JP2002034597A - ナシ類植物由来の新規マイクロサテライトｄｎａ及びそれを用いるナシ類植物の識別方法 - Google Patents
ナシ類植物由来の新規マイクロサテライトｄｎａ及びそれを用いるナシ類植物の識別方法Info
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- JP2002034597A JP2002034597A JP2000220339A JP2000220339A JP2002034597A JP 2002034597 A JP2002034597 A JP 2002034597A JP 2000220339 A JP2000220339 A JP 2000220339A JP 2000220339 A JP2000220339 A JP 2000220339A JP 2002034597 A JP2002034597 A JP 2002034597A
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【解決手段】 ナシ類植物を識別する方法であって、ナ
シ由来の５種類の特定の塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、又は上記特定の塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、上記
特定の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物の
ゲノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴と
する方法。 【効果】 マイクロサテライトＤＮＡを用いるナシ類植
物の識別が可能になった。
シ由来の５種類の特定の塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、又は上記特定の塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、上記
特定の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物の
ゲノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴と
する方法。 【効果】 マイクロサテライトＤＮＡを用いるナシ類植
物の識別が可能になった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ナシ類植物の新規
マイクロサテライトＤＮＡ及びそれを利用したナシ類植
物の識別方法に関する。
マイクロサテライトＤＮＡ及びそれを利用したナシ類植
物の識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ナシ類（ナシ属と同義、Pyrus属）に
は、ニホンナシ（Pyrus pyrifolia NAKAI）、チュウゴ
クナシ（Pyrus bretschneideri REHD.）、チュウゴクコ
ナシ（Pyrus ussuriensis Maxim.）、セイヨウナシ（Py
rus communis L.）、イワテヤマナシ（Pyrus aromatica
Kikuchi）、マンシュウマメナシ（Pyrus betulaefolia
BUNGE）、マメナシ（Pyrus calleryana Decne.）等の
多数の種が属しており、さらにそれぞれの種には、多数
の品種が属している。これらの種及び品種の識別、さら
には個体の識別は、従来から主に樹形、葉、果実等の形
態の差異によって行われてきた。
は、ニホンナシ（Pyrus pyrifolia NAKAI）、チュウゴ
クナシ（Pyrus bretschneideri REHD.）、チュウゴクコ
ナシ（Pyrus ussuriensis Maxim.）、セイヨウナシ（Py
rus communis L.）、イワテヤマナシ（Pyrus aromatica
Kikuchi）、マンシュウマメナシ（Pyrus betulaefolia
BUNGE）、マメナシ（Pyrus calleryana Decne.）等の
多数の種が属しており、さらにそれぞれの種には、多数
の品種が属している。これらの種及び品種の識別、さら
には個体の識別は、従来から主に樹形、葉、果実等の形
態の差異によって行われてきた。
【０００３】しかし、ナシ類では、開花・結実までに数
年以上の期間を要するため、品種や個体の識別に長期間
を必要とする。このことは、品種の識別や育種上の大き
な障害となっている。また、ナシ類に属する植物間では
相互に交雑が可能なため、自然交雑に起因したと考えら
れる、由来や種が不明な個体が数多く存在し、大きな問
題となっている。そこで、ナシ類植物を効率良く識別す
る方法の開発が待ち望まれていた。
年以上の期間を要するため、品種や個体の識別に長期間
を必要とする。このことは、品種の識別や育種上の大き
な障害となっている。また、ナシ類に属する植物間では
相互に交雑が可能なため、自然交雑に起因したと考えら
れる、由来や種が不明な個体が数多く存在し、大きな問
題となっている。そこで、ナシ類植物を効率良く識別す
る方法の開発が待ち望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ナシ
類植物を効率良く識別する方法を提供することにある。
類植物を効率良く識別する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討した結果、ナシ類植物から新規マイク
ロサテライトＤＮＡを取得することに成功し、さらに該
新規マイクロサテライトＤＮＡを利用することによりナ
シ類植物を識別できることを見出し、本発明に至った。
明者らは鋭意検討した結果、ナシ類植物から新規マイク
ロサテライトＤＮＡを取得することに成功し、さらに該
新規マイクロサテライトＤＮＡを利用することによりナ
シ類植物を識別できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の発明を包含す
る。 （１） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
１で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号１において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
る。 （１） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
１で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号１において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
【０００７】（２） 配列番号１で示される塩基配列を
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号１に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（１）記載の方法。
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号１に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（１）記載の方法。
【０００８】（３） 前記オリゴヌクレオチドが、配列
番号６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及
び配列番号７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである（２）記載の方法。 （４） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
２で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号２において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号２で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
番号６で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及
び配列番号７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである（２）記載の方法。 （４） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
２で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号２において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号２で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
【０００９】（５） 配列番号２で示される塩基配列を
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号２に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号２で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（４）記載の方法。
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号２に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号２で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（４）記載の方法。
【００１０】（６） 前記オリゴヌクレオチドが、配列
番号８で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及
び配列番号９で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである（５）記載の方法。 （７） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
３で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号３において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
番号８で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及
び配列番号９で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである（５）記載の方法。 （７） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番号
３で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号３において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
【００１１】（８） 配列番号３で示される塩基配列を
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号３に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号３で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（７）記載の方法。
含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号３に
おいて１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れ、かつ、配列番号３で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤ
ＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反
応を行うことを含む（７）記載の方法。
【００１２】（９） 前記オリゴヌクレオチドが、配列
番号１０で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
及び配列番号１１で示される塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドである（８）記載の方法。 （１０） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番
号４で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号４において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
番号１０で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
及び配列番号１１で示される塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドである（８）記載の方法。 （１０） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番
号４で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号４において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
【００１３】（１１） 配列番号４で示される塩基配列
を含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号４
において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加
され、かつ、配列番号４で示される塩基配列と少なくと
も８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテ
ライトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含む
ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅
反応を行うことを含む（１０）記載の方法。
を含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号４
において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加
され、かつ、配列番号４で示される塩基配列と少なくと
も８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテ
ライトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含む
ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅
反応を行うことを含む（１０）記載の方法。
【００１４】（１２） 前記オリゴヌクレオチドが、配
列番号１２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号１３で示される塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドである（１１）記載の方法。 （１３） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番
号５で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
列番号１２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号１３で示される塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドである（１１）記載の方法。 （１３） ナシ類植物を識別する方法であって、配列番
号５で示される塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮ
Ａ、又は配列番号５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲノ
ムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とする
前記方法。
【００１５】（１４） 配列番号５で示される塩基配列
を含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号５
において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加
され、かつ、配列番号５で示される塩基配列と少なくと
も８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテ
ライトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含む
ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅
反応を行うことを含む（１３）記載の方法。
を含むマイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号５
において１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加
され、かつ、配列番号５で示される塩基配列と少なくと
も８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテ
ライトＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含む
