalＥ、ＰhoＡお
よびその他の遺伝子をコードしている遺伝子から得るこ
とができる。本発明の実施に好ましい原核性シグナル配
列は、Changら〔Gene 55: 189 (1987)〕が記載している
大腸菌の熱安定性エンテロトキシンII（ＳＴII）シグナ
ル配列である。

【００４６】本発明の実施に用いられるベクターの別の
有用な成分は、表現型選択遺伝子である。通常の表現型
選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパ
ク質をコードしている遺伝子である。説明のためのもの
であるが、アンピシリン耐性遺伝子（amp）およびテト
ラサイクリン耐性遺伝子（tet）がこの目的に使用する
のが容易である。

【００４７】上記の成分ならびに所望のポリペプチドを
コードしている遺伝子（遺伝子１）を含有する適当なベ
クターの構築は、Sambrookら（上記）が記載している標
準的な組換えＤＮＡ法を用いて行なう。ベクターを形成
させるために結合される単離したＤＮＡフラグメントを
切断し、加工し、そして特定の順序および配向で一緒に
連結して所望のベクターを創製する。

【００４８】適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵
素群を用いてＤＮＡを切断する。通常、約２０μlの緩
衝溶液において、約０.２〜１μgのプラスミドまたはＤ
ＮＡフラグメントを約１〜２単位の適当な制限酵素と共
に用いる。適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度、ならびにインキ
ュベート時間および温度は、制限酵素の製造元によって
指定されている。通常、３７℃で約１または２時間のイ
ンキュベート時間が適切であるが、いくつかの酵素はさ
らに高い温度を必要とする。インキュベート後に、酵素
および他の不純物をフェノールとクロロホルムの混合物
による消化溶液の抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノ
ールによる沈澱によって水性分画から回収する。

【００４９】ＤＮＡフラグメントを共に連結して機能的
なベクターを得るためには、これらＤＮＡフラグメント
の末端を互いに適合させなければならない。ある場合に
は、エンドヌクレアーゼ消化の後にこれら末端はそのま
まで適合性である。しかし、これらを連結に対して適合
するようにするために、通常はエンドヌクレアーゼ消化
によって生成する接着末端を初めに平滑末端に変換する
ことが必要になることもある。末端を平滑にするため
に、ＤＮＡを、適当な緩衝液中、４種のデオキシヌクレ
オチド三リン酸の存在下に１０単位のＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノウフラグメント（クレノウ）を用いて１５
℃で少なくとも１５分間処理する。次いで、このＤＮＡ
のフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
り精製する。

【００５０】ＤＮＡゲル電気泳動を用いて、切断したＤ
ＮＡフラグメントをサイズ分離し、選択することができ
る。アガロースまたはポリアクリルアミドマトリックス
のどちらかによりＤＮＡを電気泳動することができる。
マトリックスの選択は、分離しようとするＤＮＡフラグ
メントのサイズに依存するであろう。電気泳動の後、Sa
mbrookら（上記）のセクション６.３０〜６.３３の記載
のように、電気溶離によって、または、低溶融アガロー
スをマトリックスとして使用したときにはアガロースの
溶融とそれからのＤＮＡの抽出によって、ＤＮＡをマト
リックスから抽出する。

【００５１】共に連結しようとするＤＮＡフラグメント
（連結しようとするそれぞれのフラグメントの末端が適
合するように適切な制限酵素により予め消化）を、ほぼ
等しい量で溶液に入れる。この溶液は、ＡＴＰ、リガー
ゼ緩衝液およびリガーゼ、例えば０.５μgのＤＮＡあた
り約１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼをも含んでいるで
あろう。ＤＮＡフラグメントをベクター中に連結すると
きには、最初にこのベクターを適当な制限エンドヌクレ
アーゼ（群）で切断することによって直線化する。次い
で、この直線化したベクターをアルカリホスファターゼ
またはウシ腸ホスファターゼで処理する。このホスファ
ターゼ処理は連結工程中のベクターの自己連結を防止す
る。

【００５２】連結の後、外来遺伝子が挿入されているベ
クターを適当な宿主細胞に導入する。原核生物が本発明
に好ましい宿主細胞である。適当な原核性宿主細胞に
は、大腸菌株ＪＭ１０１、大腸菌Ｋ１２株２９４（ATCC
No.31,446）、大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC No.27,32
5）、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC No.31,537）、大腸菌Ｘ
Ｌ-１Ｂlue（stratagene）、および大腸菌Ｂが含まれる
が、大腸菌の他の多数の株（例えば、ＨＢ１０１、ＮＭ
５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）、ならびに他の多数
の原核生物の属および種も同様に用いることができる。
上に挙げた大腸菌株に加えて、バチルス（例えば、Baci
llus Subtilis）、他の腸内細菌（例えば、Salmonella
typhimuriumあるいはSerratia marcesans）、および種
々のPseudomonas種もすべて宿主として使用することが
できる。

【００５３】原核細胞の形質転換は、Sambrookら（上
記）のセクション１.８２に記載の塩化カルシウム法を
用いて容易に達成される。別法によれば、電気穿孔法
〔Neumannら, EMBO J. 1: 841 (1982)〕を用いてこれら
細胞を形質転換することができる。通常はテトラサイク
リン（tet）またはアンピシリン（amp）などの抗生物質
上で増殖させることによって、形質転換した細胞を選択
する（形質転換細胞は、ベクター上のtetおよび／また
はamp耐性遺伝子の存在によりこれら抗生物質に対して
耐性になっている）。

【００５４】形質転換細胞の選択の後、これら細胞を培
養増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ（または、外来遺
伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミ
ドＤＮＡは当分野で既知の方法を用いて単離することが
できる。２つの適当な方法は、Sambrookら（上記）のセ
クション１.２５〜１.３３に記載されている小スケール
のＤＮＡ調製および大スケールのＤＮＡ調製である。単
離したＤＮＡは、Sambrookら（上記）のセクション１.
４０に記載されている方法のような当分野で既知の方法
によって精製することができる。次いで、この精製した
プラスミドＤＮＡを、制限マッピングおよび／またはＤ
ＮＡ配列決定によって分析する。通常、ＤＮＡの配列決
定は、Messingら〔Nucleic Acids Res. 9: 309 (198
1)〕の方法またはMaxamら〔Meth.Enzymol. 65: 499 (19
80)〕の方法のいずれかによって行なう。

【００５５】IV．遺伝子の融合 本発明は、転写中に融合タンパク質が生成するように、
所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝子
１）を第２の遺伝子（遺伝子２）に融合させることを意
図している。通常、遺伝子２はファージのコートタンパ
ク質遺伝子であり、ファージＭ１３の遺伝子IIIコート
タンパク質またはそのフラグメントであるのが好まし
い。遺伝子１および２の融合は、遺伝子１を含むプラス
ミド上の特定の部位に遺伝子２を挿入することによっ
て、または遺伝子２を含むプラスミド上の特定の部位に
遺伝子１を挿入することによって達成することができ
る。

【００５６】プラスミド中への遺伝子の挿入は、遺伝子
を挿入しようとする正確な位置においてプラスミドが切
断されることを必要とする。即ち、この位置に制限エン
ドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない（制
限エンドヌクレアーゼ消化中にプラスミドが１カ所での
み切断されるように唯一の部位であるのが好ましい）。
上記のようにプラスミドを消化し、ホスファターゼ処理
し、精製する。次いで、２つのＤＮＡを共に連結するこ
とによって、この直線化したプラスミドに遺伝子を挿入
する。プラスミドの末端が挿入しようとする遺伝子の末
端に適合するときに、連結を達成することができる。制
限酵素を用いてプラスミドを切断し、挿入すべき遺伝子
を単離するときには（平滑末端または適合性の接着末端
を創製する）、Sambrookら（上記）のセクション１.６
８の記載のように、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼなどのリガーゼを用い、ＡＴＰおよびリガーゼ緩
衝液の存在下に混合物を１６℃で１〜４時間インキュベ
ートすることによって、ＤＮＡを直接一緒に連結するこ
とができる。末端が適合性ではないときには、最初にこ
れらを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
あるいはバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
（これらは、消化されたＤＮＡの突出１本鎖末端を充填
するために４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を
必要とする）の使用によって平滑にしなければならな
い。別法によれば、これら末端を、ヌクレアーゼＳ１あ
るいは緑豆ヌクレアーゼ（これらは、ＤＮＡの突出１本
鎖を後退切断することによって機能する）などのヌクレ
アーゼを用いて平滑にすることができる。次いで、ＤＮ
Ａを上記のリガーゼを用いて連結する。ある場合には、
暗号領域の読み枠が変化するので、挿入すべき遺伝子の
末端を平滑にすることができないこともある。この問題
を克服するために、オリゴヌクレオチドリンカーを用い
てもよい。このリンカーは、プラスミドと挿入すべき遺
伝子を接続する橋となる。これらリンカーは、常法を用
いて２本鎖または１本鎖ＤＮＡとして合成により調製す
ることができる。これらリンカーは、挿入すべき遺伝子
の末端に適合する一方の末端を有しており、上記の連結
法を用いて初めにこの遺伝子に連結する。リンカーの他
の末端は、連結用のプラスミドに適合するように設計さ
れている。リンカーを設計する際には、挿入すべき遺伝
子の読み枠またはプラスミド上に含まれる遺伝子の読み
枠を破壊しないように注意しなければならない。ある場
合には、これらがアミノ酸の一部をコードするように、
または１またはそれ以上のアミノ酸をコードするように
リンカーを設計することが必要になることもある。

【００５７】遺伝子１と遺伝子２の間に終止コドンをコ
ードしているＤＮＡを挿入することもできる。このよう
な終止コドンはＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカ
ー）およびＵＧＡ（オペル）である〔Davisら, Microbi
ology, Harper & Row, New York, pp.237, 245-47およ
び274 (1980)〕。野生型宿主細胞において発現される終
止コドンは、遺伝子２のタンパク質の結合していない遺
伝子１のタンパク質産物の合成の結果を与える。しか
し、サプレッサー宿主細胞中での増殖は検出可能な量の
融合タンパク質の合成の結果を与える。このようなサプ
レッサー宿主細胞は、mＲＮＡの終止コドン位置にアミ
ノ酸を挿入するように修飾されたtＲＮＡを含有してお
り、従って検出可能な量の融合タンパク質を産生する結
果を与える。このようなサプレッサー宿主細胞は、例え
ば大腸菌のサプレッサー株〔Bullockら,Bio Techniques
5: 376-379 (1987)〕のように周知であり、開示されて
いる。任意の受け入れられている方法を用いて、このよ
うな終止コドンを融合ポリペプチドをコードしているm
ＲＮＡ中に設置することができる。

【００５８】この抑制可能なコドンを、ポリペプチドを
コードしている第１の遺伝子とファージコートタンパク
質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子の間
に挿入することができる。別法によれば、この抑制可能
な終止コドンを、ポリペプチド中の最後のアミノ酸トリ
プレットまたはファージコートタンパク質中の最初のア
ミノ酸の置換によって融合部位に隣接して挿入すること
ができる。この抑制可能なコドンを含有しているファー
ジミドをサプレッサー宿主細胞中で増殖させると、ポリ
ペプチドとコートタンパク質を含有する融合ポリペプチ
ドが検出可能に産生される結果が得られる。このファー
ジミドを非サプレッサー宿主細胞中で増殖させると、Ｕ
ＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡをコードしている挿入された
抑制可能なトリプレットのところでの終止により、ファ
ージコートタンパク質に融合していないポリペプチドが
実質的に合成される。非サプレッサー細胞においては、
ポリペプチドが合成され、融合したファージコートタン
パク質（他の方法ではポリペプチドを宿主細胞に固定す
る）が存在しないことにより宿主細胞から分泌される。

【００５９】Ｖ．選択した位置における遺伝子１の改変
（突然変異） 所望のポリペプチドをコードしている遺伝子１を、１ま
たはそれ以上の選択したコドンにおいて改変することが
できる。改変は、ポリペプチドをコードしている遺伝子
中の１またはそれ以上のコドンの置換、削除または挿入
と定義される。この改変によって、同じポリペプチドの
未改変または天然の配列と比較してポリペプチドのアミ
ノ酸配列が変化することになる。好ましくは、この改変
は、分子の１またはそれ以上の領域において少なくとも
１個のアミノ酸を他のいずれかのアミノ酸で置換するこ
とによる。この改変は、当分野で既知の種々の方法によ
って行なうことができる。これらの方法には、オリゴヌ
クレオチド媒介の突然変異誘発およびカセット突然変異
誘発が含まれるが、これらに限定はされない。

【００６０】Ａ．オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘
発 オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発は、遺伝子１の
置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい方
法である。この方法は、Zollerら〔Nucleic Acids Res.
10: 6487-6504 (1987)〕が記載しているように当分野
で周知である。簡単に説明すると、未改変または天然の
ＤＮＡ配列の遺伝子１を含有するプラスミドの１本鎖形
のＤＮＡ鋳型に所望の突然変異をコードしているオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって遺伝
子１を改変する。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて、該オリゴヌクレオチドプライマ
ーが導入されて遺伝子１中の選択した改変をコードして
いる、この鋳型の完全な第２相補鎖を合成する。

【００６１】通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチド
のオリゴヌクレオチドを用いる。最適オリゴヌクレオチ
ドは、突然変異をコードしているヌクレオチド（群）の
両側に鋳型に完全に相補性である１２〜１５ヌクレオチ
ドを有するものであろう。これにより、オリゴヌクレオ
チドが１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズす
ることが確実になる。このオリゴヌクレオチドは、当分
野で既知の方法、例えばCreaら〔Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 75: 5765 (1978)〕が記載している方法を用いて容易
に合成される。

【００６２】このＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ
１３ベクター（市販品から入手可能なＭ１３mp１８およ
びＭ１３mp１９ベクターが適当である）から導かれるベ
クター、またはVeiraら〔Meth.Enzymol. 153: 3 (198
7)〕が記載しているような一本鎖ファージ複製起点を含
有するベクターによってのみ得ることができる。即ち、
突然変異を行なうべきＤＮＡは、１本鎖の鋳型を創製す
るために、これらベクターのいずれかに挿入しなければ
ならない。１本鎖鋳型の調製はSambrookら（上記）のセ
クション４.２１〜４.４１に記載されている。

【００６３】天然のＤＮＡ配列を改変するために、この
オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条
件のもとで一本鎖の鋳型とハイブリダイズさせる。次い
で、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントを加え、このオリゴヌクレオチドを
合成のためのプライマーとして用いて鋳型の相補鎖を合
成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１
の突然変異形をコードしており、他方の鎖（最初の鋳
型）が遺伝子１の天然の未改変配列をコードしているヘ
テロ２本鎖分子が形成される。次いで、このヘテロ２本
鎖分子を適当な宿主細胞、通常は大腸菌ＪＭ１０１など
の原核生物に導入する。この細胞を増殖させた後、アガ
ロースプレートにプレーティングし、３２-リン酸で放
射標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスク
リーニングして、突然変異したＤＮＡを含有する細菌コ
ロニーを同定する。

【００６４】すぐ上に記載した方法を、プラスミドの両
方の鎖が突然変異（群）を含むヘテロ２本鎖分子が創製
されるように修飾することができる。この修飾は次のよ
うである。１本鎖のオリゴヌクレオチドを上記のように
１本鎖鋳型にアニールさせる。３種のデオキシリボヌク
レオチド、即ちデオキシリボアデノシン（dＡＴＰ）、
デオキシリボグアノシン（dＧＴＰ）およびデオキシリ
ボチミジン（dＴＴＰ）の混合物を、dＣＴＰ-（aＳ）と
呼ばれる修飾されたチオ-デオキシリボシトシン（Amers
hamから入手することができる）と混合する。この混合
物を鋳型-オリゴヌクレオチドのコンプレックスに加え
る。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然
変異した塩基を除いて鋳型と同一のＤＮＡ鎖が創製され
る。さらに、この新規なＤＮＡ鎖はdＣＴＰの代わりにd
ＣＴＰ-（aＳ）を含有しており、これがこの鎖を制限エ
ンドヌクレアーゼ消化から保護するように働く。ヘテロ
２本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、
この鋳型鎖を、突然変異すべき部位（群）を含む領域を
越えてＥxoIIIヌクレアーゼまたは別の適当なヌクレア
ーゼで消化することができる。次いで、この反応を停止
させて一部だけが１本鎖である分子を残す。次いで、４
種すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ
およびＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを
用いて、完全なＤＮＡホモ２本鎖を形成させる。次い
で、このホモ２本鎖分子を、上記のように大腸菌ＪＭ１
０１などの適当な宿主細胞に導入することができる。

【００６５】１を越える置換すべきアミノ酸を有する突
然変異体は、いくつかの方法のいずれかにより創製する
ことができる。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中に互
いに近接して存在しているときには、所望のアミノ酸置
換のすべてをコードしている１つのオリゴヌクレオチド
を用いて同時に突然変異させることができる。しかし、
アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて存在している
ときには（約１０以上のアミノ酸によって隔てられてい
る）、所望の変化のすべてをコードしている単一のオリ
ゴヌクレオチドを創製するのは比較的困難である。これ
に代えて、２種類の異なる方法のいずれかを用いること
ができる。

【００６６】第１の方法においては、独立したオリゴヌ
クレオチドを置換すべきアミノ酸のそれぞれに対して創
製する。次いで、これらオリゴヌクレオチドを１本鎖鋳
型ＤＮＡに同時にアニールさせると、この鋳型から合成
される第２のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換のすべてを
コードしているであろう。この第１のラウンドは単一突
然変異について説明したものと同じである。即ち、野生
型ＤＮＡを鋳型に用い、第１の所望のアミノ酸置換
（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型
にアニールさせ、次いでヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子を創製
する。突然変異誘発の第２ラウンドは、第１ラウンドの
突然変異誘発で得られた突然変異ＤＮＡを鋳型として用
いる。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以上の突然変
異を含んでいる。次いで、別の所望のアミノ酸置換
（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型
にアニールさせると、得られるＤＮＡ鎖は第１および第
２ラウンドの突然変異誘発の両方に由来する突然変異を
コードしている。この得られたＤＮＡを、第３ラウンド
の突然変異誘発における鋳型などとして用いることがで
きる。

【００６７】Ｂ．カセット突然変異誘発 この方法も遺伝子１の置換、削除および挿入変異体を調
製するのに好ましい方法である。この方法は、Wellsら
〔Gene 34: 315 (1985)〕の記載の方法に基づいてい
る。出発材料は、突然変異させようとする遺伝子である
遺伝子１を含有するプラスミド（または、他のベクタ
ー）である。突然変異させようとする遺伝子１中のコド
ンは決定されている。決定された突然変異部位（群）の
両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在してい
なければならない。このような制限部位が存在していな
ければ、上記のオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発
法を用いてこれら部位を創製し、遺伝子１中の適当な位
置に導入することができる。プラスミド中に制限部位を
導入した後、プラスミドをこれら部位のところで切断し
て直線化する。これら制限部位の間のＤＮＡ配列をコー
ドしており、そして所望の突然変異を含んでいる２本鎖
オリゴヌクレオチドを常法により合成する。この２本の
鎖は別々に合成し、次いで常法により一緒にハイブリダ
イズさせる。この２本鎖のオリゴヌクレオチドをカセッ
トと呼ぶ。このカセットは直線化したプラスミドの両末
端に適合する３′および５′末端を有するように設計し
て、これをプラスミドに直接連結できるようにする。こ
れにより、このプラスミドは遺伝子１の突然変異ＤＮＡ
配列を含むことになる。

【００６８】VI．所望のタンパク質をコードしているＤ
ＮＡの調製 別の態様においては、本発明は１またはそれ以上のサブ
ユニットを含有する所望のタンパク質の変異体の製造を
意図するものである。通常、それぞれのサブユニットは
別の遺伝子によってコードされている。それぞれのサブ
ユニットをコードしているそれぞれの遺伝子は、当分野
で既知の方法によって得ることができる（例えば、セク
ションIIを参照）。ある場合には、セクションIIに記載
した任意の方法から選択した独立した複数の方法を用い
て、種々のサブユニットをコードしている遺伝子を得る
のが必要であることもある。

【００６９】所望のタンパク質が１を越えるサブユニッ
トを含有している複製可能な発現ベクターを構築すると
きには、すべてのサブユニットを、通常はサブユニット
をコードしているＤＮＡの５′側に位置する同一のプロ
モーターによって調節するか、または各サブユニット
を、ベクター中で適切に配向された独立したプロモータ
ーであってそれぞれのプロモーターが調節しようとする
ＤＮＡに機能的に連結されたプロモーターによって調節
することもできる。プロモーターの選択は上記セクショ
ンIIIの記載のように行なう。

【００７０】複数サブユニットを有する所望のタンパク
質をコードしているＤＮＡを含有する複製可能な発現ベ
クターを構築する際には図１０を参照すべきであり、こ
の図には説明のためにベクターが図示されており、抗体
フラグメントの各サブユニットをコードしているＤＮＡ
が示されている。この図は、通常、所望のタンパク質の
サブユニットの１つがＭ１３遺伝子IIIなどのファージ
コートタンパク質に融合されることを示している。通
常、この遺伝子融合体はそれ自体のシグナル配列を含有
しているであろう。別の遺伝子が他のサブユニットまた
はサブユニット群をコードしており、各サブユニットが
通常はそれ自体のシグナル配列を有していることがわか
る。また、図１０は、単一のプロモーターが両サブユニ
ットの発現を調節しうることを示している。これとは異
なり、各サブユニットが異なるプロモーターによって独
立して調節されていてもよい。所望のタンパク質サブユ
ニット-ファージコートタンパク質の融合構築物は、上
記セクションIVの記載のように調製することができる。

【００７１】所望の複数サブユニットタンパク質の一群
の変異体を構築するときには、ベクター中の各サブユニ
ットをコードしているＤＮＡを、各サブユニット中の１
またはそれ以上の位置において突然変異させてもよい。
複数サブユニットの抗体変異体が構築されるときには、
好ましい突然変異誘発部位は、軽鎖、重鎖または両鎖の
いずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミ
ノ酸残基をコードしているコドンに一致する。通常、こ
のＣＤＲは超可変領域と呼ばれている。所望のタンパク
質の各サブユニットをコードしているＤＮＡを突然変異
させる方法は、実質的に上記セクションＶの記載のよう
に実施する。

【００７２】VII．標的分子の調製およびファージミド
との結合 受容体などの標的タンパク質は、当分野で既知の方法に
より、天然供給源から単離するかまたは組換え法によっ
て調製することができる。例示すると、糖タンパク質ホ
ルモン受容体はMcFarlandら〔Science 245: 494-499 (1
989)〕が記載している方法によって調製することがで
き、大腸菌中で発現させた非グリコシル化型はFuhら
〔J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕が記載してい
る。他の受容体は常法によって調製することができる。

【００７３】精製した標的タンパク質を、アガロースビ
ーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロー
ス、種々のアクリル系コポリマー、メタクリル酸ヒドロ
キシアルキル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸
コポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などの
適当なマトリックスに結合させることができる。マトリ
ックスへの標的タンパク質の結合は、文献〔Methods in
Enzymology 44 (1976)〕に記載の方法によって、また
は当分野で既知の他の手段によって行なうことができ
る。

【００７４】マトリックスに標的タンパク質を結合させ
た後、固定化した標的を、ファージミド粒子の少なくと
も一部を固定化標的と結合させるに適切な条件下で、フ
ァージミド粒子のライブラリーと接触させる。通常、ｐ
H、イオン強度、温度などを含む条件は生理学的条件に
類似したものであろう。

【００７５】固定化標的に対して高親和性を有する結合
ファージミド粒子（「結合体」）を、洗浄により低親和
性の粒子（従って、標的に結合しない粒子）から分離す
る。結合体は種々の方法によって固定化標的から解離さ
せることができる。これら方法には、野生型リガンド、
ｐHおよび／またはイオン強度の変更を用いる競合解
離、ならびに当分野で既知の方法が含まれる。

【００７６】適当な宿主細胞を結合体とヘルパーファー
ジに感染させ、この宿主細胞をファージミド粒子の増幅
に適切な条件下で培養する。次いで、ファージミド粒子
を集め、標的分子に対して所望の親和性を有する結合体
が選択されるまで選択工程を１またはそれ以上の回数繰
り返す。

