JP2002136290A

JP2002136290A - アミンオキシダーゼ遺伝子

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Publication number: JP2002136290A
Application number: JP2000336664A
Authority: JP
Inventors: Hiromoto Hisada; 博元久田; Yoji Hata; 洋二秦; Yasuhisa Abe; 康久安部; Kuniyasu Goto; 邦康後藤
Original assignee: TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency; Gekkeikan Sake Co Ltd
Current assignee: TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency; Gekkeikan Sake Co Ltd
Priority date: 2000-11-02
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2002-05-14

Abstract

(57)【要約】【解決手段】アミンオキシダーゼ遺伝子のクローニン
グが行われ、その塩基配列も決定された。また、このク
ローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿入す
ることにより宿主（麹菌）を形質転換した。【効果】形質転換体を培養することにより上記酵素を
大量に生産することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規アミンオキシ
ダーゼ遺伝子及びその利用に関するものである。更に詳
細には、本発明は、麹菌（アスペルギルス・オリゼー：
Aspergillus oryzae）より新規に単離したアミンオキシ
ダーゼ遺伝子を用いて、アミンオキシダーゼを大量に生
産させ、アミン測定試薬など様々な産業分野に利用する
ことを可能にするものである。

【０００２】

【従来の技術】アミン類は、様々な生物に存在し、生体
内でシグナル伝達などの重要な役割を担っている。たと
えば、血中における異常値が発ガンと関係があるとされ
るポリアミン（プトレッシン、スペルミジン、カダベリ
ン（Cancer Res. 1983, May; 43(5);2363-7））、アレ
ルギーの直接の原因とされるヒスタミンなどが挙げられ
る。これらの物質を定量する方法は、ＨＰＬＣにより分
離する方法（J. Assoc.Off. Anal. Chem. 1984, Nov-De
c; 67(6); 1040-3）、幾つかの酵素を組み合わせて使用
する方法（Cancer Res. 1983, May; 43(5);2363-7）が
現在主流である。しかしながら、これらの方法では、試
料の前処理に時間を費やさなければならないことが問題
となっている。

【０００３】そこで直接、かつ簡便に定量するために、
様々なポリアミンを基質とする糸状菌（Aspergillus ni
ger）由来のアミンオキシダーゼ（Eur. J. Biochem. 19
96,Apr 1;237(1); 256-65）を利用した測定が検討され
ている。この方法の特徴は、様々なポリアミンを酸化
する酵素であるためポリアミンの総量を定量できる、
オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素をペルオキシダ
ーゼとの共役反応により容易に発色反応として検出でき
る、などである。しかしながら、A.nigerのアミンオキ
シダーゼでは酵素の生産量について課題が残されてお
り、臨床検査用試薬として完成された技術にまでは達し
ていない。

【０００４】アミンオキシダーゼを産生する生物として
は、Hansenula polymorpha、Arthrobacter、House mous
e、Homo sapiensの報告がある。しかしながら、これら
の生物から産生される酵素は、生産性や安定性などが解
決されず、実用化に到っていない。また、細菌由来の場
合は、真核生物での発現に障害が発生する可能性もあ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】発明者が解決しようと
する課題は、モノアミン〜ポリアミンに至る各アミンの
定量をはじめ様々な産業に利用可能なアミンオキシダー
ゼを効率よく生産させることである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、遺伝子工学的手法によることとし、鋭意研究の結
果、アミンオキシダーゼをコードする塩基配列の決定に
成功し、更に該遺伝子を含有した形質転換体の作成、該
遺伝子の発現（しかも真核生物による高発現）、該形質
転換体の培養によるアミンオキシダーゼ又はアミンオキ
シダーゼ酵素活性を有するタンパク質の製造（しかも大
量製造）、そしてこの酵素（又は酵素活性を有するタン
パク質）の利用を現実に確認するのに成功し、本発明の
完成に至ったものである。以下、本発明について詳述す
る。

【０００７】アミンオキシダーゼ遺伝子又は該遺伝子を
含有するアミンオキシダーゼ酵素活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子（以下、単にアミンオキシダーゼ
遺伝子ということもある）をクローニングするため、液
体培養を行なった麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍＲ
ＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライ
ブラリーを構築する。このライブラリーの塩基配列を網
羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データベースとのホ
モロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンからア
ミンオキシダーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクロー
ンを検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅのアミン
オキシダーゼ遺伝子を単離する。単離したアミンオキシ
ダーゼ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめる。