ＤＮＡを増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅
反応を行うことを含む（１３）記載の方法。
【００１６】（１５） 前記オリゴヌクレオチドが、配
列番号１４で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号１５で示される塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドである（１４）記載の方法。 （１６） 配列番号１で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （１７） 配列番号１において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。 （１８） 配列番号２で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。
列番号１４で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド及び配列番号１５で示される塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドである（１４）記載の方法。 （１６） 配列番号１で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （１７） 配列番号１において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。 （１８） 配列番号２で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。
【００１７】（１９） 配列番号２において１以上の塩
基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番
号２で示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を
有する塩基配列を含むＤＮＡ。 （２０） 配列番号３で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （２１） 配列番号３において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。
基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番
号２で示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を
有する塩基配列を含むＤＮＡ。 （２０） 配列番号３で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （２１） 配列番号３において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。
【００１８】（２２） 配列番号４で示される塩基配列
を含むマイクロサテライトＤＮＡ。 （２３） 配列番号４において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。 （２４） 配列番号５で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （２５） 配列番号５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。
を含むマイクロサテライトＤＮＡ。 （２３） 配列番号４において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。 （２４） 配列番号５で示される塩基配列を含むマイク
ロサテライトＤＮＡ。 （２５） 配列番号５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で示され
る塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むＤＮＡ。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明は、ナシ類植物を識別する方法に関し、該
識別は、配列番号１、２、３、４若しくは５で示される
塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡ、又は配列番
号１、２、３、４若しくは５において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１、
２、３、４若しくは５で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡがナシ類植物のゲノムＤＮＡ中に存在するか
否かを調べることによって行う。
する。本発明は、ナシ類植物を識別する方法に関し、該
識別は、配列番号１、２、３、４若しくは５で示される
塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡ、又は配列番
号１、２、３、４若しくは５において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１、
２、３、４若しくは５で示される塩基配列と少なくとも
８０％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテラ
イトＤＮＡがナシ類植物のゲノムＤＮＡ中に存在するか
否かを調べることによって行う。
【００２０】本明細書において、「ナシ類植物」とは、
ナシ属（Pyrus属）に属する植物のことである。ナシ属
に属する植物としては、例えば、ニホンナシ（Pyrus py
rifolia NAKAI）、セイヨウナシ（Pyrus communis
L.）、チュウゴクナシ（Pyrus bretschneideri REH
D.）、チュウゴクコナシ（Pyrus ussuriensis Maxi
m.）、イワテヤマナシ（Pyrus aromatica Kikuchi）、
マンシュウマメナシ（Pyrus betulaefolia BUNGE）、マ
メナシ（Pyrus calleryana Decne.）等が挙げられる。
ナシ属（Pyrus属）に属する植物のことである。ナシ属
に属する植物としては、例えば、ニホンナシ（Pyrus py
rifolia NAKAI）、セイヨウナシ（Pyrus communis
L.）、チュウゴクナシ（Pyrus bretschneideri REH
D.）、チュウゴクコナシ（Pyrus ussuriensis Maxi
m.）、イワテヤマナシ（Pyrus aromatica Kikuchi）、
マンシュウマメナシ（Pyrus betulaefolia BUNGE）、マ
メナシ（Pyrus calleryana Decne.）等が挙げられる。
【００２１】ニホンナシとしては、例えば、幸水、豊
水、二十世紀、長十郎、巾着、新星、晩三吉、新高、新
水、新興、菊水、新世紀、赤穂、旭、愛宕、長寿、祇
園、白鳥、初日、初霜、平和、豊月、君塚早生、寿新
水、南水、おさ二十世紀、おさゴールド、世界一、秀
玉、秋水、太白、八千代、八里、吉野などの品種が挙げ
られる。
水、二十世紀、長十郎、巾着、新星、晩三吉、新高、新
水、新興、菊水、新世紀、赤穂、旭、愛宕、長寿、祇
園、白鳥、初日、初霜、平和、豊月、君塚早生、寿新
水、南水、おさ二十世紀、おさゴールド、世界一、秀
玉、秋水、太白、八千代、八里、吉野などの品種が挙げ
られる。
【００２２】セイヨウナシとしては、例えば、ラ・フラ
ンス、バートレット、ル・レクチェ、パス・クサラン、
シルバーベル、ブランデーワイン、マルゲリットマリ
ラ、マックスレッドバートレット、ハニースイート、ル
・コンテ、ナポレオンなどの品種が挙げられる。
ンス、バートレット、ル・レクチェ、パス・クサラン、
シルバーベル、ブランデーワイン、マルゲリットマリ
ラ、マックスレッドバートレット、ハニースイート、ル
・コンテ、ナポレオンなどの品種が挙げられる。
【００２３】チュウゴクナシとしては、例えば、鴨梨、
蜜梨、恩梨、紅梨、黄梨、莱陽慈梨、平梨、秋白梨など
の品種が挙げられ、チュウゴクコナシとしては、例え
ば、北京白梨、八里香、尖把梨、南果梨、酸梨などの品
種が挙げられる。また、マンシュウマメナシとしては、
例えば、ベチュレフォリア、ホクシヤマナシ、カラマメ
ナシ、杜梨などの系統が知られており、マメナシとして
は、例えば、マメナシ４、マメナシ５、マメナシ６、マ
メナシ１０、マメナシ１４、愛知マメナシ、三重マメナ
シ１、三重マメナシ２４、三重マメナシ多度１１などの
系統が知られている。
蜜梨、恩梨、紅梨、黄梨、莱陽慈梨、平梨、秋白梨など
の品種が挙げられ、チュウゴクコナシとしては、例え
ば、北京白梨、八里香、尖把梨、南果梨、酸梨などの品
種が挙げられる。また、マンシュウマメナシとしては、
例えば、ベチュレフォリア、ホクシヤマナシ、カラマメ
ナシ、杜梨などの系統が知られており、マメナシとして
は、例えば、マメナシ４、マメナシ５、マメナシ６、マ
メナシ１０、マメナシ１４、愛知マメナシ、三重マメナ
シ１、三重マメナシ２４、三重マメナシ多度１１などの
系統が知られている。
【００２４】その他に、由来不明のナシとして、秋田田
沢１号、秋田田沢２号、鉢伏の梨、秋田山梨２号、石ナ
シ、イソラ山梨、烏梨、西筑摩Ａ、島根山梨、台湾梨
Ａ、岩手１号、岩手２号、サワイリヤマナシ、鳥取１
号、鳥取２号、鳥取３号などの系統が知られている。
沢１号、秋田田沢２号、鉢伏の梨、秋田山梨２号、石ナ
シ、イソラ山梨、烏梨、西筑摩Ａ、島根山梨、台湾梨
Ａ、岩手１号、岩手２号、サワイリヤマナシ、鳥取１
号、鳥取２号、鳥取３号などの系統が知られている。
【００２５】本明細書において、「マイクロサテライト
ＤＮＡ」とは、１種類以上の塩基が４回以上反復した塩
基配列を含むＤＮＡのことである。１種類以上の塩基が
４回以上反復した塩基配列としては、例えば、（Ａ）
ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（Ｃ）ｎ、（ＡＧ）ｎ、（Ａ
Ｃ）ｎ、（ＴＧ）ｎ、（ＴＣ）ｎ、（ＧＣ）ｎ、（Ｔ
Ａ）ｎ、（ＴＡＧ）ｎ、（ＴＴＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、
（ＣＴＧ）ｎ、（ＧＴＧ）ｎ、（ＧＧＴ）ｎ、（ＡＴ
Ｇ）ｎ、（ＧＡＧＣ）ｎ、（ＧＡＴＣ）ｎ、（ＧＧＧＣ
Ｃ）ｎ（ただしｎは４以上）などを挙げることができ
る。マイクロサテライトＤＮＡは、これらの反復した塩
基配列が１種類含まれている場合及び複数種類含まれて
いる場合のどちらでもよい。
ＤＮＡ」とは、１種類以上の塩基が４回以上反復した塩
基配列を含むＤＮＡのことである。１種類以上の塩基が
４回以上反復した塩基配列としては、例えば、（Ａ）
ｎ、（Ｔ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（Ｃ）ｎ、（ＡＧ）ｎ、（Ａ
Ｃ）ｎ、（ＴＧ）ｎ、（ＴＣ）ｎ、（ＧＣ）ｎ、（Ｔ
Ａ）ｎ、（ＴＡＧ）ｎ、（ＴＴＧ）ｎ、（ＣＡＧ）ｎ、
（ＣＴＧ）ｎ、（ＧＴＧ）ｎ、（ＧＧＴ）ｎ、（ＡＴ
Ｇ）ｎ、（ＧＡＧＣ）ｎ、（ＧＡＴＣ）ｎ、（ＧＧＧＣ
Ｃ）ｎ（ただしｎは４以上）などを挙げることができ
る。マイクロサテライトＤＮＡは、これらの反復した塩
基配列が１種類含まれている場合及び複数種類含まれて
いる場合のどちらでもよい。
【００２６】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
列番号４及び配列番号５で示される塩基配列からなるマ
イクロサテライトＤＮＡは、ナシ又はナシ類植物から取
得され得る新規マイクロサテライトＤＮＡである。これ
らのマイクロサテライトＤＮＡは、例えば、ナシ又はナ
シ類植物から得られるゲノムＤＮＡを鋳型として、適当
な反復配列を含むプライマーを用いるＰＣＲを行うこと
により増幅することができ、さらに、電気泳動を行うこ
とにより単離することができる。
列番号４及び配列番号５で示される塩基配列からなるマ
イクロサテライトＤＮＡは、ナシ又はナシ類植物から取
得され得る新規マイクロサテライトＤＮＡである。これ
らのマイクロサテライトＤＮＡは、例えば、ナシ又はナ
シ類植物から得られるゲノムＤＮＡを鋳型として、適当
な反復配列を含むプライマーを用いるＰＣＲを行うこと
により増幅することができ、さらに、電気泳動を行うこ
とにより単離することができる。
【００２７】例えば、ニホンナシ品種「豊水」の組織か
ら、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶
液を用いた方法により、ゲノムＤＮＡを得る。得られた
ゲノムＤＮＡを鋳型に、例えば、TCTGTGCTGG（配列番号
１６）、TTTGCCCGGA（配列番号１７）、GTTGCGATCC（配
列番号１８）、AGCCAGCGAA（配列番号１９）又はAATCGG
GCTG（配列番号２０）にて示される配列をプライマーと
して用いるPCR法（例えば、94℃で１分間変性、40℃で
２分間アニーリング、72℃で２分間伸長を35サイクル）
によりＤＮＡ増幅産物を得る。次に、該ＤＮＡ増幅産物
を、例えば1.5％アガロースゲル電気泳動により分離さ
せ、ＤＮＡを保持可能なメンブレンにＤＮＡを転写す
る。例えば、0.4Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、
キャピラリー法によりナイロンメンブレンに分離ＤＮＡ
を転写する。その後、マイクロサテライト配列を有する
オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、サザンブロ
ット分析を行う。サザンブロット分析の方法は、PCR産
物中のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ断片を検出
できるものであればよい。例えば、マイクロサテライト
配列を有するオリゴヌクレオチドとしては、5'末端をビ
オチンラベルした(AG)n、(AT)n、(GT)n（ただし、ｎは１
０〜３０であることが望ましい）等を用いることができ
る。サザンブロット分析における検出の方法としては、
当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば、
ＤＮＡ断片が保持されたメンブレンを、マイクロサテラ
イト配列を有するオリゴヌクレオチド溶液とインキュベ
ートした後、洗浄バッファーで洗浄し、例えばBrightSt
ar BioDetect Nonisotopic Detection Kit（Ambion社
製）を用いて、マイクロサテライト配列を含むＤＮＡ断
片の検出を行うことができる。これにより、分子量約31
5ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ断片
１、分子量約343ｂｐのＤＮＡ断片２、分子量約450ｂｐ
のマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ断片３、分子
量約711ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ
断片４、分子量約246ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片５を得ることができる。
ら、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶
液を用いた方法により、ゲノムＤＮＡを得る。得られた
ゲノムＤＮＡを鋳型に、例えば、TCTGTGCTGG（配列番号
１６）、TTTGCCCGGA（配列番号１７）、GTTGCGATCC（配
列番号１８）、AGCCAGCGAA（配列番号１９）又はAATCGG
GCTG（配列番号２０）にて示される配列をプライマーと
して用いるPCR法（例えば、94℃で１分間変性、40℃で
２分間アニーリング、72℃で２分間伸長を35サイクル）
によりＤＮＡ増幅産物を得る。次に、該ＤＮＡ増幅産物
を、例えば1.5％アガロースゲル電気泳動により分離さ
せ、ＤＮＡを保持可能なメンブレンにＤＮＡを転写す
る。例えば、0.4Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、
キャピラリー法によりナイロンメンブレンに分離ＤＮＡ
を転写する。その後、マイクロサテライト配列を有する
オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、サザンブロ
ット分析を行う。サザンブロット分析の方法は、PCR産
物中のマイクロサテライト配列を含むＤＮＡ断片を検出
できるものであればよい。例えば、マイクロサテライト
配列を有するオリゴヌクレオチドとしては、5'末端をビ
オチンラベルした(AG)n、(AT)n、(GT)n（ただし、ｎは１
０〜３０であることが望ましい）等を用いることができ
る。サザンブロット分析における検出の方法としては、
当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば、
ＤＮＡ断片が保持されたメンブレンを、マイクロサテラ
イト配列を有するオリゴヌクレオチド溶液とインキュベ
ートした後、洗浄バッファーで洗浄し、例えばBrightSt
ar BioDetect Nonisotopic Detection Kit（Ambion社
製）を用いて、マイクロサテライト配列を含むＤＮＡ断
片の検出を行うことができる。これにより、分子量約31
5ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ断片
１、分子量約343ｂｐのＤＮＡ断片２、分子量約450ｂｐ
のマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ断片３、分子
量約711ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡを含むＤＮＡ
断片４、分子量約246ｂｐのマイクロサテライトＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片５を得ることができる。
【００２８】該ＤＮＡ断片を、市販のキット（アマシャ
ムファルマシア社製等）で精製した後、例えば、市販の
プラスミドベクター（例えば、pCR2.1、インビトロジェ
