JP2002065248A

JP2002065248A - 有機化合物で汚染された環境の微生物による修復をメタロチオネインにより効率化する方法

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Publication number: JP2002065248A
Application number: JP2000257458A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Yano; 哲哉矢野; Takeshi Imamura; 剛士今村; Takeshi Nomoto; 毅野本
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2002-03-05

Abstract

(57)【要約】【課題】有機化合物により汚染された環境物質と、
該有機化合物の分解能力を有する微生物を接触させる工
程と、該接触状態で該有機化合物の分解を行なう工程と
を含む、環境の修復方法において、分解中間産物による
毒性あるいは分解酵素発現そのものに由来する毒性によ
る分解活性の低下を防止する方法を提供する。【解決手段】有機化合物の分解を行なう工程中に、
該分解系内のメタロチオネインを増強させることにより
修復の効率を上げることを特徴とする、環境の修復方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は有機化合物で汚染さ
れた液体、土壌、及び空気等の環境を微生物を用いて浄
化修復する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、生体に対し有害でありかつ難分解
性である揮発性有機塩素化合物による環境汚染が大きな
問題となってきている。特に、国内外の紙・パルプ工業
や精密機械関連産業地域の土壌中にはテトラクロロエチ
レン(ＰＣＥ)やトリクロロエチレン(ＴＣＥ)、ジクロロ
エチレン(ＤＣＥ)等の揮発性有機塩素化合物による汚染
がかなりの範囲で拡がっていると考えられており、実際
に環境調査等で検出された事例が多数報告されている。

【０００３】これらの揮発性有機塩素化合物は土壌中に
残留したものが雨水等により地下水中に溶解して周辺地
域一帯に拡がるとされている。このような化合物は発癌
性や生殖毒性の疑いがあり、また環境中で非常に安定で
あるため、特に飲料水の水源として利用されている地下
水の汚染は大きな社会問題とされている。

【０００４】このようなことから、揮発性有機塩素化合
物の除去、分解による、汚染地下水等の水性媒体、土
壌、及びそれに伴う周辺気相の浄化は、環境保全の視点
から重要な課題であり、浄化に必要な技術の開発が行な
われてきている。

【０００５】例えば、活性炭による吸着処理、光や熱に
よる分解処理等が検討されてきたが、コストや操作性の
面からかならずしも実用的であるとはいえない。

【０００６】一方、環境中では安定であるＴＣＥ等の揮
発性有機塩素化合物に対して近年微生物による分解が報
告され、その実用化に向けた研究がなされ初めている。
即ち、微生物を用いた生物分解処理では用いる微生物を
選択することで無害な物質までに揮発性有機塩素化合物
を分解できること、基本的に特別な薬品が不要であるこ
と、メンテナンスにかかる労力やコストを軽減できるこ
と等の利点がある。