【０００８】宿主としては、各種微生物が適宜使用可能
であるが、本発明においては真核生物を利用することが
可能であって、目的酵素を効率よく大量に生産できると
いう特徴を有する。真核生物、例えば麹菌Ａ．ｏｒｙｚ
ａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的発酵産業
で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記
発酵産業で有用なタンパク質を非常に大量に生産するこ
とである。本菌株が持つ高い蛋白生産能と醸造微生物と
しての安全性から、異種蛋白生産の宿主として注目され
ている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭62-27
2988）。発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙｚａｅを用い
た異種蛋白生産においては、Aspergillus属などの近種
の遺伝子であれば、その生産能はさらに増大することが
認められた。特にＡ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子を、Ａ．ｏ
ｒｙｚａｅの高発現プロモーター制御下で発現させた場
合、非常に大量のタンパク質が生産されることを見いだ
した（特願平11-154271、特願2000-36754）。本発明
は、この系を利用することによって、アミンオキシダー
ゼ遺伝子を麹菌で効率的に発現せしめ、アミンオキシダ
ーゼを大量生産することにはじめて成功したものであ
る。

【０００９】上記により単離したアミンオキシダーゼ遺
伝子は、単独で、あるいは麹菌のチロシナーゼ遺伝子
（ｍｅｌＯ遺伝子：Biochem. Biophys. Acta., 1261
(1), p.151, 1995）のプロモーターや固体培養において
特異的に大量発現する麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝
子（ｇｌａＢ）のプロモーター（特願平11-154271、特
開平11-243965）のような高発現プロモーターと共に、
Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、高純度な酵素蛋白を
大量に生産させることができるものである。

【００１０】遺伝子導入方法としては常法が適宜利用さ
れるが、例えば宿主としては、ｎｉａＤ変異株（硝酸を
資化できない麹菌変異株：Nitrate Reductase欠損株）
を用いる公知方法により、目的遺伝子であるアミンオキ
シダーゼ遺伝子と形質転換用マーカー遺伝子であるｎｉ
ａＤ遺伝子（Unkle, E. S. et al., Mol．Gen. Genet.,
218, p.99-104, 1989）を同時に導入する。この遺伝子
導入の際に、ベクター配列などの異種遺伝子を排除する
ことにより、異種遺伝子を全く含まないセルフクローニ
ング株の形質転換体を得ることができる。そしてこの形
質転換体を培養することにより、目的酵素を菌体内又は
菌体外に大量分泌させることができる。

【００１１】このように本発明によれば、アミンオキシ
ダーゼ遺伝子をＡ．ｏｒｙｚａｅから単離するのに成功
し、酵素蛋白をＡ．ｏｒｙｚａｅによって大量に生産さ
せることに成功したものである。そのうえ更に、該異種
遺伝子を導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種Ｄ
ＮＡが混入しない方法を採用することにより、セルフク
ローニング株となり、組換え微生物の規制からも除外さ
れるという著効が奏される。以下、本発明を更に具体的
に説明する。

【００１２】ｃＤＮＡライブラリーを網羅的に塩基配列
を決定したデータベースより、Ａ．ｎｉｇｅｒのアミン
オキシダーゼ遺伝子と相同性を示すクローンを抽出し
た。このｃＤＮＡクローンをプローブとして、Ａ．ｏｒ
ｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーより、染色
体のアミンオキシダーゼ遺伝子を含むポジティブクロー
ンを選択した。得られたポジティブクローンをテンペレ
ートとして、アミンオキシダーゼのコーディング領域、
プロモーター領域、ターミネーター領域を含む全長３．
６ｋｂについてその全塩基配列を決定した。その結果、
アミンオキシダーゼ遺伝子は３つのイントロンに切断さ
れた４つのエキソンとして存在していることが明らかと
なった。また遺伝子から推定されるタンパク質のアミノ
酸配列は６７１残基であり、Ａ．ｎｉｇｅｒとのホモロ
ジーはアミノ酸レベルで７４．９％であった。

【００１３】上記により決定した該遺伝子の全塩基配列
を配列番号２（図５、図６、図７）に示し、この塩基配
列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号
１（図１、図２、図３、図４）に示す。