ン社製等）にキット記載の方法を用いてクローニングす
ることにより、該ＤＮＡを回収することができる。得ら
れたＤＮＡ断片１を「配列番号１のマイクロサテライト
ＤＮＡ」、ＤＮＡ断片２を「配列番号２のマイクロサテ
ライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片３を「配列番号３のマイク
ロサテライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片４を「配列番号４の
マイクロサテライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片５を「配列番
号５のマイクロサテライトＤＮＡ」と記す。
ムファルマシア社製等）で精製した後、例えば、市販の
プラスミドベクター（例えば、pCR2.1、インビトロジェ
ン社製等）にキット記載の方法を用いてクローニングす
ることにより、該ＤＮＡを回収することができる。得ら
れたＤＮＡ断片１を「配列番号１のマイクロサテライト
ＤＮＡ」、ＤＮＡ断片２を「配列番号２のマイクロサテ
ライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片３を「配列番号３のマイク
ロサテライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片４を「配列番号４の
マイクロサテライトＤＮＡ」、ＤＮＡ断片５を「配列番
号５のマイクロサテライトＤＮＡ」と記す。
【００２９】なお、本発明のマイクロサテライトＤＮＡ
の塩基配列は、配列番号１、２、３、４又は５に示され
るものに限定されるものではなく、これらの配列との相
同性がそれぞれ８０％以上、好ましくは９０％以上であ
れば利用可能である。すなわち、相同性が８０％以上、
好ましくは９０％以上である限りにおいて、配列番号
１、２、３、４又は５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入又は付加されていてもよい。この場合におい
て、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい塩基数
は、相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上という
条件により必然的に制限され、その他の制限は特に無い
が、好ましくは１〜数個である。このような塩基配列を
有するＤＮＡは、本発明におけるマイクロサテライトＤ
ＮＡとして利用することができる。従って、本明細書に
おいて、このような塩基配列を有するＤＮＡを各マイク
ロサテライトＤＮＡの「同効物」という。塩基配列の相
同性は、例えば、Genetyxソフトウェア（Software Deve
lopment社製）のマルティプルアラインメント、マキシ
マムマッチングで算出することができる。
の塩基配列は、配列番号１、２、３、４又は５に示され
るものに限定されるものではなく、これらの配列との相
同性がそれぞれ８０％以上、好ましくは９０％以上であ
れば利用可能である。すなわち、相同性が８０％以上、
好ましくは９０％以上である限りにおいて、配列番号
１、２、３、４又は５において１以上の塩基が置換、欠
失、挿入又は付加されていてもよい。この場合におい
て、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい塩基数
は、相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上という
条件により必然的に制限され、その他の制限は特に無い
が、好ましくは１〜数個である。このような塩基配列を
有するＤＮＡは、本発明におけるマイクロサテライトＤ
ＮＡとして利用することができる。従って、本明細書に
おいて、このような塩基配列を有するＤＮＡを各マイク
ロサテライトＤＮＡの「同効物」という。塩基配列の相
同性は、例えば、Genetyxソフトウェア（Software Deve
lopment社製）のマルティプルアラインメント、マキシ
マムマッチングで算出することができる。
【００３０】本発明のナシ類植物の識別方法において
は、配列番号１、２、３、４若しくは５で示される塩基
配列を含むマイクロサテライトＤＮＡ又はその同効物が
ナシ類植物のゲノム中に存在するか否かを調べる。これ
らの存否は当業者が公知の方法により調べることができ
るが、好ましくはＰＣＲ法を用いて調べる。
は、配列番号１、２、３、４若しくは５で示される塩基
配列を含むマイクロサテライトＤＮＡ又はその同効物が
ナシ類植物のゲノム中に存在するか否かを調べる。これ
らの存否は当業者が公知の方法により調べることができ
るが、好ましくはＰＣＲ法を用いて調べる。
【００３１】上記ＰＣＲ法を用いるナシ類植物の識別方
法で使用されるプライマーは、配列番号１、配列番号
２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５のマイ
クロサテライトＤＮＡ若しくはその同効物、若しくはそ
の一部又は該ＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリ
ゴヌクレオチドであればよく、特に限定されないが、マ
イクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を増幅できるプ
ライマーが望ましい。本明細書において、「マイクロサ
テライト領域」とは、１種類以上の塩基が４回以上反復
した塩基配列を含む領域をいう。また、プライマーとし
て用いるオリゴヌクレオチドは、標的とするマイクロサ
テライトＤＮＡを特異的に増幅するものであることが好
ましい。ここで、「特異的に増幅する」とは、標的だけ
を増幅し、他のゲノム領域、特に、他のマイクロサテラ
イトＤＮＡを増幅しないことをいう。プライマーとして
用いるオリゴヌクレオチドの塩基数は特に限定されない
が、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは１６塩
基以上である。具体例として、例えば、下記の配列から
なるオリゴヌクレオチド等を挙げることができる。
法で使用されるプライマーは、配列番号１、配列番号
２、配列番号３、配列番号４若しくは配列番号５のマイ
クロサテライトＤＮＡ若しくはその同効物、若しくはそ
の一部又は該ＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリ
ゴヌクレオチドであればよく、特に限定されないが、マ
イクロサテライト領域を含むＤＮＡ断片を増幅できるプ
ライマーが望ましい。本明細書において、「マイクロサ
テライト領域」とは、１種類以上の塩基が４回以上反復
した塩基配列を含む領域をいう。また、プライマーとし
て用いるオリゴヌクレオチドは、標的とするマイクロサ
テライトＤＮＡを特異的に増幅するものであることが好
ましい。ここで、「特異的に増幅する」とは、標的だけ
を増幅し、他のゲノム領域、特に、他のマイクロサテラ
イトＤＮＡを増幅しないことをいう。プライマーとして
用いるオリゴヌクレオチドの塩基数は特に限定されない
が、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは１６塩
基以上である。具体例として、例えば、下記の配列から
なるオリゴヌクレオチド等を挙げることができる。
【００３２】（１）配列番号１のマイクロサテライトＤ
ＮＡを増幅するプライマーの一例： フォワード：5'-TCATTGTAGCATTTTTATTTTT-3'（配列番号
６） リバース：5'-ATGGCAAGGGAGATTATTAG-3'（配列番号７） （２）配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-GATTTTGTCCGCAGGT-3'（配列番号８） リバース：5'-AAAGAACAGCAAGAACCA-3'（配列番号９） （３）配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-TTGGAGAATAACTGATAAG-3'（配列番号１
０） リバース：5'-TAAATAAAGGCACAATGGA-3'（配列番号１
１） （４）配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-GCCAGCGAACTCAAATCT-3'（配列番号１
２） リバース：5'-AACGAGAACGACGAGCG-3'（配列番号１３） （５）配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-CGGGCTGAGTGAACGAG-3'（配列番号１
４） リバース：5'-TTTACCGTTGTCTTTTCTTTG-3'（配列番号１
５） なお、本発明のナシ類植物の識別方法においてプライマ
ーとして使用するオリゴヌクレオチドは、例えばβ−シ
アノエチルホスホアミダイト法やチオホスファイト法を
用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって容易に得るこ
とができる。
ＮＡを増幅するプライマーの一例： フォワード：5'-TCATTGTAGCATTTTTATTTTT-3'（配列番号
６） リバース：5'-ATGGCAAGGGAGATTATTAG-3'（配列番号７） （２）配列番号２のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-GATTTTGTCCGCAGGT-3'（配列番号８） リバース：5'-AAAGAACAGCAAGAACCA-3'（配列番号９） （３）配列番号３のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-TTGGAGAATAACTGATAAG-3'（配列番号１
０） リバース：5'-TAAATAAAGGCACAATGGA-3'（配列番号１
１） （４）配列番号４のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-GCCAGCGAACTCAAATCT-3'（配列番号１
２） リバース：5'-AACGAGAACGACGAGCG-3'（配列番号１３） （５）配列番号５のマイクロサテライトＤＮＡを増幅す
るプライマーの一例： フォワード：5'-CGGGCTGAGTGAACGAG-3'（配列番号１
４） リバース：5'-TTTACCGTTGTCTTTTCTTTG-3'（配列番号１
５） なお、本発明のナシ類植物の識別方法においてプライマ
ーとして使用するオリゴヌクレオチドは、例えばβ−シ
アノエチルホスホアミダイト法やチオホスファイト法を
用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって容易に得るこ
とができる。
【００３３】上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によ
り植物のゲノムＤＮＡを増幅し、該増幅ゲノムＤＮＡを
電気泳動にて分離後、増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行
うことにより、マイクロサテライトＤＮＡの差異に基づ
き、ナシ類植物を識別することができる。ここで、「Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法」とは、変性工
程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラ
ーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り
返して行う反応を利用して特定のＤＮＡを増幅させる方
法であり、これは当業者に公知の方法（例えば、Saiki
ら, Science, 230,1350-1354, 1985; 植物細胞工学別冊
「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、島本功、佐々木卓
治監修、1995、秀潤社発行）に従って行うことができ
る。
り植物のゲノムＤＮＡを増幅し、該増幅ゲノムＤＮＡを
電気泳動にて分離後、増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出を行
うことにより、マイクロサテライトＤＮＡの差異に基づ
き、ナシ類植物を識別することができる。ここで、「Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼチェイン反応）法」とは、変性工
程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラ
ーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り
返して行う反応を利用して特定のＤＮＡを増幅させる方
法であり、これは当業者に公知の方法（例えば、Saiki
ら, Science, 230,1350-1354, 1985; 植物細胞工学別冊
「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、島本功、佐々木卓
治監修、1995、秀潤社発行）に従って行うことができ
る。
【００３４】本発明のナシ類植物の識別方法において用
いられる植物のゲノムＤＮＡ（鋳型となる検体試料）
は、当業者に公知の方法、例えば通常の植物のゲノムＤ
ＮＡ抽出方法（例えば、「最新農学実験の基礎」、東北
大学農学部農学科編、1990、ソフトサイエンス社発行；
植物細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、
島本功、佐々木卓治監修、1995、秀潤社発行）によって
調製することができる。具体的には、例えば、以下のよ
うな方法を挙げることができる。まず、供試植物の緑葉
等の組織を液体窒素中で磨砕する。該磨砕物に臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を添加して
インキュベートした後、クロロホルム−イソアミルアル
コールを加えてよく混和する。遠心分離により水層を分
離・回収し、これにイソプロピルアルコールを加えてよ
く混和する。遠心分離により沈殿部を回収後、例えばＥ
ＤＴＡ等含有の緩衝液を加えて溶解し、RNase処理す
る。処理後、フェノール、フェノールとクロロホルム−
イソアミルアルコール、クロロホルム−イソアミルアル
コールの順序で溶媒を置換する。置換処理後、エタノー
ルを加えてよく混和し、遠心分離によりゲノムＤＮＡを
得ることができる。
いられる植物のゲノムＤＮＡ（鋳型となる検体試料）
は、当業者に公知の方法、例えば通常の植物のゲノムＤ
ＮＡ抽出方法（例えば、「最新農学実験の基礎」、東北
大学農学部農学科編、1990、ソフトサイエンス社発行；
植物細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、
島本功、佐々木卓治監修、1995、秀潤社発行）によって
調製することができる。具体的には、例えば、以下のよ
うな方法を挙げることができる。まず、供試植物の緑葉
等の組織を液体窒素中で磨砕する。該磨砕物に臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）溶液を添加して
インキュベートした後、クロロホルム−イソアミルアル
コールを加えてよく混和する。遠心分離により水層を分
離・回収し、これにイソプロピルアルコールを加えてよ
く混和する。遠心分離により沈殿部を回収後、例えばＥ
ＤＴＡ等含有の緩衝液を加えて溶解し、RNase処理す
る。処理後、フェノール、フェノールとクロロホルム−
イソアミルアルコール、クロロホルム−イソアミルアル
コールの順序で溶媒を置換する。置換処理後、エタノー
ルを加えてよく混和し、遠心分離によりゲノムＤＮＡを
得ることができる。
【００３５】本発明のナシ類植物の識別方法で用いられ
るＰＣＲにおけるＰＣＲ反応液としては、例えば、上記
プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基
（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）及び植物のゲノムＤＮＡを
加えた、約１．０mM〜約４．０mM、好ましくは約１．５
mM〜約３．０mMの塩化マグネシウム等を含有する増幅用
緩衝液を挙げることができる。プライマーとしては、上
記のようなプライマーを単独で用いるか、又は組み合わ
せて用いることができる。また、プライマーとして、5'
末端を蛍光色素やラジオアイソトープ等でラベルしたプ
ライマーを用いてもよく、これにより、効率良く、高感
度に増幅断片を検出することができる。耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、例えば、ライフテックオリエンタ
ル社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものを挙
げることができる。上記プライマー、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、４種類の塩基（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）及
び植物のゲノムＤＮＡの添加量は、それぞれ通常のＰＣ
Ｒに用いられる添加量であってよく、特に限定されな
い。さらに、増幅用緩衝液としては、ＰＣＲに用いられ
るものとして当業者に公知の緩衝液を用いることがで
き、例えば、50mMの塩化カリウムを含む20mMのTris-HCl
（pH8.4）を挙げることができる。
るＰＣＲにおけるＰＣＲ反応液としては、例えば、上記
プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基
（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）及び植物のゲノムＤＮＡを
加えた、約１．０mM〜約４．０mM、好ましくは約１．５
mM〜約３．０mMの塩化マグネシウム等を含有する増幅用
緩衝液を挙げることができる。プライマーとしては、上
記のようなプライマーを単独で用いるか、又は組み合わ
せて用いることができる。また、プライマーとして、5'
末端を蛍光色素やラジオアイソトープ等でラベルしたプ