【００７７】所望により、ファージミド粒子のライブラ
リーを、１を越える固定化標的に連続的に接触させて特
定の標的に対する選択性を改善することができる。例え
ば、hＧＨなどのリガンドは１を越える天然受容体を有
していることが多い。このhＧＨの場合には、成長ホル
モン受容体とプロラクチン受容体の両方がhＧＨリガン
ドに結合する。hＧＨの選択性を、プロラクチン受容体
に対する以上に成長ホルモン受容体に対して改善するの
が望ましいであろう。これは、初めにファージミド粒子
ライブラリーを固定化プロラクチン受容体と接触させ、
これを低親和性（即ち、野生型hＧＨよりも低い）でプ
ロラクチン受容体について溶離し、次いでこの低親和性
プロラクチン「結合体」または非結合体を固定化成長ホ
ルモン受容体と接触させ、高親和性成長ホルモン受容体
結合体を選択することによって達成することができる。
この場合、プロラクチン受容体に対して低親和性を有す
るhＧＨの突然変異体は、成長ホルモン受容体に対する
親和性が野生型hＧＨの親和性よりも若干低いときであ
っても、治療用途を有しているであろう。これと同じ方
法を用いて、特定ホルモンまたはタンパク質の、そのク
リアランス受容体を凌ぐ１次機能受容体に対する選択性
を改善することができる。

【００７８】本発明の別の態様においては、改良された
基質アミノ酸配列を得ることができる。これらは、タン
パク質リンカーのためのより良好な「切断部位」を作成
する際に、またはより良好なプロテアーゼ基質／阻害物
質のために有用であろう。この態様においては、固定化
しうる分子（例えば、hＧＨ-受容体、ビオチン-アビジ
ン、またはマトリックスと共有結合しうる分子）をリン
カーによって遺伝子IIIに融合させる。このリンカー
は、好ましくは長さが３〜１０アミノ酸であり、プロテ
アーゼの基質として作用する。ファージミドを上記のよ
うに構築する（ここで、リンカー領域をコードしている
ＤＮＡにランダム突然変異を行なって、結合部位に異な
るアミノ酸配列を有するファージミド粒子のランダムラ
イブラリーを調製する）。次いで、このファージミド粒
子のライブラリーをマトリックス上に固定化し、所望の
プロテアーゼに暴露する。所望のプロテアーゼのライナ
ー領域に好ましいかまたはより良好な基質アミノ酸配列
を有するファージミド粒子が溶離され、好ましいリンカ
ーをコードしているファージミド粒子の豊富化されたプ
ールが最初に得られるであろう。次いで、さらに数回こ
れらファージミド粒子を反復処理し、コンセンス配列
（群）をコードしている粒子の豊富化されたプールを得
る（実施例XIIIおよびXIVを参照）。

【００７９】VIII．成長ホルモン変異体および使用方法 hＧＨのクローン化遺伝子がEschericha colaにおいて分
泌型で発現され〔Chang,C.N.ら, Gene 55: 189 (198
7)〕、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている
〔Goeddelら, Nature 281: 544 (1979); Grayら, Gene
39: 247 (1985)〕。本発明は、ファージミド選択法を用
いて得た新規なhＧＨ変異体を記載するものである。１
０、１４、１８、２１、１６７、１７１、１７２、１７
４、１７５、１７６、１７８および１７９位に置換を含
むヒト成長ホルモン変異体が記載されている。比較的高
い結合親和性を有する変異体を表VII、XIIIおよびXIVに
記載している。これら変異体を記載するためのアミノ酸
命名法は後記する。成長ホルモン変異体は、正規の成長
ホルモンと同じように投与および製剤化してよい。本発
明の成長ホルモン変異体は、天然またはmet hＧＨを発
現しうる任意の組換え系において発現させることができ
る。

【００８０】治療用投与のためのhＧＨの製剤は、所望
の精製度のhＧＨを所望により生理学的に許容しうる担
体、賦形剤または安定剤〔Remington's Pharmaceutical
Scien ces, 第16版, Osol,A.編 (1980)〕と混合するこ
とにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用
に調製される。許容しうる担体、賦形剤または安定剤は
使用される用量および濃度で受容対象に対して非毒性で
あり、これらには、緩衝液（例えば、リン酸、クエン
酸、および他の有機酸の緩衝液）；抗酸化剤（アスコル
ビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）のポリペ
プチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチ
ン、あるいは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例え
ば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリ
シン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるい
はリジン）；単糖類、二糖類およびその他の炭水化物
（グルコース、マンノースあるいはデキストリンを含
む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；二価の金属
イオン（例えば、亜鉛、コバルトあるいは銅）；糖アル
コール（例えば、マンニトールあるいはソルビトー
ル）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；
および／またはノニオン系界面活性化剤〔例えば、ツイ
ーン、プルロニックあるいはポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）〕が含まれる。本発明の製剤は、薬学的に許
容しうる緩衝剤、アミノ酸、増量剤、および／またはノ
ニオン系界面活性剤をさらに含有していてもよい。これ
らには、例えば緩衝液、キレート化剤、抗酸化剤、保存
剤、共溶媒などが含まれる。これらの具体例には、トリ
メチルアマイン塩（「トリス緩衝液」）、および二ナト
リウム・エデテートが含まれるであろう。本発明のファ
ージミドを用いてファージタンパク質を含まない多量の
hＧＨ変異体を製造することができる。融合体の遺伝子I
II部分を含まないhＧＨ変異体を発現させるために、単
にpＳ０６４３および誘導体を１６Ｃ９などの非サプレ
ッサー株中で増殖させることができる。この場合には、
アンバーコドン（ＴＡＧ）が翻訳の終止を導き、独立し
たＤＮＡの構築を必要とすることなく遊離のホルモンが
得られる。hＧＨ変異体は宿主から分泌され、これを培
養培地から単離することができる。

【００８１】８つのhＧＨアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ
１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ
１７９のうちの１またはそれ以上のアミノ酸を、ここに
示した天然hＧＨ中の該位置に見い出されるアミノ酸以
外のいずれかのアミノ酸に置換することができる。即
ち、ここに示したアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ
２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ１７９の
うちの１、２、３、４、５、６、７、または８個全部
を、以下に挙げる２０アミノ酸のうちの他の１９アミノ
酸のいずれかで置換することができる。好ましい態様に
おいては、ここに挙げた８個全部のアミノ酸を別のアミ
ノ酸で置換する。置換されるべき最も好ましい８個のア
ミノ酸は、実施例XII中の表XIVに示す。 アミノ酸の命名 Ａla（Ａ） Ａrg（Ｒ） Ａsn（Ｎ） Ａsp（Ｄ） Ｃys（Ｃ） Ｇln（Ｑ） Ｇlu（Ｅ） Ｇly（Ｇ） Ｈis（Ｈ） Ｉle（Ｉ） Ｌeu（Ｌ） Ｌys（Ｋ） Ｍet（Ｍ） Ｐhe（Ｆ） Ｐro（Ｐ） Ｓer（Ｓ） Ｔhr（Ｔ） Ｔrp（Ｗ） Ｔyr（Ｙ） Ｖal（Ｖ） １文字のhＧＨ変異体の命名法は、削除されるhＧＨアミ
ノ酸（例えば、グルタメート１７９）を最初に記し、次
に挿入されるアミノ酸（例えば、セリン）を記し、結果
として（Ｅ１７９５Ｓ）となる。

【００８２】

【実施例】さらに説明することなく、当業者なら以上の
説明および例示の実施例を用いて本発明を完全に実施お
よび利用することができると考えられる。即ち、以下の
具体的な実施例は本発明の好ましい態様を示すものであ
り、いかなる意味においても開示の残部を限定するもの
とみなすべきではない。

【００８３】実施例１ プラスミドの構築およびhＧＨ
−ファージミド粒子の調製 プラスミドphＧＨ-Ｍ１３gIII（図１）を、Ｍ１３ＫＯ
７⁷およびhＧＨ産生プラスミドpＢＯ４７３〔Cunningha
m,B.C.ら, Science 243: 1330-1336 (1989)〕から構築
した。合成オリゴヌクレオチド： 5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-TTA-GCA-TTT-AAT-GCG-GTA
-3' を用いて、pＢＯ４７３中のhＧＨの最後のＰhe１９１コ
ドンの後に唯一のＡpaＩ制限部位（下線部）を導入し
た。オリゴヌクレオチド： 5'-TTC-ACA-AAC-GAA-GGG-CCC-CTA-ATT-AAA-GCC-AGA-3' を用いて、唯一のＡpaＩ制限部位（最初の下線部）、お
よびＧlu１９７−アンバー停止コドン（２番目の下線
部）をＭ１３ＫＯ７遺伝子III中に導入した。オリゴヌ
クレオチド： 5'-CAA-TAA-TAA-CGG-GCT-AGC-CAA-AAG-AAC-TGG-3' により、遺伝子III暗号配列の３′末端の後に唯一のＮh
eＩ部位（下線部）を導入する。二重に突然変異させた
Ｍ１３ＫＯ７の遺伝子III由来の得られた６５０塩基対
（bp）のＡpaＩ−ＮheＩフラグメントを、pＢＯ４７３
の大きいＡpaＩ−ＮheＩフラグメント中にクローン化し
てプラスミドpＳＯ１３２を創製した。これにより、Ａp
aＩ部位からコードされるグリシン残基を挿入しつつhＧ
Ｈのカルボキシ末端（Ｐhe１９１）を遺伝子IIIタンパ
ク質のＰro１９８残基に融合させ、この融合タンパク質
を大腸菌アルカリホスファターゼ（phoＡ）プロモータ
ーおよびstII分泌シグナル配列〔Chang,C.N.ら, Gene 5
5: 189-196 (1987)〕の支配下に置いた。豊富培地中で
の融合タンパク質の誘導可能な発現のために、このpho
Ａプロモーターをlacプロモーターおよびオペレーター
で置換した。lacプロモーター、オペレーター、および
Ｃap結合部位を含有する１３８bpのＥcoＲＩ−ＸbaＩフ
ラグメントを、オリゴヌクレオチド： 5'-CACGACAGAATTCCCGACTGGAAA-3' および 5'-CTGTTTCTA
GAGTGAAATTGTTA-3' 〔これらは、所望のlac配列と境界を接し、ＥcoＲＩお
よびＸbaＩ制限部位（下線部）を導入する〕を用いるプ
ラスミドpＵＣ１１９のＰＣＲによって調製した。このl
acフラグメントをゲル精製し、pＳＯ１３２の大きいＥc
oＲＩ−ＸbaＩフラグメントに連結してプラスミドphＧ
Ｈ-Ｍ１３gIIIを創製した。すべての加工したＤＮＡ連
結点の配列はジデオキシ配列決定法によって確認した
〔Sanger,F.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74: 5463-546
7 (1977)〕。Ｒ６４Ａ変異hＧＨファージミドは次のよ
うにして構築した。即ち、Ａrg６４のＡla置換（Ｒ６４
Ａ）〔Cunningham,B.C., Wells,J.A, Science 244: 108
1-1085 (1989)〕をコードしているhＧＨ〔Cunninghamら
（上記）〕のＮsiＩ−ＢglII突然変異フラグメントを、
phＧＨ-Ｍ１３gIIIプラスミド（図１）中の対応する制
限部位の間にクローン化して野生型hＧＨ配列を置換し
た。このＲ６４Ａ hＧＨファージミド粒子を、野生型h
ＧＨ−ファージミドについて以下に記載したようにして
増殖させ、滴定した。

【００８４】プラスミドを大腸菌の雄性株（ＪＭ１０
１）中に導入し、カルベニシリン・プレート上で選択し
た。単一の形質転換体を２ＹＴ培地（２ml）中にて３７
℃で４時間増殖させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ
（５０μl）に感染させた。この感染培養物を２ＹＴ
（３０ml）に希釈し、一晩培養し、ポリエチレングリコ
ールによる沈澱によってファージミド粒子を集めた〔Vi
erra,J., Messing,J., Methods in Enzymology 153: 3-
11 (1987)〕。通常、ファージミド粒子の力価は２〜５
ｘ１０¹¹cfu／mlの範囲内であった。この粒子をＣsＣl
密度遠心〔Day,L.A., J.Mol.Biol. 39: 265-277 (196
9)〕によって均質になるまで精製し、ビリオンに未結合
のすべての融合タンパク質を除去した。

【００８５】実施例II 融合ファージ上のhＧＨの免疫
化学分析 hＧＨに対するウサギポリクローナル抗体をプロテイン
Ａを用いて精製し、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐH
１０）中、２μg/mlの濃度にて４℃で１６〜２０時間、
微量滴定プレート（Nunc）に被覆した。０.０５％ツイ
ーン２０を含むＰＢＳ中で洗浄した後、hＧＨまたはhＧ
Ｈ−ファージミド粒子を緩衝液Ａ〔５０mMトリス（ｐH
７.５）、５０mM ＮaＣl、２mM ＥＤＴＡ、５mg/mlウシ
血清アルブミン、および０.０５％ツイーン２０〕中で
２.０〜０.００２nMに連続希釈した。室温（rt）で２時
間の後、このプレートを十分に洗浄し、示したＭab〔Cu
nninghamら（上記）〕をrtで２時間、緩衝液Ａ中１μg/
mlで加えた。洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-
コンジュゲート化したヤギ抗-マウスＩgＧ抗体をrtで１
時間結合させた。最後の洗浄の後、ペルオキシダーゼ活
性を、基質o-フェニレンジアミンを用いて検定した。

【００８６】実施例III hＧＨ結合タンパク質のポリア
クリルアミドビーズへの結合および結合の豊富化 オキシラン ポリアクリルアミドビーズ（Sigma）を、２
３７位に部位指向性突然変異誘発により導入した余分の
システイン残基（hＧＨの結合に悪影響を及ぼさない；
J.Wells：未公表）を含むhＧＨ受容体の精製した細胞外
ドメイン（hＧＨbp）〔Fuh,G.ら, J.Biol.Chem. 265: 3
111-3115 (1990)〕とコンジュゲート化した。このhＧＨ
bpは、供給元の推奨のように、樹脂に対する〔¹²⁵Ｉ〕h
ＧＨの結合によって測定したときに１.７pモルhＧＨbp
／mg乾燥オキシランビーズの量となるようにコンジュゲ
ート化した。次いで、すべての未反応オキシラン基をＢ
ＳＡおよびトリスでブロックした。ファージミド粒子の
非特異的結合の対照として、ＢＳＡを同様にビーズに結
合させた。吸着および洗浄のための緩衝液は、１０mMト
リス-ＨＣl（ｐH７.５）、１mM ＥＤＴＡ、５０mM Ｎa
Ｃl、１mg/ml ＢＳＡおよび０.０２％ツイーン２０を含
有していた。溶離緩衝液は、洗浄緩衝液に加えて２００
nM hＧＨまたは０.２Mグリシン（ｐH２.１）を含有して
いた。親ファージＭ１３ＫＯ７をhＧＨファージミド粒
子とほぼ３０００：１（最初の混合物）の比で混合し、
５０μl容量中、室温でいずれかの吸収剤（５μlづつ；
０.２mgのアクリルアミドビーズ）と８〜１２時間混合
した。このビーズを遠心によってペレット化し、上清を
注意深く除去した。このビーズを洗浄緩衝液（２００μ
l）に再懸濁し、室温で４時間混合した（洗浄液１）。
２回目の洗浄の後（洗浄液２）、このビーズを２回、そ
れぞれ２００nMのhＧＨで６〜１０時間溶離した（溶出
液１、溶出液２）。最後の溶離はグリシン緩衝液（ｐH
２.１）を用いて４時間行ない、残存するhＧＨファージ
ミド粒子を除去した（溶出液３）。それぞれの分画を２
ＹＴ培地で適切に希釈し、新鮮なＪＭ１０１と混合し、
３７℃で５分間インキュベートし、そして２ＹＴ軟寒天
（３ml）を用いてＬＢまたはＬＢカルベニシリンプレー
トにプレーティングした。

【００８７】実施例IV 遺伝子III産物の混合物によるh
ＧＨ−ファージミド粒子の構築 遺伝子IIIタンパク質は４１０残基からなり、可変リン
カー配列によって隔てられた２つのドメインに分かれて
いる〔Armstrong,J.ら, FEBS Lett. 135: 167-172 (198
1)〕。アミノ末端ドメインは大腸菌の線毛に付着するた
めに必要であり、一方、カルボキシ末端ドメインはファ
ージのコート（外殻）に組込まれ、適切なファージ組立
てに必要である〔Crissman,J.W., Smith,G.P., Virolog
y 132: 445-455 (1984)〕。遺伝子IIIのシグナル配列お
よびアミノ末端ドメインを、遺伝子IIIのカルボキシ末
端ドメイン中の残基１９８への融合により、stIIシグナ
ルおよび全hＧＨ遺伝子〔Changら（上記）〕で置換した
（図１）。このhＧＨ−遺伝子III融合体を、pＢＲ３２
２のβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣolＥ１複製起点な
らびにファージf１の遺伝子間領域を含むプラスミド（p
hＧＨ-Ｍ１３gIII；図１）中のlacプロモーター／オペ
レーターの支配下に置いた。このベクターは、カルベニ
シリンによる選択によって小さなプラスミドベクターと
して容易に維持することができ、これにより増殖のため
に機能的な遺伝子III融合体に依存することが回避され
る。また、このプラスミドは、Ｍ１３ＫＯ７〔Vieraら
（上記）〕などのヘルパーファージによる感染によって
ビリオン（即ち、ファージミド粒子）に効率的にパッケ
ージングされることができ、これによりファージ組立て
の問題が回避される。この系におけるカルベニシリン耐
性に対する形質導入に基づくファージミドの感染性力価
は、２〜５ｘ１０¹¹コロニー形成単位（cfu）／mlに変
化した。これらのファージミド保存物におけるＭ１３Ｋ
Ｏ７ヘルパーファージの力価は〜１０¹⁰プラーク形成単
位（pfu）／mlである。

【００８８】この系を用いて、遺伝子IIIに融合した大
きいタンパク質の均質発現がファージの生成に有害であ
るという以前の研究〔Parmley, Smith （上記）〕を確
認した（データは示していない）。例えば、ＩＰＴＧの
添加によるphＧＨ-Ｍ１３gIII中のlacプロモーターの誘
導により、低いファージミド力価が得られた。さらに、
遺伝子III中にアンバー突然変異を含むＭ１３ＫＯ７に
よる同時感染によって得られたファージミド粒子は、極
めて低いファージミド力価（＜１０¹⁰cfu／ml）を与え
た。我々は、ファージミド表面に結合した複数コピーの
遺伝子III融合体が、固定化標的タンパク質への融合フ
ァージの複数点結合（「キレート作用」）を導きうるも
のと考えた。従って、融合タンパク質のコピー数を制御
するために、構成的に高レベルのlacリプレッサータン
パク質を含有する大腸菌ＪＭ１０１（lacl^Q）中でプラ
スミドを培養することによって、hＧＨ−遺伝子III融合
体の転写を制限した。phＧＨ-Ｍ１３gIIIを含有する大
腸菌ＪＭ１０１培養物を最高に増殖させ、lacオペロン
誘導物質（ＩＰＴＧ）の非存在下にＭ１３ＫＯ７に感染
させた（しかし、この系は柔軟性を持っており、他の遺
伝子III融合タンパク質の同時発現と平衡させることが
できる）。我々は、ビリオンあたりのhＧＨ量の比（Ｃs
Ｃl勾配で精製したファージミド中のhＧＨ免疫反応性物
質に基づく）から、約１０％のファージミド粒子が１コ
ピーのhＧＨ遺伝子III融合タンパク質を含有しているも
のと概算している。従って、hＧＨ遺伝子III融合体を表
示する融合ファージの力価は約２〜５ｘ１０¹⁰／mlであ
る。この数値は、これらを導いた培養物中の大腸菌の力
価（〜１０⁸〜１０⁹／ml）よりも相当に大きい。即ち、
平均的に全大腸菌細胞は、hＧＨ遺伝子III融合タンパク
質で装飾されたファージを１０〜１００コピー生成す
る。

【００８９】実施例Ｖ hＧＨ−遺伝子III融合体の構造
的完全性 hＧＨ−遺伝子IIIファージミドの免疫ブロット分析（図
２）により、hＧＨ交差反応性物質がアガロースゲル中
でファージミド粒子と同時移動することがわかる。この
ことは、hＧＨがファージミド粒子に強固に結合してい
ることを示すものである。このファージミド粒子からの
hＧＨ−遺伝子III融合タンパク質は単一の免疫染色され
るバンドとして移動し、hＧＨが遺伝子IIIに結合したと
きにhＧＨの分解がわずかしかないことを示す。約２５
％のファージミド粒子が感染性であるので、野生型遺伝
子IIIタンパク質が明らかに存在する。これは、ＵＶ吸
収によって評価した濃度、および同様に精製（ＣsＣl密
度勾配法による）した野生型Ｍ１３ファージに対して行
なった比感染性評価に類似する〔Smith,G.P.（上記）お
よびParmley, Smith（上記）〕。即ち、野生型遺伝子II
IおよびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の両方がファ
ージプール中に表示される。

【００９０】結合選択による結果が天然タンパク質に転
換するという信頼性を得るために、表示されたhＧＨの
３次構造が維持されていることを確認するのが重要であ
った。hＧＨに対するモノクローナル抗体（Ｍab）を用
いて、表示されたhＧＨ遺伝子III融合タンパク質の構造
的完全性を評価した（表Ｉ）。 表Ｉ．hＧＨおよびhＧＨファージミド粒子への８種の異なる モノクローナル抗体（Ｍab）の結合 * ＩＣ₅₀（nM） Ｍab hＧＨ hＧＨ−ファージミド １ ０.４ ０.４ ２ ０.０４ ０.０４ ３ ０.２ ０.２ ４ ０.１ ０.１ ５ ０.２ ＞０.２ ６ ０.０７ ０.２ ７ ０.１ ０.１ ８ ０.１ ０.１ * 表中の値は、特定のＭabに対する半-最大結合を与えるhＧＨ またはhＧＨ−ファージミド粒子の濃度（nM）を表す。これらの 測定の標準誤差は、通常、表示値の±３０％またはそれ以下 である。詳細については原材料および方法の項を参照。

【００９１】これらＭabに対するhＧＨ上のエピトープ
はマッピングされており〔Cunninghamら（上記）〕、８
種のＭabのうちの７種に対する結合はhＧＨが適切に折
り畳まれることを必要とする。すべてのＭabのＩＣ₅₀値
は、Ｍab ５および６を除いて野生型hＧＨと等価であっ
た。Ｍab ５および６の両方は、遺伝子III融合タンパク
質中でブロックされるhＧＨのカルボキシ末端の近くに
結合決定基を有していることが知られている。天然およ
び変性hＧＨの両方と反応するＭab１の相対ＩＣ₅₀値
は、立体配座的に敏感なＭab ２〜５、７および８と比
較して変わることがない。即ち、Ｍab１は、hＧＨ−遺
伝子III融合体の濃度に対するhＧＨ標準の濃度を適合さ
せる際のあらゆる過誤の良好な内部対照として働く。

【００９２】実施例VI 受容体親和性ビーズに対する結
合の豊富化 これまでの研究者〔Parmley, Smith（上記）；Smith
（上記）；Cwirlaら（上記）；およびDevlinら（上
記）〕は、ストレプトアビジン被覆したポリスチレン製
ペトリ皿または微量滴定プレートで選別することによっ
てファージを分画していた。しかし、クロマトグラフィ
ー系は、異なる結合親和性を有する突然変異タンパク質
を表示するファージミド粒子のさらに効率的な分画を可
能にする。我々は、非多孔性のオキシランビーズ（Sigm
a）を選択してクロマトグラフィー樹脂中のファージミ
ド粒子の捕捉を回避した。さらに、これらビーズは小さ
い粒子サイズ（１μm）を有しており、量に対する表面
積の比が最大になる。遊離のシステイノ残基を含有する
hＧＨ受容体の細胞外ドメイン（hＧＨbp）〔Fuhら（上
記）〕はこれらビーズに効率的に結合し、ファージミド
粒子はウシ血清アルブミンにのみ結合させたビーズに対
して極めて低い非特異的な結合を示した（表II）。