【００１４】次に、この遺伝子のコーディング領域を、
Ａ．ｏｒｙｚａｅでの高発現プロモーターであるｍｅｌ
Ｏプロモーター下流に連結し（図１０）、アミンオキシ
ダーゼの麹菌での高生産を検討した。Ａ．ｏｒｙｚａｅ
の遺伝子発現ベクターにアミンオキシダーゼ遺伝子のコ
ーディング領域（ＡＴＧ下流２．２ｋｂ）を連結し、
Ａ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株に導入した。形質転
換体を４株取得し、グルコースとミネラルのみの液体培
地で、１４日間培養を行い、菌体内のアミンオキシダー
ゼ活性を測定した。その結果、ｍｅｌＯプロモター制御
下においてアミンオキシダーゼが菌体内に０．０１〜
０．０２Ｕ／ｍｇ蓄積されることが判明した。

【００１５】この酵素蛋白を精製し、アミンに対する反
応を検討した結果、n-butylamine、benzylamineを酸化
する活性が認められた。さらに本酵素とペルオキシダー
ゼとの共役反応系において、n-butylamineの定量を検討
した。その結果、n-butylamineを０．００１ｍＭ〜０．
１ｍＭの範囲で定量できることが明らかとなった。

【００１６】得られた形質転換体の内、好適なもののひ
とつを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１７９４３として寄託した。ｍｅｌＯプロモーター
プロモーターの塩基配列は、配列番号５及び図１１に示
す。

【００１７】以上の結果より、クローニングした遺伝子
断片には、アミンオキシダーゼ活性を有する蛋白がコー
ドされていることが確認できた。またこの遺伝子を用い
て、アミンオキシダーゼ蛋白を高生産させることが可能
であり、生産されたタンパク質はn-butylamineの定量の
他、様々な産業分野で応用が可能である。

【００１８】本発明にかかるアミンオキシダーゼ又はア
ミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質は、各種アミ
ンを酸化してアルデヒドとアンモニアにする作用を有す
るものである。アミン類としては、第一アミン、第二ア
ミン、第三アミン等すべてのアミンが包含される。脂肪
族アミン、脂環式アミン、芳香族アミン；モノアミンの
ほか、ジアミン、トリアミン等のポリアミンを問わず、
すべてのアミン類が包含される。

【００１９】アミンの非限定例としては次のものが挙げ
られる：メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミ
ン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、アミルアミ
ン、ヘキシルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミ
ン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチ
ルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ
プロピルアミン、トリブチルアミン、アリルアミン、シ
クロプロピルアミン、シクロブチルアミン、シクロペン
チルアミン、アニリン、モノ又はジメチルアニリン、モ
ノ又はジメチルアニリン、トルイジン、モノ又はジベン
ジルアミン、ジフェニルアミン、プトレッシン、スペル
ミジン、カダベリン、ヒスタミンその他。

【００２０】

【実施例１】アミンオキシダーゼ遺伝子のクローニング液体培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラ
リー（ＥＳＴライブラリー）の中より、A.nigerのアミ
ンオキシダーゼ遺伝子に相同性の高いクローンＡＣ２０
７８を選択した。次にＥＭＢＬ３ファージを用いたアス
ペルギルス・オリゼーＯ−１０１３株（工業技術院生命
工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１６５２８）の
染色体ジーンライブラリーより、プラークハイブリダイ
ゼーション法によりアミンオキシダーゼ遺伝子をクロー
ニングした。プローブとしては、下記に示す２種類のオ
リゴＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅
したＤＮＡを用いた。

【００２１】上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、
オリゴＤＮＡ＃１であって、その塩基配列は配列番号３
（図８）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃２であっ
て、その塩基配列は配列番号４（図９）に示される。

【００２２】この方法により約１００００個のファージ
クローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズす
るクローンλＡＯ−１を単離した。上記のオリゴＤＮＡ
をプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列
を決定し、本クローンが確かに目的のアミンオキシダー
ゼ遺伝子であることを確認した。