ライマーを用いてもよく、これにより、効率良く、高感
度に増幅断片を検出することができる。耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、例えば、ライフテックオリエンタ
ル社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものを挙
げることができる。上記プライマー、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、４種類の塩基（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）及
び植物のゲノムＤＮＡの添加量は、それぞれ通常のＰＣ
Ｒに用いられる添加量であってよく、特に限定されな
い。さらに、増幅用緩衝液としては、ＰＣＲに用いられ
るものとして当業者に公知の緩衝液を用いることがで
き、例えば、50mMの塩化カリウムを含む20mMのTris-HCl
（pH8.4）を挙げることができる。
【００３６】ＰＣＲにおける変性工程、プライマーのア
ニーリング工程及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程
の反応条件は、当業者であれば適宜設定することができ
るため特に限定されないが、例えば、以下のような条件
とすることができる。変性工程は、例えば、約９０℃〜
約９５℃、好ましくは９４℃〜９５℃で、約１分間〜約
３分間、好ましくは１分間〜２分間加熱することにより
行う。プライマーのアニーリング工程は、例えば、約４
０℃〜約６０℃、好ましくは５０℃〜６０℃で、約１分
間〜約３分間、好ましくは１分間〜２分間インキュベー
トすることにより行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長
工程は、例えば、約７０℃〜約７３℃、好ましくは７２
℃〜７３℃で、約１分間〜約４分間、好ましくは２分間
〜３分間インキュベートすることにより行う。これらの
工程からなるＤＮＡ複製サイクルの繰り返し回数は、当
業者であれば適宜設定することができるため特に限定さ
れないが、例えば、約２０回〜約４０回、好ましくは２
５回〜３５回とすることができる。
ニーリング工程及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程
の反応条件は、当業者であれば適宜設定することができ
るため特に限定されないが、例えば、以下のような条件
とすることができる。変性工程は、例えば、約９０℃〜
約９５℃、好ましくは９４℃〜９５℃で、約１分間〜約
３分間、好ましくは１分間〜２分間加熱することにより
行う。プライマーのアニーリング工程は、例えば、約４
０℃〜約６０℃、好ましくは５０℃〜６０℃で、約１分
間〜約３分間、好ましくは１分間〜２分間インキュベー
トすることにより行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長
工程は、例えば、約７０℃〜約７３℃、好ましくは７２
℃〜７３℃で、約１分間〜約４分間、好ましくは２分間
〜３分間インキュベートすることにより行う。これらの
工程からなるＤＮＡ複製サイクルの繰り返し回数は、当
業者であれば適宜設定することができるため特に限定さ
れないが、例えば、約２０回〜約４０回、好ましくは２
５回〜３５回とすることができる。
【００３７】上記方法により得られる増幅ゲノムＤＮＡ
は、通常ＤＮＡの分離に用いられる電気泳動法によって
分離することができる。一般に、電気泳動用ゲルとし
て、１０００bp以下の短いＤＮＡ断片の分離には、約３
％〜約２０％のポリアクリルアミドゲルが、また、それ
以上に長いＤＮＡの分離には、約０．２％〜約２％のア
ガロースゲルが用いられる。本発明の上記方法において
は、好ましくは、約４％〜約８％の変性ポリアクリルア
ミドゲルを用いることができる。電気泳動に用いられる
緩衝液としては、Tris−リン酸系（pH7.5-8.0）、Tris
−酢酸系（pH7.5-8.0）、Tris−ホウ酸系（pH7.5-8.3）
等があげられ、好ましくはTris−ホウ酸系を挙げること
ができる。また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等を添加する
こともできる。5'末端に蛍光色素などでラベルしたプラ
イマーを用いて得られた増幅ＤＮＡの分離では、蛍光Ｄ
ＮＡシークエンサーを利用することができる。
は、通常ＤＮＡの分離に用いられる電気泳動法によって
分離することができる。一般に、電気泳動用ゲルとし
て、１０００bp以下の短いＤＮＡ断片の分離には、約３
％〜約２０％のポリアクリルアミドゲルが、また、それ
以上に長いＤＮＡの分離には、約０．２％〜約２％のア
ガロースゲルが用いられる。本発明の上記方法において
は、好ましくは、約４％〜約８％の変性ポリアクリルア
ミドゲルを用いることができる。電気泳動に用いられる
緩衝液としては、Tris−リン酸系（pH7.5-8.0）、Tris
−酢酸系（pH7.5-8.0）、Tris−ホウ酸系（pH7.5-8.3）
等があげられ、好ましくはTris−ホウ酸系を挙げること
ができる。また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等を添加する
こともできる。5'末端に蛍光色素などでラベルしたプラ
イマーを用いて得られた増幅ＤＮＡの分離では、蛍光Ｄ
ＮＡシークエンサーを利用することができる。
【００３８】増幅ゲノムＤＮＡの視覚検出法としては、
例えば、蛍光ＤＮＡシークエンサーにおいてレーザー光
照射により発生した蛍光をＣＣＤカメラで検出する方
法、エチジウムブロミド等のフェナントリジン系の色素
で染色し、ＤＮＡを検出する方法等を挙げることができ
る。次いで、検出された増幅ゲノムＤＮＡの存否、及び
増幅ゲノムＤＮＡの長さの差異によって、マイクロサテ
ライトＤＮＡがナシ類植物のゲノムＤＮＡ中に存在する
か否かを調べることにより、ナシ類植物を識別すること
ができる。
例えば、蛍光ＤＮＡシークエンサーにおいてレーザー光
照射により発生した蛍光をＣＣＤカメラで検出する方
法、エチジウムブロミド等のフェナントリジン系の色素
で染色し、ＤＮＡを検出する方法等を挙げることができ
る。次いで、検出された増幅ゲノムＤＮＡの存否、及び
増幅ゲノムＤＮＡの長さの差異によって、マイクロサテ
ライトＤＮＡがナシ類植物のゲノムＤＮＡ中に存在する
か否かを調べることにより、ナシ類植物を識別すること
ができる。
【００３９】必要に応じて、使用するプライマーを他の
ものに代え、上記と同様な方法により増幅ゲノムＤＮＡ
の存否を調べることができ、これにより、より詳細で正
確な識別が可能となる。すなわち、本発明の一のマイク
ロサテライトＤＮＡ又はその同効物を標的とする上記識
別を行った後、さらに、本発明の他のマイクロサテライ
トＤＮＡ又はその同効物を標的とする上記識別を行い、
これらの結果を統合することにより、より詳細かつ正確
にナシ類植物を識別することができる。標的とする本発
明のマイクロサテライトＤＮＡ又はその同効物は、配列
番号１〜５から選択される少なくとも２つ、好ましくは
少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さら
に好ましくは５つとすることができる。
ものに代え、上記と同様な方法により増幅ゲノムＤＮＡ
の存否を調べることができ、これにより、より詳細で正
確な識別が可能となる。すなわち、本発明の一のマイク
ロサテライトＤＮＡ又はその同効物を標的とする上記識
別を行った後、さらに、本発明の他のマイクロサテライ
トＤＮＡ又はその同効物を標的とする上記識別を行い、
これらの結果を統合することにより、より詳細かつ正確
にナシ類植物を識別することができる。標的とする本発
明のマイクロサテライトＤＮＡ又はその同効物は、配列
番号１〜５から選択される少なくとも２つ、好ましくは
少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さら
に好ましくは５つとすることができる。
【００４０】また、さらに識別能力を高めるために、プ
ライマーのアニーリング工程の温度、増幅用緩衝液中の
マグネシウム濃度等のＰＣＲの条件を変化させて同一の
挙動を示すか否かを調べることができる。
ライマーのアニーリング工程の温度、増幅用緩衝液中の
マグネシウム濃度等のＰＣＲの条件を変化させて同一の
挙動を示すか否かを調べることができる。
【００４１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定され
るものではなく、本発明の属する技術分野における通常
の変更を加えて実施することができることは言うまでも
ない。 〔実施例１〕ナシ類植物のゲノムＤＮＡの単離 ニホンナシ品種「豊水」（品種番号１）、「新星」（品
種番号２）、「幸水」（品種番号３）、「長寿」（品種
番号４）、「長十郎」（品種番号５）、「晩三吉」（品
種番号６）、「南勢チャボ」（品種番号７）、「二十世
紀」（品種番号８）、「新高」（品種番号９）、「愛
宕」（品種番号１０）、「あきづき」（品種番号１
１）、「筑水」（品種番号１２）、「八里」（品種番号
１３）、「豊月」（品種番号１４）、「秀玉」（品種番
号１５）、「新水」（品種番号１６）、「巾着」（品種
番号１７）、チュウゴクナシ品種「鴨梨」（品種番号１
８）、「莱陽慈梨」（品種番号１９）、「蜜梨」（品種
番号２０）、「紅梨」（品種番号２１）、チュウゴクコ
ナシ品種「北京白梨」（品種番号２２）、「八里香」
（品種番号２３）、セイヨウナシ品種「ラ・フランス」
（品種番号２４）、「バートレット」（品種番号２
５）、「ルレクチェ」（品種番号２６）、「シルバーベ
ル」（品種番号２７）、ニホンナシとセイヨウナシの雑
種「２８２−１２」（品種番号２８）、「２９０−３
６」（品種番号２９）、イワテヤマナシ品種「イワテヤ
マナシ」（品種番号３０）、マンシュウマメナシ品種
「ベチュレフォリア」（品種番号３１）、マメナシ品種
「マメナシ６」（品種番号３２）、「マメナシ１４」
（品種番号３３）を用いた。
明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定され
るものではなく、本発明の属する技術分野における通常
の変更を加えて実施することができることは言うまでも
ない。 〔実施例１〕ナシ類植物のゲノムＤＮＡの単離 ニホンナシ品種「豊水」（品種番号１）、「新星」（品
種番号２）、「幸水」（品種番号３）、「長寿」（品種
番号４）、「長十郎」（品種番号５）、「晩三吉」（品
種番号６）、「南勢チャボ」（品種番号７）、「二十世
紀」（品種番号８）、「新高」（品種番号９）、「愛
宕」（品種番号１０）、「あきづき」（品種番号１
１）、「筑水」（品種番号１２）、「八里」（品種番号
１３）、「豊月」（品種番号１４）、「秀玉」（品種番
号１５）、「新水」（品種番号１６）、「巾着」（品種
番号１７）、チュウゴクナシ品種「鴨梨」（品種番号１
８）、「莱陽慈梨」（品種番号１９）、「蜜梨」（品種
番号２０）、「紅梨」（品種番号２１）、チュウゴクコ
ナシ品種「北京白梨」（品種番号２２）、「八里香」
（品種番号２３）、セイヨウナシ品種「ラ・フランス」
（品種番号２４）、「バートレット」（品種番号２
５）、「ルレクチェ」（品種番号２６）、「シルバーベ
ル」（品種番号２７）、ニホンナシとセイヨウナシの雑
種「２８２−１２」（品種番号２８）、「２９０−３
６」（品種番号２９）、イワテヤマナシ品種「イワテヤ
マナシ」（品種番号３０）、マンシュウマメナシ品種
「ベチュレフォリア」（品種番号３１）、マメナシ品種
「マメナシ６」（品種番号３２）、「マメナシ１４」
（品種番号３３）を用いた。
【００４２】供試品種の若葉から以下のようにゲノムＤ
ＮＡを抽出した。約１ｇの葉を液体窒素で凍結した後、
乳棒と乳鉢ですりつぶした。粉砕した葉を遠心チューブ
に移し、１０mlの２×ＣＴＡＢ溶液（２％臭化セチルト
リメチルアンモニウム、２０mMのＥＤＴＡ、１００mMの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．４Mの塩化ナトリウム、ｐＨ
８．０）、０．２ｍｌのメルカプトエタノール、１ｍｌ
のリシスバッファー（１０％N-ラウロイルサルコシン酸
ナトリウム、２０mMのＥＤＴＡ、１００mMのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、約１００ｍｇの不溶性ポリビニ
ルピロリドンを入れ、かき混ぜた。６０℃で約１時間イ
ンキュベートし、その後１０mlのクロロホルム液（クロ
ロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、
５分間緩やかに震盪した。１００００ｒｐｍで約１０分
間遠心した後、上層の水層をとり、新しい遠心チューブ
に移した。再度１０mlのクロロホルム液を加え、５分間
緩やかに震盪した。１００００ｒｐｍで約１０分間遠心
した後、上層の水層をとり、新しい遠心チューブに移し
た。該水層に１ｍｌの１０％ＣＴＡＢ液（１０％臭化セ
チルトリメチルアンモニウム、０．７Ｍの塩化ナトリウ
ム）と２０ｍｌのＣＴＡＢ沈殿液（１％臭化セチルトリ
メチルアンモニウム、１０mMのＥＤＴＡ、５０mMのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加え、３０分間室温で放
置した。１５０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、ゲノム
ＤＮＡの沈殿を得た。上清を捨て、１．６ｍｌのハイソ
ルトＴＥバッファー（１Ｍの塩化ナトリウム、１mMのＥ
ＤＴＡ、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加
え、５５℃で1時間インキュベートし、該ゲノムＤＮＡ
の沈殿を溶解させた。１．１２ｍｌのイソプロパノール
を加え、緩やかに震盪混合した後、１５０００ｒｐｍで
約１０分間遠心し、再度ゲノムＤＮＡの沈殿を得た。上
清を捨て、０．５ｍｌの７０％エタノールを加え、１５
０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、該ゲノムＤＮＡの沈
殿を洗浄した。該ゲノムＤＮＡを減圧乾燥した後、約
０．５mlのＴＥバッファー（１mMのＥＤＴＡ、１０mMの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、ゲノムＤＮＡ
を溶解させた。
ＮＡを抽出した。約１ｇの葉を液体窒素で凍結した後、
乳棒と乳鉢ですりつぶした。粉砕した葉を遠心チューブ
に移し、１０mlの２×ＣＴＡＢ溶液（２％臭化セチルト
リメチルアンモニウム、２０mMのＥＤＴＡ、１００mMの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．４Mの塩化ナトリウム、ｐＨ
８．０）、０．２ｍｌのメルカプトエタノール、１ｍｌ
のリシスバッファー（１０％N-ラウロイルサルコシン酸
ナトリウム、２０mMのＥＤＴＡ、１００mMのＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、約１００ｍｇの不溶性ポリビニ
ルピロリドンを入れ、かき混ぜた。６０℃で約１時間イ
ンキュベートし、その後１０mlのクロロホルム液（クロ
ロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、
５分間緩やかに震盪した。１００００ｒｐｍで約１０分
間遠心した後、上層の水層をとり、新しい遠心チューブ
に移した。再度１０mlのクロロホルム液を加え、５分間
緩やかに震盪した。１００００ｒｐｍで約１０分間遠心
した後、上層の水層をとり、新しい遠心チューブに移し
た。該水層に１ｍｌの１０％ＣＴＡＢ液（１０％臭化セ
チルトリメチルアンモニウム、０．７Ｍの塩化ナトリウ
ム）と２０ｍｌのＣＴＡＢ沈殿液（１％臭化セチルトリ
メチルアンモニウム、１０mMのＥＤＴＡ、５０mMのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加え、３０分間室温で放
置した。１５０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、ゲノム
ＤＮＡの沈殿を得た。上清を捨て、１．６ｍｌのハイソ
ルトＴＥバッファー（１Ｍの塩化ナトリウム、１mMのＥ
ＤＴＡ、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加
え、５５℃で1時間インキュベートし、該ゲノムＤＮＡ
の沈殿を溶解させた。１．１２ｍｌのイソプロパノール
を加え、緩やかに震盪混合した後、１５０００ｒｐｍで
約１０分間遠心し、再度ゲノムＤＮＡの沈殿を得た。上
清を捨て、０．５ｍｌの７０％エタノールを加え、１５
０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、該ゲノムＤＮＡの沈
殿を洗浄した。該ゲノムＤＮＡを減圧乾燥した後、約
０．５mlのＴＥバッファー（１mMのＥＤＴＡ、１０mMの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、ゲノムＤＮＡ
を溶解させた。
【００４３】ＤＮＡ溶液１５０μｌに２μｌのＲＮａｓ
ｅ（ベーリンガー社製）を加え、３７℃で２時間インキ
ュベートした。その後、キアゲン社製プラスミドミニキ
ットを用いて、ＤＮＡを精製した。すなわち、ＤＮＡ溶
液に２×ＱＢＴ溶液１５０μｌを加えて混ぜた後、カラ
ム平衡化緩衝液１ｍｌで平衡化させたカラムｔｉｐ２０
を通した。カラム洗浄用緩衝液１ｍｌを加えて自然落下
させた後、再度カラム洗浄用緩衝液１ｍｌを加えて洗浄
した。カラム溶出用緩衝液１．５ｍｌをカラムに通し、
溶出するＤＮＡを回収した。該溶出液に−２０℃のイソ
プロパノールを１ｍｌ加えよく混合した後、４℃、１５
０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、ゲノムＤＮＡの沈殿
を得た。上清を捨て、１ｍｌの７０％エタノール（−２
０℃）を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで約１０分間遠
心し、該ゲノムＤＮＡの沈殿を洗浄した。該ゲノムＤＮ
Ａを減圧乾燥した後、約０．１mlのＴＥバッファー（１