【０００７】揮発性有機塩素化合物の分解菌のうち、例
えばトリクロロエチレン(ＴＣＥ)分解菌としては、以下
の単離株が報告されており、これらを用いることができ
る。Ｗelchia alkenophila sero ５(ＵＳＰ４８７７７３
６、ＡＴＣＣ 53 570)、Ｗelchia alkenophila sero ３
３(ＵＳＰ４８７７７３６、ＡＴＣＣ 53 571)、Ｍethy
locystis sp.strain Ｍ(Ａgric.Ｂiol.Ｃheｍ.,５３、2
903(1989)、Ｂiosci.Ｂiotech.Ｂiocheｍ.,５６、486(1
992)、同５６、736(1992))、Ｍethylosinus trichospri
uｍＯＢ３(Am.Chem.Soc.Natl.Meet.Dev.Environ.Micro
biol.,２９、365(1989)、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,
５５、3155(1989)、Ａppl.Ｂiocheｍ.Ｂiotechnol.,２
８、877(1991)、特開平２-９２２７４号公報、特開平３
-２９２９７０号公報)、Ｍethyloｍonas sp.ＭＭ２(Ａp
pl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,５７、236(1991))、Alcalige
nes denitrificans ssp.xylosoxidans JE75、(Ａrch.ｍi
crobiol.,１５４、410(1990))、Ａlcaligenes eutrophu
s ＪＭＰ134(Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,５６、1179
(1990)) Ａlcaligenes eutrophus ＦＥＲＭ-13 761(特開平７-１
２３９７６号公報)、Pseudoｍonas aeruginosa ＪI104
(特開平７-２３６８９５号公報)、Ｍycobacteriuｍ vac
cae ＪＯＢ５(Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiol.,８２、163(1974)、
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,５４、2960(1989)、ＡＴ
ＣＣ 29 678)、Pseudoｍonas putida ＢＨ(下水道協会
誌,２４、27(1987))、Ｇ４株(Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobi
ol.,５２、383(1986)、同５３、949(1987)、同５４、95
1(1989)、同５６、279(1990)、同５７、193(1991)、Ｕ
ＳＰ４９２５８０２,ＡＴＣＣ 53 617、この菌は初めP
seudoｍonas cepaciaと分類されていたが、Pseudoｍona
s sp.に変更された。)、Pseudoｍonas ｍendocina ＫＲ
-１(Ｂio/Ｔechnol.,７、282(1989))、Pseudoｍonas pu
tida Ｆ１(Ａppl.Environ.Ｍicrobiol.,５４、1703(198
8)、同５４、2578(1988))、Pseudoｍonas fluorescens
ＰＦＬ１２(Ａppl.Environ.Ｍicrobiol.,５４、2578(19
88))、Pseudoｍonas putida ＫＷI-9(特開平６-７０７
５３号公報)、Pseudoｍonas cepacia ＫＫ01(特開平６-
２２７７６９号公報)、Ｎitrosoｍonas europaea(Ａpp
l.Environ.Ｍicrobiol.,５６、1169(1990))、Ｎocardia
corallina Ｂ-276(特開平８-７０８８１号公報、ＦＥ
ＲＭＢＰ-5124,ＡＴＣＣ 31 338) しかし、特にＴＣＥやＤＣＥといった塩素化エチレン化
合物の分解菌を実際の環境浄化処理に用いる場合に非常
に問題となるのが、それらの化合物を分解するために、
その分解誘導物質(インデューサー)として芳香族化合物
やメタン等の化学物質を必要とするということである。

【０００８】例えば、フェノールやトルエンといった芳
香族化合物は非常に優れた誘導物質であるが、その毒性
が高く、環境中への放出は何らかの規制に基づいて行な
う必要があり、また、同じく優れた誘導物質であるメタ
ンは、可燃性の気体であり、環境中での制御が非常に危
険かつ煩雑である。

【０００９】このような問題を解決する一つの方法が特
開平４-５０２２７７号公報に開示されている。該方法
では、塩素化エチレンの微生物分解誘導物質として芳香
族アミノ酸の一つであるトリプトファンを用いて誘導物
質の毒性及び危険性の問題を回避している。更に、特開
平７-１７１５４８号公報によれば、草本類植物より抽
出した天然物質であるリグノセルロースを誘導物質とし
て用い、上記の問題を回避している。

【００１０】また、分解微生物の改良という点で見れ
ば、分解酵素であるオキシゲナーゼ或いはハイドロキシ
ラーゼをコードする遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を組み
込んだプラズミドを宿主細菌に導入し、無害な誘導物質
により、或いは誘導物質が存在しない条件下でも構成的
に分解活性を発現させようとする試みがなされている。

【００１１】ＤＮＡ断片由来菌株としては、シュードモ
ナス・メンドシナＫＲ-１(特開平２-５０３８６６号公
報)、シュードモナス・プチダＫＷ1-9(特開平６-１０５
６９１号公報)、シュードモナス・プチダＢＨ(地下水・
土壌汚染とその防止対策に関する研究集会第３回講演
集、231(1994))等が挙げられる。

【００１２】また、別の解決法が国際公開番号ＷＯ９２
/１９７３８号公報に開示されている。本報によれば、
フェノールやトルエン等の誘導物質を用いることなく塩
素化エチレン化合物を分解する変異株を、トランスポゾ
ンを用いた変異によって取得した。

【００１３】また、更に別の解決法が、米国特許第５５
４３３１７号、及び特開平８-２９４３８７号公報に開
示されている。本報によれば、フェノールやトルエン等
の誘導物質を用いることなく塩素化エチレン化合物や芳
香族化合物を分解する変異株を、変異源であるニトロソ
グアニジンで処理することにより取得した。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】このように、塩素化エ
チレン化合物や芳香族化合物を微生物分解処理する際の
誘導物質に関する問題は回避されつつあり、微生物の分
解による環境修復処理という技術に対しては充分実用に
耐えうるものとなりつつある。