【００２３】

【実施例２】アミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決
定ポジティブクローンλＡＯ−１株をテンペレートとして
アミンオキシダーゼ遺伝子の全塩基配列の決定を行なっ
た。プロモーター部分、コーディング領域、ターミネー
ター部分をあわせて、３．６ｋｂの配列を決定した（配
列番号２：図５、図６、図７）。上記配列の内、１位置
から９９８の位置までがプロモーター部分であり、９９
９の位置から３１６９の位置までの領域がコーディング
領域であり、３１７０の位置から３６１３の位置までが
ターミネーター部分である。

【００２４】また、Aspergillus nigerとのホモロジー
検索の結果から、アミンオキシダーゼには３つのイント
ロンが存在し、そのコーディング領域は２１７１ｂｐで
あり、塩基配列から推定されるタンパク質は、６７１残
基であることが明らかとなった。（配列番号１：図１、
図２、図３、図４）。

【００２５】

【実施例３】アスペルギルス・オリゼーのアミンオキシ
ダーゼを多量に蓄積するアスペルギルス・オリゼー形質
転換体の作成実施例２に記載のアミンオキシダーゼ遺伝子のコーディ
ング領域（約２．２ｋｂｐ）をｍｅｌＯプロモーター下
流に接続し、プラスミドｐＩＮ９３のＰｓｔＩサイトに
挿入した麹菌発現プラスミドｐＡＯＥを作製した（図１
０）。なお、ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を配列番
号５（図１１）に示す。このプラスミドｐＡＯＥをＡ．
ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株Aspergillus oryzae 101
3 nia D（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託Ｆ
ＥＲＭＰ−１７７０７）に導入し、硝酸資化能が回復
した株を遺伝子導入株として選択した。このようにして
得た形質転換体の内、そのひとつをAspergillus oryzae
MEL-AODと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭＰ−１７９４３として寄託した。

【００２６】得られた遺伝子導入株をＣｚａｐｅｋ−Ｄ
ｏｘ培地にて液体培養を行い、菌体内のアミンオキシダ
ーゼ活性を測定した（表１）。アミンオキシダーゼ活性
の測定は、八木らの方法（八木ら（１９７７）生化学実
験講座１２、下、４７１−５４３）によって行った。

【００２７】（表１） ────────────────────────────────── 菌体内のタンパク濃度アミンオキシダーゼの比活性 ────────────────────────────────── （ｍｇ／ｍｌ）（Ｕ／ｍｇ）親株０．５１１検出できず形質転換体Ｎｏ．１０．７６７０．０１３６形質転換体Ｎｏ．２０．７２００．０２１５形質転換体Ｎｏ．６０．７８３０．００７２形質転換体Ｎｏ．７０．５９２０．００９７ ──────────────────────────────────

【００２８】その結果、アミンオキシダーゼ遺伝子を導
入した形質転換体は、菌体内に非常に高いアミンオキシ
ダーゼ活性が認められた。この結果、単離したアミンオ
キシダーゼ遺伝子には、アミンオキシダーゼ活性を有す
る蛋白がコードされていること及び該蛋白を効率的に生
産できることが確認できた。

【００２９】

【実施例４】組換えアミンオキシダーゼの利用基質を測定する方法の一例として、n-butylamineの定量
法を用いて詳しく説明する。n-butylamineが基質の場
合、アミンオキシダーゼが触媒する反応の式を以下に示
す。

【００３０】ＣＨ₃(ＣＨ₂)₃ＮＨ₃ ⁺＋Ｏ₂＋Ｈ₂Ｏ→ＣＨ₃
(ＣＨ₂)₂ＣＨＯ＋Ｈ₂Ｏ₂＋ＮＨ₄ ⁺

【００３１】反応式から明らかな様に、反応生成物のn-
butylaldehyde、過酸化水素またはアンモニアの何れを
検出してもn-butylamineを定量することが出来る。例え
ば生成した過酸化水素の検出には、比色法、蛍光法、化
学発光法、電極法などが知られており、その何れもが使
用できる。比色法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素でペルオキシダーゼの基質を酸化発色さ
せ、発色濃度を分光光度計で測定する。ペルオキシダー
ゼの基質としては、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミ
ノサリチル酸、４−アミノアンチピリンとフェノール、
２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−
６−スルフォン酸）、ビス［３−ビス（４−クロロフェ
ニル）メチル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン
等が利用できる。