mMのＥＤＴＡ、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５）を加え、カラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
ｅ（ベーリンガー社製）を加え、３７℃で２時間インキ
ュベートした。その後、キアゲン社製プラスミドミニキ
ットを用いて、ＤＮＡを精製した。すなわち、ＤＮＡ溶
液に２×ＱＢＴ溶液１５０μｌを加えて混ぜた後、カラ
ム平衡化緩衝液１ｍｌで平衡化させたカラムｔｉｐ２０
を通した。カラム洗浄用緩衝液１ｍｌを加えて自然落下
させた後、再度カラム洗浄用緩衝液１ｍｌを加えて洗浄
した。カラム溶出用緩衝液１．５ｍｌをカラムに通し、
溶出するＤＮＡを回収した。該溶出液に−２０℃のイソ
プロパノールを１ｍｌ加えよく混合した後、４℃、１５
０００ｒｐｍで約１０分間遠心し、ゲノムＤＮＡの沈殿
を得た。上清を捨て、１ｍｌの７０％エタノール（−２
０℃）を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで約１０分間遠
心し、該ゲノムＤＮＡの沈殿を洗浄した。該ゲノムＤＮ
Ａを減圧乾燥した後、約０．１mlのＴＥバッファー（１
mMのＥＤＴＡ、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５）を加え、カラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００４４】〔実施例２〕マイクロサテライトＤＮＡの
取得（その１） 実施例１で得られたナシ品種「豊水」を原料とするカラ
ム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型として以下のようにPCR
法にてＤＮＡの増幅を行った。PCR反応液として、カラ
ム精製ゲノムＤＮＡ約30ng、プライマーＤＮＡ（5’-TC
TGTGCTGG-3’：配列番号１６）20pmol、10×PCRバッフ
ァー（PERKIN ELMER社製）2μl、2.5mMのdNTPs 1.6μ
l、及びTaqDNAポリメラーゼリコビナント（Gibco BRL社
製）0.2μlを混合し、滅菌蒸留水にて希釈して全量を20
μlとした。サーマルサイクラー（Gene Amp PCR system
9700、PERKIN ELMER社製）中で、鋳型ＤＮＡを94℃で5
分間変性させた後、94℃で1分間変性、40℃で2分間アニ
ーリング、そして72℃で2分間伸長を1サイクルとして35
サイクル反応させ、さらに72℃で10分間伸長反応させ、
最後に4℃まで温度を下げてPCR反応を終了した。
取得（その１） 実施例１で得られたナシ品種「豊水」を原料とするカラ
ム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型として以下のようにPCR
法にてＤＮＡの増幅を行った。PCR反応液として、カラ
ム精製ゲノムＤＮＡ約30ng、プライマーＤＮＡ（5’-TC
TGTGCTGG-3’：配列番号１６）20pmol、10×PCRバッフ
ァー（PERKIN ELMER社製）2μl、2.5mMのdNTPs 1.6μ
l、及びTaqDNAポリメラーゼリコビナント（Gibco BRL社
製）0.2μlを混合し、滅菌蒸留水にて希釈して全量を20
μlとした。サーマルサイクラー（Gene Amp PCR system
9700、PERKIN ELMER社製）中で、鋳型ＤＮＡを94℃で5
分間変性させた後、94℃で1分間変性、40℃で2分間アニ
ーリング、そして72℃で2分間伸長を1サイクルとして35
サイクル反応させ、さらに72℃で10分間伸長反応させ、
最後に4℃まで温度を下げてPCR反応を終了した。
【００４５】次に、該PCR反応液からPCR産物を分離させ
るために、1.5%アガロースゲルによる電気泳動を行っ
た。PCR反応液9μlと1μlのローディングバッファーを
混合した後、1.5%アガロースゲルで、100Vにて30分間電
気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを0.5
μg/mlのエチジウムブロマイドを含むTAEバッファー溶
液に約30分間浸し、アガロース内のDNAを染色した。そ
の後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを
検出した。
るために、1.5%アガロースゲルによる電気泳動を行っ
た。PCR反応液9μlと1μlのローディングバッファーを
混合した後、1.5%アガロースゲルで、100Vにて30分間電
気泳動を行った。泳動終了後、該アガロースゲルを0.5
μg/mlのエチジウムブロマイドを含むTAEバッファー溶
液に約30分間浸し、アガロース内のDNAを染色した。そ
の後、暗所で紫外線を照射し、ゲル中のＤＮＡバンドを
検出した。
【００４６】該アガロースゲルをブロッティング台に乗
せ、以下のように分離ＤＮＡをナイロンメンブレンに転
写した。まず、Hybond-N+ナイロンメンブレン（Amersha
m社製）を該アガロースゲル上に密着させるように乗
せ、その上に濾紙３枚、キムタオル20枚、平板１枚、約
１kgの重石を乗せた。0.4Nの水酸化ナトリウム溶液をア
ガロースゲルの下から吸わせ、約12〜16時間ブロッティ
ングし、分離ＤＮＡを１本鎖に乖離させながらナイロン
メンブレンに転写した。ブロッティング終了後、得られ
たＤＮＡ結合ナイロンメンブレンを2×SSC溶液（ナイロ
ンメンブレン１cm 2 当たり１mlの2×SSC溶液）で15分間
洗浄した。その後、インキュベーターで50℃に保温した
ハイブリダイゼーションバッファー（5×SSC、0.1%Nラ
ウロイルサルコシン、0.02%SDS、１%ブロッキング試
薬）中で、ナイロンメンブレンを30分間インキュベート
した。サザンブロット分析のプローブとして、5'末端を
ビオチンラベルした(AG)15（配列番号２１）、(AT)15
（配列番号２２）及び(GT)15（配列番号２３）の各オリ
ゴヌクレオチド溶液混合物を用いた。オリゴヌクレオチ
ド溶液混合物を5分間煮沸し、氷中で5分間急冷した後、
5〜25ng/mlの濃度になるようにハイブリダイゼーション
バッファーの中に加え約16時間インキュベートした。
せ、以下のように分離ＤＮＡをナイロンメンブレンに転
写した。まず、Hybond-N+ナイロンメンブレン（Amersha
m社製）を該アガロースゲル上に密着させるように乗
せ、その上に濾紙３枚、キムタオル20枚、平板１枚、約
１kgの重石を乗せた。0.4Nの水酸化ナトリウム溶液をア
ガロースゲルの下から吸わせ、約12〜16時間ブロッティ
ングし、分離ＤＮＡを１本鎖に乖離させながらナイロン
メンブレンに転写した。ブロッティング終了後、得られ
たＤＮＡ結合ナイロンメンブレンを2×SSC溶液（ナイロ
ンメンブレン１cm 2 当たり１mlの2×SSC溶液）で15分間
洗浄した。その後、インキュベーターで50℃に保温した
ハイブリダイゼーションバッファー（5×SSC、0.1%Nラ
ウロイルサルコシン、0.02%SDS、１%ブロッキング試
薬）中で、ナイロンメンブレンを30分間インキュベート
した。サザンブロット分析のプローブとして、5'末端を
ビオチンラベルした(AG)15（配列番号２１）、(AT)15
（配列番号２２）及び(GT)15（配列番号２３）の各オリ
ゴヌクレオチド溶液混合物を用いた。オリゴヌクレオチ
ド溶液混合物を5分間煮沸し、氷中で5分間急冷した後、
5〜25ng/mlの濃度になるようにハイブリダイゼーション
バッファーの中に加え約16時間インキュベートした。
【００４７】インキュベート終了後、該ナイロンメンブ
レンを洗浄バッファー（2×SSC, 0.1%SDS、1ml/cm2 メ
ンブレン）中で5分間浸透させ、新しい洗浄バッファー
で再度浸透させた。次に、68℃に保温した洗浄バッファ
ー中に該ナイロンメンブレンを移し、５分間浸透させ
た。その後、BrightStar BioDetect Nonisotopic Detec
tion Kit（Ambion社製）を用いて、マイクロサテライト
配列を含むＤＮＡ断片の検出を行った。検出の手順は、
該キットのプロトコールに従った。すなわち、ナイロン
メンブレンをブロッキングバッファー（0.5ml/cm2メン
ブレン）中で５分間浸透させ、再度新しいブロッキング
バッファー中で浸透させた。次に、ストレプトアビジン
（1μl/100cm2メンブレン）とブロッキングバッファー
（10ml/100cm2メンブレン）を混合した溶液中で、該ナ
イロンメンブレンを約30分間浸透させ、ストレプトアビ
ジンをビオチンに結合させた。再度ブロッキングバッフ
ァー中で10分間浸透後、Washバッファー（１ml/cm2メン
ブレン)中で約５分間の洗浄を３回行い、１×Assayバッ
ファー（0.5ml/cm2メンブレン）中で約２分間の浸透を
２回、さらにCDP-Star（5ml/100cm2メンブレン）に約５
分間浸した。次に、サランラップで該ナイロンメンブレ
ンを覆い、暗室でX線フィルムに1〜2分間感光させた。X
線フィルムをレンドール液（FUJI FILM社製）につけて
現像し、水道水で発色を停止させ、レンフィクス液（FU
JI FILM社製）につけて固定した。その結果、約320bpの
DNA断片がバンドとして検出された。
レンを洗浄バッファー（2×SSC, 0.1%SDS、1ml/cm2 メ
ンブレン）中で5分間浸透させ、新しい洗浄バッファー
で再度浸透させた。次に、68℃に保温した洗浄バッファ
ー中に該ナイロンメンブレンを移し、５分間浸透させ
た。その後、BrightStar BioDetect Nonisotopic Detec
tion Kit（Ambion社製）を用いて、マイクロサテライト
配列を含むＤＮＡ断片の検出を行った。検出の手順は、
該キットのプロトコールに従った。すなわち、ナイロン
メンブレンをブロッキングバッファー（0.5ml/cm2メン
ブレン）中で５分間浸透させ、再度新しいブロッキング
バッファー中で浸透させた。次に、ストレプトアビジン
（1μl/100cm2メンブレン）とブロッキングバッファー
（10ml/100cm2メンブレン）を混合した溶液中で、該ナ
イロンメンブレンを約30分間浸透させ、ストレプトアビ
ジンをビオチンに結合させた。再度ブロッキングバッフ
ァー中で10分間浸透後、Washバッファー（１ml/cm2メン
ブレン)中で約５分間の洗浄を３回行い、１×Assayバッ
ファー（0.5ml/cm2メンブレン）中で約２分間の浸透を
２回、さらにCDP-Star（5ml/100cm2メンブレン）に約５
分間浸した。次に、サランラップで該ナイロンメンブレ
ンを覆い、暗室でX線フィルムに1〜2分間感光させた。X
線フィルムをレンドール液（FUJI FILM社製）につけて
現像し、水道水で発色を停止させ、レンフィクス液（FU
JI FILM社製）につけて固定した。その結果、約320bpの
DNA断片がバンドとして検出された。
【００４８】次に、PCR反応液からサザンブロット分析
でバンドとして検出されたPCR産物を分離精製するため
に、2%アガロースゲルによる電気泳動を行った。すなわ
ち、該PCR反応液50μlに5μlのローディングバッファー
を加え、電気泳動装置に設置した2%のアガロースゲルに
添加し、100Vにて約30分間電気泳動を行った。泳動終了
後、該アガロースゲルを0.5μg/mlのエチジウムブロマ
イドを含むTAEバッファーに約30分間浸し、アガロース
内のＤＮＡを染色した。この電気泳動を行ったアガロー
スゲルを暗所で紫外線を照射し、ゲル中の約320bpのＤ
ＮＡバンドを検出し、該ＤＮＡバンドを含むアガロース
ゲルを切り出した。そして、GFX PCR DNA and Gel Band
Purificationキット（アマシャムファルマシア社製）
を使用して、該アガロースゲルからＤＮＡバンドを回収
し、精製した。すなわち、キットの使用法に従い、切り
出したアガロースゲルの重量を測定して1.5mlチューブ
に移し、そのゲルと等量のCaptureバッファーを添加し
て60℃で10分間加温することにより、アガロースゲルを
溶解した。この溶解したアガロースゲルをGFXカラム上
に添加し1分間静置した後、1500rpmで30秒間遠心分離し
てカラム中にPCR産物であるＤＮＡを保持させた。ま
た、カラム透過物については除去した。さらに、そのPC
R産物ＤＮＡを保持したカラム上にWashバッファーの0.5
mlを添加し、再び1500rpmで30秒間遠心分離し、カラム
に残るPCR産物を洗浄してＤＮＡ以外のものを除去し
た。この洗浄したカラム上に25μlの滅菌蒸留水を添加
して1分間静置した後、1500rpmで1分間遠心分離を行
い、カラムからPCR産物ＤＮＡを溶出させ、精製PCR産物
とした。
でバンドとして検出されたPCR産物を分離精製するため
に、2%アガロースゲルによる電気泳動を行った。すなわ
ち、該PCR反応液50μlに5μlのローディングバッファー
を加え、電気泳動装置に設置した2%のアガロースゲルに
添加し、100Vにて約30分間電気泳動を行った。泳動終了
後、該アガロースゲルを0.5μg/mlのエチジウムブロマ
イドを含むTAEバッファーに約30分間浸し、アガロース
内のＤＮＡを染色した。この電気泳動を行ったアガロー
スゲルを暗所で紫外線を照射し、ゲル中の約320bpのＤ
ＮＡバンドを検出し、該ＤＮＡバンドを含むアガロース
ゲルを切り出した。そして、GFX PCR DNA and Gel Band
Purificationキット（アマシャムファルマシア社製）
を使用して、該アガロースゲルからＤＮＡバンドを回収
し、精製した。すなわち、キットの使用法に従い、切り
出したアガロースゲルの重量を測定して1.5mlチューブ
に移し、そのゲルと等量のCaptureバッファーを添加し
て60℃で10分間加温することにより、アガロースゲルを
溶解した。この溶解したアガロースゲルをGFXカラム上
に添加し1分間静置した後、1500rpmで30秒間遠心分離し
てカラム中にPCR産物であるＤＮＡを保持させた。ま
た、カラム透過物については除去した。さらに、そのPC
R産物ＤＮＡを保持したカラム上にWashバッファーの0.5
mlを添加し、再び1500rpmで30秒間遠心分離し、カラム
に残るPCR産物を洗浄してＤＮＡ以外のものを除去し
た。この洗浄したカラム上に25μlの滅菌蒸留水を添加
して1分間静置した後、1500rpmで1分間遠心分離を行
い、カラムからPCR産物ＤＮＡを溶出させ、精製PCR産物
とした。
【００４９】次にOriginal TAクローニングキット（Inv
itrogen社製）を使用し、この精製PCR産物のクローニン
グを行った。まず、キットの使用法に従い、1.5mlチュ
ーブに該精製PCR産物をＤＮＡ量として100ng加え、さら
に10×PCRバッファーを1μl、ベクターを5ng、T4 ligas
eを1μl加え、これに滅菌蒸留水を加え全量で10μlとな
るようにした。この混合液を14℃で保持し、ライゲーシ
ョン反応を行ってベクター中にPCR産物ＤＮＡを結合さ
せた。次に、このPCR産物をライゲーションしたプラス
ミドベクターを使用し、INVαF’コンピテントセル（In
vitrogen社製）の形質転換を行った。まず、コンピテン
トセルを氷上に静置し、これに2μlの0.5M β-メルカプ
トエタノールを加え、ピペットのチップで穏和に混合し
た。さらにこのコンピテントセルに上述のPCR産物をラ
イゲーションしたプラスミドベクターを2μl添加し、同
様にピペットで穏和に混合した。このコンピテントセル
を氷上に30分間静置した後、42℃で30秒間加温してヒー
トショックを与えた。再びこのコンピテントセルを2分
間氷上に静置した後、室温にしたSOC培地を250μl加え
て37℃で1時間振とう培養した。このコンピテントセル
を含む培養液の全量を採取し、アンピシリンを50μg/m
l、X-galを80μg/mlの濃度で含むLB寒天培地にコンラー
ジ棒で一様に播種した。37℃で18時間培養後、コンピテ
ントセルにプラスミドベクターが取り込まれたことを示
すアンピシリン耐性でβ-ガラクトシダーゼ活性を持た
ない、白色のコロニーの発生を確認し、このコロニーを
形質転換体として釣菌し、別のアンピシリン、X-galを
含むLB寒天培地に画線培養して保存した。
itrogen社製）を使用し、この精製PCR産物のクローニン
グを行った。まず、キットの使用法に従い、1.5mlチュ
ーブに該精製PCR産物をＤＮＡ量として100ng加え、さら
に10×PCRバッファーを1μl、ベクターを5ng、T4 ligas
eを1μl加え、これに滅菌蒸留水を加え全量で10μlとな
るようにした。この混合液を14℃で保持し、ライゲーシ
ョン反応を行ってベクター中にPCR産物ＤＮＡを結合さ
せた。次に、このPCR産物をライゲーションしたプラス
ミドベクターを使用し、INVαF’コンピテントセル（In
vitrogen社製）の形質転換を行った。まず、コンピテン
トセルを氷上に静置し、これに2μlの0.5M β-メルカプ
トエタノールを加え、ピペットのチップで穏和に混合し
た。さらにこのコンピテントセルに上述のPCR産物をラ
イゲーションしたプラスミドベクターを2μl添加し、同
様にピペットで穏和に混合した。このコンピテントセル
を氷上に30分間静置した後、42℃で30秒間加温してヒー
トショックを与えた。再びこのコンピテントセルを2分
間氷上に静置した後、室温にしたSOC培地を250μl加え
て37℃で1時間振とう培養した。このコンピテントセル
を含む培養液の全量を採取し、アンピシリンを50μg/m
l、X-galを80μg/mlの濃度で含むLB寒天培地にコンラー
ジ棒で一様に播種した。37℃で18時間培養後、コンピテ
ントセルにプラスミドベクターが取り込まれたことを示
すアンピシリン耐性でβ-ガラクトシダーゼ活性を持た
ない、白色のコロニーの発生を確認し、このコロニーを
形質転換体として釣菌し、別のアンピシリン、X-galを
含むLB寒天培地に画線培養して保存した。
【００５０】保存したものと同一のコロニーの一部を採
取してPCRを行い、形質転換体のプラスミド中に該PCR産
物ＤＮＡが取り込まれていることを確認した。つまり、
10×PCRバッファー（PERKIN ELMER社製）2μl、2.5mM d
NTPs 1.6μl、3.2μM T7及びM13プライマー各1.0μl、
そしてTaqポリメラーゼ（Gibco BRL社製）0.1μlを加