【００１５】更に有機化合物の、微生物の分解による環
境修復処理において、長期間の浄化を必要とする場合が
有り、そのためには、微生物の分解活性を長期間にわた
り維持する必要があるが、現状の技術ではこれらの微生
物の分解活性が非常に短期間で失活してしまうという事
実が存在する。有機化合物の、微生物の分解による環境
修復処理においては、該微生物の培養に時間やコストが
かかり、一旦培養された微生物の目的とする能力を最大
限に有効活用することが必須である。

【００１６】該微生物の分解活性が非常に短期間で失活
してしまう現象の原因は、分解酵素の菌体内での自己消
化、分解中間産物による毒性、分解に必要なエネルギー
の不足等々が考えられているが、この中でも、分解中間
産物による毒性、分解酵素発現そのものに由来する毒性
の問題は、該有機化合物の微生物分解活性の消失という
意味で大変重要な課題である。

【００１７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは分解
中間産物による毒性あるいは分解酵素発現そのものに由
来する毒性による分解活性の低下の問題を解決する方法
を鋭意研究した結果、以下の方法を発明するに至った。
すなわち:環境を汚染している有機化合物を分解して環
境を修復する方法であって、有機化合物により汚染され
た環境物質と、該有機化合物の分解能力を有する微生物
を、分解系内において接触させる工程と、該接触状態で
該有機化合物の分解を行なう工程とを含む、環境の修復
方法において、該分解系内のメタロチオネインの存在下
で該分解を行なうことを特徴とするものである。

【００１８】前記分解系に前記メタロチオネインを存在
させる方法は、直接を前記分解系内に添加することで
も、微生物に分解酵素系とともにメタロチオネイン生成
酵素を共発現させることでもよい。

【００１９】該有機化合物が塩素化脂肪族化合物、とり
わけトリクロロエチレン、またはジクロロエチレンであ
ることが好ましい。

【００２０】前記環境には、液体、土壌、空気などが挙
げられる。

【００２１】前記環境が空気の場合、該微生物を含む溶
液中に該有機物質を含む空気を導入することが好まし
い。

【００２２】前記環境が土壌である場合、前記接触工程
として、前記微生物を含む液体を該土壌中に導入するこ
とができる。この場合、導入を、該土壌に設けた注入井
から行なうのが好ましい。また、前記接触工程として逆
に、該微生物を含む溶液中に該土壌を導入することもで
きる。また、該微生物を含む溶液と該土壌とを混合して
もよい。

【００２３】前記微生物が、担体に担持されていてもよ
い。この場合前記接触工程は該担体と前記環境の接触で
あり、特に、前記環境が液体または気体の場合、前記担
体に接触させる前記液体または気体の導入と、前記分解
処理後の液体または気体の排出が、該担体を充填した部
分をはさんで互いに反対側の位置にある導入口と排出口
から行なわれるのが好ましい。

【００２４】前記微生物の代表的なものとして、ＪＭ１
株(ＦＥＲＭＢＰ-5352)、シュードモナス・セパシアＫ
Ｋ01株(ＦＥＲＭＢＰ-4235)を挙げることができる。

【００２５】

【発明の実施の形態】本発明の有機化合物の分解で分解
系で共存するメタロチオネインは、カドミウム結合タン
パク質として見い出された分子量約 6000 の低分子量タ
ンパク質であり、その構成アミノ酸の１/３がシステイ
ンであり、しかも分子内Ｓ-Ｓ結合を１つも有さないと
いうきわめて特異的な構造を持つ。近年の研究よりメタ
ロチオネインがアルキル化剤、放射線、紫外線などの障
害に対して軽減作用を示すことが明かとなってきてお
り、薬毒物に対する重要な生体防御タンパク質の一つと
して認識されるに至っている。

【００２６】塩素化エチレン化合物や芳香族化合物の微
生物分解に供される酵素群は、その反応機作として、Ｎ
ＡＤＨから電子を受け取り、この電子と酸素により活性
中心が活性化されることにより基質に酸素を添加するこ
とが知られている。ここで電子のやりとりを行なう酵素
系においては、ある程度の確率で電子の漏えいが起こる
ことが知られており、たとえばこの漏えいした電子が酸
素にわたると、スーパーオキシドアニオン、過酸化水
素、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素種が生じること
が知られている。上に記したように塩素化エチレン化合
物や芳香族化合物の微生物分解に供される酵素群は電子
のやりとりを行なう酵素系であり、分解酵素発現による
毒性についてはこれらの活性酸素種が原因である可能性
が高い。