【００３２】蛍光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒に
より、過酸化水素で基質を酸化して蛍光物質を生成さ
せ、その蛍光強度を蛍光光度計で測定する。ペルオキシ
ダーゼの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、
ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などが利用でき
る。化学発光法では、ペルオキシダーゼ等の触媒によ
り、過酸化水素で基質を酸化して発光させ、その発光強
度をルミノメーターで測定する。化学発光する基質とし
ては、ルミノール化合物、ルシゲニン、アリルシュウ酸
エステル類の化合物などが利用できる。アミンオキシダ
ーゼとポリアミンの検出に必要な前記の試薬成分を含む
試薬を調製し、ポリアミンの測定キットとして診断薬に
組み立てることが出来る。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、麹菌のアミンオキシダー
ゼを大量に生産することがはじめて可能となり、各種ア
ミン測定用の検査薬への応用などアミンオキシダーゼを
産業上広く利用することを可能にするものである。また
本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産され
る酵素蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧
品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。

【００３４】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ <110> Gekkeikan Inc., Ltd. <120> Amine Oxidase Gene <130> 6327 <141> 2000-11-2 <160> 5 <210> 1 <211> 671 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 1 Met Ala Pro His Pro Leu Ala Ile Leu Ser Glu Glu Glu Thr Asn 5 10 15 Ile Ala Arg Glu Val Val Val Ala Ala His Pro Asn Thr Val Leu 20 25 30 His Phe Arg Glu Ile Tyr Leu Ser Glu Pro Pro Lys Glu Gln Leu 35 40 45 Gln Glu Phe Leu Ala Ile Glu His Ala Gly Arg Leu Ser Pro Thr 50 55 60 Thr Pro Arg Pro Pro Arg Leu Ala Leu Cys Gln Tyr Asp Val Ile 65 70 75 Ser Gly Asp Arg Ile Pro Val Tyr Gln Glu Ala Glu Val Asp Val 80 85 90 Asn Thr Arg Lys Arg Val Gln His Lys Ile Ile Gly Lys Glu His 95 100 105 His Ala Ala Leu Thr Leu Ala Glu Phe Glu Val Leu Val Glu Arg 110 115 120 Cys Phe Ala Ser Pro Leu Phe Gln Lys Ala Met Glu Asp Phe Asp 125 130 135 Leu Pro Lys Gly Phe Glu Val Val Ile Glu Pro Trp Pro Tyr Gly 140 145 150 Gly Arg Asp His Ser Asp Pro Asn Arg Arg Phe Phe Gln Ala Leu 155 160 165 Cys Phe Ala Thr Asn Thr Thr Lys Asn Asn Glu Asp Ala Asn Phe 170 175 180 Tyr Ser Tyr Pro Leu Pro Ile Ile Pro Val Met Asp Ala Thr Thr 185 190 195 Gln Glu Ile Val Arg Ile Asp Arg Pro Ala Thr Gly Gly Lys Gly 200 205 210 Glu Gly Leu His Glu Gln Thr Phe Ser Arg Asp Ile Ile Gly His 215 220 225 Cys Lys Asp Ser Asp Tyr Val Pro Glu Leu Leu Pro Asn Gly Ser 230 235 240 Arg Lys Asp Leu Lys Pro Leu Asn Val Val Gln Pro Glu Gly Pro 245 250 255 Ser Phe Lys Ile Thr Asn Glu Ser Leu Val Glu Trp Gln Lys Trp 260 265 270 Arg Phe Arg Val Ala Phe Asn Pro Arg Glu Gly Ala Thr Ile His 275 280 285 Asp Val Trp Tyr Asp Gly Arg Ser Val Met Tyr Arg Leu Ala Ile 290 295 300 Ser Glu Met Thr Val Pro Tyr Ala Asp Pro Arg Pro Pro Tyr His 305 310 315 Arg Lys Gln Ala Phe Asp Phe Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asn Met 320 325 330 Ala Asn Asn Leu Ser Ile Gly Cys Asp Cys Leu Gly Val Ile Lys 335 340 345 Tyr Phe Asp Ala Val Ile Thr Gly Ala Asp Gly Lys Ala Gln Lys 350 355 360 Leu Pro Asn Ala Ile Cys Leu His Glu Gln Asp Asn Gly Ile Gly 365 370 375 Trp Lys His Ser Asn Trp Arg Thr Gly Arg Ala Val Val Thr Arg 380 385 390 His Arg Glu Leu Val Val Gln Phe Ile Ile Thr Leu Ala Asn Tyr 395 400 405 Glu Tyr Ile Phe Ala Tyr Lys Phe Asp Gln Ala Gly Gly Ile Thr 410 415 420 Val Glu Ser Arg Ala Thr Gly Ile Leu Asn Val Val Asn Ile Asp 425 430 435 Pro Gly Lys Thr Ser Asp Tyr Gly Asn Val Val Ser Gly Gly Val 440 445 450 Leu Ala Gln Asn His Gln His Ile Ser Cys Val Arg Met Asp Pro 455 460 465 Ala Val Asp Gly Ala Asn Asn Ser Val Val Ile Glu Glu Ser His 470 475 480 Pro Glu Pro Met Asn Glu Ala Thr Asn Pro Asn Gly Asn Tyr Tyr 485 490 495 Lys Val Thr Asn Gln Thr Ile Glu