え、滅菌蒸留水で希釈して全量を20μlとした。この反
応液を0.2mlチューブに移し、少量の形質転換コンピテ
ントセルを添加し、サーマルサイクラー中において94℃
で5分間変性反応させた後、94℃で1分間の変性反応、55
℃で1分間のアニーリング反応、72℃で2分間の伸長反応
を1サイクルとして35サイクル反応させた。さらに、72
℃で7分伸長反応させた後、4℃まで冷却してPCR反応を
終了した。このPCR反応液の5μlに1μlのローディング
バッファーを加え、電気泳動装置に設置した2%のアガロ
ースゲルに添加し、100Vにて約30分間電気泳動を行っ
た。泳動終了後、アガロースゲルを0.5μg/mlのエチジ
ウムブロマイドを含むTAEバッファーに約30分間浸して
アガロース内のＤＮＡを染色し、暗所で紫外線を照射し
てゲル中のＤＮＡバンドを検出し、PCR増幅ＤＮＡ断片
を含んだプラスミドベクターでコンピテントセルが形質
転換されたことを確認した。
取してPCRを行い、形質転換体のプラスミド中に該PCR産
物ＤＮＡが取り込まれていることを確認した。つまり、
10×PCRバッファー（PERKIN ELMER社製）2μl、2.5mM d
NTPs 1.6μl、3.2μM T7及びM13プライマー各1.0μl、
そしてTaqポリメラーゼ（Gibco BRL社製）0.1μlを加
え、滅菌蒸留水で希釈して全量を20μlとした。この反
応液を0.2mlチューブに移し、少量の形質転換コンピテ
ントセルを添加し、サーマルサイクラー中において94℃
で5分間変性反応させた後、94℃で1分間の変性反応、55
℃で1分間のアニーリング反応、72℃で2分間の伸長反応
を1サイクルとして35サイクル反応させた。さらに、72
℃で7分伸長反応させた後、4℃まで冷却してPCR反応を
終了した。このPCR反応液の5μlに1μlのローディング
バッファーを加え、電気泳動装置に設置した2%のアガロ
ースゲルに添加し、100Vにて約30分間電気泳動を行っ
た。泳動終了後、アガロースゲルを0.5μg/mlのエチジ
ウムブロマイドを含むTAEバッファーに約30分間浸して
アガロース内のＤＮＡを染色し、暗所で紫外線を照射し
てゲル中のＤＮＡバンドを検出し、PCR増幅ＤＮＡ断片
を含んだプラスミドベクターでコンピテントセルが形質
転換されたことを確認した。
【００５１】次に、QIAprep Spin Miniprepキット（キ
アゲン社製）を使用して、該PCR増幅ＤＮＡの配列決定
のための試料とするために形質転換体からプラスミドを
回収した。まず、保存した該形質転換体の少量を2mlのL
B培養液（100μg/mlでアンピシリンを含む）に接種して
12時間の培養を行い、形質転換体を増殖させた。このLB
培養液の約1.5mlを遠心チューブに移し、1200rpmで5分
間遠心分離して上清を除去し、形質転換体のペレットを
得た。この形質転換体のペレットを250μlのP1バッファ
ー中に懸濁し、250μlのP2バッファーを加えて穏和に混
合することにより、形質転換体を溶解した。この形質転
換体溶解液に350μlのN3バッファーを加えて穏和に混合
し、この混合液を12000rpmで10分間遠心分離して上清を
回収し、新たな1.5mlチューブ中に設置したQIA prepス
ピンカラム上に上清を添加した。これを1200rpmで1分間
遠心分離し、カラム中にプラスミドを保持させ、それ以
外の透過物は除去した。次に、これを0.5mlのPBバッフ
ァーカラム上に添加して1分間遠心分離し、ＤＮＡを保
持したカラムを洗浄した。さらに、0.75mlのPEバッファ
ーをカラム上に添加し、1分間遠心分離して再びカラム
を洗浄した。透過物を除去後、もう一度1200rpmで1分間
遠心分離を行い、余分なバッファーを完全に除去した。
この洗浄したカラムを新たな1.5mlチューブに移し、こ
のカラム上に50μlの滅菌蒸留水を加えて1200rpmで1分
間遠心分離し、カラム内に保持されていたプラスミドを
回収した。
アゲン社製）を使用して、該PCR増幅ＤＮＡの配列決定
のための試料とするために形質転換体からプラスミドを
回収した。まず、保存した該形質転換体の少量を2mlのL
B培養液（100μg/mlでアンピシリンを含む）に接種して
12時間の培養を行い、形質転換体を増殖させた。このLB
培養液の約1.5mlを遠心チューブに移し、1200rpmで5分
間遠心分離して上清を除去し、形質転換体のペレットを
得た。この形質転換体のペレットを250μlのP1バッファ
ー中に懸濁し、250μlのP2バッファーを加えて穏和に混
合することにより、形質転換体を溶解した。この形質転
換体溶解液に350μlのN3バッファーを加えて穏和に混合
し、この混合液を12000rpmで10分間遠心分離して上清を
回収し、新たな1.5mlチューブ中に設置したQIA prepス
ピンカラム上に上清を添加した。これを1200rpmで1分間
遠心分離し、カラム中にプラスミドを保持させ、それ以
外の透過物は除去した。次に、これを0.5mlのPBバッフ
ァーカラム上に添加して1分間遠心分離し、ＤＮＡを保
持したカラムを洗浄した。さらに、0.75mlのPEバッファ
ーをカラム上に添加し、1分間遠心分離して再びカラム
を洗浄した。透過物を除去後、もう一度1200rpmで1分間
遠心分離を行い、余分なバッファーを完全に除去した。
この洗浄したカラムを新たな1.5mlチューブに移し、こ
のカラム上に50μlの滅菌蒸留水を加えて1200rpmで1分
間遠心分離し、カラム内に保持されていたプラスミドを
回収した。
【００５２】次に、回収したプラスミドを使用してサイ
クルシークエンスを行い、PCR産物の塩基配列を決定し
た。つまり、ＤＮＡシークエンスキット（PERKIN ELMER
社製）のリアクションミクスチャー溶液 4μl、3.2μM
のT7プライマー若しくはM13プライマー0.5μl及び回収
したプラスミドＤＮＡ300ngを混合し、滅菌蒸留水で全
量10μlに希釈して、サーマルサイクラー中において96
℃で5分間反応させた後、96℃で10秒、50℃で5秒、60℃
で4分を1サイクルとして25サイクル反応させた。さら
に、60℃で7分間反応させ、4℃に冷却して反応を終了し
た。1.5mlチューブにPCR反応液10μlを移し、3M 酢酸ナ
トリウム1μl、氷冷100%エタノール25μlを加え、氷上
で10分間静置した。この氷冷した溶液を15000rpmで15分
間遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。この沈殿
物に250μlの氷冷した70%エタノールを加え、1500rpmで
再び遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。この沈
殿物を遠心エバポレータで乾燥させ、ホルムアミドとロ
ーディングバッファーを５：１の割合で混合した溶液の
4μlで溶解し、この溶液を90℃で2分間加熱し、急冷し
てシークエインス用サンプルとした。このシークエンス
用サンプルをABI377DNAシーケンサー（PERKIN ELMER社
製）を使用し、6%変性アクリルアミドゲルにより分析
し、プラスミド中に導入された目的のＤＮＡ配列と長さ
を決定し、配列番号１で示されるＤＮＡを得た。配列番
号１で示されるＤＮＡは、反復配列として、５反復の(C
A)配列、５反復の(CA)配列等を含む、長さ315bpのマイ
クロサテライトＤＮＡであった。
クルシークエンスを行い、PCR産物の塩基配列を決定し
た。つまり、ＤＮＡシークエンスキット（PERKIN ELMER
社製）のリアクションミクスチャー溶液 4μl、3.2μM
のT7プライマー若しくはM13プライマー0.5μl及び回収
したプラスミドＤＮＡ300ngを混合し、滅菌蒸留水で全
量10μlに希釈して、サーマルサイクラー中において96
℃で5分間反応させた後、96℃で10秒、50℃で5秒、60℃
で4分を1サイクルとして25サイクル反応させた。さら
に、60℃で7分間反応させ、4℃に冷却して反応を終了し
た。1.5mlチューブにPCR反応液10μlを移し、3M 酢酸ナ
トリウム1μl、氷冷100%エタノール25μlを加え、氷上
で10分間静置した。この氷冷した溶液を15000rpmで15分
間遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。この沈殿
物に250μlの氷冷した70%エタノールを加え、1500rpmで
再び遠心分離し、上清を除去して沈殿物を得た。この沈
殿物を遠心エバポレータで乾燥させ、ホルムアミドとロ
ーディングバッファーを５：１の割合で混合した溶液の
4μlで溶解し、この溶液を90℃で2分間加熱し、急冷し
てシークエインス用サンプルとした。このシークエンス
用サンプルをABI377DNAシーケンサー（PERKIN ELMER社
製）を使用し、6%変性アクリルアミドゲルにより分析
し、プラスミド中に導入された目的のＤＮＡ配列と長さ
を決定し、配列番号１で示されるＤＮＡを得た。配列番
号１で示されるＤＮＡは、反復配列として、５反復の(C
A)配列、５反復の(CA)配列等を含む、長さ315bpのマイ
クロサテライトＤＮＡであった。
【００５３】〔実施例３〕マイクロサテライトＤＮＡの
取得（その２） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-TTTGCCCGGA
-3’（配列番号１７）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号２で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号２で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、４反復の(CT)配列等を含む、長さ343bpのマイク
ロサテライトＤＮＡであった。
取得（その２） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-TTTGCCCGGA
-3’（配列番号１７）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号２で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号２で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、４反復の(CT)配列等を含む、長さ343bpのマイク
ロサテライトＤＮＡであった。
【００５４】〔実施例４〕マイクロサテライトＤＮＡの
取得（その３） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-GTTGCGATCC
-3’（配列番号１８）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号３で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号３で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、5.5反復の(AG)配列、4.5反復の(AG)配列等を含
む、長さ450bpのマイクロサテライトＤＮＡであった。
取得（その３） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-GTTGCGATCC
-3’（配列番号１８）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号３で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号３で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、5.5反復の(AG)配列、4.5反復の(AG)配列等を含
む、長さ450bpのマイクロサテライトＤＮＡであった。
【００５５】〔実施例５〕マイクロサテライトＤＮＡの
取得（その４） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-AGCCAGCGAA
-3’（配列番号１９）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号４で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号４で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、１７反復の(TC)配列等を含む、長さ711bpのマイ
クロサテライトＤＮＡであった。
取得（その４） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-AGCCAGCGAA
-3’（配列番号１９）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号４で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号４で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、１７反復の(TC)配列等を含む、長さ711bpのマイ
クロサテライトＤＮＡであった。
【００５６】〔実施例６〕マイクロサテライトＤＮＡの
取得（その５） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-AATCGGGCTG
-3’（配列番号２０）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号５で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号５で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、４反復の(TC)配列、５反復の(TC)配列等を含む、
長さ246bpのマイクロサテライトＤＮＡであった。
取得（その５） 実施例１にて得られたナシ品種「豊水」を原料とするカ
ラム精製ゲノムＤＮＡ溶液を鋳型とし、5’-AATCGGGCTG
-3’（配列番号２０）で示されるプライマーを用いて、
実施例２と同様の方法により配列番号５で示されるＤＮ
Ａを得た。配列番号５で示されるＤＮＡは、反復配列と
して、４反復の(TC)配列、５反復の(TC)配列等を含む、
長さ246bpのマイクロサテライトＤＮＡであった。
【００５７】〔実施例７〕マイクロサテライトＤＮＡ配
列１を利用したナシ類植物の識別 配列番号１で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-TCATTGTAGCATTTTTATTTTT-3'（配列番号６）と
5'-ATGGCAAGGGAGATTATTAG-3'（配列番号７）（5'末に蛍
光色素Tetでラベル）の組合せをプライマーとして用い
るＰＣＲ法により、ニホンナシ品種「豊水」（品種番号
１）、「新星」（品種番号２）、「幸水」（品種番号
３）、「長寿」（品種番号４）、「長十郎」（品種番号
５）、「晩三吉」（品種番号６）、「南勢チャボ」（品
種番号７）、「二十世紀」（品種番号８）、「新高」
（品種番号９）、「愛宕」（品種番号１０）、「あきづ
き」（品種番号１１）、「筑水」（品種番号１２）、
「八里」（品種番号１３）、「豊月」（品種番号１
４）、「秀玉」（品種番号１５）、「新水」（品種番号
１６）、「巾着」（品種番号１７）、チュウゴクナシ品
種「鴨梨」（品種番号１８）、「莱陽慈梨」（品種番号
１９）、「蜜梨」（品種番号２０）、「紅梨」（品種番
号２１）、チュウゴクコナシ品種「北京白梨」（品種番
号２２）、「八里香」（品種番号２３）、セイヨウナシ
品種「ラ・フランス」（品種番号２４）、「バートレッ
ト」（品種番号２５）、「ルレクチェ」（品種番号２
６）、「シルバーベル」（品種番号２７）、ニホンナシ
とセイヨウナシの雑種「２８２−１２」（品種番号２
８）、「２９０−３６」（品種番号２９）、イワテヤマ
ナシ品種「イワテヤマナシ」（品種番号３０）、マンシ
ュウマメナシ品種「ベチュレフォリア」（品種番号３
１）、マメナシ品種「マメナシ６」（品種番号３２）、
「マメナシ１４」（品種番号３３）の識別を行った。
列１を利用したナシ類植物の識別 配列番号１で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-TCATTGTAGCATTTTTATTTTT-3'（配列番号６）と
5'-ATGGCAAGGGAGATTATTAG-3'（配列番号７）（5'末に蛍
光色素Tetでラベル）の組合せをプライマーとして用い
るＰＣＲ法により、ニホンナシ品種「豊水」（品種番号
１）、「新星」（品種番号２）、「幸水」（品種番号
３）、「長寿」（品種番号４）、「長十郎」（品種番号
５）、「晩三吉」（品種番号６）、「南勢チャボ」（品
種番号７）、「二十世紀」（品種番号８）、「新高」
（品種番号９）、「愛宕」（品種番号１０）、「あきづ
き」（品種番号１１）、「筑水」（品種番号１２）、
「八里」（品種番号１３）、「豊月」（品種番号１
４）、「秀玉」（品種番号１５）、「新水」（品種番号
１６）、「巾着」（品種番号１７）、チュウゴクナシ品
種「鴨梨」（品種番号１８）、「莱陽慈梨」（品種番号
１９）、「蜜梨」（品種番号２０）、「紅梨」（品種番
号２１）、チュウゴクコナシ品種「北京白梨」（品種番
号２２）、「八里香」（品種番号２３）、セイヨウナシ
品種「ラ・フランス」（品種番号２４）、「バートレッ
ト」（品種番号２５）、「ルレクチェ」（品種番号２
６）、「シルバーベル」（品種番号２７）、ニホンナシ
とセイヨウナシの雑種「２８２−１２」（品種番号２
８）、「２９０−３６」（品種番号２９）、イワテヤマ
ナシ品種「イワテヤマナシ」（品種番号３０）、マンシ
ュウマメナシ品種「ベチュレフォリア」（品種番号３
１）、マメナシ品種「マメナシ６」（品種番号３２）、
「マメナシ１４」（品種番号３３）の識別を行った。
【００５８】ＰＣＲ反応は、上記品種のゲノムＤＮＡを
約10ng、前記プライマー２種類を各10pmol、Taqポリメ
ラーゼ0.5ユニット、４種類の塩基（dATP, dTTP, dCTP,
dGTP）を終濃度で0.2mM加えた、1.5mMの塩化マグネシ
ウムを含有する増幅用緩衝液（組成：20mMのTris-HCl
（pH8.4）、50mMの塩化カリウム）20μl中で、３５回Ｄ