【００２７】ここで、一般的にＳＨ化合物は活性酸素除
去作用を示すことが知られており、さらに上に記したよ
うにメタロチオネインは遊離ＳＨ基に富んだタンパク質
であり、ヒドロキシルラジカルを効果的に除去する能力
を有していることが明かになっている。その反応定数は
システイン、グルタチオンに比較し約４００倍と見積も
られている。

【００２８】このように酸化ストレスによって生じる過
酸化物の還元無毒化、或いは様々な外来化合物の抱合、
排出といった生体防御機能の一部をメタロチオネインが
機能することにより行なわれていることが知られてお
り、本発明者らは分解中間産物による毒性あるいは分解
酵素発現そのものに由来する毒性による分解活性の低下
の問題を解決する方法を鋭意研究した結果、該微生物を
該有機化合物に接触せしめて分解を行なわせる際の、メ
タロチオネインの共存が分解活性の低下の問題を解決す
る方法としてきわめて効果的であることを見い出した。

【００２９】この様なメタロチオネインを分解酵素とと
もに共存させる方法については通常の手法を用いること
ができ、さらにメタロチオネインの起源についても特に
その制約はない。

【００３０】また上述のようにメタロチオネインを分解
酵素とともに共存させるための手段として、メタロチオ
ネイン生成酵素を分解酵素とともに共発現あるいは過剰
発現させる方法を用いることも可能であり、その方法に
ついては従来提供されている遺伝子工学の手法を用いる
ことができ、さらにメタロチオネインの起源についても
特にその制約はない。

【００３１】また本発明に用いる分解微生物としては、
芳香族化合物および/あるいは有機塩素化合物を分解し
うる微生物であればいかなるものでもよく、具体的には
エシェリチア(Esherichia)属、シュードモナス(Pseudo
ｍonas)属、バークホルデリア(Burkholderia)属、アシ
ネトバクター(Acinetobacter)属、モラセラ(Ｍoraxell
a)属、アルカリゲネス(Ａlcaligenes)属、ラルストーニ
ャ(Ralstonia)属、コマモナス(Coｍaｍonas)属、ビブリ
オ(Ｖibrio)属、ノカルジア(Ｎocardia)属、バチルス(B
acillus)属、ラクトバチルス(Ｌactobacillus)属、アク
ロモバクター(Achroｍobacter)属、アルスロバクター
(Ａrthrobacter)属、ミクロコッカス(Ｍicrococcus)
属、マイコバクテリウム(Ｍycobacteriuｍ)属、メチロ
シナス(Ｍethylosinus)属、メチロモナス(Ｍethyloｍon
as)属、ベルキア(Ｗelchia)属、メチロシスチス(Ｍethy
locystis)属、ニトロゾモナス(Ｎitrosoｍonas)属、サ
ッカロミセス(Saccharoｍyces)属、カンジダ(Candida)
属、トルロプシス(Torulopsis)属、に属する微生物など
が挙げられる。

【００３２】浄化の対象としての汚染物質はトリクロロ
エチレン(ＴＣＥ)やジクロロエチレン(ＤＣＥ)等の塩素
化エチレン化合物を挙げることができ、本発明の方法は
該汚染物質で汚染された液体、土壌、空気いずれの浄化
にも用いることができる。

【００３３】この様なメタロチオネインを与える時の効
果的な濃度としては、１μｍol/Lから１ｍｍol/L、より
好ましくは１０μｍol/Lから５００μｍol/L程度である
が、用いる微生物の種類によって若干異なる。

【００３４】本発明の実施形態において用いる微生物の
一つであるシュードモナス・セパシアＫＫ01株(ブタペ
スト条約に基づく国際寄託の番号:ＦＥＲＭＢＰ-423
5、受託日:平成４年３月１１日)は平８-２４５８９号特
許公報においてフェノール、クレゾール等の芳香族化合
物を分解する菌として公告された菌株であり、特開平６
-２９６７１１号公報において、フェノール等の芳香族
化合物を誘導物質としてＴＣＥ等の有機塩素化合物を分
解することが開示されている。尚、シュードモナス・セ
パシア種は、現在分類学上バークホルデリア・セパシア
に変更されている。