【００９３】表II ．hＧＨbp被覆したビーズに対するホルモンファージの特異的な結合により 得られるＭ１３ＫＯ７ファージを凌ぐhＧＨ-ファージの豊富化*１ 試料 吸収物質*3 全pfu 全cfu 比(cfu／pfu) 豊富化*4 最初の混合物*2 8.3x10¹¹ 2.9x10⁸ 3.5x10^-4 (1) 上清 ＢＳＡ 7.4x10¹¹ 2.8x10⁸ 3.8x10^-4 1.1 hＧＨbp 7.6x10¹¹ 3.3x10⁸ 4.3x10^-4 1.2 洗浄液１ ＢＳＡ 1.1x10¹⁰ 6.0x10⁶ 5.5x10^-4 1.6 hＧＨbp 1.9x10¹⁰ 1.7x10⁷ 8.9x10^-4 2.5 洗浄液２ ＢＳＡ 5.9x10⁷ 2.8x10⁴ 4.7x10^-4 1.3 hＧＨbp 4.9x10⁷ 2.7x10⁶ 5.5x10^-2 1.6x10² 溶出液１ (hＧＨ)ＢＳＡ 1.1x10⁶ 1.9x10³ 1.7x10^-3 4.9 hＧＨbp 1.2x10⁶ 2.1x10⁶ 1.8 5.1x10³ 溶出液２ (hＧＨ)ＢＳＡ 5.9x10⁵ 1.2x10³ 2.0x10^-3 5.7 hＧＨbp 5.5x10⁵ 1.3x10⁶ 2.4 6.9x10³ 溶出液３ (ｐH2.1)ＢＳＡ 4.6x10⁵ 2.0x10³ 4.3x10^-3 12.3 hＧＨbp 3.8x10⁵ 4.0x10⁶ 10.5 3.0x10⁴ *1 それぞれの分画中のＭ１３ＫＯ７およびhＧＨ−ファ
ージミド粒子の力価は、それぞれプラーク形成単位（pf
u）またはカルベニシリン耐性コロニー形成単位（cfu）
の数値に希釈係数を掛けることによって測定した。詳細
には実施例IVを参照。 *2 Ｍ１３ＫＯ７のhＧＨ−ファージミド粒子に対する比
は最初の混合物において３０００：１に調節した。 *3 吸収物質はＢＳＡまたはhＧＨbpとコンジュゲート化
した。 *4 豊富化は、各工程後のcfu／pfu比を最初の混合物のc
fu／pfu比で割ることによって計算した。

【００９４】代表的な豊富化実験（表II）において、１
部のhＧＨファージミドを＞３,０００部のＭ１３ＫＯ７
ファージと混合した。１サイクルの結合と溶離の後、１
０⁶のファージが回収され、ファージミドのＭ１３ＫＯ
７ファージに対する比は２：１であった。即ち、１回の
結合選択工程によって、＞５０００倍の豊富化が得られ
た。残存するファージミドを除去するための遊離hＧＨ
または酸処理による追加の溶離によって、さらに高い豊
富化が得られた。この豊富化は、被覆ポリスチレンプレ
ートからのバッチ溶離を用いてSmithおよびその共同研
究者が得た豊富化に匹敵した〔Smith,G.P.（上記）およ
びParmley, Smith（上記）〕。しかし、さらに少ない容
量がビーズに対して用いられている（２００μl vs ６m
l）。ＢＳＡにのみ結合させたビーズを用いたときに
は、Ｍ１３ＫＯ７を凌ぐhＧＨファージミドの豊富化は
ほとんど存在しなかった。対照ビーズに対して観察され
たわずかな豊富化（ｐH２.１溶離に対して〜１０倍；表
２）は、ビーズに結合するＢＳＡ中に存在するウシ成長
ホルモン結合タンパク質の微量の不純物に由来するもの
であろう。それにもかかわらず、これらのデータは、h
ＧＨファージの豊富化がビーズ上のhＧＨbpの存在に依
存することを示し、結合がhＧＨとhＧＨbpの間の特異的
な相互作用によって起こることを示唆する。

【００９５】我々は、融合ファージミド上のhＧＨの比
較的弱い結合変異体を凌ぐ野生型hＧＨの豊富化を評価
して、豊富化の特異性をさらに調べ、精製ホルモンに対
する結合親和性の減少を融合ファージミド選別後の豊富
化因子と関連させた。Ａrg６４がＡlaで置換されたhＧ
Ｈ突然変異体（Ｒ６４Ａ）を用いて融合ファージミドを
構築した。このＲ６４Ａ変異ホルモンは、hＧＨと比べ
て受容体結合親和性が約２０倍減少している〔それぞ
れ、Ｋd値が７.１nMおよび０.３４nM；Cunningham,Well
s（上記）〕。Ｒ６４Ａ hＧＨ−遺伝子III融合ファージ
ミドの力価は、野生型hＧＨファージミドの力価と同等
であった。１ラウンドの結合と溶離の後（表III）、野
生型hＧＨファージミドは、２種類のファージミドとＭ
１３ＫＯ７の混合物から、ファージミドＲ６４Ａに対し
ては８倍およびＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに対して
は〜１０⁴で豊富化された。

【００９６】表III ．比較的弱い結合のhＧＨ変異ファージミド以上にhＧＨファージミドを選 択する hＧＨbp被覆ビーズ 対照ビーズ hＧＨbpビーズ 試料 WTファージミド WT／R64A WTファージミド WT／R64A ／全ファージミド の豊富化 ／全ファージミド の豊富化 最初の混合物 ８／２０ (1) ８／２０ (1) 上清 ＮＤ − ４／１０ １.０ 溶出液１(hGH) ７／２０ ０.８ １７／２０ ８.５*3溶出液２(ｐH2.1)１１／２０ １.８ ２１／２７ ５.２ *1 親Ｍ１３ＫＯ７ファージ、野生型hＧＨファージミド
およびＲ６４Ａファージミド粒子を１０⁴：０.４：０.
６の比で混合した。結合選択は、表IIならびに原材料お
よび方法の項の記載のように、ＢＳＡ（対照ビーズ）ま
たはhＧＨbp（hＧＨbpビーズ）により結合させたビーズ
を用いて行なった。各工程の後、プラスミドＤＮＡをカ
ルベニシリン耐性コロニーから単離し〔Birnboim,H.D.,
Doly,J.,Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523 (197
9)〕、制限分析によって分析して、このＤＮＡが野生型
hＧＨまたはＲ６４Ａ hＧＨ遺伝子III融合体を含有して
いるか否か測定した。 *2 Ｒ６４Ａ突然変異体を越える野生型hＧＨファージミ
ドの豊富化は、各工程後に存在するhＧＨファージミド
の最初の混合物中に存在するファージミドに対する比
（８／２０）に基づき、Ｒ６４Ａファージミドの対応す
る比で割ることにより計算した。 ＷＴ＝野生型；ＮＤ＝測定せず。 *3 全Ｍ１３ＫＯ７親ファージを越えるファージミドの
豊富化は、この工程後に〜１０⁴であった。

【００９７】ファージミド粒子上に野生型遺伝子IIIお
よび遺伝子III融合タンパク質の混合物を表示させるこ
とにより、遺伝子IIIに対する融合体として大きな適切
に折り畳まれたタンパク質を表示するビリオンを組立て
そして増殖させることができる。遺伝子III融合タンパ
ク質のコピー数を有効に制御して、ファージミドプール
において十分に高いレベルになお維持されている「キレ
ート作用」を避け、大きいエピトープライブラリー（＞
１０¹⁰）の選別をすることができる。我々は、hＧＨ
（２２kＤのタンパク質）を天然の折り畳まれた形態で
表示させうることを示した。遊離のhＧＨで溶離し、受
容体親和性ビーズ上で行なった結合選択は、低い受容体
結合親和性を有することが示された突然変異hＧＨファ
ージミド以上に野生型hＧＨファージミドを効率的に豊
富化した。即ち、結合定数がナノモル範囲で低下してい
るファージミド粒子を選別することができる。タンパク
質−タンパク質および抗体−抗原の相互作用は、不連続
エピトープによって支配されている〔Janin,J.ら, J.Mo
l.Biol. 204: 155-164 (1988); Argos,P., Prot.Eng.
2: 101-113 (1988); Barlow,D.J.ら, Nature 322: 747-
748 (1987); およびDavies,D.R.ら, J.Biol.Chem. 263:
10541-10544 (1988)〕。即ち、結合に直接関与してい
る残基は３次構造において近接しているが、結合に関与
していない残基によって隔てられている。本発明により
提供されるスクリーニング系は、さらに好都合にタンパ
ク質−受容体の相互作用を分析し、新規かつ高親和性の
結合性を有するタンパク質中の不連続エピトープを単離
することを可能にするものである。

【００９８】実施例VII hＧＨコドン１７２、１７４、
１７６、１７８においてランダム化したライブラリーか
らのhＧＨ突然変異体の選択鋳型の構築 hＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の突然変異体は、Kunk
elら〔Meth.Enzymol.154: 367-382 (1987)〕の方法を用
いて構築した。鋳型ＤＮＡは、Ｍ１３-Ｋ０７ファージ
をヘルパーとして加えて、プラスミドpＳ０１３２（Ｍ
１３遺伝子IIIのカルボキシ末端側半分に融合させた天
然hＧＨ遺伝子をアルカリホスファターゼプロモーター
の支配下に含有する）をＣＪ２３６細胞中で増殖させる
ことによって調製した。１本鎖のウラシル含有ＤＮＡを
突然変異誘発用に調製して、(1)hＧＨ結合タンパク質
（hＧＨbp）に対する結合を大きく減少させるhＧＨ中の
突然変異；および(2)親のバックグラウンドファージを
検定し、それに対して選択するために使用しうる唯一の
制限部位（ＫpnＩ）を導入した。Ｔ７ ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび以下のオリゴデオキシヌクレオチド： Gly Thr hGHコドン： 178 179 5'-G ACA TTC CTG GGT ACC GTG CAG T-3' < KpnI > を用いてオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発を行
なった。このオリゴは、hＧＨ中に突然変異（Ｒ１７８
Ｇ、Ｉ１７９Ｔ）と共にＫpnＩ部位（上に示す）を導入
する。突然変異誘発からのクローンをＫpnＩ消化によっ
てスクリーニングし、ジデオキシＤＮＡ配列決定によっ
て確認した。ランダム突然変異誘発の鋳型として使用さ
れるこの得られた構築物をｐHＯ４１５と命名した。

【００９９】hＧＨのヘリックス４中のランダム突然変
異誘発 ここでもKunkelの方法を用いて、コドン１７２、１７
４、１７６、１７８をhＧＨ中のランダム突然変異誘発
の標的とした。上記のようにｐHＯ４１５から１本鎖鋳
型を調製し、以下のオリゴ： hGHコドン： 172 174 5'- GC TTC AGG AAG GAC ATG GAC NNS GTC NNS ACA- Ile 176 178 179 - NNS CTG NNS ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG G-3' のプールを用いて突然変異誘発を行なった。上に示した
ように、このオリゴプールはコドン１７９を野生型（Ｉ
le）に復帰させ、ｐH０４１５の唯一のＫpnＩ部位を破
壊し、そして１７２、１７４、１７６および１７８位に
ランダムコドン（ＮＮＳ；ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃまた
はＴであり、ＳはＧまたはＣである）を導入する。上記
の配列に対してこのコドン選択を用いて、付加的なＫpn
Ｉ部位を創製することはできない。このＮＮＳ同義性配
列の選択により、４つの部位に３２種の可能なコドン
（１つの「停止」コドンおよび少なくとも１つの各アミ
ノ酸のためのコドン）が得られ、合計（３２）⁴＝１,０
４８,５７６の可能なヌクレオチド配列（この１２％は
少なくとも１つの停止コドンを含有する）、または（２
０）⁴＝１６０,０００の可能なポリペプチド配列と３
４,４８１の未成熟で終止した配列（即ち、少なくとも
１つの停止コドンを含有する配列）が得られる。

【０１００】最初のライブラリーの増殖 突然変異誘発産物をフェノール：クロロホルム（５０：
５０）で２回抽出し、後の電気穿孔工程を面倒にする塩
の添加を避けるために過剰のキャリアーtＲＮＡを用い
てエタノール沈澱させた。約５０ng（１５fモル）のＤ
ＮＡを、０.２cmキュベット中の全容量４５μlにおい
て、単一パルスの電圧設定２.４９kＶ（時間定数＝４.
７m秒）でＷＪＭ１０１細胞（２.８ｘ１０¹⁰細胞／ml）
に電気穿孔導入した。

【０１０１】この細胞を振盪しながら３７℃で１時間回
復させ、次いで２ＹＴ培地（２５ml）、１００μg/mlカ
ルベニシリン、およびＭ１３-Ｋ０７（感染の多重度＝
１０００）と混合した。この培養物からの連続希釈物を
カルベニシリン含有培地にプレーティングすることによ
り、８.２ｘ１０⁶の電気形質転換体が得られたことがわ
かった。２３℃で１０分間の後、培養物を振盪しながら
３７℃で一晩（１５時間）インキュベートした。

【０１０２】一晩インキュベートの後、細胞をペレット
化し、pＬＩＢ１と命名した２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）
をアルカリ溶解法によって調製した。この上清をもう一
度遠心してすべての残存細胞を除去し、ファージプール
φ１と命名したファージをＰＥＧ沈澱させ、ＳＴＥ緩衝
液〔１０mMトリス（ｐH７.６）、１mM ＥＤＴＡ、５０m
M ＮaＣl〕(１ml）に再懸濁した。ファージ力価は、hＧ
Ｈ-g３p遺伝子III融合（hＧＨ-g³）プラスミドを含有す
る組換えファージミドについてはコロニー形成単位（Ｃ
ＦＵ）として、そしてＭ１３-Ｋ０７ヘルパーファージ
についてはプラーク形成単位（ＰＦＵ）として測定し
た。

【０１０３】固定化hＧＨbpを用いる結合選択 １．結合：ファージプールφ１（６ｘ１０⁹ＣＦＵ、６
ｘ１０⁷ＰＦＵ）の一部を緩衝液Ａ〔リン酸緩衝食塩
水、０.５％ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、０.０１
％チメロサール〕で４.５倍に希釈し、１.５mlのシラン
処理したポリプロピレン試験管において、Ｓer２３７Ｃ
ys突然変異を含むhＧＨbp（３５０fモル）と結合させた
オキシラン-ポリアクリルアミドビーズの懸濁液（５μ
l）と混合した。対照として、等量のファージを、ＢＳ
Ａだけで被覆したビーズと別の試験管で混合した。この
ファージを、ゆっくり回転（約７rpm）させながら室温
（２３℃）で３時間インキュベートすることによって、
ビーズと結合させた。以下の工程は、２００μlの一定
容量を用い、室温で行なった。

【０１０４】２．洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上
清を除去した（上清１）。非特異的に結合したファージ
／ファージミドを除去するため、このビーズを緩衝液Ａ
に再懸濁することにより２回洗浄し、次いでペレット化
した。最後の洗浄は、緩衝液Ａ中で２時間、このビーズ
を回転させることにより行なった。

【０１０５】３．hＧＨ溶離：ビーズに弱く結合したフ
ァージ／ファージミドを、hＧＨによる段階溶離によっ
て除去した。最初の工程において、ビーズを２nM hＧＨ
含有の緩衝液Ａを用いて回転させた。１７時間後に、こ
のビーズをペレット化し、２０nM hＧＨ含有の緩衝液Ａ
に再懸濁し、３時間回転させ、次いでペレット化した。
最後のhＧＨ洗浄において、このビーズを２００nM hＧ
Ｈ含有の緩衝液Ａに懸濁させ、３時間回転させ、次いで
ペレット化した。

【０１０６】４．グリシン溶離：最も強固に結合したフ
ァージミド（即ち、hＧＨ洗浄後になお結合しているフ
ァージミド）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液
〔１Mグリシン、ＨＣlでｐH２.０〕に懸濁させ、２時間
回転させ、ペレット化した。この上清（分画「Ｇ」；２
００μl）を、１Mトリス塩基（３０μl）の添加によっ
て中和した。

【０１０７】hＧＨbp-ビーズから溶出した分画Ｇ（１ｘ
１０⁶ＣＦＵ、５ｘ１０⁴ＰＦＵ）は、実質的にＫ０７ヘ
ルパーファージ以上にファージミドに富むことはなかっ
た。我々は、これは、組換えファージミドの増殖中にパ
ッケージされたＫ０７ファージがhＧＨ-g３p融合体を表
示するということに起因するものと考えている。

【０１０８】しかし、ＢＳＡ被覆された対照ビーズから
溶出した分画Ｇと比較すると、hＧＨbp-ビーズは１４倍
高いＣＦＵを与えた。これは、非特異的に結合したファ
ージミド以上の、強固に結合したhＧＨを表示するファ
ージミドの豊富化を反映するものである。

【０１０９】５．増殖：hＧＨbp-ビーズから溶出した分
画Ｇの一部（４.３ｘ１０⁵ＣＦＵ）を用いて対数増殖期
のＷＪＭ１０１細胞を感染させた。形質導入は、分画Ｇ
（１００μl）をＷＪＭ１０１細胞（１ml）と混合し、
３７℃で２０分間インキュベートし、次いでＫ０７（感
染の多重度＝１０００）を加えることによって行なっ
た。培養物（２５mlの２ＹＴとカルベニシリン）を上記
のように増殖させ、ファージの第２プール（ライブラリ
ー１Ｇ、第１のグリシン溶離用）を上記のように調製し
た。

【０１１０】ライブラリー１Ｇからのファージ（図３）
を、上記のように、hＧＨbpビーズへの結合について選
択した。hＧＨbpビーズから溶出した分画Ｇは、この選
択においてＢＳＡビーズから溶出した分画Ｇに比べて３
０倍高いＣＦＵを含んでいた。もう一度、分画Ｇの一部
をＷＪＭ１０１細胞中で増殖させ、ライブラリー１Ｇ ²
（グリシン溶離によってこのライブラリーを２回選択し
たことを示す）を得た。また、２本鎖ＤＮＡ（pＬＩＢ
１Ｇ²）をこの培養物から調製した。dsＤＮＡのＫpnＩ検定および制限選択

【０１１１】バックグラウンド（ＫpnＩ⁺）鋳型の量を
減少させるため、pＬＩＢ １Ｇ²の一部（約０.５μg）
をＫpnＩで消化し、ＷＪＭ１０１細胞中に電気穿孔導入
した。これらの細胞を、最初のライブラリーについて記
載したようにＫ０７（感染の多重度＝１００）の存在下
で増殖させ、新しいファージプールpＬＩＢ３を調製し
た（図３）。

【０１１２】さらに、最初のライブラリー（pＬＩＢ
１）由来のdsＤＮＡの一部（約０.５μg）をＫpnＩで消
化し、ＷＪＭ１０１細胞中に直接電気穿孔導入した。形
質転換体を上記のように回復させ、Ｍ１３-Ｋ０７に感
染させ、一晩増殖させてファージライブラリー２と命名
した新しいファージライブラリーを得た（図３）。

【０１１３】連続ラウンドの選択 (1)過剰（ＣＦＵの１０倍）の精製Ｋ０７ファージ（hＧ
Ｈを表示しない）をビーズ結合カクテル中に添加した；
および(2)hＧＨ段階溶離を緩衝液Ａ単独の短い洗浄に換
えたことを除き、上記のようにしてpＬＩＢ２およびpＬ
ＩＢ３の両方に由来するファージミドに対して連続ラウ
ンドでファージミドの結合、溶離および増殖を行なっ
た。また、一部においてはＸＬ１-Ｂlue細胞をファージ
ミドの増殖に用いた。

【０１１４】ＫpnＩによるdsＤＮＡの追加の消化を、最
終ラウンドのビーズ結合選択の前にpＬＩＢ ２Ｇ³およ
びpＬＩＢ ３Ｇ⁵に対して実施した（図３）。

【０１１５】選択したファージミドのＤＮＡ配列決定 ＬＩＢ ４Ｇ⁴由来の４種の独立して単離したクローンお
よびＬＩＢ ５Ｇ⁶由来の４種の独立して単離したクロー
ンを、ジデオキシ配列決定によって配列決定した。これ
ら８種クローンのすべてが、同一のＤＮＡ配列： hGHコドン： 172 174 176 178 5'-AAG GTC TCC ACA TAC CTG AGG ATC-3' を有していた。即ち、これらのすべてがhＧＨの同一突
然変異体（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）をコードしてい
る。これらクローン中の残基１７２は野生型と同様にＬ
ysである。また、１７２に対して選択されたコドンも野
生型hＧＨと同一である。このことは、ＡＡＧが同義
「ＮＮＳ」コドンのセットから可能な唯一のリジン-コ
ドンであるので驚くには当たらない。さらに、残基１７
８-Ａrgも野生型と同一であるが、ここではライブラリ
ーから選択されたコドンはＡＡＧであって野生型hＧＨ
で見い出されるＣＧＣではなかった（後者コドンも「Ｎ
ＮＳ」コドンのセットを用いて可能である）。

【０１１６】Ｋ０７感染の多重度 Ｋ０７感染の感染多重度は、組換えファージミドの増殖
において重要なパラメーターである。Ｋ０７の感染多重
度は、ファージミドで形質転換またはトランスフェクシ
ョンされた実質的にすべての細胞が新しいファージミド
粒子をパッケージしうることを確保するに十分に高いも
のでなければならない。さらに、それぞれの細胞中の野
生型遺伝子IIIの濃度は高く維持されて、複数のhＧＨ−
遺伝子III融合分子がそれぞれのファージミド粒子上に
表示される可能性を減少させ、それによって結合におけ
るキレート作用を減少させるものであるべきである。し
かし、Ｋ０７の感染多重度が高すぎるときには、Ｋ０７
のパッケージングは組換えファージミドのパッケージン
グと競合するであろう。我々は、１〜１０％のバックグ
ラウンドＫ０７ファージしか持たない許容しうるファー
ジミド収量が、Ｋ０７の感染多重度が１００であるとき
に得られることを見い出した。

【０１１７】 表 IV ファージ moi(K07) 豊富化 hGHbp／ 分画KpnIプール CFU／PFU BSAビーズ ＬＩＢ１ １０００ ＮＤ １４ ０.４４ ＬＩＢ１Ｇ １０００ ＮＤ ３０ ０.５７ ＬＩＢ３ １００ ＮＤ １.７ ０.２６ ＬＩＢ３Ｇ³ １０ ＮＤ ８.５ ０.１８ ＬＩＢ３Ｇ⁴ １００ ４６０ ２２０ ０.１３ ＬＩＢ５ １００ ＮＤ １５ ＮＤ ＬＩＢ２ １００ ＮＤ １.７ ＜０.０５ ＬＩＢ２Ｇ １０ ＮＤ ４.１ ＜０.１０ ＬＩＢ２Ｇ² １００ １０００ ２７ ０.１８ＬＩＢ４ １００ １７０ ３８ ＮＤ

【０１１８】ファージプールを先に示したように標識し
た（図３）。感染多重度（moi）はファージミドの増殖
の際のＫ０７感染の多重度（ＰＦＵ／細胞）を意味す
る。ＰＦＵを越えるＣＦＵの豊富化は、精製したＫ０７
を結合工程に加えたときに示される。ＢＳＡビーズから
溶出したＣＦＵを越える、hＧＨbpビーズから溶出され
るＣＦＵの比が示されている。プール中に残存するＫpn
Ｉ含有鋳型（即ち、ｐH０４１５）の分画は、dsＤＮＡ
をＫpnＩおよびＥcoＲＩで消化し、生成物を１％アガロ
ースゲルで移動させ、陰性の臭化エチジウム染色ＤＮＡ
をレーザー-スキャニングすることによって測定した。