ＮＡ複製サイクルを繰り返して行った。変性工程は９４
℃で１分間、プライマーのアニーリング工程は５５℃で
２分間、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は７２℃で
２分間行った。該ＰＣＲ増幅産物をＴＥバッファーで１
〜２０倍に希釈した後3μlをとり、1.875μlのホルムア
ミド、0.375μlの色素液、0.75μlのTAMRA350（蛍光色
素TAMRAで標識したＤＮＡサイズスタンダード）と混和
し、ＤＮＡシークエンサー分析用の試料とした。
約10ng、前記プライマー２種類を各10pmol、Taqポリメ
ラーゼ0.5ユニット、４種類の塩基（dATP, dTTP, dCTP,
dGTP）を終濃度で0.2mM加えた、1.5mMの塩化マグネシ
ウムを含有する増幅用緩衝液（組成：20mMのTris-HCl
（pH8.4）、50mMの塩化カリウム）20μl中で、３５回Ｄ
ＮＡ複製サイクルを繰り返して行った。変性工程は９４
℃で１分間、プライマーのアニーリング工程は５５℃で
２分間、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は７２℃で
２分間行った。該ＰＣＲ増幅産物をＴＥバッファーで１
〜２０倍に希釈した後3μlをとり、1.875μlのホルムア
ミド、0.375μlの色素液、0.75μlのTAMRA350（蛍光色
素TAMRAで標識したＤＮＡサイズスタンダード）と混和
し、ＤＮＡシークエンサー分析用の試料とした。
【００５９】ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ−ＡＢＩ社
製、ABI PRISM 377）を用いて、該ＰＣＲ増幅産物の分
離と検出を行った。４％変性ポリアクリルアミドゲルを
用い、3000V、60mA、200Wの条件で、約３時間電気泳動
を行った。ジーンスキャンソフトウェアを用いて、サイ
ズスタンダードを基に検出されたバンドの長さと有無を
確認した。以下の表１に、供試したナシ３３品種のバン
ドサイズ及びタイプを記した。その結果、３３品種を、
以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉの９
タイプに識別することができた。
製、ABI PRISM 377）を用いて、該ＰＣＲ増幅産物の分
離と検出を行った。４％変性ポリアクリルアミドゲルを
用い、3000V、60mA、200Wの条件で、約３時間電気泳動
を行った。ジーンスキャンソフトウェアを用いて、サイ
ズスタンダードを基に検出されたバンドの長さと有無を
確認した。以下の表１に、供試したナシ３３品種のバン
ドサイズ及びタイプを記した。その結果、３３品種を、
以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉの９
タイプに識別することができた。
【００６０】
【表１】
【００６１】〔実施例８〕マイクロサテライトＤＮＡ配
列２を利用したナシ類植物の識別 配列番号２で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-GATTTTGTCCGCAGGT-3'（配列番号８）と5'-AAA
GAACAGCAAGAACCA-3'（配列番号９）（5'末に蛍光色素Fa
mでラベル）の組合せをプライマーとして用いるＰＣＲ
法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物の識別を
行った。以下の表２に、供試したナシ３３品種のバンド
サイズ、及びタイプを記した。その結果、３３品種を、
以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの４タイプに識別すること
ができた。
列２を利用したナシ類植物の識別 配列番号２で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-GATTTTGTCCGCAGGT-3'（配列番号８）と5'-AAA
GAACAGCAAGAACCA-3'（配列番号９）（5'末に蛍光色素Fa
mでラベル）の組合せをプライマーとして用いるＰＣＲ
法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物の識別を
行った。以下の表２に、供試したナシ３３品種のバンド
サイズ、及びタイプを記した。その結果、３３品種を、
以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄの４タイプに識別すること
ができた。
【００６２】
【表２】
【００６３】〔実施例９〕マイクロサテライトＤＮＡ配
列３を利用したナシ類植物の識別 配列番号３で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-TTGGAGAATAACTGATAAG-3'（配列番号１０）
（5'末に蛍光色素Hexでラベル）と5'-TAAATAAAGGCACAAT
GGA-3'（配列番号１１）の組合せをプライマーとして用
いるＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植
物の識別を行った。以下の表３に、供試したナシ３３品
種のバンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３
３品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、Ｆ，Ｇ，
Ｈ，Ｉの９タイプに識別することができた。
列３を利用したナシ類植物の識別 配列番号３で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-TTGGAGAATAACTGATAAG-3'（配列番号１０）
（5'末に蛍光色素Hexでラベル）と5'-TAAATAAAGGCACAAT
GGA-3'（配列番号１１）の組合せをプライマーとして用
いるＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植
物の識別を行った。以下の表３に、供試したナシ３３品
種のバンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３
３品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ、Ｆ，Ｇ，
Ｈ，Ｉの９タイプに識別することができた。
【００６４】
【表３】
【００６５】〔実施例１０〕マイクロサテライトＤＮＡ
配列４を利用したナシ類植物の識別 配列番号４で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-GCCAGCGAACTCAAATCT-3'（配列番号１２）と5'
-AACGAGAACGACGAGCG-3'（配列番号１３）（5'末に蛍光
色素Hexでラベル）の組合せをプライマーとして用いる
ＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物の
識別を行った。以下の表４に、供試したナシ３３品種の
バンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３３品
種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，
Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，
Ｕ，Ｖの２２タイプに識別することができた。
配列４を利用したナシ類植物の識別 配列番号４で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-GCCAGCGAACTCAAATCT-3'（配列番号１２）と5'
-AACGAGAACGACGAGCG-3'（配列番号１３）（5'末に蛍光
色素Hexでラベル）の組合せをプライマーとして用いる
ＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物の
識別を行った。以下の表４に、供試したナシ３３品種の
バンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３３品
種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，
Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，
Ｕ，Ｖの２２タイプに識別することができた。
【００６６】
【表４】
【００６７】〔実施例１１〕マイクロサテライトＤＮＡ
配列５を利用したナシ類植物の識別 配列番号５で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-CGGGCTGAGTGAACGAG-3'（配列番号１４）と5'-
TTTACCGTTGTCTTTTCTTTG-3'（配列番号１５）（5'末に蛍
光色素Famでラベル）の組合せをプライマーとして用い
るＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物
の識別を行った。以下の表５に、供試したナシ３３品種
のバンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３３
品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌの１２タイプに識別することができ
た。
配列５を利用したナシ類植物の識別 配列番号５で示される塩基配列からなるマイクロサテラ
イトＤＮＡを含むＤＮＡを増幅するようなオリゴヌクレ
オチド5'-CGGGCTGAGTGAACGAG-3'（配列番号１４）と5'-
TTTACCGTTGTCTTTTCTTTG-3'（配列番号１５）（5'末に蛍
光色素Famでラベル）の組合せをプライマーとして用い
るＰＣＲ法により、実施例７と同様の方法でナシ類植物
の識別を行った。以下の表５に、供試したナシ３３品種
のバンドサイズ、及びタイプを記した。その結果、３３
品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，
Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌの１２タイプに識別することができ
た。
【００６８】
【表５】
【００６９】〔実施例１２〕マイクロサテライトＤＮＡ
配列１，２，３，４及び５を利用したナシ類植物の識別 実施例７，８，９，１０及び１１のナシ類植物の識別結
果を、以下の表６にまとめた。その結果、供試したナシ
３３品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，
Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，
Ｓ，Ｔ，Ｕ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚ，ＡＡ，ＡＢ，ＡＣの
２９タイプに識別することができた。
配列１，２，３，４及び５を利用したナシ類植物の識別 実施例７，８，９，１０及び１１のナシ類植物の識別結
果を、以下の表６にまとめた。その結果、供試したナシ
３３品種を、以下のようにＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，
Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，
Ｓ，Ｔ，Ｕ，Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚ，ＡＡ，ＡＢ，ＡＣの
２９タイプに識別することができた。
【００７０】
【表６】
【００７１】
【発明の効果】本発明により、マイクロサテライトＤＮ
Ａを用いるナシ類植物の識別が可能になった。
Ａを用いるナシ類植物の識別が可能になった。
【００７２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Fruit Tree Science, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries <120> Novel Microsatellite DNAs from PYRUS Plants and Methods for Discerning PYRUS Plants Using thereof <130> P00-0396 <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 315 <212> DNA <213> Pyrus pyrifolia <400> 1 tatcattttt attaatttga aagctgaaaa gtctttcaag tcattgtagc atttttattt 60 ttaatttgtg tgtgtatcta tatatactca cacacacaga cacgcacaca cacaattgaa 120 tatacctagc aaagctactt gctcattatt ccatctgcaa tttgtgcaac atggactttc 180 ttcttctgca acttttgttc ctaataatct cccttgccat gcccttgtgc ttttctctga 240 aactccaaat caacttatcc accacatatc agacttattc agtgaaacac caaatagtta 300 ggctggccaa cgaac 315 <210> 2 <211> 343 <212> DNA <213> Pyrus pyrifolia <400> 2 gctctgttgg tatggcaaat attcgaaaaa tcataggatt ttgtccgcag gtgctctctc 60 tttctctctc ggtctgtctc ataagtacat atgtttatat ggtcatgttg tcttggtcac 120 cgttgatcaa gagcttttgt ggtctactat cagtaaatca aaaggcgaaa ttggttcttg 180 ctgttctttt tcaagaagat catgtgtgtg gtaacctgaa attttcaaaa acatacaagt 240 tacattgttt ttaccgcgtt gcagcaactc attcgaaaac ttcgagttaa ttttgtatgt 300 aaattgtctc tattgatagt ttgatattct ttggaatgcg ttg 343 <210> 3 <211> 450 <212> DNA <213> Pyrus pyrifolia <400> 3 gatgataatt taatagatac atttagatga ctaaacaata gccgaattga acaattattt 60 gtagtggtga tatttacggt aacgatatgt tataaacaaa ttggagaata actgataagc 120 tcatctccaa gagagaatgc aagcattaac agtaatgtgt gtttcaaaaa attaaaaaaa 180 acaattatag tgttgtaggc ataattcact gaataattat aaggccatag agagagagaa 240 atgtgtggca atagtagaga gaaagagaga gatgtgtaat tgtgggtgtg tgttattcca 300 ctccattgtg cctttattta taatagtagg gaaggttaat tccttactca ttaggattac 360 aacatttaat aggtaatcta ctcctaatag gaatataaga tacattccca tatctactag 420 gatttacata atcacattcc tattccaata 450 <210> 4 <211> 711 <212> DNA <213> Pyrus pyrifolia <400> 4 gccagcgaac tcaaatctct catcactctt tctctctctc tctctctctc tctctctctc 60 tctcatcaaa tttcaagttt caaattttca aatctctgat cgatatcaac ggagtttcag 120 cgctcgtcgt tctcgttccg atcttctgac tactgggtcc atgtgacgct gcagggtttc 180 ccatctccag cggactttaa gtcccaattt gtcggcgagc tttctctccg tcaacaccag 240 atttttcaga aacgcttcca cgcccttatt ctcgatgaat ttccactggg tcctgatcgc 300 tacgctacgc tccgtttcgc tccccgccaa ctcctactcc ccgagttgcg cgctaactta 360 cgatctctct cctcttcctt caacctcgat cctgccatct acgaagcact agccccccag 420 atcaaatcca tggcacggtt aaaatcctga ccattgaata tgtcgaccaa ccgtttgatg 480 atttgtccga ctcaatggct ttgcttgcga atggtagtag cgattgtggt tcaacttcgt 540 cgtcaatttc tttggacttt gtggttgaga aattgggggc agagaaattt ttcggaaggg 600 gagacgacga cttgggttct tgcagtgtat gtttggagga attgtctagt gggactgcga 660 gtgagctcat tcggatgccg tgctctcatg tctatcaccc accttgcatc c 711 <210> 5 <211> 246 <212> DNA <213> Pyrus pyrifolia <400> 5 cgggctgagt gaacgaggcc atgatcgagt caaatgtacg gacatgcaag aaaggtctct 60 ctcactgtct ctcgctgtct ctctctcatg caagaaatgc