【００３５】本発明の実施形態において用いる微生物の
一つであるＪＭ１株(ブタペスト条約に基づく国際寄託
の番号:ＦＥＲＭＢＰ-5352、受託日:平成７年１月１０
日)は、Ｊ１株(ブタペスト条約に基づく国際寄託の番
号:ＢＰ-5102、受託日:平成６年５月２５日)を、変異源
を用いた変異操作によって変異させて取得した、誘導物
質を用いることなくＴＣＥ等の有機塩素化合物を分解す
ることができる変異株であることが、特開平８-２９４
３８７号公報に開示されている。なお、本菌株は当初、
コリネバクテリウム属に属しているものとして「コリネ
バクテリウム・スピーシズＪＭ１株」と表示したが、後
の検討により本菌株が“コリネバクテリウム属に属さな
い”と認められたため、識別の表示を「ＪＭ１株」と変
更した。

【００３６】該微生物の培養に使用する培地としては、
基本的には生育に必要な炭素源、窒素源、リン源、無機
塩類等を含んでいればよい。

【００３７】該微生物を培養するために用いられる基本
的な無機塩培地としては、該菌株が生育するために必要
な成分が含有されていれば特に制限はなく、例えばＭ９
培地やＭＳＢ培地等の基礎塩培地が用いられる。以下に
Ｍ９培地の組成を示す。

【００３８】Ｎa₂ＨＰＯ₄:６.２g ＫＨ₂ＰＯ₄:３.０g ＮaＣl:０.５g ＮＨ₄Ｃl:１.０g (培地１リットル中；pＨ７.０) 培養は好気条件下で行なうことができ、液体培養でも固
体培養でもよい。培養温度は１５℃から３０℃が望まし
い。

【００３９】なお、微生物は培地中に分散させてもよい
し、セルロースなどの担体に担持したものを用いてもよ
い。浄化対象が液体または気体の場合、導入口と浄化さ
れた液体または気体の排出口はできるだけ離れているほ
うが好ましい。特に担体を使用する場合、導入口と排出
口は担体を充填した部分をはさんで互いに反対側の位置
にあるのが好ましい。

【００４０】土壌を浄化する場合は微生物を含む液体と
接触させることになるが、この場合、微生物を含む液体
を土壌に導入(たとえば土壌に注入井を設ける)する方
法、逆に溶液中に土壌を導入する方法、あるいはその両
者を浄化装置に導入して混合する方法のいずれをとって
もよい。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。

【００４２】[実施例１] ＪＭ１株のＴＣＥ分解における還元型メタロチオネイン
の効果(液体系) ＪＭ１株の寒天Ｍ９培地(０.５％グルタミン酸ナトリウ
ム含有)上のコロニーを、０.５％グルタミン酸ナトリウ
ム含有した液体Ｍ９培地 200ｍLに接種し、500ｍL容振
盪フラスコ中、２５℃で振盪培養を行なった。

【００４３】対数増殖後期にあたる２０時間目に菌体を
遠心分離により集菌し、等量の炭素源を含まないＭ９培
地に再懸濁した。

【００４４】この様にして調製した菌懸濁液を 10ｍLず
つ 27.5ｍL容バイアル瓶に注入したものを２本用意し
た。このうち１本には還元型メタロチオネイン(以下Ｍ
Ｔと記す)を最終濃度２００μｍol/Lとなるように加
え、もう一本には同量の滅菌蒸留水を加えた。これらの
バイアル瓶と、ブランクとしてＭ９培地のみ 10ｍL加え
たバイアル瓶合計３本に、バイアル瓶中の液中濃度が１
２ppｍ程度になるようにＴＣＥ飽和水溶液を加え、テフ
ロンライナー付きブチルゴム栓及びアルミシールで密栓
した。

【００４５】これらのバイアル瓶を３０℃で振とうし、
気相部分のＴＣＥを経時的にガスクロマトグラフィーで
測定した。値が初期濃度の１０％以下になった時点で、
一旦開放し、初期の９０％程度のＴＣＥ飽和水溶液を加
えた後に密栓し直した(ブランクは初期状態のまま)。こ
のような操作を繰り返し、ＴＣＥの繰り返し分解におけ
るＭＴの効果を評価した。

【００４６】測定時間は以下の通りである。

【００４７】１回目:１時間後、２回目:１時間後
(合計２時間後)、３回目:１.５時間後 (合計３.５時
間後)、４回目:１.５時間後 (合計５時間後)、５回
目:１.５時間後 (合計６.５時間後)、６回目:２時間
後 (合計８.５時間後)、７回目:２時間後
(合計１０.５時間後)、８回目:２時間後 (合計１
２.５時間後)、９回目:１０時間後 (合計２２.５時
間後)。