Arg Ala Thr Tyr Leu Asp Ala 500 505 510 Ala Pro Gln Leu Asn Arg Val Val Lys Met Val Asn Pro Asn Lys 515 520 525 Thr Asn Pro Ile Ser Gln Lys Pro Val Ala Tyr Lys Phe Thr Pro 530 535 540 Leu Ala Thr Gln Thr Leu Leu Ala Asp Pro Asn Ser Ile Gln Ala 545 550 555 Arg Arg Ala Gln Phe Ala Gln His His Val Trp Val Thr Lys Tyr 560 565 570 Arg Asp Ala Glu Leu Tyr Ala Gly Gly Arg Tyr Thr Leu Gln Ser 575 580 585 Gln Val Glu Val Asp Gly Val Arg Asp Ala Val Lys Arg Gly Asp 590 595 600 Ala Val Asp Asn Thr Asp Val Val Val Trp Ser Thr Phe Gly Ile 605 610 615 Thr His Asn Pro Arg Val Glu Asp Trp Pro Val Met Pro Val Glu 620 625 630 Ile Phe Gln Leu Met Ile Arg Pro Ser Asp Phe Phe Thr Glu Asn 635 640 645 Pro Ala Ile Asp Val Pro Ser Gly Lys Asn Ala Ala Ser Arg Val 650 655 660 Val Gln Ser Glu Cys Cys Arg Asn Ser His Ile 665 670 <210> 2 <211> 3613 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 2 tagcacgcac ctggaatagt ctgtgcgcta tcactcggca caagcgcatg cgccaatacg 60 gccccatacc tgctgcggaa aagcaagtca ttggctaaca atgataggtg cttcccatat 120 tacagacact taggcatcat atgaccccga tgtaacaccg tcccttgctc cactttgaac 180 tcgcatttgg ttggattcgg gttgcgtacc agagagaaca aaatgcgatc tttaggatcc 240 agattgtgtt ggcgtgtctc tgctcgaatg ccttttagac atattagggc ttgcaggttt 300 cagttgacat ggatagttga atcttgaacc tctctctgag tttgtgttct cataagttga 360 caagggtgat atagcgcaaa tattacttgt tatgatagct ggatgctgtc ttttctgata 420 gtcgggtggt ttgggccatt cttttagaat taacccgttt gaactatccg ttcaaggacc 480 cacatcaaaa tatgtttcag actctcaatt tagtcgctag gcacaagata gcattgagtc 540 aatcagatac aatgtcagta tttcctttac ttcccggtta cgactccctt gcagcattta 600 acatatttag tagtcaaaac ttgctgcggt taagtgtagt gctggttggt gtgtgtcaaa 660 gtatatacta tgaccaagag aggcgttcgg gagttgacga ggaggacaag gttatcttga 720 accacaactc ccgctatcaa aaacacaagt catagcttca aaatcaatcc gatagatcga 780 tagatcgata ggcaacgaaa tcaaatcgcg gggttcccca aggaagggtt ccgcgcgctc 840 cgaggcaaac cgtcggactc aattccgacg ttccgagtgg agatatctcg cttatctcga 900 ttgggaaaca gttacgctgg cttcatgcat aataagcgcg cctcttccta cctttcgtcc 960 tcttttttcc tcagactatc aacagatcca aattaaccat ggcgcctcat ccccttgcca 1020 ttctctccga ggaggagaca aacattgccc gcgaggttgt tgtcgctgca cacccaaaca 1080 cagttcttca cttccgtgag atttacttgt cggaaccccc gaaagagcaa ctccaggagt 1140 tcctggctat cgaacatgca ggacgtctca gtccaactac gcctcgcccc cctcgactgg 1200 ctttgtgtca gtacgatgtg attagcggtg accgcattcc agtctatcaa gaggcggagg 1260 tcgatgtgaa tacccgcaag cgtgtgcagc acaagattat tggaaaggag caccatgctg 1320 ctttgacttt gtacgtctcg aatggattca ttgattgttg acaaaagatt aacatgggtg 1380 acagggccga attcgaggtc ttggtcgaac ggtgtttcgc ttccccactg ttccagaaag 1440 ccatggagga ctttgacctc cccaagggct ttgaggttgt cattgagcca tggccatacg 1500 gtggacgtga ccactccgat cccaaccggc gtttcttcca ggctttgtgc tttgcgacaa 1560 ataccactaa gaataacgag gatgccaact tctactctta tcctctgccc atcatccctg 1620 tcatggatgc caccacccaa gaaattgtcc gcattgaccg tcccgcgacc ggaggtaagg 1680 gtgagggatt gcatgagcag accttctccc gagacattat cggccattgc aaggactccg 1740 actatgtacc agaactgctg ccgaacggaa gccggaagga cttaaagcca ctgaacgtcg 1800 tgcagccgga gggcccttca ttcaagatca ccaatgagtc acttgtcgaa tggcagaagt 1860 ggcggttccg tgtcgcattc aacccgcgtg agggtgcaac gattcacgat gtctggtatg 1920 atggccgcag tgtcatgtac cgactggcta ttagtgagat ggtgagtcaa ccaactttgg 1980 gcccacccgc aggaaggtac taacaatagc agacggtccc atacgccgat cccaggcctc 2040 catatcaccg taagcaggct ttcgacttcg gtgatggtgg cggtggtaac atggccaaca 2100 acctgtccat cggttgcgat