【０１１９】ホルモンhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６
Ｙ）の受容体結合の親和性 単一のクローンが２種類の異なる選択経路（図３）から
単離されたという事実は、二重突然変異体（Ｅ１７４
Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）がhＧＨbpに強く結合することを示唆
した。hＧＨbpに対するこのhＧＨ突然変異体の親和性を
測定するために、我々はこのhＧＨ突然変異体を、プラ
スミドpＢ０７２０を用いる部位指向性突然変異誘発に
よって構築した。このプラスミドは、鋳型としての野生
型hＧＨ遺伝子、ならびにコドン１７４および１７６を
変化させる次のオリゴヌクレオチド： hGHコドン： 172 174 176 178 Lys Ser Tyr Arg 5'- ATG GAC AAG GTG TCG ACA TAC CTG CGC ATC GTG -3' を含有している。得られた構築物ｐH０４５８Ｂを、突
然変異ホルモンの発現のために大腸菌株１６Ｃ９に導入
した。hＧＨbpに対するhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６
Ｙ）と¹²⁵Ｉ-hＧＨの競合結合のスカッチャード分析に
より、この（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）突然変異体が野
生型hＧＨの結合親和性よりも少なくとも５.０倍強固な
結合親和性を有していることがわかった。

【０１２０】実施例VIII ホルモン−ファージのヘリッ
クス４ランダムカセットライブラリーからのhＧＨ変異
体の選択 ヒト成長ホルモン変異体を、図９に記載のファージミド
を用いる本発明の方法によって調製した。

【０１２１】脱-融合性のホルモン−ファージベクター
の構築 我々は、(1)ファージ上でhＧＨ部分の表示をさらに有利
にするように、hＧＨと遺伝子III部分の間の結合を改良
する；(2)実質的に「一価の表示」を得るために融合タ
ンパク質の発現を限定する；(3)出発ベクターに対する
制限ヌクレアーゼの選択を可能にする；(4)出発ベクタ
ーからの融合タンパク質の発現を排除する；および(5)
あるhＧＨ−遺伝子III融合突然変異体からの対応する遊
離ホルモンの容易な発現を達成する；という目的をもっ
て、カセット突然変異誘発〔Wellsら, Gene 34: 315-32
3 (1985)〕およびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の発
現のためのベクターを設計した。

【０１２２】pＢＲ３２２およびf１の複製起点を含有
し、大腸菌phoＡプロモーター〔Bassら, Proteins 8: 3
09-314 (1990)〕の支配下にhＧＨ−遺伝子III融合タン
パク質（hＧＨ残基１〜１９１、これに１個のＧly残基
が続き、遺伝子IIIのＰro-１９８に融合している）を発
現する、pＳ０１３２のオリゴヌクレオチド指向性の突
然変異誘発〔Kunkelら, Methods Enzymol. 154: 367-38
2 (1987)〕によってプラスミドpＳ０６４３を構築した
（図９）。オリゴヌクレオチド： 5'-GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG-AGT-GGC-GGC-GGC-TCT-GGT
-3' を用いて突然変異誘発を行った〔このオリゴヌクレオチ
ドは、hＧＨのＰhe-１９１に続いてＸbaＩ部位（下線
部）およびアンバー停止コドン（ＴＡＧ）を導入す
る〕。得られた構築物pＳ０６４３においては、遺伝子I
IIの一部が削除され、２つのサイレント突然変異誘発
（下線部）が生じ、hＧＨと遺伝子IIIの間に次の連結点
が生成する： --- hＧＨ ---------> 遺伝子III -----> 187 188 189 190 191 am* 249 250 251 252 253 254 Gly Ser Cys Gly Phe Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly GGC AGC TGT GGA TTC TAG AGT GGC GGT GGC TCT GGT これは、融合タンパク質の全体サイズをpＳ０１３２中
の４０１残基からpＳ０６４３中の３５０残基まで短縮
する。hＧＨに対するモノクローナル抗体を用いた実験
により、ファージ粒子に組立てられる新しい融合タンパ
ク質のhＧＨ部分は以前の長い融合体よりも接近しやす
いことがわかった。

【０１２３】ホルモンを表示するファージを増殖させる
ため、pＳ０６４３および誘導体をＪＭ１０１またはＸ
Ｌ１-Ｂlueなどの大腸菌のアンバー-サプレッサー株〔B
ullockら, BioTechniques 5: 376-379 (1987)〕中で増
殖させることができる。上に示したのは、supＥサプレ
ッサー株中で起こるアンバーコドンにおけるＧluの置換
である。また、他のアミノ酸による抑制が、周知かつ一
般に入手可能な種々の大腸菌株において可能である。

【０１２４】融合体の遺伝子III部分を含まないhＧＨ
（または、突然変異体）を発現させるために、pＳ０６
４３および誘導体を単に１６Ｃ９などの非サプレッサー
株において増殖させることができる。この場合にはアン
バーコドン（ＴＡＧ）は翻訳の終止を導き、独立したＤ
ＮＡ構築を必要とすることなく遊離のホルモンを与え
る。

【０１２５】カセット突然変異誘発のための部位を創製
するため、pＳ０６４３をオリゴヌクレオチド： (1)5'-CGG-ACT-GGG-CAG-ATA-TTC-AAG-CAG-ACC-3' 〔これは、pＳ０６４３の唯一のＢglII部位を破壊す
る〕； (2)5'-CTC-AAG-AAC-TAC-GGG-TTA-CCC-TGA-CTG-CTT-CAG-
GAA-GG-3' 〔これは、唯一のＢstＥII部位、１塩基のフレームシフ
ト、および非アンバー停止コドン（ＴＧＡ）を挿入す
る〕；および (3)5'-CGC-ATC-GTG-CAG-TGC-AGA-TCT-GTG-GAG-GGC-3' 〔これは、新規なＢglII部位を導入する〕 で突然変異させて出発ベクターｐH０５０９を得た。Ｔ
ＧＡ停止コドンと共にフレームシフトを加えることによ
り、出発ベクターから遺伝子III融合体が産生され得な
いことが確保される。ＢstＥII−ＢglIIセグメントをｐ
H０５０９から切出し、所望のコドンのところで突然変
異させたＤＮＡカセットで置換した。また、hＧＨ中の
他の位置におけるカセット突然変異誘発のための他の制
限部位も、このホルモン−ファージベクター中に導入し
た。

【０１２６】hＧＨのヘリックス４内のカセット突然変
異誘発 hＧＨのコドン１７２、１７４、１７６および１７８を
ランダム突然変異誘発の標的とした。この理由は、これ
らすべてがhＧＨの表面またはその近くに存在し、受容
体結合に有意に寄与し〔CunninghamおよびWells, Scien
ce 244: 1081-1085 (1989)〕；これらすべてが十分に定
義された構造内に存在し、ヘリックス４の同じ側の２
「ターン」を占め；そして、これらのそれぞれがhＧＨ
の既知の進化変異体の中の少なくとも１つのアミノ酸で
置換されているためである。

【０１２７】我々は、それぞれの標的残基にＮＮＳ（Ｎ
＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ）の置換を選択した。こ
のＮＮＳ同義性配列の選択により、４つの部位に３２種
の可能なコドン（少なくとも１つの各アミノ酸のための
コドン）が得られ、合計（３２）⁴＝１,０４８,５７６
の可能なヌクレオチド配列、または（２０）⁴＝１６０,
０００の可能なポリペプチド配列が得られる。唯一の停
止コドンであるアンバー（ＴＡＧ）がこのコドン選択に
より可能であり、このコドンは大腸菌のsupＥ株におい
てＧlu１として抑制することができる。

【０１２８】コドン１７２、１７４、１７６および１７
８にＮＮＳを有する２種類の同義性（縮重）オリゴヌク
レオチドを合成し、ホスホリル化し、アニールさせて突
然変異カセットを構築した： 5'-GT-TAC-TCT-ACT-GCT-TTC-AGG-AAG-GAC-ATG-GAC-NNS-
GTC-NNS-ACA-NNS-CTG-NNS-ATC-GTG-CAG-TGC-A-3' および 5'-GA-TCT-GCA-CTG-CAC-GAT-SNN-CAG-SNN-TGT-SNN-GAC-
SNN-GTC-CAT-GTC-CTT-CCT-GAA-GCA-GTA-GA-3' 。 ＢstＥIIに続いてＢglIIでｐH０５０９を消化すること
によってベクターを調製した。生成物を１％アガロース
ゲル上で移動させ、大きいフラグメントを切り出し、フ
ェノール抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメ
ントをウシ腸ホスファターゼ（Boehringer）で処理し、
次いでフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈
澱させ、突然変異用カセットとの連結用に再懸濁した。

【０１２９】ＸＬ１-Ｂlue細胞における最初のライブラ
リーの増殖 連結の後、反応生成物をＢstＥIIでもう一度消化し、次
いでフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱
させ、水に再懸濁した〔ＢstＥII認識部位（ＧＧＴＮＡ
ＣＣ）が、コドン１７２の３位にＧおよび１７４にＡＣ
Ｃ（Ｔhr）コドンを含むカセット内に創製される。しか
し、この工程でのＢstＥIIによる処理は、あらゆる可能
な突然変異カセットに対して選択しないはずである。こ
の理由は、実質的にすべてのカセットがヘテロ２本鎖で
あり、この酵素によって切断され得ないためである〕。
約１５０ng（４５fモル）のＤＮＡを、０.２cmキュベッ
ト中のＸＬ１-Ｂlue細胞（０.０４５ml中に１.８ｘ１０
⁹細胞）に、単一パルスの電圧設定２.４９kＶ（時間定
数＝４.７m秒）で電気穿孔導入した。

【０１３０】この細胞を振盪しながらＳ.Ｏ.Ｃ.培地に
おいて３７℃で１時間回復させ、次いで２ＹＴ培地（２
５ml）、１００mg/mlカルベニシリン、およびＭ１３-Ｋ
０７（moi＝１００）と混合した。２３℃で１０分間の
後、培養物を振盪しながら３７℃で一晩（１５時間）イ
ンキュベートした。この培養物からの連続希釈物をカル
ベニシリン含有培地にプレーティングすることにより、
３.９ｘ１０⁷の電気形質転換体が得られたことがわかっ
た。

【０１３１】一晩インキュベートの後、細胞をペレット
化し、ｐH０５２９Ｅ（最初のライブラリー）と命名し
た２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をアルカリ溶解法によって
調製した。この上清をもう一度遠心してすべての残存細
胞を除去し、ファージプールφＨ０５２９Ｅ（最初のフ
ァージライブラリー）と命名したファージをＰＥＧ沈澱
させ、ＳＴＥ緩衝液〔１０mMトリス（ｐH７.６）、１mM
ＥＤＴＡ、５０mM ＮaＣl〕(１ml）に再懸濁した。フ
ァージ力価は、hＧＨ-g３pを含有する組換えファージミ
ドについてコロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定し
た。出発ライブラリーから約４.５ｘ１０¹³ＣＦＵが得
られた。

【０１３２】出発ライブラリーの同義性（縮重） 電気形質転換体のプールからの５８のクローンを、Ｂst
ＥII−ＢglIIカセットの領域において配列決定した。こ
れらの中で、１７％が出発ベクターに対応しており、１
７％が少なくとも１つのフレームシフトを含有してお
り、そして７％が４つの標的コドンの外側に非サイレン
ト（非終止）突然変異を含有していた。我々は、４１％
のクローンが上記基準のいずれかによる欠点を有してお
り、２.０ｘ１０⁷の当初形質転換体の合計機能的プール
が残るものと結論した。それでもなお、この数は可能性
あるＤＮＡ配列数をほぼ２０倍越えている。従って、我
々は出発ライブラリーにおいて示されるすべての可能性
ある配列を有することを確信している。

【０１３３】我々は、選択されなかったファージの配列
を調べて突然変異誘発におけるコドンの偏向度を評価し
た（表Ｖ）。これらの結果により、一部のコドン（およ
び、アミノ酸）がランダムな予想に比べて多いかまたは
少ないことが示されるが、このライブラリーは極めて多
様性が高く、大量の「兄弟」縮重の証拠は存在しないこ
とがわかった（表VI）。

【０１３４】表Ｖ．選択されなかったホルモンファージ
のコドン分布（１８８コドンあたり）クローンを出発ラ
イブラリー（ｐH０５２９Ｅ）から配列決定した。疑似
突然変異および／またはフレームシフトを含有するクロ
ーンからのコドンを含むすべてのコドンを表にした。
＊：アンバー停止コドン（ＴＡＧ）はＸＬ１-Ｂlue細胞
においてはＧluとして抑制される。下線を引いたコドン
は、５０％またはそれ以上に多い／少ないことが示され
た。 残基 予想数 実測数 実測／予想 Ｌeu １７.６ １８ １.０ Ｓer １７.６ ２６ １.５ Ａrg １７.６ １０ ０.５７ Ｐro １１.８ １６ １.４ Ｔhr １１.８ １４ １.２ Ａla １１.８ １３ １.１ Ｇly １１.８ １６ １.４ Ｖal １１.８ ４ ０.３ Ｉle ５.９ ２ ０.３ Ｍet ５.９ １ ０.２ Ｔyr ５.９ １ ０.２ Ｈis ５.９ ２ ０.３ Ｔrp ５.９ ２ ０.３ Ｐhe ５.９ ５ ０.９ Ｃys ５.９ ５ ０.９ Ｇln ５.９ ７ １.２ Ａsn ５.９ １４ ２.４ Ｌys ５.９ １１ １.９ Ａsp ５.９ ９ １.５ Ｇlu ５.９ ６ １.０ アンバー * ５.９ ６ １.０

【０１３５】表VI．オープン読み枠を有する選択されな
かった（ｐH０５２９Ｅ）クローン 表示、例えばＴＷＧＳは、hＧＨ突然変異体１７２Ｔ／
１７４Ｗ／１７６Ｇ／１７８Ｓを示す。ＸＬ１-Ｂlue細
胞においてＧluとして翻訳されたアンバー（ＴＡＧ）コ
ドンはεで示す。 ＫεＮＴ ＫＴＥＱ ＣＶＬＱ ＴＷＧＳ ＮＮＣＲ ＥＡＳＬ ＰεＥＲ ＦＰＣＬ ＳＳＫＥ ＬＰＰＳ ＮＳＤＦ ＡＬＬＬ ＳＬＤＰ ＨＲＰＳ ＰＳＨＰ ＱＱＳＮ ＬＳＬε ＳＹＡＰ ＧＳＫＴ ＮＧＳＫ ＡＳＮＧ ＴＰＶＴ ＬＴＴＥ ＥＡＮＮ ＲＳＲＡ ＰＳＧＧ ＫＮＡＫ ＬＣＧＬ ＬＷＦＰ ＳＲＧＫ ＴＧＲＬ ＰＡＧＳ ＧＬＤＧ ＡＫＡＳ ＧＲＡＫ ＮＤＰＩ ＧＮＤＤ ＧＴＮＧ

【０１３６】固定化hＧＨbpおよびhＰＲＬbpの調製 野生型hＧＨbp〔Fuhら, J.Biol.Chem. 265: 3111-3115
(1990)〕を用いたことを除き、文献〔Bassら, Proteins
8: 309-314 (1990)〕に記載のようにして固定化hＧＨb
p（「hＧＨbp-ビーズ」）を調製した。〔¹²⁵Ｉ〕hＧＨ
との競合結合実験により、１μlのビーズ懸濁液あたり
５８fモルの機能的hＧＨbpが結合することがわかった。

【０１３７】プロラクチン受容体〔Cunninghamら, Scie
nce 250: 1709-1712 (1990)〕の２１１残基の細胞外ド
メインを用いて、上記のように固定化hＰＲＬbp（「hＰ
ＲＬbp-ビーズ」）を調製した。５０μMの亜鉛の存在下
での〔¹²⁵Ｉ〕hＧＨとの競合結合実験により、１μlの
ビーズ懸濁液あたり２.１fモルの機能的hＰＲＬbpが結
合することがわかった。

【０１３８】「ブランクビーズ」は、オキシラン-アク
リルアミドビーズを０.６Ｍエタノールアミン（ｐH９.
２）により４℃で１５時間処理することによって調製し
た。

【０１３９】固定化hＧＨbpおよびhＰＲＬbpを用いる結
合選択 ビーズに対するホルモン−ファージの結合を、次の緩衝
液のいずれかにおいて実施した：hＧＨbpおよびブラン
クビーズを用いる選択に対しては緩衝液Ａ〔ＰＢＳ、
０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、０.０１％チ
メロサール〕；亜鉛の存在下（＋Ｚn²⁺）にhＰＲＬbpを
用いる選択に対しては緩衝液Ｂ〔５０mMトリス（ｐH７.
５）、１０mM ＭgＣl₂、０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツ
イーン２０、１００mM ＺnＣl₂〕；または、亜鉛の非存
在下（＋ＥＤＴＡ）にhＰＲＬbpを用いる選択に対して
は緩衝液Ｃ〔ＰＢＳ、０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツイ
ーン２０、０.０１％チメロサール、１０mM ＥＤＴ
Ａ〕。結合選択は、次の経路のそれぞれに従って実施し
た：(1)ブランクビーズに対する結合、(2)hＧＨbp-ビー
ズに対する結合、(3)hＰＲＬbp-ビーズに対する結合
（＋Ｚn²⁺）、(4)hＰＲＬbp-ビーズに対する結合（＋Ｅ
ＤＴＡ）、(5)hＧＨbpビーズによる２回の予備吸着とそ
の後の未吸着分画のhＰＲＬbp-ビーズへの結合（「−h
ＧＨbp、＋hＰＲＬbp」選択）、または(6)hＰＲＬbp-ビ
ーズによる２回の予備吸着とその後の未吸着分画のhＧ
Ｈbp-ビーズへの結合（「−hＰＲＬbp、＋hＧＨbp」選
択）。後者の２つの操作は、それぞれhＰＲＬbpと結合
するがhＧＨbpとは結合しない突然変異体、またはhＧＨ
bpと結合するがhＰＲＬbpとは結合しない突然変異体を
豊富化するものと予想される。各サイクルにおけるファ
ージの結合と溶離は、次のように実施した：

【０１４０】１．結合：ホルモンファージの一部（通常
は１０⁹〜１０¹⁰ＣＦＵ）を等量の非ホルモンファージ
（pＣＡＴ）と混合し、適当な緩衝液（Ａ、Ｂまたは
Ｃ）で希釈し、１.５mlのポリプロピレン試験管におい
て２００mlの総容量でhＧＨbp、hＰＲＬbpまたはブラン
クビーズの懸濁液（１０ml）と混合した。このファージ
を、ゆっくり回転（約７rpm）させながら室温（２３
℃）で１時間インキュベートすることによってビーズと
結合させた。以下の工程は、２００μlの一定容量を用
い、室温で行なった。

【０１４１】２．洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上
清を除去した。非特異的に結合したファージ数を減少さ
せるため、このビーズを適当な緩衝液に短時間再懸濁す
ることにより５回洗浄し、次いでペレット化した。

【０１４２】３．hＧＨ溶離：ビーズに弱く結合したフ
ァージを、hＧＨによる溶離によって除去した。このビ
ーズを４００nM hＧＨ含有の適当な緩衝液と共に１５〜
１７時間回転させた。この上清を「hＧＨ溶出液」およ
びビーズとした。このビーズを緩衝液に短時間再懸濁
し、ペレット化することによって洗浄した。

【０１４３】４．グリシン溶離：最も強固に結合したフ
ァージ（即ち、hＧＨ洗浄後になお結合しているファー
ジ）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液〔緩衝液
Ａに０.２Mグリシンを追加し、ＨＣlでｐH２.０にす
る〕に懸濁させ、１時間回転させ、ペレット化した。こ
の上清（「グリシン溶出液」；２００μl）を、１Mトリ
ス塩基（３０ml）の添加によって中和し、４℃で保存し
た。

【０１４４】５．増殖：各組の条件のもと各組のビーズ
からのhＧＨ溶出液およびグリシン溶出液の一部を用い
て対数増殖期のＸＬ１-Ｂlue細胞の独立した培養物を感
染させた。形質導入は、ファージをＸＬ１-Ｂlue細胞
（１ml）と混合し、３７℃で２０分間インキュベート
し、次いでＫ０７（moi＝１００）を加えることによっ
て行なった。培養物（２５mlの２ＹＴとカルベニシリ
ン）を上記のように増殖させ、ファージの次のプールを
上記のように調製した。

【０１４５】ファージの結合、溶離および増殖を、上記
のサイクルに従って、連続ラウンドで行なった。例え
ば、hＧＨbpビーズからのhＧＨ溶出液から増幅したファ
ージをhＧＨbpビーズでもう一度選択し、hＧＨで溶離
し、次いでＸＬ１-Ｂlue細胞の新鮮培養物の感染に用い
た。上記の選択法のそれぞれに対して５ラウンドの選択
および増殖の３ラウンドを実施した。

【０１４６】選択したファージミドのＤＮＡ配列決定 各サイクルのhＧＨおよびグリシン溶離工程からのファ
ージの一部をＸＬ１-Ｂlue細胞の接種に用い、これをカ
ルベニシリンおよびテトラサイクリン含有のＬＢ培地に
プレーティングして各ファージプールに由来する独立し
たクローンを得た。単離したコロニーから１本鎖ＤＮＡ
を調製し、突然変異カセット領域の配列決定を行なっ
た。このＤＮＡ配列決定の結果を、図５、図６、図７お
よび図８に推定アミノ酸配列としてまとめる。

【０１４７】hＧＨ突然変異体の発現および検定 hＧＨbpに対する選択したhＧＨ突然変異体の一部の結合
親和性を測定するため、配列決定したクローン由来のＤ
ＮＡを大腸菌株１６Ｃ９に導入した。上記のように、こ
の株は非サプレッサー株であり、hＧＨの最後のＰhe-１
９１残基の後でタンパク質の翻訳を終止させる。１本鎖
ＤＮＡをこれらの形質転換に用いたが、２本鎖ＤＮＡま
たは全ファージであっても、遊離ホルモンの発現用の非
サプレッサー株中に容易に電気穿孔導入することができ
る。

【０１４８】hＧＨの突然変異体は、hＧＨについて記載
されているように、硫酸アンモニウム沈澱により浸透圧
ショックを与えた細胞から調製した〔Olsonら, Nature
293:408-411 (1981)〕。また、タンパク質濃度は、hＧ
Ｈを標準として用いて、クーマシー染色ＳＤＳ-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動ゲルのレーザー・デンシトメ
トリーによって測定した〔CunninghamおよびWells, Sci
ence 244: 1081-1085(1989)〕。

【０１４９】各突然変異体の結合親和性は、抗-受容体
モノクローナル抗体（Ｍab２６３）を用い、文献〔Spen
cerら, J.Biol.Chem. 263: 7862-7867 (1988); Fuhら,
J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕記載のように
¹²⁵Ｉ hＧＨを置換することによって測定した。

【０１５０】異なる経路（図６）によって選択したhＧ
Ｈ突然変異体数の結果を表VIIに示す。これら突然変異
体の多くが、hＧＨbpに対して野生型hＧＨよりも強い結
合親和性を有している。最も改善された突然変異体であ
るＫＳＹＲは、野生型hＧＨよりも５.６倍高い結合親和
性を有している。これら検定した突然変異体の中で選択
された最も弱い突然変異体は、hＧＨに比べて結合親和
性が約１０倍低いものでしかなかった。

【０１５１】結合検定は、hＰＲＬbp-結合に対して選択
した突然変異体について実施することもできる。

【０１５２】表VII. hＧＨbpに対する競合結合 それぞれの突然変異体が見い出された選択したプール
を、１Ｇ（第１のグリシン選択）、３Ｇ（第３のグリシ
ン選択）、３Ｈ（第３のhＧＨ選択）、３*（第３の選
択：hＰＲＬbpに結合しなかったがhＧＨbpに結合した）
と表示する。配列決定したすべてのクローンの中に現れ
る各突然変異体の回数を（ ）に示す。 突然変異体 Ｋd (nM) Ｋd（突然変異体） プール ／Ｋd（hＧＨ） ＫＳＹＲ(６) ０.０６＋０.０１ ０.１８ １Ｇ、３Ｇ ＲＳＦＲ ０.１０＋０.０５ ０.３０ ３Ｇ ＲＡＹＲ ０.１３＋０.０４ ０.３７ ３* ＫＴＹＫ(２) ０.１６＋０.０４ ０.４７ Ｈ、３Ｇ ＲＳＹＲ(３) ０.２０＋０.０７ ０.５８ １Ｇ、３Ｈ、３Ｇ ＫＡＹＲ(３) ０.２２＋０.０３ ０.６６ ３Ｇ ＲＦＦＲ(２) ０.２６＋０.０５ ０.７６ ３ＨＫＱＹＲ ０.３３＋０.０３ １.０ ３ＧＫＥＦＲ＝wt(９) ０.３４＋０.０５ １.０ ３Ｈ、３Ｇ、３* ＲＴＹＨ ０.６８＋０.１７ ２.０ ３Ｈ ＱＲＹＲ ０.８３＋０.１４ ２.５ ３* ＫＫＹＫ １.１ ＋０.４ ３.２ ３* ＲＳＦＳ(２) １.１ ＋０.２ ３.３ ３Ｇ、*ＫＳＮＲ ３.１ ＋０.４ ９.２ ３*