【００４８】なお、エネルギー源としてホルムアルデヒ
ドを３回目、５回目、７回目の合計３回、各最終濃度１
ｍｍol/Lとなるように加えた。

【００４９】結果を表１に示す。ＴＣＥ濃度は、得られ
たガスクロマトグラフィーのエリア値から、全てのＴＣ
Ｅがバイアル瓶中の水溶液中に溶解したとした時の濃度
として換算し、示した(以下の実施例も同様)。明らかに
メタロチオネインの効果が見られた。

【００５０】また、同様の実験をメタロチオネインの濃
度を変えて行なった結果、１μｍol/Lから１ｍｍol/Lま
で効果が見られたが、２００μｍol/Lの効果が最も顕著
であった。

【００５１】

【表１】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下 [実施例２] ＪＭ１株のＤＣＥ分解におけるＭＴの効果(液体系) 分解対象物質をcis-１,２-ジクロロエチレン(cis-１,２
-ＤＣＥ)、trans-１,２-ジクロロエチレン、及び１,１-
ジクロロエチレン(１,１-ＤＣＥ)それぞれ５.０ppｍと
し、還元型メタロチオネイン(以下ＭＴと記す)を２００
μｍol/L添加した時のＪＭ１株の分解に対する効果を評
価した。実験系としては基本的に実施例１と同様に行な
い、１回目(１時間後)、２回目(１.５時間後、合計２.
５時間後)、３回目(２時間後、合計４.５時間後)、
４回目(２.５時間後、合計７時間後)、５回目(３時間
後、合計１０時間後)、６回目(１２時間後、合計２
２時間後)にそれぞれの濃度を測定した。なお、エネル
ギー源としてのホルムアルデヒドは１回目、３回目、５
回目に各最終濃度１ｍｍol/Lとなるように加えた。

【００５２】結果を表２(cis１,２-ＤＣＥ)、表３(tran
s-１,２-ＤＣＥ)、及び表４(１,１-ＤＣＥ)に示す。

【００５３】

【表２】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下

【００５４】

【表３】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下

【００５５】

【表４】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下本結果より、ＪＭ１株液体系のＤＣＥの分解処理におけ
るＭＴの効果が示された。

【００５６】[実施例３] ＫＫ01株のＴＣＥ分解におけるＭＴの効果(液体系) ＫＫ01株の寒天Ｍ９培地(０.１％酵母エキス及び２ｍｍ
ol/Lフェノール含有)上のコロニーを、同じ組成の液体
Ｍ９培地 200ｍLに接種し、500ｍL容振盪フラスコ中、
３０℃で振盪培養を行なった。対数増殖後期にあたる２
４時間目に菌体を遠心分離により集菌し、等量の炭素源
を含まないＭ９培地に再懸濁した。

【００５７】この様にして調製した菌懸濁液を 10ｍLず
つ 27.5ｍL容バイアル瓶に注入したものを２本用意し
た。このうち１本にはＭＴを最終濃度２００μｍol/Lと
なるように加え、もう一本には同量の滅菌蒸留水を加え
た。これらのバイアル瓶と、ブランクとしてＭ９培地の
み 10ｍL加えたバイアル瓶合計３本に、バイアル瓶中の
液中濃度が１２ppｍ程度になるようにＴＣＥ飽和水溶液
を加え、テフロンライナー付きブチルゴム栓及びアルミ
シールで密栓した。

【００５８】これらのバイアル瓶を３０℃で振とうし、
気相部分のＴＣＥを一定時間後にガスクロマトグラフィ
ーで測定した。その後キャップを、一旦開放し、初期と
同程度のＴＣＥ飽和水溶液を加えた後に密栓し直した
(ブランクは初期状態のまま)。この様な操作を繰り返
し、ＴＣＥの繰り返し分解におけるＭＴの効果を評価し
た。測定時間は以下の通りである。

【００５９】１回目:１時間後、２回目:１時間後
(合計２時間後)、３回目:１.５時間後 (合計３.５時間
後)、４回目:１.５時間後 (合計５時間後)、５回目:
１.５時間後 (合計６.５時間後)、６回目:２時間後
(合計８.５時間後)、７回目:２時間後 (合計１
０.５時間後)、８回目:２時間後 (合計１２.５時間
後)、９回目:１０時間後 (合計２２.５時間後)、結果
を表５に示す。