tgcctaggtg tcatcaaata cttcgatgcc gtcatcaccg 2160 gtgcggacgg caaggcccag aagctgccca acgcaatctg cttgcacgaa caggacaacg 2220 gcattggttg gaagcattcc aactggcgga ccggccgtgc tgtggtgact cgccaccggg 2280 agctcgtcgt acagttcatc atcaccctcg ctaactatga gtacatcttc gcgtacaagt 2340 tcgaccaagc aggaggtatt acggtcgagt cgcgtgccac gggtatcttg aacgtggtca 2400 acattgaccc cggcaagacg agcgattacg gaaacgtggt cagtggaggt gttctggccc 2460 agaaccatca gcatatctcc tgtgttcgta tggatcctgc cgtcgatgga gcaaacaatt 2520 ccgttgtcat tgaagaatca catcccgaac ccatgaacga agccaccaac cccaacggta 2580 actactacaa ggtcacgaat cagacgattg agcgcgccac ctatctggat gccgccccgc 2640 agctgaacag agtggttaag atggtcaacc ccaacaagac caacccaatt agtcagaagc 2700 ctgtggcata caaattcaca cctttagcca cccagacgct cttggcggat ccgaactcca 2760 tccaggctag gcgtgcccag tttgcccagc accatgtctg ggtcaccaag taccgtgacg 2820 ctgagctgta tgctggcggt cgctacacgc tccagagcca ggtagaggtg gacggtgtgc 2880 gcgacgccgt caagcgaggg gacgccgtcg acaacactga tgtcgtggtc tggagcacgt 2940 tcggtatcac ccataaccct cgtgttgagg attggcccgt tatgtaagtt gacccgtttt 3000 tacattattg aaaactctat gctaacaaat aaacaggcca gtcgagatct tccagctcat 3060 gatccgccca tcggacttct tcaccgagaa cccagcgatc gacgttccgt ccggcaagaa 3120 tgctgcctct cgcgtcgttc agtcggagtg ctgccggaac tcgcatattt aggtactggg 3180 taaggttatg ctcgagttga tgatttcttt ctatctgtac agtacatagt tagcgttgga 3240 cttggcagtt ggtgtacggt cggactgtca acgtaaatag gccgatttgg aattccgagc 3300 gaataacggt tggagctatg aattgaattc tggtacattt caaggacttt attccgacta 3360 ttcttttttt ggttattcca tatcagcctt ttgtgaaata ggaattggtt gaaagaagta 3420 gatctatatt attaacgcca agactaaaga tagggtaggg aaatgggcca tttagcatca 3480 gacgtcgggg tcatcacagg gggtctaggt cgaagagtct agaccgcatt cctgctttca 3540 cagcatagta agtcatagtg agggcacaga ggttggtact ctatgtcaaa caaagacctc 3600 ctccgggcca atg 3613 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ataccgaacg tgctccagac cacg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gtccgaccgt acaccaactg ccaag 25 <210> 5 <211> 1173 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 5 gcttgccttg gctcaaatcg ttcatgacac ccatctaggc catggcgcct gtagagcagg 60 ttacatttca tggccggtta atccgaatcc agtgcttgca catgtagcgc cacatggtct 120 gtgctattct attctgtgtt ataatagtgt gatttattgc gtttgggcgt ttcagttgat 180 tcgactggcc ttgcacatta ctctcgcatt ccacagctgg ctggaggagt tatctttact 240 tcttctttgt gactgtggct gcatgaggcg cttagtatac tatcagctga tactatgttg 300 aaactgaatc acggtgcttg aaggtctgcg tgaagtggtt cattgggctg tgatattaac 360 cgcagcctgt ctagaactat gactagacgg agcgccaaga atggacgaca acaggaatac 420 tgcccagcta gccacagctg aatcctaaag aagtttgcca gccctcgtat tcctatcctg 480 catggacggc aacattgccc tgacgagcta aattaggccg cagcgctagt attagaatga 540 actacggtag caatgagggg aacgcccaca agccaattaa cagcgctagt cttgatatga 600 cgggcctagc cttaattacg gggtactgtg aggacgttgt gcctgctgca attgtctatc 660 cgtgccgacg gtgttgacag ccactagcca ttcagctcgc cacactttca accccacacc 720 tcaaagtaag acctaaactt attttggact tccttgcagc tactatgctg tcactgttat 780 ttgactggac atgacatgca gtatcatggc gccaataaag agagtatctc gagagtttca 840 ttgcatcgta ggaaaggctt gcattccggt gttgccggga aagggatcat tggtaatgcg 900 tagttgtttt gtctagctgt gatgccgggc tttgatggac ggaggacctg gagtgcagct 960 cttcatgcaa agcccgagat agactgattt gtaacatgtg tgatgcgtat cattcattat 1020 caatacgtct cgtggatatt taagaagggc gacagtcgtg tgaatatccg ctacttcaag 1080 ttcaaaacat cattcctacg aaaaggaaaa ccacagcttc cgcttcaaag ccctagtcaa 1140 cactagttca tcttctgatt actttggttc aca 1173