【０１５３】結合に及ぼす加成および非加成効果 一部の残基において、特定アミノ酸の置換が周囲残基と
は独立した実質的に同じ作用を有している。例えば、１
７２Ｒ／１７４ＳのバックグラウンドにおいてＦ１７６
Ｙの置換は結合親和性を２.０倍減少させる（ＲＳＦＲ
対ＲＳＹＲ）。同様に、１７２Ｋ／１７４Ａのバックグ
ラウンドにおいてＦ１７６Ｙ突然変異体（ＫＡＹＲ）の
結合親和性は、対応する１７６Ｆ突然変異体〔ＫＡＦ
Ｒ；CunninghamおよびWells (1989)〕よりも２.９倍弱
い。

【０１５４】他方、いくつかの選択したhＧＨ突然変異
体について測定した結合定数は、残基１７２、１７４、
１７６および１７８における一部のアミノ酸置換の非加
成性の効果を示す。例えば、１７２Ｋ／１７６Ｙのバッ
クグラウンドにおいて、Ｅ１７４Ｓの置換は、Ｅ１７４
Ａを含有する対応する突然変異体（ＫＡＹＲ）よりも
３.７倍強固にhＧＨbpと結合する突然変異体（ＫＳＹ
Ｒ）を与える結果になる。しかし、１７２Ｒ／１７６Ｙ
のバックグラウンドにおいて、これらＥ１７４置換の効
果は逆になる。この場合、Ｅ１７４Ａ突然変異体（ＲＡ
ＹＲ）はＥ１７４Ｓ突然変異体（ＲＳＹＲ）よりも１.
５倍強固に結合する。

【０１５５】このような近接残基における置換の結合に
及ぼす非加成性効果は、いくつかの位置においてランダ
ム化されたライブラリーから最適突然変異体を選択する
手段としてのタンパク質-ファージ結合選択の用途を示
すものである。詳細な構造の情報が存在せず、このよう
な選択法がないと、最適突然変異体の発見までに多数の
置換の組合せが試されることになるであろう。

【０１５６】実施例IX ホルモン−ファージのヘリック
ス１ランダムカセットライブラリーからのhＧＨ突然変
異体の選択

【０１５７】実施例VIIIに記載した方法を用いて、hＧ
Ｈbpおよび／またはhＰＲＬbpへの結合に関与しているh
ＧＨの別の領域、即ちヘリックス１の残基１０、１４、
１８、２１をphＧＨam-g３pベクター（pＳ０６４３とし
ても知られている；実施例VIIIを参照）におけるランダ
ム突然変異誘発の標的とした。

【０１５８】我々は「アンバー」hＧＨ-g３構築物（ph
ＧＨam-g３pと呼ぶ）の使用を選択したが、この理由は
それが結合に対してより接近しやすい標的タンパク質h
ＧＨを作成するようであるためである。このことは、モ
ノクローナル抗体結合の比較ＥＬＩＳＡ検定からのデー
タによって支持される。pＳ０１３２〔S.Bass, R.Green
e, J.A.Wells, Proteins 8: 306 (1990)〕およびphＧＨ
am-g３の両方から生成したファージを、hＧＨのカルボ
キシ末端の近くに結合決定基を有することが知られてい
る３種の抗体（Medix２、１Ｂ５.Ｇ２、および５Ｂ７.
Ｃ１０）〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wel
ls, Science 243: 1330 (1989); B.C.Cunninghamおよび
J.A.Wells, Science 244: 1081 (1989); L.JinおよびJ.
Wells（未公表の結果）〕、ならびにヘリックス１およ
び３中の決定基を認識する１種の抗体（Medix１）〔B.
C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science
243: 1330 (1989); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, S
cience 244: 1081 (1989)〕を用いて試験した。phＧＨa
m-g３からのファージミド粒子は、pＳ０１３２からのフ
ァージミド粒子よりも抗体Medix２、１Ｂ５.Ｇ２および
５Ｂ７.Ｃ１０とさらに強く反応した。特に、pＳ０１３
２粒子の結合は、Medix１に対する結合と比較して、Med
ix２および５Ｂ７.Ｃ１０の両方に対しては＞２０００
倍減少し、１Ｂ５.Ｇ２に対しては＞２５倍減少した。
一方、phＧＨam-g３ファージの結合は、Medix１に対す
る結合と比較して、Medix２、１Ｂ５.Ｇ２および５Ｂ
７.Ｃ１０抗体に対してそれぞれ約１.５倍、１.２倍お
よび２.３倍弱くなるにすぎなかった。

【０１５９】カセット突然変異誘発によるヘリックス１
ライブラリーの作成 アラニン-スキャニング突然変異誘発〔B.C.Cunningham,
P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (19
89); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1
081 (1989)，15, 16〕によって以前に同定されていたヘ
リックス１中の残基に突然変異を行なって、hＧＨおよ
び／またはhＰＲＬ受容体（それぞれ、hＧＨbpおよびh
ＰＲＬbpと呼ぶ）の細胞外ドメインの結合を変調させ
た。カセット突然変異誘発は実質的に文献〔J.A.Wells,
M.Vasser, D.B.Powers, Gene 34:315 (1985)〕記載の
ように行なった。このライブラリーは、オリゴヌクレオ
チド： 5'-GCC TTT GAC AGG TAC CAG GAG TTT G-3' および 5'-CCA ACT ATA CCA CTC TCG AGG TCT ATT CGA TAA C-
3' をそれぞれ用いる突然変異誘発によって唯一のＫpnＩ
（hＧＨコドン２７のところ）およびＸhoＩ（hＧＨコド
ン６のところ）制限部位（下線部）が挿入されたphＧＨ
am-g３〔T.A.Kunkel, J.D.Roberts, R.A.Zakour, Metho
ds Enzymol. 154:367-382〕の突然変異体を用いる、４
残基を一度にすべて突然変異させるカセット突然変異誘
発（実施例VIIIを参照）によって作成した。また、後者
のオリゴは＋１のフレームシフト（下線部の最後のＧ）
を導入し、これが出発ベクターからの翻訳を終止させ、
ファージミドライブラリー中の野生型のバックグラウン
ドを最少にした。この出発ベクターをｐH０５０８Ｂと
命名した。hＧＨ残基１０、１４、１８、２１を突然変
異させたヘリックス１ライブラリーは、相補性オリゴヌ
クレオチド： 5'-pTCG AGG CTC NNS GAC AAC GCG NNS CTG CGT GCT NN
S CGT CTT NNS CAGCTG GCC TTT GAC ACG TAC-3' および 5'-pGT GTC AAA GGC CAG CTG SNN AAG ACG SNN AGC ACG
CAG SNN CGC GTTGTC SNN GAG CC-3' から調製したカセットを、ｐH０５０８Ｂの大きいＸho
Ｉ−ＫpnＩフラグメントに連結することによって作成し
た。このＫpnＩ部位は連結生成物の連結部において破壊
され、非突然変異バックグラウンドの分析に制限酵素消
化を使用することを可能にした。

【０１６０】このライブラリーは少なくとも１０⁷の別
個の形質転換体を含んでおり、このライブラリーが完全
にランダム（１０⁶の異なるコドン組合せ）であるとき
には、平均して約１０コピーのそれぞれ可能な突然変異
hＧＨ遺伝子が得られる。ＫpnＩを用いる制限分析によ
り、ヘリックス１ライブラリー構築物の少なくとも８０
％が挿入されたカセットを含有していることがわかっ
た。

【０１６１】このライブラリーからのhＧＨ-ファージの
結合豊富化を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン
-ポリアクリルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上
に固定化したhＧＨbpを用いて行なった。ヘリックス１
中の４つの残基（Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８およびＨ２
１）が同じように突然変異され、４および６サイクル後
に非野生型コンセンサスが現れた（表VIII）。ヘリック
ス１の疎水性面の１０位は疎水性である傾向にあり、一
方、親水性面の２１および１８位は傾向的にＡsnが優勢
であり、１４位には明白なコンセンサスが認められなか
った（表IX）。

【０１６２】hＧＨbpに対するこれらhＧＨ突然変異体の
結合定数は、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９中で遊離
のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製
し、そしてhＧＨbpからの標識化wt-hＧＨの競合置換に
より検定することによって測定した（実施例VIIIを参
照）。示したように、いくつかの突然変異体がwt-hＧＨ
が結合するよりもhＧＨbpに強く結合する。

【０１６３】表VIII．hＧＨヘリックス１突然変異体の
選択 ファージミド粒子上に発現されたhＧＨ変異体（残基Ｆ
１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１においてランダム突然変
異）を、hＧＨbp-ビーズへの結合、およびhＧＨ（０.４
mM）緩衝液と次いでグリシン（０.２M、ｐH２）緩衝液
による溶離によって選択した（実施例VIIIを参照）。 Ｇly溶離 Ｆ１０ Ｍ１４ Ｈ１８ Ｈ２１ ４サイクル Ｈ Ｇ Ｎ Ｎ Ａ Ｗ Ｄ Ｎ(2) Ｙ Ｔ Ｖ Ｎ Ｉ Ｎ Ｉ Ｎ Ｌ Ｎ Ｓ Ｈ Ｆ Ｓ Ｆ Ｇ ６サイクル Ｈ Ｇ Ｎ Ｎ(6) Ｆ Ｓ Ｆ Ｌ コンセンサス Ｈ Ｇ Ｎ Ｎ

【０１６４】表IX．選択したヘリックス１ライブラリー
からのコンセンサス配列 観察された頻度は、表示したアミノ酸を有する配列決定
した全クローンの分数である。名目頻度はＮＮＳの３２
コドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、あ
る残基に対する名目頻度値に依存して１１〜３２に変化
する。単一のアラニン突然変異に対する〔Ｋd（Ａla突
然変異体）／Ｋd（wt-hＧＨ）〕の値は、文献〔B.C.Cun
ninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081(1989)；
B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 24
7: 1461(1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407(1991)〕から採用した。 野生型 Ｋd(Ａla突然変異体) 選択した 頻度 残基 ／Ｋd(wt-hＧＨ) 残基 観察 名目 豊富化 Ｆ１０ ５.９ Ｈ ０.５０ ０.０３１ １７ Ｆ ０.１４ ０.０３１ ５ Ａ ０.１４ ０.０６２ ２ Ｍ１４ ２.２ Ｇ ０.５０ ０.０６２ ８ Ｗ ０.１４ ０.０３１ ５ Ｎ ０.１４ ０.０３１ ５ Ｓ ０.１４ ０.０９３ ２ Ｈ１８ １.６ Ｎ ０.５０ ０.０３１ １７ Ｄ ０.１４ ０.０３１ ５ Ｆ ０.１４ ０.０３１ ５ Ｈ２１ ０.３３ Ｎ ０.７９ ０.０３１ ２６ Ｈ ０.０７ ０.０３１ ２

【０１６５】表Ｘ．hＧＨbpに対する精製したhＧＨヘリ
ックス１突然変異体の結合 競合結合実験は、〔¹²⁵Ｉ〕hＧＨ（野生型）、hＧＨbp
（細胞外受容体ドメイン、残基１〜２３８を含む）、お
よびＭab２６３〔B.C.Cunningham, P.Jhurani,P.Ng, J.
A.Wells, Science 243: 1330 (1989)〕を用いて行なっ
た。数値Ｐは、１またはそれ以上の選択ラウンド後に配
列決定した全クローン中の各突然変異体の発生率を分数
で示すものである。 配列の位置 Ｐ Kd(nM)＼f（Kd突然変異体） Kd(wt-hGH) １０ １４ １８ ２１ Ｈ Ｇ Ｎ Ｎ ０.５０ ０.１４±０.０４ ０.４２ Ａ Ｗ Ｄ Ｎ ０.１４ ０.１０±０.０３ ０.３０ wt＝ Ｆ Ｍ Ｈ Ｈ ０ ０.３４±０.０５ (1) Ｆ Ｓ Ｆ Ｌ ０.０７ ０.６８±０.１９ ２.０ Ｙ Ｔ Ｖ Ｎ ０.０７ ０.７５±０.１９ ２.２ Ｌ Ｎ Ｓ Ｈ ０.０７ ０.８２±０.２０ ２.４ Ｉ Ｎ Ｉ Ｎ ０.０７ １.２ ±０.３１ ３.４

【０１６６】実施例Ｘ ホルモン−ファージの豊富化に
より予め見い出した突然変異を含むヘリックス４ランダ
ムカセットライブラリーからのhＧＨ変異体の選択ホルモン−ファージを用いる反復選択による改善された
結合性を有する突然変異タンパク質の設計 hＧＨ進化変異体の新入の非結合相同体を用いる我々の
実験から、多数の独立したアミノ酸置換を組合せること
によって特定受容体との結合に関してhＧＨの累積して
改善された突然変異体を得ることができると示唆される
〔B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 2
47: 1461 (1990); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991); H.B.Lowman,
B.C.Cunningham, J.A.Wells, J.Biol.Chem. 266, 印刷
中 (1991)〕。

【０１６７】hＧＨ受容体にさらに強固に結合すること
がわかったヘリックス４aライブラリーから選択したヘ
リックス４の二重突然変異体（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６
Ｙ；実施例VIIIを参照）をさらに改善する試みにおい
て、ヘリックス４bライブラリーを作成した。Ｅ１７４
Ｓ／Ｆ１７６Ｙ hＧＨ突然変異体をバックグラウンドの
出発ホルモンとして用いて、ヘリックス４の親水性面上
の１７４および１７６位の周りの残基に突然変異を行な
った。

【０１６８】カセット突然変異誘発によるヘリックス４
bライブラリーの作成 実質的に文献〔J.A.Wells, M.Vasser, D.B.Powers, Gen
e 34: 315 (1985)〕記載のようにしてカセット突然変異
誘発を行なった。唯一のＢstＥIIおよびＢglII制限部位
が予め挿入されたphＧＨam-g３（実施例VIII）の突然変
異体を用い、４残基を一度にすべて突然変異させるカセ
ット突然変異誘発（実施例VIIIを参照）を用いて、Ｅ１
７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙバックグラウンド内で残基１６７、
１７１、１７５および１７９を突然変異させたヘリック
ス４bライブラリーを作成した。相補性オリゴヌクレオ
チド： 5'-pG TTA CTC TAC TGC TTC NNS AAG GAC ATG NNS AAG
GTC AGC NNS TACCTG CGC NNS GTG CAG TGC A-3' および 5'-pGA TCT GCA CTG CAC SNN GCG CAG GTA SNN GCT GAC
CTT SNN CAT GTCCTT SNN GAA GCA GTA GA-3' から調製したカセットを、ベクターのＢstＥII−ＢglII
部位に挿入した。このＢstＥII部位は連結したカセット
において削除された。このヘリックス４bライブラリー
由来の１５の選択されなかったクローンを配列決定し
た。これらのうち、カセット挿入体を欠くものはなく、
２０％がフレームシフトしており、７％が非サイレント
突然変異を有していた。

【０１６９】hＧＨbp豊富化の結果 このライブラリーからのhＧＨ-ファージの結合豊富化
を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン-ポリアク
リルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上に固定化し
たhＧＨbpを用いて行なった。６サイクルの結合の後
に、合理的かつ明白なコンセンサスが現れた（表XI）。
興味あることに、すべての位置が極性の残基、特にＳe
r、ＴhrおよびＡsnを含有する傾向があった（表XII）。

【０１７０】hＧＨ突然変異体の検定 hＧＨbpに対するこれらhＧＨ突然変異体の一部の結合定
数を、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９中で遊離のホル
モン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し、そし
てhＧＨbpからの標識化wt-hＧＨの競合置換により検定
することによって測定した（実施例VIIIを参照）。示し
たように、いくつかのヘリックス４b突然変異体のhＧＨ
bpに対する結合親和性はwt-hＧＨのものよりも強固であ
った（表XIII）。

【０１７１】hＧＨ変異体の受容体選択性 最後に、我々は、hＰＲＬbpに結合する能力について、
いくつかの一層強固なhＧＨbp結合突然変異体の結合親
和性の分析を始めた。Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ突然変異
体は、hＧＨに比べてhＰＲＬbpに２００倍弱く結合す
る。Ｅ１７４Ｔ／Ｆ１７６Ｙ／Ｒ１７８ＫおよびＲ１６
７Ｎ／Ｄ１７１Ｓ／Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ／Ｉ１７９
Ｔ突然変異体のそれぞれは、hＧＨに比べhＰＲＬbpに＞
５００倍弱く結合する。即ち、ファージ表示法によって
hＧＨの新規な受容体選択性突然変異体を得ることがで
きる。

【０１７２】ホルモン−ファージミド選択によって同定
される特定残基の情報内容 ３種のhＧＨ−ファージミドライブラリー（実施例VII
I、IX、Ｘ）において突然変異させた１２残基のうち、
４種が野生型残基の強い（他を排除するものではない）
保存を示した（Ｋ１７２、Ｔ１７５、Ｆ１７６およびＲ
１７８）。驚くべきことではないが、Ａlaに変換したと
きにhＧＨbpに対する結合親和性に最大の破壊（４〜６
０倍）を引き起こす残基が存在した。Ａla置換が結合に
対してより弱い作用（２〜７倍）を引き起こす一群の４
個の他の残基（Ｆ１０、Ｍ１４、Ｄ１７１およびＩ１７
９）が存在し、これらの位置はわずかの野生型コンセン
サスしか示さなかった。最後に、hＰＲＬbpへの結合を
促進したがhＧＨbpへの結合は促進しなかった別の４残
基（Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７およびＥ１７４）は、h
ＧＨbp-ビーズによる選択によって野生型hＧＨ配列に対
してどのようなコンセンサスも示さなかった。事実、２
つの残基（Ｅ１７４およびＨ２１）は、Ａla置換したと
きにhＧＨbpに対する結合親和性を２〜４倍に高める
〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Scie
nce 243: 1330 (1989)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Well
s, Science 244: 1081 (1989)；B.C.Cunningham, D.J.H
enner, J.A.Wells, Science 247: 1461 (1990)；B.C.Cu
nninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl .Acad.Sci.USA 8
8: 3407 (1991)〕。即ち、アラニン-スキャニング突然
変異誘発データは、それぞれの位置を置換する可変性と
十分合理的に関係している。事実、アラニン置換によっ
て引き起こされる結合親和性の減少〔B.C.Cunningham,
P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (198
9)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 10
81 (1989)；B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells,
Science 247: 1461 (1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.
Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991)〕
は、３〜６ラウンドの選択後にファージミドプール中に
野生型残基が見い出される割合を合理的に予言するもの
となる。アラニン-スキャニングの情報は結合を変調さ
せる側鎖を標的化するのに有用であり、ファージ選択は
側鎖の最適化に、および置換のための各部位（および／
または部位の組合せ）の可変性を定義するのに適してい
る。スキャニング突然変異法〔B.C.Cunningham, P.Jhur
ani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.
C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (19
89)〕とファージ表示の組合せは、受容体−リガンドの
界面の設計およびインビトロでの分子進化の研究に対す
る強力な手段である。

【０１７３】ホルモン−ファージミドライブラリーの反
復豊富化の変異 hＧＨ中の組合せ突然変異が受容体に対する結合親和性
に加成効果を有している場合には、結合を改良するため
のホルモン−ファージミド豊富化により既知となった突
然変異を、単に制限フラグメントの切断と連結または突
然変異誘発によって組合わせてhＧＨの累積して最適化
された突然変異体を得ることができる。

【０１７４】一方、受容体結合を最適化するhＧＨの１
つの領域における突然変異が、分子の重なり合うかまた
は別の領域における突然変異と構造的または機能的に適
合しないこともある。このような場合には、以下に挙げ
る反復豊富化法のいくつかの変法のいずれかによってホ
ルモン−ファージミド豊富化を行なうことができる：
(1)カセットまたは他の突然変異誘発法によって分子の
２つ（または、恐らくはそれ以上）の領域のそれぞれに
おいてランダムＤＮＡライブラリーを創製することがで
きる：次いで、これら２つのＤＮＡライブラリーからの
制限フラグメントの連結によって混合ライブラリーを創
製することができる；(2)分子の１つの領域における突
然変異により結合を最適化されたhＧＨ変異体を、ヘリ
ックス４bライブラリーの例のように分子の第２の領域
においてランダムに突然変異させることができる；(3)
２またはそれ以上のランダムライブラリーを、ホルモン
−ファージミド豊富化により、改善された結合について
部分的に選択することができる：この最適化結合部位の
「粗選択」の後、なお部分的な別のライブラリーを制限
フラグメントの連結によって再混合して、分子の２また
はそれ以上の領域において部分的に異なっている単一の
ライブラリーを得ることができ、次いでこのライブラリ
ーをホルモン−ファージミド豊富化を用いて最適化結合
についてさらに選択することができる。

【０１７５】表XI．４および６サイクルの豊富化の後に
ヘリックス４bライブラリーから選択したhＧＨの突然変
異ファージミド それぞれがＥ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ二重突然変異を含む
hＧＨヘリックス４b突然変異体（残基１６７、１７１、
１７５、１７９においてランダム突然変異）を、hＧＨb
p-ビーズへの結合、およびhＧＨ（０.４mM）緩衝液と次
いでグリシン（０.２M、ｐH２）緩衝液による溶離によ
って選択した。１つの突然変異体（＋）が疑突然変異Ｒ
１７８Ｈを含んでいた。

【０１７６】 Ｒ１６７ Ｄ１７１ Ｔ１７５ Ｉ１７９ ４サイクル Ｎ Ｓ Ｔ Ｔ Ｋ Ｓ Ｔ Ｔ Ｓ Ｎ Ｔ Ｔ Ｄ Ｓ Ｔ Ｔ Ｄ Ｓ Ｔ Ｔ＋ Ｄ Ｓ Ａ Ｔ Ｄ Ｓ Ａ Ｎ Ｔ Ｄ Ｔ Ｔ Ｎ Ｄ Ｔ Ｎ Ａ Ｎ Ｔ Ｎ Ａ Ｓ Ｔ Ｔ ６サイクル Ｎ Ｓ Ｔ Ｔ(2) Ｎ Ｎ Ｔ Ｔ Ｎ Ｓ Ｔ Ｑ Ｄ Ｓ Ｓ Ｔ Ｅ Ｓ Ｔ Ｉ Ｋ Ｓ Ｔ Ｌ コンセンサス Ｎ Ｓ Ｔ Ｔ Ｄ Ｎ

【０１７７】表XII．選択したライブラリーからのコン
センサス配列 観察された頻度は、表示したアミノ酸を有する配列決定
した全クローンの分数である。名目頻度はＮＮＳの３２
コドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、あ
る残基に対する名目頻度値に依存して１１〜１６〜３２
に変化する。単一のアラニン突然変異に対する〔Ｋd
（Ａla突然変異体）／Ｋd（wt-hＧＨ）〕の値は、以下
の文献から採用した；１７５位に対してはＴ１７５Ｓ突
然変異体の値のみ〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng,
J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.C.Cunningh
amおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)；B.C.C
unningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 146
1 (1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991)〕。

【０１７８】 野生型 Ｋd(Ａla突然変異体) 選択した 頻度 残基 ／Ｋd(wt-hＧＨ) 残基 観察 名目 豊富化 Ｒ１６７ ０.７５ Ｎ ０.３５ ０.０３１ １１ Ｄ ０.２４ ０.０３１ ８ Ｋ ０.１２ ０.０３１ ４ Ａ ０.１２ ０.０６２ ２ Ｄ１７１ ７.１ Ｓ ０.７６ ０.０９３ ８ Ｎ ０.１８ ０.０３１ ６ Ｄ ０.１２ ０.０３１ ４ Ｔ１７５ ３.５ Ｔ ０.８８ ０.０６２ １４ Ａ ０.１２ ０.０３１ ４ Ｉ１７９ ２.７ Ｔ ０.７１ ０.０６２ １１ Ｎ ０.１８ ０.０３１ ６