【００６０】

【表５】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下本結果より、ＫＫ01株液体系のＴＣＥの分解処理におけ
るＭＴの効果が示された。

【００６１】また、同様の実験をメタロチオネインの濃
度を変えて行なった結果、１μｍol/Lから１ｍｍol/Lま
で効果が見られた。

【００６２】さらに、ＤＣＥの分解処理についても同様
の効果が見られた。

【００６３】[実施例４] ＪＭ１株のＴＣＥ分解におけるＭＴの効果(土壌系) 佐原通し砂(含水比３％、未滅菌)を 68ｍL容バイアル瓶
１５本に５０g入れ、土壌中の濃度が５ppｍとなるよう
にＴＣＥ飽和水溶液を加え、密栓して１５℃で３日間静
置して擬似ＴＣＥ汚染土壌試料を３本作成した。

【００６４】その後、実施例１のようにして調製したＪ
Ｍ１株の菌懸濁液(ＭＴ２００μｍol/Lを添加したも
の、無添加のもの)を１本ずつのバイアル瓶に５ｍL注入
し、もう１本にはブランクとしてＭ９培地のみ５ｍL添
加し、ＴＣＥ培地土壌浄化におけるＭＴの効果を評価し
た。

【００６５】なお、菌懸濁液の静置及び分解実験は実際
の土壌温度に近い２０℃で行なった。ＴＣＥ分解実験
は、菌懸濁液をえた後、土壌中の液体部分にＴＣＥがす
べて溶解した場合の濃度が１０ppｍとなるようにＴＣＥ
飽和水溶液を加え、テフロンライナーブチルゴム栓及び
アルミキャップで完全密封した。

【００６６】２０℃で静置し、気相部分のＴＣＥを一定
時間後にガスクロマトグラフィーで測定した。その後キ
ャップを開放し、ＴＣＥガスを加えて密閉し直して、同
様の操作を繰り返した。各測定時間は、１回目:２時間
後、２回目:３時間後(合計５時間後)、３回目:４時間後
(合計９時間後)、４回目:５時間後(合計１４時間後)、
５回目:１０時間後(合計２４時間後)とした。なお、エ
ネルギー源としてのホルムアルデヒドは１回目、３回
目、５回目に各最終濃度１ｍｍol/Lとなるように加え
た。

【００６７】結果を表６に示す。

【００６８】

【表６】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ、ＮＤ:検出
限界以下本結果より、ＪＭ１株を用いた土壌系のＴＣＥの分解処
理においてＭＴの効果が示された。

【００６９】さらに、ＤＣＥの分解処理についても、ま
た実施例３のＫＫ01株をそれぞれに応用した場合にも同
様の効果が見られた。

【００７０】[実施例５] ＪＭ１株のＴＣＥ分解におけるＭＴの効果(気相系) 多孔質セルロース担体(平均ポアサイズ約５０ｍｍ、直
径約５ｍｍ)をオートクレーブにて滅菌し、室温以下に
冷却したものを実施例２と同様のバイアル瓶３本に詰め
た。

【００７１】実施例１のようにして調製したＪＭ１株の
菌懸濁液(ＭＴ２００μｍol/L添加系、無添加系)をバイ
アル瓶に 15ｍL注入し、４時間毎にＴＣＥ汚染空気(パ
ーミエーターにて作成、ガス濃度１００ppｍ)を１ｍLガ
スタイトシリンジでバイアル瓶中に加え、汚染空気浄化
における本発明の効果を評価した。なお、分解実験は２
５℃で行なった。なお、エネルギー源としてのホルムア
ルデヒドは１回目、３回目、５回目に各最終濃度１ｍｍ
ol/Lとなるように加えた。

【００７２】結果を表７に示す。なお、濃度はガス濃度
である。

【００７３】

【表７】単位はppｍ(ガス濃度)、検出器の検出限界は１０ppｍ、
ＮＤ:検出限界以下本結果より、ＪＭ１株を用いた気相ＴＣＥの分解処理に
おいてＭＴの効果が示された。

【００７４】さらに、ＤＣＥの分解処理についても、ま
た実施例３のＫＫ01株をそれぞれに応用した場合にも同
様の効果が見られた。

【００７５】[比較例１] メタロチオネインそのもののＴＣＥに与える影響評価ＭＴのＴＣＥに対する影響を評価するため、ＭＴを含ん
だ蒸留水と含んでいない蒸留水中でのＴＣＥの濃度を比
較した。