【図面の簡単な説明】

【図１】アミンオキシダーゼのアミノ酸配列を示す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】同上続きを示す。

【図４】同上続きを示す。

【図５】アミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を示す。

【図６】同上続きを示す。

【図７】同上続きを示す。

【図８】オリゴＤＮＡ＃１プライマーを示す。

【図９】オリゴＤＮＡ＃２プライマーを示す。

【図１０】麹菌発現プラスミドｐＡＯＥ構築及びその制
限酵素地図を示す。

【図１１】ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:69）Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者安部康久京都府宇治市宇治大谷29番地の41 (72)発明者後藤邦康広島県東広島市鏡山３丁目７番１号国税庁醸造研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA08 CA04 DA11 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD03 LL02 LL03 LL05 4B065 AA63X AA63Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA47

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
を有するアミンオキシダーゼ酵素活性を有するタンパク
質。
【請求項２】配列番号２の塩基配列で示される、請求
項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくと
もコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項４】組換えベクターｐＡＯＥ。
【請求項５】請求項３又は４に記載の組換えベクター
を麹菌に導入してなる形質転換体。
【請求項６】 Aspergillus oryzae MEL-AOD（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７９４３）。
【請求項７】請求項５又は６に記載の形質転換体を利
用すること、を特徴とするアミンオキシダーゼタンパク
質を生産する方法。
【請求項８】請求項１に記載のタンパク質を使用する
こと、を特徴とするアミン類の測定方法。
【請求項９】請求項１に記載のタンパク質を含有して
なること、を特徴とするアミン類の測定試薬。