tcgcagaggc aaaaactacg 120 caggagaaat atccacgggc tttgagttgg gctgaggccg gccaatacaa tgttgccaaa 180 gaaacaaccg aagatgtctc tttcgaacgt acataatcaa tttaccgttg tcttttcttt 240 gacctc 246 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 6 tcattgtagc atttttattt tt 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 7 atggcaaggg agattattag 20 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 gattttgtcc gcaggt 16 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 aaagaacagc aagaacca 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 ttggagaata actgataag 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 11 taaataaagg cacaatgga 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 12 gccagcgaac tcaaatct 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 13 aacgagaacg acgagcg 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 14 cgggctgagt gaacgag 17 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 15 tttaccgttg tcttttcttt g 21 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 16 tctgtgctgg 10 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 17 tttgcccgga 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 18 gttgcgatcc 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 19 agccagcgaa 10 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 20 aatcgggctg 10 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 21 agagagagag agagagagag agagagagag 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 22 atatatatat atatatatat atatatatat 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Probe <400> 23 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 30
【００７３】
【配列表フリーテキスト】配列番号６〜２０：プライマ
ー 配列番号２１〜２３：プローブ
ー 配列番号２１〜２３：プローブ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 今井 剛 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 松田 長生 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 斎藤 寿広 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 正田 守幸 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 壽 和夫 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 林 健樹 茨城県つくば市藤本２−１ 農林水産省 果樹試験場内 (72)発明者 伴 義之 茨城県つくば市竹園３丁目505−102 (72)発明者 小曽納 雅則 茨城県つくば市吾妻２丁目702−102 (72)発明者 木村 鉄也 茨城県つくば市吾妻２丁目711−1201 Ｆターム(参考） 2B030 AA03 AB03 AD08 CA05 CB03 4B024 AA07 AA11 CA03 CA09 DA06 EA04 GA11 GA19 HA14 4B063 QA01 QA12 QA13 QA18 QQ04 QQ42 QQ57 QR08 QR32 QR40 QR41 QR42 QR58 QR62 QS05 QS10 QS16 QS25 QS39 QX02
Claims (25)
- 【請求項１】 ナシ類植物を識別する方法であって、配
列番号１で示される塩基配列を含むマイクロサテライト
ＤＮＡ、又は配列番号１において１以上の塩基が置換、
欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で示さ
れる塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲ
ノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とす
る前記方法。 - 【請求項２】 配列番号１で示される塩基配列を含むマ
イクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号１において
１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、か
つ、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも８０％
の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテライトＤ
ＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤＮＡを
増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を
行うことを含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６
で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列
番号７で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ナシ類植物を識別する方法であって、配
列番号２で示される塩基配列を含むマイクロサテライト
ＤＮＡ、又は配列番号２において１以上の塩基が置換、
欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号２で示さ
れる塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲ
ノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とす
る前記方法。 - 【請求項５】 配列番号２で示される塩基配列を含むマ
イクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号２において
１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、か
つ、配列番号２で示される塩基配列と少なくとも８０％
の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテライトＤ
ＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤＮＡを
増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を
行うことを含む請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８
で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列
番号９で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ナシ類植物を識別する方法であって、配
列番号３で示される塩基配列を含むマイクロサテライト
ＤＮＡ、又は配列番号３において１以上の塩基が置換、
欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で示さ
れる塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物のゲ
ノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴とす
る前記方法。 - 【請求項８】 配列番号３で示される塩基配列を含むマ
イクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号３において
１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、か
つ、配列番号３で示される塩基配列と少なくとも８０％
の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテライトＤ
ＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤＮＡを
増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を
行うことを含む請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１
０で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配
列番号１１で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドである請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 ナシ類植物を識別する方法であって、
配列番号４で示される塩基配列を含むマイクロサテライ
トＤＮＡ、又は配列番号４において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物
のゲノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴
とする前記方法。 - 【請求項１１】 配列番号４で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号４におい
て１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、
かつ、配列番号４で示される塩基配列と少なくとも８０
％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテライト
ＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤＮＡ
を増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を
行うことを含む請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号
１２で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号１３で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 ナシ類植物を識別する方法であって、
配列番号５で示される塩基配列を含むマイクロサテライ
トＤＮＡ、又は配列番号５において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むマイクロサテライトＤＮＡがナシ類植物
のゲノムＤＮＡ中に存在するか否かを調べることを特徴
とする前記方法。 - 【請求項１４】 配列番号５で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ、若しくは配列番号５におい
て１以上の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加され、
かつ、配列番号５で示される塩基配列と少なくとも８０
％の相同性を有する塩基配列を含むマイクロサテライト
ＤＮＡ、若しくはその一部、又は該ＤＮＡを含むＤＮＡ
を増幅し得るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、ナシ類植物のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を
行うことを含む請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号
１４で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び
配列番号１５で示される塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドである請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 配列番号１で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ。 - 【請求項１７】 配列番号１において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号１で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項１８】 配列番号２で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ。 - 【請求項１９】 配列番号２において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号２で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２０】 配列番号３で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ。 - 【請求項２１】 配列番号３において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号３で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２２】 配列番号４で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ。 - 【請求項２３】 配列番号４において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号４で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むＤＮＡ。 - 【請求項２４】 配列番号５で示される塩基配列を含む
マイクロサテライトＤＮＡ。 - 【請求項２５】 配列番号５において１以上の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加され、かつ、配列番号５で
示される塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むＤＮＡ。
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|---|---|---|---|
| JP2000220339A JP2002034597A (ja) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | ナシ類植物由来の新規マイクロサテライトｄｎａ及びそれを用いるナシ類植物の識別方法 |
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|---|---|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004106554A2 (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | Astrazeneca Ab | Primase dna templates |
| CN113388694A (zh) * | 2021-07-13 | 2021-09-14 | 延边大学 | 一种桃叶卫矛的rapd反应体系与试剂盒 |
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2000
- 2000-07-21 JP JP2000220339A patent/JP2002034597A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004106554A2 (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-09 | Astrazeneca Ab | Primase dna templates |
| WO2004106554A3 (en) * | 2003-05-23 | 2005-03-03 | Astrazeneca Ab | Primase dna templates |
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