【００７６】27.5ｍL容のバイアル瓶に、10ｍLの蒸留水
を入れ、ＭＴを最終濃度２００μｍol/Lになるように添
加したものと、同量の蒸留水を添加したものを各４本ず
つ作成し、バイアル瓶中の濃度が５、１０、２０、４０
ppｍ程度になるようにＴＣＥ飽和水溶液を加え、テフロ
ンライナー付きブチルゴム栓及びアルミシールで密栓し
た後、３０℃で２７時間振とうして気相部分のガスをガ
スクロマトグラフィーで測定した。

【００７７】結果を表８に示す。この結果より、ＴＣＥ
がＭＴにより直接影響を受けることは無いことが判明し
た。

【００７８】

【表８】単位はppｍ、検出器の検出限界は０.１ppｍ

【００７９】

【発明の効果】上記のように、塩素化エチレン化合物の
ような有機化合物により汚染された環境の液体、土壌、
及び空気を、該有機化合物の分解能力を有する微生物を
接触させて該有機化合物の生物分解浄化処理を行なう際
に、該分解系内のメタロチオネインを増強させることで
分解を促進し、環境の修復の効率を上げることができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｃ１２Ｒ 1:38）Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＡ (72)発明者野本毅東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内Ｆターム(参考） 4B065 AA41X BB19 BB40 BC41 CA56 4D004 AA41 AB06 CA15 CA18 CC08 CC15 4D027 AC00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】環境を汚染している有機化合物を分解し
て環境を修復する環境修復方法であって、有機化合物
と、該有機化合物の分解能力を有する微生物を、分解系
内において接触させる工程と、該接触状態で該有機化合物の分解を行なう工程とを含
む、環境の修復方法において、該分解系内のメタロチオネインの存在下で該分解を行な
うことを特徴とする、環境修復のための方法。
【請求項２】前記メタロチオネインを直接前記分解系
内に添加することで系内にメタロチオネインを存在させ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記微生物に分解酵素系とともにメタロ
チオネイン生成酵素を共発現させることで前記分解系に
メタロチオネインを存在させる、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】該有機化合物が塩素化脂肪族化合物であ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】該塩素化脂肪族化合物がトリクロロエチ
レン、またはジクロロエチレンである請求項４に記載の
方法。
【請求項６】前記環境が液体である請求項１〜５のい
ずれかに記載の方法。
【請求項７】前記微生物が、担体に担持されており、
前記接触工程が該担体と該液体との接触である請求項６
に記載の方法。
【請求項８】前記担体に接触させる前記液体の導入
と、前記分解処理後の液体の排出が、該担体を充填した
部分をはさんで互いに反対側の位置にある導入口と排出
口から行なわれる請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記環境が土壌である請求項１〜５のい
ずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記接触工程が、前記微生物を含む液
体を該土壌中に導入する工程である請求項９に記載の方
法。
【請求項１１】該微生物の該土壌中への導入を、該土
壌に設けた注入井から行なう請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記接触工程が、該微生物を含む溶液
中に該土壌を導入する工程である請求項９に記載の方
法。
【請求項１３】前記接触工程が、該微生物を含む溶液
と該土壌との混合工程である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】前記微生物が、担体に担持されてお
り、前記接触工程が、該担体と該土壌との接触である請
求項９に記載の方法。
【請求項１５】前記環境が空気である請求項１〜５の
いずれかに記載の方法。
【請求項１６】前記接触工程が、該微生物を含む溶液
中に該有機物質を含む空気を導入する工程である請求項
１５に記載の方法。
【請求項１７】前記微生物が、担体に担持されてお
り、前記接触工程が該担体と該空気との接触である請求
項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記担体に接触させる前記空気の導入
と、前記分解処理後の空気の排出が、該担体を充填した
部分をはさんで互いに反対側の位置にある導入口と排出
口から行なわれる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】該微生物がＪＭ１株(ＦＥＲＭＢＰ-
５３５２)である請求項１〜１８のいずれかに記載の方
法。
【請求項２０】該微生物がシュードモナス・セパシア
ＫＫ０１株(ＦＥＲＭＢＰ-４２３５)である請求項１〜
１８のいずれかに記載の方法。