【０１７９】表XIII．hＧＨbpに対する精製したhＧＨ突
然変異体の結合 競合結合実験は、〔¹²⁵Ｉ〕hＧＨ（野生型）、hＧＨbp
（細胞外受容体ドメイン、残基１〜２３８を含む）、お
よびＭab２６３(11)を用いて行なった。数値Ｐは、１ま
たはそれ以上の選択ラウンド後に配列決定した全クロー
ン中の各突然変異体の発生率を分数で示すものである。
ヘリックス４b突然変異（*）はhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ
１７６Ｙ）のバックグラウンドにあることに注意すべき
である。このヘリックス４b突然変異のリストにおい
て、１６７、１７１、１７５、１７９にwt残基を有する
Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ突然変異体（*）は下線で示
す。

【０１８０】 配列の位置 Ｐ Ｋd(nM) Ｋd(Ａla突然変異体) ／Ｋd(wt-hＧＨ) ＊ ＊ ＊ ＊１６７ １７１ １７５ １７９ Ｎ Ｓ Ｔ Ｔ ０.１８ ０.０４±０.０２ ０.１２ Ｅ Ｓ Ｔ Ｉ ０.０６ ０.０４±０.０２ ０.１２ Ｋ Ｓ Ｔ Ｌ ０.０６ ０.０５±０.０３ ０.１６ Ｎ Ｎ Ｔ Ｔ ０.０６ ０.０６±０.０３ ０.１７ Ｒ Ｄ Ｔ Ｉ ０ ０.０６±０.０１ （０.１８） Ｎ Ｓ Ｔ Ｑ ０.０６ ０.２６±０.１１ ０.７７

【０１８１】実施例XI ファージミド表面におけるＦab
分子の組立てプラスミドの構築 プラスミドpＤＨ１８８は、ＨＥＲ-２受容体を認識する
４Ｄ５と呼ばれるヒト化ＩgＧ抗体のＦab部分をコード
しているＤＮＡを含有する。このプラスミドは大腸菌株
ＳＲ１０１中に含まれ、ＡＴＣＣ〔Rockville, MD〕に
寄託されている。

【０１８２】簡単に説明すると、このプラスミドは次の
ようにして調製された。出発プラスミドは、上記のアル
カリホスファターゼプロモーターを含有するpＳ０１３
２である。ヒト成長ホルモンをコードしているＤＮＡを
切り出し、プラスミドの末端を連結に適合するようにす
る一連の操作を行なった後、４Ｄ５をコードしているＤ
ＮＡを挿入した。この４Ｄ５ ＤＮＡは２つの遺伝子を
含有している。第１の遺伝子は、軽鎖の可変および不変
領域をコードしており、その５′末端にstIIシグナル配
列をコードしているＤＮＡを含有する。第２の遺伝子は
４つの部分を含有し、その第１は５′末端のstIIシグナ
ル配列をコードしているＤＮＡである。これに重鎖の可
変ドメインをコードしているＤＮＡが続き、次いで重鎖
不変領域の第１ドメインをコードしているＤＮＡが続
き、さらにＭ１３遺伝子IIIをコードしているＤＮＡが
続く。この構築物の顕著な特徴が図１０に示されてい
る。４Ｄ５をコードしているＤＮＡの配列を図１１に示
す。

【０１８３】大腸菌の形質転換およびファージの生成 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および電気穿孔の両
方を用いて、ＳＲ１０１細胞にプラスミドを導入した。
ＰＥＧコンピテントな細胞は、ChungおよびMiller〔Nuc
leic Acids Res. 16: 3580 (1988)〕の方法に従って調
製し、形質転換した。電気穿孔にコンピテントな細胞
は、ZabarovskyおよびWinberg〔Nucleic A cids Res. 1
8: 5912 (1990)〕の方法に従って調製し、次いで電気穿
孔により形質転換した。ＳＯＣ培地〔Sambrookら（上
記）が記載〕(１ml)に細胞を蒔いた後、振盪しながら３
７℃で１時間増殖させた。この時点で、細胞濃度をＯＤ
₆₀₀の光分散を用いて測定した。滴定したＫＯ７ファー
ジストックを加えて感染多重度（ＭＯＩ）が１００とな
るようにし、このファージを室温で２０分間、細胞に付
着させた。次いで、この混合物を２ＹＴブロス〔Sambro
okら（上記）が記載〕(２５ml）中に希釈し、振盪しな
がら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、５０００
ｘｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化
し、上清を集め、０.５Ｍ ＮaＣlおよび４％ＰＥＧ（最
終濃度）を用いて室温で１０分間、ファージ粒子を沈澱
させた。１０,０００ｘｇで１０分間遠心することによ
ってファージ粒子をペレット化し、ＴＥＮ〔１０mMトリ
ス（ｐH７.６）、１mM ＥＤＴＡ、および１５０mM Ｎa
Ｃl〕(１ml)に再懸濁し、４℃で保存した。

【０１８４】抗原被覆したプレートの調製 ０.１M炭酸水素ナトリウム（ｐH８.５）中のＢＳＡ（対
照抗原）の０.５mg/ml溶液またはＨＥＲ−２抗原の細胞
外ドメイン（ＥＤＣ）の０.１mg/ml溶液からの０.５ml
づつを用いて、Falcon１２ウエル組織培養プレートのウ
エルを被覆した。溶液をウエルに適用した後、このプレ
ートを揺れ台の上にて４℃で一晩インキュベートした。
次いで、最初の溶液を除去し、ブロック緩衝液〔０.１M
炭酸水素ナトリウム中に３０mg/ml ＢＳＡ〕(０.５ml）
を適用し、そして室温で１時間インキュベートすること
によって、プレートをブロックした。最後に、このブロ
ック緩衝液を除去し、緩衝液Ａ〔ＰＢＳ、０.５％ＢＳ
Ａ、および０.０５％ツイーン２０〕(１ml）を加え、そ
してこのプレートをファージ選択に使用するまで４℃で
１０日間まで保存した。

【０１８５】ファージの選択法 約１０⁹のファージ粒子を１００倍過剰のＫＯ７ヘルパ
ーファージおよび緩衝液Ａ（１ml）と混合した。この混
合物を０.５mlづつ２つに分け、その１つをＥＣＤ被覆
ウエルに適用し、他方をＢＳＡ被覆ウエルに適用した。
これらのプレートを振盪させながら室温で１〜３時間イ
ンキュベートし、次いで緩衝液Ａ（１mlづつ）を用いて
３０分間、３回洗浄した。プレートからのファージの溶
離は次の２つの方法のいずれかにより室温で行なった：
(1)０.０２５mg/mlの精製Ｍu４Ｄ５抗体（ネズミ）の最
初の一晩インキュベートとそれに続いて酸溶離緩衝液
〔０.２Mグリシン（ｐH２.１）、０.５％ＢＳＡ、およ
び０.０５％ツイーン２０〕(０.４ml）による３０分間
インキュベート、または(2)酸溶離緩衝液単独によるイ
ンキュベート。次いで、溶出液を１Mトリス塩基で中和
し、ＴＥＮ（０.５mlづつ）を加えた。次に、これら試
料を増殖させ、滴定し、４℃で保存した。

【０１８６】ファージの増殖 溶出したファージの一部を２ＹＴブロス（０.４ml）に
加え、約１０⁸の中間対数期雄性大腸菌株ＳＲ１０１と
混合した。ファージを室温で２０分間、細胞に付着さ
せ、次いで５０μg/mlカルベニシリンおよび５μg/mlテ
トラサイクリンを含有する２ＹＴブロス（５ml）に加え
た。これら細胞を、中間対数相に到達するまで３７℃で
４〜８時間増殖させた。ＯＤ₆₀₀を測定し、細胞をファ
ージ生成用のＫＯ７ヘルパーファージに重感染させた。
ファージ粒子を得た後、これらを滴定してコロニー形成
単位（cfu）数を測定した。これは、あるファージスト
ックの連続希釈液の一部を取り、中間対数期のＳＲ１０
１に感染させ、５０νg／mlカルベニシリン含有のＬＢ
プレートにプレーティングすることにより行なった。

【０１８７】ＲＩＡ親和性の測定 ＥＣＤ抗原に対するＦabファージおよびh４Ｄ５ Ｆabフ
ラグメントの親和性を、競合受容体結合ＲＩＡ〔Burt,
D.R., Receptor Binding in Drug Research, O'Brien,
R.A.（編）, pp.3-29, Dekker, New York (1986)〕を用
いて測定した。このＥＣＤ抗原は連続クロラミン-Ｔ法
〔De Larco,J.E.ら, J.Cell.Physiol. 109:143-152 (19
81)〕を用いて¹²⁵Ｉで標識した。これにより、受容体１
モルあたり０.４７モルのヨウ素が導入された１４μCi/
μgの比活性を有する放射活性トレーサーが得られた。
０.５ng（ＥＬＩＳＡによる）のＦabまたはＦabファー
ジ、５０nCiの¹²⁵Ｉ-ＥＣＤトレーサー、およびある範
囲量の未標識ＥＣＤ（６.４ng〜３２７７ng）を含有す
る一連の０.２ml溶液を調製し、室温で一晩インキュベ
ートした。標識化ＥＣＤ-ＦabまたはＥＣＤ-Ｆabファー
ジ コンプレックスを、抗ヒトＩgＧ（Fitzgerald 40-GH
23）と６％ＰＥＧ８０００の添加により誘導される集合
コンプレックスを形成させることによって、未結合の標
識化抗原から分離した。このコンプレックスを遠心（１
５,０００ｘｇで２０分間）によってペレット化し、標
識化ＥＣＤの量（cpm）をガンマカウンターで測定し
た。解離定数（Ｋd）は、スカッチャード分析〔Scatcha
rd,G., Ann.N.Y.Acad.Sci. 51: 660-672 (1949)〕を用
いるプログラムＬＩＧＡＮＤの改良バージョン〔Munso
n,P.およびRothbard,D., Anal.Biochem. 107: 220-239
(1980)〕を用いて計算した。このＫd値を図１３に示
す。

【０１８８】競合細胞結合の検定 ロドゲン法を用い、¹²⁵Ｉによりネズミ４Ｄ５抗体を４
０〜５０μCi/μgの比活性に標識した。一定量の標識化
抗体と増加量の未標識変異Ｆabを含有する溶液を調製
し、９６ウエル微量滴定皿中のほぼ全面のＳＫ-ＢＲ-３
細胞培養物に加えた（標識化抗体の最終濃度は０.１nM
であった）。４℃で一晩インキュベートした後、上清を
除去し、細胞を洗浄し、細胞に結合した放射活性をガン
マカウンターで測定した。プログラムＬＩＧＡＮＤの改
良バージョン〔Munson,P.およびRothbard,D.（上記）〕
を用いてデータを分析することによってＫd値を決定し
た。

【０１８９】プラスミドpＤＨ１８８（ＡＴＣＣ Ｎo.６
８６６３）の寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的
承認に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブ
ダペスト条約）のもとに為されている。これにより、寄
託日から３０年間の生存微生物の維持が確保されてい
る。この微生物は、ブダペスト条約の条項のもとで、お
よびジェネンテク，インコーポレイテッドとＡＴＣＣの
間の同意のもとでＡＴＣＣから入手可能となるものであ
り、関連米国特許の発行またはいずれかの米国もしくは
外国特許出願の公開のいずれか早い方により、だれでも
この培養物の子孫を永続的かつ制限されずに入手可能に
なることが保証されており、また、３５ＵＳＣ §１２
２に従って権利を付与された米国特許商標庁長官および
それに従う規則（８８６ ＯＧ ６３８に具体的に言及し
ている３７ ＣＦＲ §１.１４を含む）によって決定さ
れた者に該子孫が入手可能になることが保証されてい
る。

【０１９０】本出願の譲受人は、寄託微生物が適切な条
件下で培養されたときに死滅しているか、失われている
か、または破壊されているときには、通知により該培養
物の生存試料と速やかに交換することに同意している。
寄託培養物の入手可能性は、各国特許法に従っていずれ
かの政府の権限のもとに認可された権利に違反して本発
明を実施するライセンスと解釈すべきではない。

【０１９１】以上に既述した明細書は、当業者に本発明
の実施を可能ならしめるに十分であると考えられる。寄
託が為された態様は本発明の特定態様の独立した例示と
して意図されており、機能的に等価なあらゆる培養物が
本発明の範囲内にあるので、本発明は寄託された微生物
によってその範囲を限定されるものではない。本明細書
中の物質の寄託は、本明細書中に含まれる既述が本発明
のいずれかの態様（最良の態様を含む）の実施を可能に
するに不適切であるということを認めたものではなく、
また、特許請求の範囲をその特定の例示に限定すること
を意図するものでもない。実際には、本明細書中で説明
および示したものに加えて本発明の種々の修飾が上記既
述から当業者には明白になるものであり、これらは添付
した請求の範囲内に入るものである。

【０１９２】必然的に本発明を好ましい態様との関係で
説明したが、上記明細書を読んだ後に当業者なら、本発
明の思想および範囲から逸脱することなく、本明細書中
に記載した対象に種々の変化、等価置換、変異を加える
ことができるであろう。即ち、本発明は本明細書に具体
的に記載した方法以外の方法で実施することができる。
従って、本願の特許証により認められる保護は添付した
請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるも
のである。

【０１９３】実施例XII ヘリックス１およびヘリック
ス４ ホルモン−ファージ変異体の組合せ体からのhＧＨ
変異体の選択hＧＨの加成変異体の作成 加成性の原理〔J.A.Wells, Biochemistry 29: 8509 (19
90)〕によると、タンパク質の異なる部分の突然変異が
相互に作用を及ぼしていないときであっても、それらを
組合せることによって、別の分子に対する結合の遊離エ
ネルギーにおいて加成的な変化が得られることが予想さ
れる（変化はΔΔＧ_bindingの点で加法的であるか、ま
たはＫd＝exp〔−ΔＧ／ＲＴ〕の点で乗法的である）。
即ち、結合親和性において２倍の増加を与える突然変異
は、３倍の増加を引き起こす第２の突然変異と組合せた
ときに、出発変異体の６倍増加した親和性を有する二重
突然変異を与えることが予想される。

【０１９４】hＧＨ-ファージ選択によって得た複数の突
然変異がhＧＨbp（hＧＨ−結合タンパク質；hＧＨ受容
体の細胞外ドメイン）結合において累積的に良好な効果
を与えるか否かを試験するため、ヘリックス１ライブラ
リーに由来するhＧＨの最も強固に結合する３種の変異
体（実施例IX：Ｆ１０Ａ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２１
Ｎ、Ｆ１０Ｈ／Ｍ１４Ｇ／Ｈ１８Ｎ／Ｈ２１Ｎ、および
Ｆ１０Ｆ／Ｍ１４Ｓ／Ｈ１８Ｆ／Ｈ２１Ｌ）に見い出さ
れる突然変異を、ヘリックス４bライブラリーにおいて
見い出される最も強固に結合する３種の変異体（実施例
Ｘ：Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｓ／Ｔ１７５／Ｉ１７９Ｔ、
Ｒ１６７Ｅ／Ｄ１７１Ｓ／Ｔ１７５／Ｉ１７９、および
Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｎ／Ｔ１７５／Ｉ１７９Ｔ）に見
い出される突然変異と組合せた。

【０１９５】１ヘリックス変異体のそれぞれからhＧＨ
−ファージミド２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）を単離し、制
限酵素ＥcoＲＩおよびＢstＸＩで消化した。次いで、そ
れぞれのヘリックス４b変異体から大きいフラグメント
を単離し、それぞれのヘリックス１変異体からの小さい
フラグメントと連結して表XIIIに示す新規な２ヘリック
ス変異体を得た。さらに、これら変異体のすべては先の
hＧＨ-ファージ結合選択において得られたＥ１７４Ｓ／
Ｆ１７６Ｙの突然変異を含有していた（詳細には実施例
Ｘを参照）。

【０１９６】hＧＨの選択組合せライブラリーの作成 加成性の原理は多数の突然変異の組合せに当てはまるよ
うであるが、一部の組合せ（例えば、Ｆ１７６Ｙを伴う
Ｅ１７４Ｓ）は明らかに非加成性である（実施例VIIIお
よびＸを参照）。例えば、ヘリックス１中に４つの突然
変異とヘリックス４中に４つの突然変異を有する最も強
固に結合する変異体を確実性をもって同定するために
は、理想的には８残基全部を一度に突然変異させ、次い
で全体的に最も強固に結合する変異体のプールを選別す
ることになるであろう。しかし、このようなプールは、
２.６ｘ１０¹⁰の異なるポリペプチドをコードしている
１.１ｘ１０¹²のＤＮＡ配列（ＮＮＳコドンの縮重を用
いて）からなる。全変異体（恐らく、１０¹³の形質転換
体）の表示を確実にするに十分大きなランダムファージ
ミドライブラリーを得ることは、現在の形質転換法によ
っては実際的ではない。

【０１９７】我々は、第１に、連続ラウンドの突然変異
誘発を用い、１つのライブラリーから最も強固に結合す
る変異を取り、次いで他の残基を突然変異させてさらに
結合を改善することによってこの難題に取り組んだ（実
施例Ｘ）。第２の方法において、我々は、加成性の原理
を用いて２つの独立して選別したライブラリーからの最
良の突然変異を組合わせて、改善された結合を有する複
数の突然変異体を創製した（上記）。ここで我々は、ラ
ンダムまたは部分的ランダム突然変異体の組合せライブ
ラリーを創製することによって、hＧＨ中の１０、１
４、１８、２１、１６７、１７１、１７５、および１７
９位における可能な突然変異の組合せをさらに探索し
た。ヘリックス１ライブラリーからのプールしたファー
ジミド（独立して０、２または４サイクル選別；実施例
IX）およびヘリックス４bライブラリーからのプール
（独立して０、２または４サイクル選別；実施例Ｘ）を
用いてhＧＨ−ファージミドの３つの異なる組合せライ
ブラリーを作成し、この組合せ変異体プールをhＧＨbp
結合について選別した。ある量の配列多様性がこれらプ
ールのそれぞれに存在するので、得られる組合せライブ
ラリーは手で作成しうる配列の組合せよりも多くの配列
組合せを調べることができる（例えば、表XIII）。

【０１９８】１ヘリックスライブラリーのプール（０、
２または４ラウンド選択）のそれぞれからhＧＨ−ファ
ージミドの２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）を単離し、制限酵
素ＡccＩおよびＢstＸＩで消化した。次いで、それぞれ
のヘリックス１変異体プールから大きいフラグメントを
単離し、それぞれのヘリックス４b変異体プールからの
小さいフラグメントと連結して、３つの組合せライブラ
リーｐH０７０７Ａ（実施例IXおよびＸに記載の未選択
のヘリックス１およびヘリックス４bプール）、ｐH０７
０７Ｂ（２回選択したヘリックス１プールと２回選択し
たヘリックス４bプール）、およびｐH０７０７Ｃ（４回
選択したヘリックス１プールと４回選択したヘリックス
４bプール）を得た。さらに、より少ないＤＮＡを用い
て同じ連結を行ない、ｐH０７０７Ｄ、ｐH０７０７Ｅお
よびｐH０７０７Ｆ（それぞれ、０、２および４ラウン
ドの出発ライブラリーに対応する）と命名した。また、
これら変異体プールのすべては、先のhＧＨ-ファージ結
合選択で得られた突然変異Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙを含
有していた（詳細については実施例Ｘを参照）。

【０１９９】hＧＨ-ファージ変異体の組合せライブラリ
ーの選別 連結生成物ｐH０７０７Ａ〜Ｆを加工処理し、記載（実
施例VIII）のようにＸＬ１-Ｂlue細胞に電気導入した。
コロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて、それぞれのプ
ールから得られた形質転換体の数は次のようであった：
ｐH０７０７Ａから２.４ｘ１０⁶、ｐH０７０７Ｂから
１.８ｘ１０⁶、ｐH０７０７Ｃから１.６ｘ１０⁶、ｐH０
７０７Ｄから８ｘ１０⁵、ｐH０７０７Ｅから３ｘ１
０⁵、およびｐH０７０７Ｆから４ｘ１０⁵。hＧＨ−ファ
ージミド粒子を調製し、実施例VIIIの記載のように２〜
７サイクルにわたってhＧＨbp-結合について選択した。

【０２００】hＧＨ−ファージミドライブラリーの迅速
な選別 平衡結合親和性によって測定したときの強固に結合する
タンパク質変異体についてのファージミドライブラリー
の選別に加えて、受容体あるいは他の分子に対する結合
のオン-速度（ｋ_on）またはオフ-速度（ｋ_off）のどち
らかが変化した変異体を選別することも重要である。熱
力学から、これら速度は平衡解離定数Ｋd＝（ｋ_off／ｋ
_on）に関係している。我々は、特定タンパク質の一部の
変異体は結合に対して類似したＫdを有しているが、非
常に異なったｋ_onおよびｋ_offを有しているものと想定
している。逆に、ある変異体と別の変異体のＫdの変化
は、ｋ_onに対する効果、ｋ_offに対する効果、またはそ
の両方によるものであろう。タンパク質の薬理学的性質
は、結合親和性またはｋ_onもしくはｋ_offに依存してい
ることもある（作用の詳細な機序に依存する）。ここで
我々は、より高いオン-速度を有するhＧＨ変異体を同定
してｋ_onの変化の効果を調べようとした。我々は、結合
時間を増加させることによって、ならびに同族リガンド
（hＧＨ）による洗浄時間および／または濃縮を増加さ
せることによって、選択をｋ_offの方に選択的に加重す
ることができると想定している。

【０２０１】固定化hＧＨbpに対する野生型hＧＨ−ファ
ージミド結合の経時分析から、最終のｐH２洗浄液中に
溶出されうる全hＧＨ−ファージミド粒子（全体の結合
および溶離プロトコールについては実施例VIIIを参照）
のうち、１０％未満が１分間のインキュベートの後に結
合するが、９０％以上は１５分間のインキュベート後に
結合するようである。

【０２０２】「迅速な結合選択」のために、ｐH０７０
７Ｂプール由来のファージミド粒子（ヘリックス１およ
び４に対して独立して２回選択）を固定化hＧＨbpと１
分間だけインキュベートし、次いで結合緩衝液（１ml）
で６回洗浄した〔hＧＨ洗浄工程は削除し、残存するhＧ
Ｈ−ファージミド粒子はｐH２（結合緩衝液中の０.２M
グリシン）洗浄液で溶離した〕。非表示粒子に対するh
ＧＨ−ファージミド粒子の豊富化は、短時間の結合を用
い、同族リガンド（hＧＨ）チャレンジを用いないとき
であっても、hＧＨ−ファージミド結合選択がランダム
化プールから強固に結合する変異体を選別することを示
した。

【０２０３】hＧＨ突然変異体の検定 これらhＧＨ突然変異体の一部のhＧＨbpに対する結合定
数を、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９または３４Ｂ８
中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質
を精製し、そして放射免疫沈澱検定法におけるhＧＨbp
からの標識化wt-hＧＨの競合置換（実施例VIIIを参照）
により検定することによって測定した。以下の表XIII-
Ａにおいて、すべての変異体はセリン₁₇₄によって置換
されたグルタメート₁₇₄およびチロシン₁₇₆によって置換
されたフェニルアラニン₁₇₆（Ｅ１７４ＳおよびＦ１７
６Ｙ）に加えて、hＧＨアミノ酸の１０、１４、１８、
２１、１６７、１７１、１７５および１７９位に表中に
示した追加の置換を有している。

【０２０４】 表XIII-A．ヘリックス１およびヘリックス４b突然変異の加算によるhＧＨ 変異体 ヘリックス１ ヘリックス４ 野生型残基： F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179 変異体 H0650AD H G N N N S T T H0650AE H G N N E S T I H0650AF H G N N N N T T H0650BD A W D N N S T T H0650BE A W D N E S T I H0650BF A W D N N N T T H0650CD F S F L N S T T H0650CD F S F L E S T I H0650CD F S F L N N T T

【０２０５】以下の表XIVにおいて、hＧＨ変異体を、フ
ァージミド結合選択法によって組合せライブラリーから
選択した。表XIV中のすべてのhＧＨ変異体は２つのバッ
クグラウンド突然変異（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）を含
んでいる。ライブラリーｐH０７０７Ａ（パートＡ）、
ｐH０７０７ＢおよびｐH０７０７Ｅ（パートＢ）または
ｐH０７０７Ｃ（パートＣ）からのhＧＨ−ファージミド
プールを、hＧＨbpに対する結合について２〜７サイク
ルで選別した。数値Ｐは、それぞれのプールから配列決
定した１組のクローン中のそれぞれの変異体型の分数発
生率を示す。

【０２０６】 表XIV．組合せライブラリーのホルモン−ファージミド結合選択からの hＧＨ変異体 ヘリックス１ ヘリックス４ 野生型残基： F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179 Ｐ 変異体 パートＡ： ４サイクル： 0.60 H0714A.1 H G N N N S T N 0.40 H0714A.4 A N D A N N T N* パートＢ： ２サイクル： 0.13 H0712B.1 F S F G H S T T 0.13 H0712B.2 H Q T S A D N S 0.13 H0712B.4 H G N N N A T T 0.13 H0712B.5 F S F L S D T T 0.13 H0712B.6 A S T N R D T I 0.13 H0712B.7 Q Y N N H S T T 0.13 H0712B.8 W G S S R D T I 0.13 H0712E.1 F L S S K N T V 0.13 H0712E.2 W N N S H S T T 0.13 H0712E.3 A N A S N S T T 0.13 H0712E.4 P S D N R D T I 0.13 H0712E.5 H G N N N N T S 0.13 H0712E.6 F S T G R D T I 0.13 H0712E.7 M T S N Q S T T 0.13 H0712E.8 F S F L T S T S ４サイクル： 0.17 H0714B.1 A W D N R D T I 0.17 H0714B.2 A W D N H S T N 0.17 H0714B.3 M Q M N N S T T 0.17 H0714B.4 H Y D H R D T T 0.17 H0714B.5 L N S H R D T I 0.17 H0714B.6 L N S H T S T T ７サイクル： 0.57 H0717B.1 A W D N N A T T 0.14 H0717B.2 F S T G R D T I 0.14 H0717B.6 A W D N R D T I 0.14 H0717B.7 I Q E H N S T T 0.50 H0717E.1 F S L A N S T V パートＣ： ４サイクル： 0.67 H0714C.2 F S F L K D T T * ＝ 突然変異Ｌ１５Ｒ、Ｋ１６８Ｒをも含んでいた。

【０２０７】以下の表XVにおいて、hＧＨ変異体を、フ
ァージミド結合選択法によって組合せライブラリーから
選択した。表XV中のすべてのhＧＨ変異体は２つのバッ
クグラウンド突然変異（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）を含
んでいる。数値Ｐは、４サイクルの迅速結合選択の後に
配列決定した全クローン中の特定変異体の分数発生率で
ある。

【０２０８】 表XV．hＧＨ−ファージミド組合せライブラリーの迅速hＧＨbp結合選択からの hＧＨ変異体 ヘリックス１ ヘリックス４ 野生型残基： F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179 Ｐ 変異体 0.14 H07BF4.2 W G S S R D T I 0.57 H07BF4.3 M A D N N S T T 0.14 H07BF4.6 A W D N S S V T≠ 0.14 H07BF4.7 H Q T S R D T I ≠ ＝ 突然変異Ｙ１７６Ｆをも含んでいた（野生型hＧＨもＦ１７６を含んでい る）。

【０２０９】以下の表XVIにおいて、hＧＨbp（１〜２３
８）およびＭab５またはＭab２６３のいずれかを用いる
¹²⁵Ｉ-標識化ホルモンＨ０６５０ＢＤまたは標識化hＧ
Ｈの競合置換によって結合定数を測定した。変異Ｈ０６
５０ＢＤは野生型hＧＨよりも３０倍強固に結合するよ
うである。

【０２１０】 表XVI．選択したhＧＨ変異体の平衡結合定数 hGH変異体 Kd(変異体)／Kd(H0650BD) Kd(変異体)／Kd(hGH) Kd(pM) hGH ３２ −１− ３４０±５０ H0650BD −１− ０.０３１ １０±３ H0650BF １.５ ０.０４５ １５±５ H0714B.6 ３.４ ０.０９９ ３４±１９ H0712B.7 ７.４ ０.２２ ７４±３０ H0712E.2 １６ ０.４８ ６０±７０

【０２１１】実施例XIII プロテアーゼ基質配列を含有
するhＧＨ-ファージと非基質ファージの選択豊富化 実施例Ｉに記載したように、プラスミドpＳ０１３２
は、余分のグリシン残基の挿入を伴って遺伝子IIIタン
パク質の残基Ｐro１９８に融合したhＧＨの遺伝子を含
有している。このプラスミドを用いて、hＧＨ−遺伝子I
II融合産物がファージ表面に１価で表示されるhＧＨ-フ
ァージ粒子を得ることができる（実施例IV）。この融合
タンパク質は、可変性リンカー配列によって遺伝子III
のカルボキシ末端ドメインに融合した全hＧＨタンパク
質を含有している。

【０２１２】あるタンパク質加水分解酵素の好ましい基
質配列を選択するためにファージ表示法を使用すること
の可能性を調べるために、スブチリシンＢＰＮ'の遺伝
子操作変異体を用いた〔Carter,P.ら, Proteins: Struc
ture, function and genetics 6: 240-248 (1989)〕。
この変異体（以下においてはＡ６４ＳＡＬスブチリシン
と呼ぶ）は以下の突然変異：Ｓer２４Ｃys、Ｈis６４Ａ
la、Ｇlu１５６Ｓer、Ｇly１６９ＡlaおよびＴyr２１７
Ｌeuを含んでいる。この酵素は必須の触媒残基Ｈis６４
を欠いているので、その基質特異性が大きく制限されて
おり、ある種のヒスチジン含有基質が優先的に加水分解
される〔Carterら, Science 237: 394-399 (1987)〕。

【０２１３】hＧＨ-基質-ファージベクターの構築 pＳ０１３２中のリンカー領域の配列を、オリゴヌクレ
オチド： 5'-TTC-GGG-CCC-TTC-GCT-GCT-CAC-TAT-ACG-CGT-CAG-TCG
-ACT-GAC-CTG-CCT-3' を用いて突然変異させ、Ａ６４ＳＡＬスブチリシンの基
質配列を創製した。これにより、タンパク質配列： Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ala-His-Tyr-Thr-Arg-Gln-Ser-Th
r-Asp がhＧＨと遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインの間のリ
ンカー領域中に導入される結果が得られた（上記配列中
の最初のＰhe残基はhＧＨのＰhe１９１である）。配
列： Ala-Ala-His-Tyr-Thr-Arg-Gln はＡ６４ＳＡＬスブチリシンの良好な基質であることが
既知である〔Carterら(1989)；上記〕。得られたプラス
ミドをpＳ０６４０と命名した。

【０２１４】hＧＨ-基質-ファージの選択豊富化 pＳ０１３２およびpＳ０６４０から導かれるファージミ
ド粒子を実施例Ｉの記載のように作成した。最初の実験
において、それぞれのファージプール（１０μlづつ）
を、２０mMトリス-ＨＣl（ｐH８.６）および２.５Ｍ Ｎ
aＣlを含有する緩衝液（１００μl）中でオキシランビ
ーズ（実施例IIの記載のように調製；３０μl）と別々
に混合した。結合と洗浄工程は実施例VIIの記載のよう
に行なった。次いで、このビーズを５０nMのＡ６４ＳＡ
Ｌスブチリシンを含むかまたは含まない同緩衝液（４０
０μl）に再懸濁した。１０分間インキュベートした
後、上清を集め、ファージ力価（cfu）を測定した。表X
VIIは、約１０倍多い基質含有ファージミド粒子（pＳ０
６４０）が、酵素の非存在下よりも酵素の存在下におい
て溶出され、また、酵素の存在下もしくは非存在下の非
基質ファージミド（pＳ０１３２）の場合よりも多く溶
出されることを示している。酵素、ファージミドまたは
ビーズ濃度の増加はこの比率を変えることはなかった。

【０２１５】選択豊富化法の改良 固定化ファージミドの非特異的溶離を減少させる試みに
おいて、強固に結合するhＧＨ変異体を野生型hＧＨ遺伝
子の代わりにpＳ０１３２およびpＳ０６４０に導入し
た。使用したhＧＨ変異体は実施例XIに記載した変異体
（ｐH０６５０bp）であり、突然変異Ｐhe１０Ａla、Ｍe
t１４Ｔrp、Ｈis１８Ａsp、Ｈis２１Ａsn、Ａrg１６７
Ａsn、Ａsp１７１Ｓer、Ｇlu１７４Ｓer、Ｐhe１７６Ｔ
yrおよびＩle１７９Ｔhrを含有している。これにより、
２つの新規なファージミド：pＤＭ０３９０（強固に結
合するhＧＨを含有し、基質配列を含まない）およびpＤ
Ｍ０４１１（強固に結合するhＧＨおよび基質配列Ａla-
Ａla-Ｈis-Ｔyr-Ｔhr-Ａrg-Ｇlnを含有する）が構築さ
れた。また、結合の洗浄および溶離のプロトコールは次
のように変えた： (i) 結合：COSTAR １２ウエル組織培養プレートを、０.
５ml／ウエルの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐH１０.０）中
の２μg/ml hＧＨbpで１６時間被覆した。次いで、この
プレートを、１ml／ウエルのブロック緩衝液〔０.１％w
／vウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）〕とともに２時間インキュベートし、１０mM
トリス-ＨＣl（ｐH７.５）、１mM ＥＤＴＡおよび１０
０mM ＮaＣlを含有する検定緩衝液で洗浄した。ファー
ジミドを再び実施例Ｉの記載のように調製し、ファージ
プールを上記検定緩衝液で１：４に希釈し、ウエルあた
り０.５mlのファージを２時間インキュベートした。 （ii）洗浄：このプレートをＰＢＳ＋０.０５％ツイー
ン２０で徹底的に洗浄し、この洗浄緩衝液（１ml）とと
もに３０分間インキュベートした。この洗浄工程を３回
繰返した。 （iii）溶離：このプレートを、２０mMトリス-ＨＣl
（ｐH８.６）＋１００mMＮaＣlからなる溶離緩衝液中で
１０分間インキュベートし、次いで５００nMのＡ６４Ｓ
ＡＬスブチリシンを含むかまたは含まない上記緩衝液
（０.５ml）でファージを溶離した。

【０２１６】表XVIIは、pＳ０６４０およびpＳ０１３２
について先に記載した方法と比較して、特異的に溶出し
た基質-ファージミド粒子の割合が劇的に増加したこと
を示している。この結果は、強固に結合するhＧＨ突然
変異体が、野生型hＧＨに比べてhＧＨ結合タンパク質へ
の結合に対して有意に低いオフ-速度を有していること
によるものと考えられる。

【０２１７】表XVII．Ａ６４ＳＡＬスブチリシンによる
基質-ファージミドの特異的溶離 ファージの１０倍希釈液（１０μl）を、５０μg/mlカ
ルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上のＸＬ１-
Ｂlue細胞の１０μlスポット上にプレーティングするこ
とによってコロニー形成単位（cfu）を評価した。 （ｉ）野生型hＧＨ遺伝子：hＧＨbp-オキシランビーズへの結合 ファージミド ＋５０nM Ａ６４ＳＡＬ 酵素なし pＳ０６４０（基質） ９×１０⁶cfu／１０μl １.５×１０⁶cfu／１０μl pＳ０１３２（非基質） ６×１０⁵cfu／１０μl ３×１０⁵cfu／１０μl （ii）ｐH０６５０bp突然変異体hＧＨ遺伝子：hＧＨbp被覆プレートへの結合 ファージミド ＋５０nM Ａ６４ＳＡＬ 酵素なし pＤＭ０４１１（基質） １.７×１０⁵cfu／１０μl ２×１０³cfu／１０μlpＤＭ０３９０（非基質） ２×１０³cfu／１０μl １×１０³cfu／１０μl

【０２１８】実施例XIV 基質配列ライブラリーの選択
豊富化を用いるＡ６４ＳＡＬスブチリシンの好ましい基
質の同定 実施例XIIIに記載した選択的豊富化法を用いてランダム
基質配列のライブラリーから良好な基質配列を同定しよ
うとした。ランダム化基質カセットの挿入のためのベクターの構築 ランダム化基質カセットの導入およびその後の基質配列
ライブラリーの発現に適したベクターを設計した。出発
点は実施例VIIIに記載したベクターpＳ０６４３であっ
た。オリゴヌクレオチド： 5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-GCC-GCG-TCG-ACT-GGC
-GGT-GGC-TCT-3' を用いて部位指向性の突然変異誘発を行ない、これによ
ってhＧＨと遺伝子IIIの間にＡpaＩ（ＧＧＧＣＣＣ）お
よびＳalＩ（ＧＴＣＧＡＣ）制限部位が導入された。こ
の新規な構築物をpＤＭ０２５３と命名した（pＤＭ０２
５３の実際の配列は、 5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-CCC-GCG-TCG-ACT-GGC
-GGT-GGC-TCT-3' であり、下線を引いた塩基の置換は突然変異オリゴヌク
レオチド中の偽錯誤によるものである）。また、pＤＭ
０４１１（実施例XIII）由来のフラグメントを交換する
ことによって、実施例中に記載した強固に結合するhＧ
Ｈ変異体を導入した。得られたライブラリーベクターを
pＤＭ０４５４と命名した。

【０２１９】ライブラリーカセットベクターの調製およ
び突然変異カセットの挿入 ライブラリーカセットを導入するために、pＤＭ０４５
４をＡpaＩ、次いでＳalＩで消化し、次に１３％ＰＥＧ
８０００＋１０mM ＭgＣl₂で沈澱させ、７０％エタノー
ルで２回洗浄し、再懸濁した。これによりベクターが効
率的に沈澱するが、小さいＡpaＩ−ＳalＩフラグメント
が溶液中に残る〔Paithankar,K.R.およびPrasad,K.S.
N., Nucleic Acids Research 19: 1346〕。この生成物
を１％アガロースゲル上を移動させ、ＡpaＩ−ＳalＩ消
化したベクターを切り出し、Bandprepキット（Pharmaci
a）を用いて精製し、そして突然変異カセットとの連結
用に再懸濁した。

【０２２０】挿入するカセットはpＳ０６４０およびpＤ
Ｍ０４１１のリンカー領域中のＤＮＡ配列と同様の配列
を含有していたが、ランダム化コドンによって置換され
た基質配列中のヒスチジンおよびチロシン残基のコドン
を有していた。実施例VIIIに記載したようにランダム化
位置のそれぞれにおいてＮＮＳ（Ｎ＝Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ；
Ｓ＝Ｇ／Ｃ）を置換することを選択した。突然変異カセ
ット中に用いたオリゴヌクレオチドは、 5'-C-TTC-GCT-GCT-NNS-NNS-ACC-CGG-CAA-3'（暗号鎖）
および 5'-T-CGA-TTG-CCG-GGT-SNN-SNN-AGC-AGC-GAA-GGG-CC-3'
（非暗号鎖） であった。また、このカセットはＳalＩ部位を破壊し、
従ってＳalＩによる消化を用いてベクター バックグラ
ウンドを減少させることができる。これらオリゴヌクレ
オチドはＡpa−Ｓalカセット部位への挿入の前にホスホ
リル化しなかった。この理由は、続いて起こるカセット
小集団のオリゴマー化が複数カセット挿入体による偽の
結果を導くことがあることを恐れたためである。アニー
ルと連結の後、反応生成物をフェノール：クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱させ、そして水に再懸濁した。
最初は、バックグラウンドベクターを減少させるための
ＳalＩによる消化を行なわなかった。実施例VIIIに記載
したように、約２００ngをＸＬ１-Ｂlue細胞に電気穿孔
導入し、ファージミドライブラリーを調製した。

【０２２１】基質ライブラリーからの切断されやすい基
質の選択 使用した選択法は、実施例XIIIにおいてpＤＭ０４１１
およびpＤＭ０３９０について記載した方法と同じであ
る。各ラウンドの選択の後、実施例VIIIにおいてhＧＨ-
ファージについて記載されているように、新鮮なＸＬ１
-Ｂlue細胞の培養物に形質導入し、新しいファージミド
ライブラリーを増殖させることによって、溶出したファ
ージを増殖させた。選択法の進行は、溶出ファージの力
価の測定および各ラウンドの選択後の個々のクローンの
配列決定によってモニターした。

【０２２２】表Ａは、１、２および３ラウンドの選択後
の酵素の存在下および非存在下での溶離に対する連続フ
ァージ力価を示すものである。特異的に溶出したファー
ジ：非特異的に溶出したファージ（即ち、酵素を用いて
溶出したファージ：酵素を用いずに溶出したファージ）
の比がラウンド１からラウンド３まで劇的に増加してい
るのが明らかであり、このことは、良好な基質集団が各
選択ラウンドにつれて増加していることを示唆する。

【０２２３】出発ライブラリーからの１０個の単離体の
配列決定は、これらのすべてが野生型pＤＭ０４６４配
列からなることを示した。このことは、ＡpaＩによる消
化の後にＳalＩ部位がＤＮＡフラグメントの末端に非常
に近接しており、従って低効率の消化を導くことに起因
している。それにもかかわらず、ライブラリー中に４０
０の可能な配列が存在しているにすぎず、従ってこの集
団はなお特筆されるべきである。

【０２２４】表Ｂ１およびＢ２は、ラウンド２およびラ
ウンド３の選択後に得られた単離体の配列を示すもので
ある。２ラウンドの選択の後に、ヒスチジン残基の高い
発生が明確に存在する。これは正に予想されていたこと
である（実施例XIIIに記載したように、Ａ６４ＳＡＬス
ブチリシンは基質中にヒスチジン残基を必要とするが、
この理由はそれが基質-助力の触媒機序を使用するため
である）。３ラウンドの選択の後に、配列決定した１０
個のクローンのそれぞれがランダム化カセット中にヒス
チジンを有している。しかし、これら配列の２つはpＤ
Ｍ０４１１のものであり、出発ライブラリー中に存在し
ていなかったものであり、従って不純物であることに注
意すべきである。

【０２２５】表Ａ．最初のファージプールおよび３ラウ
ンドの選択豊富化からの溶出ファージの滴定 ファージの１０倍希釈液（１０μl）を、５０μg/mlカ
ルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上のＸＬ１-
Ｂlue細胞の１０μlスポット上にプレーティングするこ
とによってコロニー形成単位（cfu）を評価した。 ラウンド１ 出発ライブラリー： 3×10¹²cfu/ml ライブラリー： +500nM A64SAL ： 4×10³cfu/10μl 酵素なし ： 3×10³cfu/10μl pＤＭ０４１１： +500nM A64SAL ： 2×10⁶cfu/10μl (対照) 酵素なし ： 8×10³cfu/10μlラウンド２ ラウンド１ライブラリー： 7×10¹²cfu/ml ライブラリー： +500nM A64SAL ： 3×10⁴cfu/10μl 酵素なし ： 6×10³cfu/10μl pＤＭ０４１１： +500nM A64SAL ： 3×10⁶cfu/10μl (対照) 酵素なし ： 1.6×10⁴cfu/10μlラウンド３ ラウンド２ライブラリー： 7×10¹¹cfu/ml ライブラリー： +500nM A64SAL ： 1×10⁵cfu/10μl 酵素なし ： <10³cfu/10μl pＤＭ０４１１： +500nM A64SAL ： 5×10⁶cfu/10μl (対照) 酵素なし ： 3×10⁴cfu/10μl

【０２２６】表Ｂ１．２ラウンドの選択豊富化の後の溶
出ファージの配列 すべてのタンパク質配列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にある
はずである（ここで、＊はランダム化コドンを表す）。
以下の表においては、ランダム化コドンおよびアミノ酸
に下線を引く。 ラウンド２後： 配 列 発生数 * * A A H Y T R Q ... GCT GCT CAC TAC ACC CGG CAA ... ２ A A H M T R Q ... GCT GCT CAC ATG ACC CGG CAA ... １ A A L H T R Q ... GCT GCT CTC CAC ACC CGG CAA ... １ A A L H T R Q ... GCT GCT CTG CAC ACC CGG CAA ... １ A A H T R Q ... GCT GCT CAC ACC CGG CAA ... １ # A A ? H T R Q ... GCT GCT ??? CAC ACC CGG CAA １ ## ... 野生型 pＤＭ０４５４ ３ # カセット内の１コドンの偽削除 ## アンビギュアス配列 表Ｂ２．３ラウンドの選択豊富化の後の溶出ファージの配列 すべてのタンパク質配列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にあるはず である（ここで、＊はランダム化コドンを表す）。以下の表に おいては、ランダム化コドンおよびアミノ酸に下線を引く。 ラウンド３後： 配 列 発生数 * * A A H Y T R Q ... GCT GCT CAC TAT ACG CGT CAG ... ２ # A A L H T R Q ... GCT GCT CTC CAC ACC CGG CAA ... ２ A A Q H T R Q ... GCT GCT CAG CAC ACC CGG CAA ... １ A A T H T R Q ... GCT GCT ACG CAC ACC CGG CAA ... １ A A H S R Q ... GCT GCT CAC TCC CGG CAA ... １ A A H H T R Q ... GCT GCT CAT CAT ACC CGG CAA １ ## A A H F R Q ... GCT GCT CAC TTC CGG CAA ... １ A A H T R Q ... GCT GCT CAC ACC CGG CAA ... １ # pＤＭ０４１１由来の汚染配列 ## 「違法」コドンＣＡＴを含有する：Ｔがコドンの３番 目の位置に現れるはずがない

【配列表】配 列 表 （１） 一般的情報 （ｉ） 特許出願人： ジェネンテク，インコーポレイ
テッド ゲイラード，ライザ・ジェイ ヘンナー，デニス・ジェイ バース，スティーブン グリーン，ロナルド ロウマン，ヘンリー・ビー ウエルズ，ジェームズ・エー マシューズ，デイビッド・ジェイ （ii） 発明の名称： 改変された結合性を有する変異
タンパク質の豊富化法 （iii） 配列の数： ２７ （iv） 連絡先： （Ａ） 名宛人：ジェネンテク，インコーポレイテッド （Ｂ） 通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバー
ド４６０番 （Ｃ） 市：サウス・サン・フランシスコ （Ｄ） 州：カリフォルニア （Ｅ） 国：アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ：９４０８０ （ｖ） コンピューター解読書式： （Ａ） 媒体型：５.２５インチ、３６０Ｋbフロッピー
（登録商標）ディスク （Ｂ） コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合 （Ｃ） オペレーティング・システム：ＰＣ-ＤＯＳ／
ＭＳ-ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア：patin （ジェネンテク） （vi） 本出願のデータ： （Ａ） 出願番号：未 定 （Ｂ） 出願日：本 日 （Ｃ） 分類：未 定 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号：０７／７４３６１４ （Ｂ） 出願日：１９９１年８月９日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号：０７／７１５３００ （Ｂ） 出願日：１９９１年６月１４日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号：０７／６８３４００ （Ｂ） 出願日：１９９１年４月１０日 （vii） 優先権主張出願のデータ： （Ａ） 出願番号：０７／６２１６６７ （Ｂ） 出願日：１９９０年１２月３日 （viii） 弁理士／代理人 情報： （Ａ） 氏名：ベンソン，ロバート・エイチ （Ｂ） 登録番号：３０,４４６ （Ｃ） 参照／整理番号：６４５Ｐ４ （ix） 電話連絡先情報： （Ａ） 電話番号：４１５／２６６−１４８９ （Ｂ） ファックス番号：４１５／９５２−９８８１ （Ｃ） テレックス番号：９１０／３７１−７１６８ （２） 配列番号１の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３６塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号１： GGCAGCTGTG GCTTCTAGAG TGGCGGCGGC TCTGGT 36 （２） 配列番号２の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３６塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号２： AGCTGTGGCT TCGGGCCCTT AGCATTTAAT GCGGTA 36 （２） 配列番号３の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３３塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号３： TTCACAAACG AAGGGCCCCT AATTAAAGCC AGA 33 （２） 配列番号４の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３０塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号４： CAATAATAAC GGGCTAGCCA AAAGAACTGG 30 （２） 配列番号５の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：２４塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号５： CACGACAGAA TTCCCGACTG GAAA 24 （２） 配列番号６の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：２３塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号６： CTGTTTCTAG AGTGAAATTG TTA 23 （２） 配列番号７の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：２１塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号７： ACATTCCTGG GTACCGTGCA G 21 （２） 配列番号８の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：６３塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号８： GCTTCAGGAA GGACATGGAC NNSGTCNNSA CANNSCTGNN SATCGTGCAG 50 TGCCGCTCTG TGG 63 （２） 配列番号９の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：２４塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号９： AAGGTCTCCA CATACCTGAG GATC 24 （２） 配列番号１０の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３３塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号１０： ATGGACAAGG TGTCGACATA CCTGCGCATC GTG 33 （２） 配列番号１１の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３６塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号１１： GGCAGCTGTG GCTTCTAGAG TGGCGGCGGC TCTGGT 36 （２） 配列番号１２の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：３６塩基 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号１２： GGCAGCTGTG GATTCTAGAG TGGCGGTGGC TCTGGT 36 （２） 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TGCCAGTCAG 150 GATGTGAATA CTGCTGTAGC CTGGTATCAA CAGAAACCAG GAAAAGCTCC 200 GAAACTACTG ATTTACTCGG CATCCTTCCT CTACTCTGGA GTCCCTTCTC 250 GCTTCTCTGG ATCCAGATCT GGGACGGATT TCACTCTGAC CATCAGCAGT 300 CTGCAGCCGG AAGACTTCGC AACTTATTAC TGTCAGCAAC ATTATACTAC 350 TCCTCCCACG TTCGGACAGG GTACCAAGGT GGAGATCAAA CGAACTGTGG 400 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 450 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 500 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 550 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 600 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 650 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 700 GGGGAGAGTG TTAAGCTGAT CCTCTACGCC GGACGCATCG TGGCCCTAGT 750 ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA GGTTGAGGTG ATTTTATGAA 800 AAAGAATATC GCATTTCTTC TTGCATCTAT GTTCGTTTTT TCTATTGCTA 850 CAAACGCGTA CGCTGAGGTT CAGCTGGTGG AGTCTGGCGG TGGCCTGGTG 900 CAGCCAGGGG GCTCACTCCG TTTGTCCTGT GCAGCTTCTG GCTTCAACAT 950 TAAAGACACC TATATACACT GGGTGCGTCA GGCCCCGGGT AAGGGCCTGG 1000 AATGGGTTGC AAGGATTTAT CCTACGAATG GTTATACTAG ATATGCCGAT 1050 AGCGTCAAGG GCCGTTTCAC TATAAGCGCA GACACATCCA AAAACACAGC 1100 CTACCTGCAG ATGAACAGCC TGCGTGCTGA GGACACTGCC GTCTATTATT 1150 GTTCTAGATG GGGAGGGGAC GGCTTCTATG CTATGGACTA CTGGGGTCAA 1200 GGAACCCTGG TCACCGTCTC CTCGGCCTCC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT 1250 CCCCCTGGCA CCCTCCTCCA AGAGCACCTC TGGGGGCACA GCGGCCCTGG 1300 GCTGCCTGGT CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC 1350 TCAGGCGCCC TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC 1400 CTCAGGACTC TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACTGTGCCC TCTAGCAGCT 1450 TGGGCACCCA GACCTACATC TGCAACGTGA ATCACAAGCC CAGCAACACC 1500 AAGGTGGACA AGAAAGTTGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCACACAGG 1550 GCCCTTCGTT TGTGAATATC AAGGCCAATC GTCTGACCTG CCTCAACCTC 1600 CTGTCAATGC TGGCGGCGGC TCTGGTGGTG GTTCTGGTGG CGGCTCTGAG 1650 GGTGGTGGCT CTGAGGGTGG CGGTTCTGAG GGTGGCGGCT CTGAGGGAGG 1700 CGGTTCCGGT GGTGGCTCTG GTTCCGGTGA TTTTGATTAT GAAAAGATGG 1750 CAAACGCTAA TAAGGGGGCT ATGACCGAAA ATGCCGATGA AAACGCGCTA 1800 CAGTCTGACG CTAAAGGCAA ACTTGATTCT GTCGCTACTG ATTACGGTGC 1850 TGCTATCGAT GGTTTCATTG GTGACGTTTC CGGCCTTGCT AATGGTAATG 1900 GTGCTACTGG TGATTTTGCT GGCTCTAATT CCCAAATGGC TCAAGTCGGT 1950 GACGGTGATA ATTCACCTTT AATGAATAAT TTCCGTCAAT ATTTACCTTC 2000 CCTCCCTCAA TCGGTTGAAT GTCGCCCTTT TGTCTTTAGC GCTGGTAAAC 2050 CATATGAATT TTCTATTGAT TGTGACAAAA TAAACTTATT CCGTGGTGTC 2100 TTTGCGTTTC TTTTATATGT TGCCACCTTT ATGTATGTAT TTTCTACGTT 2150 TGCTAACATA CTGCGTAATA AGGAGTCT 2178 （２） 配列番号２６の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：２３７アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号２６： Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln 50 55 60 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 65 70 75 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser 80 85 90 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 95 100 105 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 110 115 120 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 125 130 135 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 140 145 150 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 155 160 165 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 170 175 180 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 185 190 195 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 200 205 210 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 215 220 225 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 230 235 237 （２） 配列番号２７の情報 （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ：４６１アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号２７： Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 35 40 45 Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr 65 70 75 Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 80 85 90 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 95 100 105 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 110 115 120 Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 125 130 135 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 140 145 150 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 155 160 165 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 170 175 180 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 185 190 195 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 200 205 210 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 215 220 225 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 230 235 240 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Pro Phe Val 245 250 255 Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val 260 265 270 Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr 305 310 315 Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala 320 325 330 Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser 335 340 345 Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp 350 355 360 Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala 365 370 375 Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser 380 385 390 Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln 395 400 405 Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr 410 415 420 Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val 425 430 435 Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser 440 445 450 Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 455 460 461

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：線状ファージの表面に大きいタンパク質
を表示（顕示）させるための方法および改変された受容
体結合性を豊富化する方法を示すものである。hＧＨの
全暗号配列をＭ１３遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメイ
ンに融合させたプラスミドphＧＨ-Ｍ１３gIIIを構築し
た。この融合タンパク質の転写はlacプロモーター／オ
ペレーター配列の支配下にあり、分泌はstIIシグナル配
列によって指令されている。ファージミド粒子は「ヘル
パー」ファージＭ１３ＫＯ７による感染によって得ら
れ、hＧＨを表示する粒子はhＧＨ受容体を含む親和性マ
トリックスに結合させることによって豊富化することが
できる。野生型遺伝子III（Ｍ１３ＫＯ７ファージから
導く）はファージの先端の４〜５コピーの複数矢印によ
り図示し、融合タンパク質（ファージミドphＧＨ-Ｍ１
３gIIIから導く）はhＧＨの折り畳み図形（矢印の頭部
を置換）によって図示した。

【図２】図２：全ファージ粒子の免疫ブロットはhＧＨ
がファージと同時移動することを示す。塩化セシウム勾
配で精製したファージミド粒子を二重のウエルに付し、
３７５mMトリス、４０mMグリシン（ｐH９.６）緩衝液
中、１％アガロースゲルで電気泳動を行なった。このゲ
ルを、２％ＳＤＳおよび２％β−メルカプトエタノール
を含む移転緩衝液〔２５mMトリス（ｐH８.３）、２００
mMグリシン、２０％メタノール〕中に２時間浸漬し、次
いで移転緩衝液中で６時間すすいだ。次いで、ゲル中の
タンパク質をイモビロン膜（Millipore）上に電気ブロ
ットした。１組の試料を含む膜はクーマシーブルーで染
色してファージタンパク質の位置を示した（Ａ）。二重
の膜をポリクローナルウサギ抗-hＧＨ抗体と反応させ、
次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲート化
したヤギ抗-ウサギＩgＧ抗体と反応させることによっ
て、膜のhＧＨを免疫染色した（Ｂ）。レーン１はＭ１
３ＫＯ７親ファージを含み、これはhＧＨを欠いている
のでクーマシーブルー染色した膜においてのみ観察する
ことができた。レーン２および３はホルモン ファージ
ミド粒子の別の調製物を含んでおり、クーマシーおよび
hＧＨ免疫染色の両方で観察することができた。親のＭ
１３ＫＯ７ファージとホルモン ファージミド粒子の間
の移動距離の差異は、内部にパッケージされたゲノムの
大きさの相違を反映するものである（それぞれ、８.７k
bと５.１kb）。

【図３】図３：コドン１７２、１７４、１７６および１
７８のところをランダム化したhＧＨ-ファージライブラ
リーの選択法における各工程をまとめる図である。hＧ
Ｈ（Ｒ１７８Ｇ、Ｉ１７９Ｔ）遺伝子および唯一のＫpn
Ｉ制限部位を含有する鋳型分子ｐH０４１５を本明細書
に記載のように突然変異誘発し、大腸菌株ＷＪＭ１０１
中に電気導入して最初のファージミドライブラリー（ラ
イブラリー１）を得た。ライブラリー１の一部（約２
％）を、本明細書に記載のように最初の選択ラウンドに
直接用いてライブラリー１Ｇを得た。一方、２本鎖ＤＮ
Ａ（dsＤＮＡ）をライブラリー１から調製し、制限酵素
ＫpnＩで消化して鋳型のバックグラウンドを排除し、Ｗ
ＪＭ１０１中に電気導入してライブラリー２を得た。こ
れらに続く選択ラウンド（または、ＫpnＩ消化；陰影を
付けた箱）とその後のファージミドの増殖は、本明細書
に記載した方法に従い、矢印で示したように行なった。
ライブラリー４Ｇ⁴からの４種の独立したクローンおよ
びライブラリー５Ｇ⁶からの４種の独立したクローンを
ジデオキシ配列決定法によって配列決定した。これらク
ローンのすべてが、hＧＨ突然変異体（Ｇlu １７４ Ｓe
r、Ｐhe １７６ Ｔyr）に一致する同一ＤＮＡ配列を有
していた。

【図４】図４：結晶学により決定したブタ成長ホルモン
の２.８Å折り畳み図から導いたhＧＨの構造モデルを示
すものである。hＧＨ−結合タンパク質への結合を強く
変調させるhＧＨ中の残基の位置を陰影を付けた円内に
示した。結合親和性において１０倍以上の減少（黒
丸）、４〜１０倍の減少（・）、増加（○）、または２
〜４倍の減少（・）を引き起こすアラニン置換が示され
ている。α−ヘリックス領域におけるらせん輪投影によ
り、これらの両極性が明らかになった。黒くした、陰影
を付けた、あるいは陰影を付けていない残基は、それぞ
れ荷電、極性、または非極性を示す。ヘリックス４にお
いて、突然変異のための最も重要な残基は親水性の面上
にある。

【図５】図５：表示した経路（hＧＨ溶離、グリシン溶
離、または予吸着後のグリシン溶離）に対するラウンド
１および３の選択工程からの多数のクローンを配列決定
した後にわかったhＧＨの１７２、１７４、１７６およ
び１７８位のアミノ酸置換を示すものである（例えば、
ＫＳＹＲという表示はhＧＨ突然変異体１７２Ｋ／１７
４Ｓ／１７６Ｙ／１７８Ｒを表す）。非機能的な配列
（即ち、ベクターバックグラウンド、または他の未成熟
に終わった突然変異体および／またはフレームシフトし
た突然変異体）は「ＮＦ」として示している。非サイレ
ントの疑似突然変異（即ち、上に挙げた組の標的残基以
外）を含む機能的な配列は「＋」で示している。すべて
の配列決定クローンの中で１回を越えて現れたが異なる
ＤＮＡ配列を有するタンパク質配列は「＃」で示してい
る。配列決定クローンの中で１回を越えて現れ、そして
同じＤＮＡ配列を有するタンパク質配列は「＊」で示し
ている。３ラウンドの選択の後に２種の異なる汚染配列
が見い出されたことに注意すべきである（これらのクロ
ーンはカセット突然変異体に一致しなかったが、先に構
築したホルモン ファージに一致した）。pＳ０６４３汚
染体は野生型hＧＨ-ファージに一致する（hＧＨ「ＫＥ
ＦＲ」）。第３ラウンドのグリシン選択したファージの
プールに多いｐH０４５７汚染体は、先に同定したhＧＨ
の突然変異体「ＫＳＹＲ」に一致する。これら汚染体の
増幅は、まれにしか発生しない突然変異体を選択するた
めのホルモン−ファージ選択法の能力を強調するもので
ある。また、これらの配列の集中性は３種すべての経路
において顕著であった（即ち、ＲまたはＫは１７２およ
び１７８位に最も多く発生し、ＹまたはＦは１７６位に
最も多く発生し、そしてＳ、Ｔ、Ａおよびその他の残基
は１７４位に発生する）。

【図６】図６：亜鉛の存在下にhＰＲＬbp-ビーズ上で選
択したファージからの配列を示すものである。表示は図
５で説明したものと同じである。ここでは、配列の集中
性は予測できないが、最もストリンジェントな（グリシ
ン）選択条件下で疎水性配列への偏りがあるようである
（Ｌ、ＷおよびＰ残基がこのプールに多く見い出され
る）。

【図７】図７：亜鉛の非存在下にhＰＲＬbp-ビーズ上で
選択したファージからの配列を示すものである。表示は
図５で説明したものと同じである。図６の配列とは対照
的に、ここでの配列は比較的親水性が高いようである。
hＧＨ溶離による４ラウンドの選択の後、２種類のクロ
ーン（ＡＮＨＱおよびＴＬＤＴ／１７１Ｖ）がプールに
多く存在する。

【図８】図８：ブランクのビーズ上で選択したファージ
からの配列を示すものである。表示は図５で説明したも
のと同じである。グリシン溶離による３ラウンドの選択
の後、同胞体は観察されず、非機能的な配列のバックグ
ラウンド水準が保持された。

【図９】図９：ｐHＯ４１５からのファージミドfl起点
（ori）の構築を示すものである。カセット突然変異誘
発およびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の発現のため
のこのベクターを次のように構築した。pＢＲ３２２お
よびflの複製起点を含有し、大腸菌phoＡプロモーター
の制御下にhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質（hＧＨの
残基１〜１９１に１個のＧly残基が続き、これが遺伝子
IIIのＰro-１９８に融合している）を発現する、pＳ０
１３２のオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発によ
って、プラスミドpＳ０６４３を構築した。以下のオリ
ゴヌクレオチド： 5'-GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG-AGT-GGC-GGC-GGC-TCT-GGT
-3' を用いて突然変異誘発を行なった。このオリゴヌクレオ
チドは、hＧＨのＰhe-１９１に続いてＸbaＩ部位（下線
部）とアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を導入した。

【図１０】図１０：Ａは、ＨＥＲ-２受容体に指向性の
Ｆabヒト化抗体の軽鎖および重鎖（可変および不変ドメ
イン１）をコードしているＤＮＡを含有するプラスミド
pＤＨ１８８挿入体を図示したものである。Ｖ_LおよびＶ
_Hはそれぞれ軽鎖および重鎖の可変領域である。Ｃ_kはヒ
トκ軽鎖の不変領域である。ＣＨ１_G1はヒトγ１鎖の最
初の不変領域である。両暗号領域は細菌性のstIIシグナ
ル配列から始まっている。Ｂは、５Ａに示した挿入体を
含有する全プラスミドpＤＨ１８８を図示するものであ
る。このプラスミドを大腸菌ＳＲ１０１細胞に導入し、
ヘルパーファージを添加した後、このプラスミドはファ
ージ粒子にパッケージされる。これら粒子の一部はＦab
-pIII融合体を表示する（ここで、pIIIはＭ１３遺伝子I
IIＤＮＡによってコードされているタンパク質であ
る）。このプラスミド図中のセグメントは５Ａに示した
挿入体に対応している。

【図１１Ａ】図１１Ａ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｂ】図１１Ｂ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｃ】図１１Ｃ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｄ】図１１Ｄ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｅ】図１１Ｅ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｆ】図１１Ｆ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｇ】図１１Ｇ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１１Ｈ】図１１Ｈ：ファージミド表面に発現された
４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチ
ド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミ
ノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ
酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。

【図１２】図１２：変異Ｆabファージミドからの野生型
４Ｄ５ Ｆabファージミドの豊富化を示すものである。
１：１,０００の比の野生型ファージミドと変異４Ｄ５
Ｆabファージミドの混合物を、ＨＥＲ-２受容体の細胞
外ドメインタンパク質で被覆したプレートで選択した。
各ラウンドの選択の後、溶離したファージミドの一部を
大腸菌に感染させ、プラスミドＤＮＡを調製した。次い
で、このプラスミドＤＮＡをＥcoＲＶおよびＰstＩで消
化し、５％ポリアクリルアミドゲルで分離し、臭化エチ
ジウムで染色した。バンドをＵＶ光のもとで可視化し
た。野生型および変異プラスミドに起因するバンドは矢
印で示した。第１ラウンドの選択は酸条件のもとでのみ
溶離した。以後のラウンドは、酸溶離（図の左側）また
は実施例VIIIに記載した方法を用いるヒト化４Ｄ５抗体
洗浄工程とその後の酸溶離（図の右側）のいずれかによ
って溶離した。３種の変異４Ｄ５ Ｆab分子を調製し
た。即ち、Ｈ９１Ａ（Ｖ_L鎖の９１位のアミノ酸ヒスチ
ジンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ａ」レーン
に示す）、Ｙ４９Ａ（Ｖ_L鎖の４９位のアミノ酸チロシ
ンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ｂ」レーンに
示す）、ならびにＹ９２Ａ（Ｖ_L鎖の９２位のアミノ酸
チロシンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ｃ」レ
ーンに示す）である。アミノ酸位置の数え方はKabatら
に従った〔「免疫学的挿入体のタンパク質の配列」, 第
4版, U.S.Dept of Health and Human Services, Public
Health Service, Nat'l.Institute of Health, Bethes
da, MD (1987)〕。

【図１３】図１３：実験プロトコール中に記載したＲＩ
Ａ親和性測定のスカッチャード分析が示されている。結
合した標識化ＥＣＤ抗原の量がｘ軸に示されており、結
合量を遊離量で割った数値がｙ軸に示されている。線の
傾きはＫaを示し、計算したＫdは１／Ｋaである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/36 (71)出願人 596168317 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 ヘンナー，デニス・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア94044、パ シフィカ、アンジェリタ・アベニュー297 番 (72)発明者 バース，スティーブン アメリカ合衆国カリフォルニア94061、レ ッドウッド・シティー、シーラ・ストリー ト1355番 (72)発明者 グリーン，ロナルド アメリカ合衆国ノース・キャロライナ 27707、ダラム、ノーウッド・アベニュー 1014番 (72)発明者 ロウマン，ヘンリー・ビー アメリカ合衆国カリフォルニア94547、ハ ーキュリーズ、ファルコン・ウェイ205番 (72)発明者 ウエルズ，ジェームズ・エー アメリカ合衆国カリフォルニア94010、バ ーリンゲーム、コロンブス・アベニュー 1341番 (72)発明者 マシューズ，ディビッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア94122、サ ン・フランシスコ、ノリエガ・ストリート 1527番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 CA02 CA07 CA10 CA20 DA06 EA03 EA04 GA11 GA25 HA01 HA11 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 CA18 CA53 DB22 NA05 ZC042 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA01 CA40 DA31 EA30 EA34 FA74

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の群より選択されるヒト成長ホルモ
   ン変異体： (a)hＧＨアミノ酸の１７２、１７４、１７６、および１
   ７８のそれぞれが、 (1)Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｒ；(2)Ｒ、Ａ、Ｙ、Ｒ；(3)Ｋ、Ｔ、
   Ｙ、Ｋ；(4)Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ｒ；(5)Ｋ、Ａ、Ｙ、Ｒ；(6)
   Ｒ、Ｆ、Ｆ、Ｒ；(7)Ｋ、Ｑ、Ｙ、Ｒ；(8)Ｒ、Ｔ、Ｙ、
   Ｈ；(9)Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｒ；(10)Ｋ、Ｋ、Ｙ、Ｋ；(11)
   Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｓ；および(12)Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｒよりなる群
   からグループとして順に選択されるヒト成長ホルモン変
   異体； (b)hＧＨアミノ酸の１０、１４、１８および２１のそれ
   ぞれが、 (1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ；(2)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ；(3)Ｆ、Ｓ、
   Ｆ、Ｌ；(4)Ｙ、Ｔ、Ｖ、Ｎ；および(5)Ｉ、Ｎ、Ｉ、Ｎ
   よりなる群からグループとして順に選択されるヒト成長
   ホルモン変異体； (c)hＧＨアミノ酸の１７４がセリンであり、１７６がチ
   ロシンであり、そしてhＧＨアミノ酸の１６７、１７
   １、１７５および１７９のそれぞれが、 (1)Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；(2)Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；(3)Ｋ、Ｓ、
   Ｔ、Ｌ；(4)Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；(5)Ｒ、Ｄ、Ｉ、Ｉ；およ
   び(6)Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｑよりなる群からグループとして順
   に選択されるヒト成長ホルモン変異体； (d)hＧＨアミノ酸のグルタメート₁₇₄がセリン₁₇₄によっ
   て置換され、フェニルアラニン₁₇₆がチロシン₁₇₆によっ
   て置換され、そして８個の天然hＧＨアミノ酸Ｆ１０、
   Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７
   ５およびＩ１７９の１またはそれ以上が別の天然アミノ
   酸によって置換されているヒト成長ホルモン 変異体； (e)(d)のhＧＨ変異体において、８個の天然hＧＨアミノ
   酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７
   １、Ｔ１７５およびＩ１７９のそれぞれが、 (1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ； (2)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｅ、
   Ｓ、Ｔ、Ｉ；(3)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ； (4)Ａ、Ｗ、
   Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；(5)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；
   (6)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；(7)Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、
   Ｔ、Ｔ； (8)Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；(9)Ｆ、Ｓ、Ｆ、
   Ｌ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ； (10)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｎ；(1
   1)Ａ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｎ； (12)Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、
   Ｓ、Ｔ、Ｔ；(13)Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｓ； (14)Ｈ、
   Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；(15)Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、
   Ｔ； （16）Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；(17)Ｑ、Ｙ、Ｎ、
   Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ； (18)Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；(1
   9)Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｓ、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｖ； (20)Ｗ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、
   Ｓ、Ｔ、Ｔ；(21)Ａ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ； (22)Ｐ、
   Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；(23)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、
   Ｓ； (24)Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；(25)Ｍ、Ｔ、Ｓ、
   Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｔ； (26)Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｓ；(2
   7)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ； (28)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、
   Ｓ、Ｔ、Ｎ；(29)Ｍ、Ｑ、Ｍ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ； (30)Ｈ、
   Ｙ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；(31)Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、
   Ｉ； (32)Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；(33)Ａ、Ｗ、Ｄ、
   Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ； (34)Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；(3
   5)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ； (36)Ｉ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、
   Ｓ、Ｔ、Ｔ；(37)Ｆ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ； (38)Ｆ、
   Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；(39)Ｍ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、
   Ｔ； (40)Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｖ、Ｔ；(41)Ｈ、Ｑ、Ｙ、
   Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；よりなる群から順に選択される対応ア
   ミノ酸によってグループとして置換されているヒト成長
   ホルモン変異体； (f)ヒト成長ホルモン変異体(e)の、ｈＧＨ変異体が、ア
   ルギニン₁₅によって置換されたロイシン₁₅およびアルギ
   ニン₁₆₈によって置換されたリジン₁₆₈をさらに含有する
   ヒト成長ホルモン変異体； (g)ヒト成長ホルモン変異体(e)のｈＧＨ変異体が、フェ
   ニルアラニン₁₇₆をさらに含有するヒト成長ホルモン変
   異体。