JP2002018265A - 蛋白質の吸着防止剤 - Google Patents
蛋白質の吸着防止剤Info
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- JP2002018265A JP2002018265A JP2000205581A JP2000205581A JP2002018265A JP 2002018265 A JP2002018265 A JP 2002018265A JP 2000205581 A JP2000205581 A JP 2000205581A JP 2000205581 A JP2000205581 A JP 2000205581A JP 2002018265 A JP2002018265 A JP 2002018265A
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- protein
- reducing agent
- adsorption
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- Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】コーティング操作等の複雑な操作が不要でしか
もコーティング剤が容器から剥がれて蛋白質溶液中に混
入する恐れや目的とする蛋白質の精製度（純度）の低下
を招く恐れがなく、そして蛋白質の修飾等の変性を生じ
ることのない吸着防止剤を提供すること。 【解決手段】還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成る蛋白質の吸着防止剤。
もコーティング剤が容器から剥がれて蛋白質溶液中に混
入する恐れや目的とする蛋白質の精製度（純度）の低下
を招く恐れがなく、そして蛋白質の修飾等の変性を生じ
ることのない吸着防止剤を提供すること。 【解決手段】還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成る蛋白質の吸着防止剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、蛋白質の吸着防
止剤に関するものであり、詳しくは、還元剤及びポリオ
キシエチレン系の非イオン性界面活性剤より成る、蛋白
質の容器への吸着を防止するための吸着防止剤に関する
ものである。
止剤に関するものであり、詳しくは、還元剤及びポリオ
キシエチレン系の非イオン性界面活性剤より成る、蛋白
質の容器への吸着を防止するための吸着防止剤に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質を精製する場合には、精製に用い
る容器への該蛋白質の吸着がしばしば大きな問題とな
る。特に蛋白質濃度が低い溶液（例えば０．１ｍｇ／ｍ
ｌ以下の溶液）では、溶液中の大部分の蛋白質が容器に
吸着してしまうということもある。このような容器への
吸着は、疎水性の高い蛋白質においてより顕著である。
る容器への該蛋白質の吸着がしばしば大きな問題とな
る。特に蛋白質濃度が低い溶液（例えば０．１ｍｇ／ｍ
ｌ以下の溶液）では、溶液中の大部分の蛋白質が容器に
吸着してしまうということもある。このような容器への
吸着は、疎水性の高い蛋白質においてより顕著である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記のような蛋白質の
吸着を防ぐ方法として、容器をシリコン等であらかじめ
コーティングする方法が知られている。しかしながらこ
の方法では、コーティング操作が煩雑であることや、最
悪の場合、コーティングしたシリコンが容器から剥が
れ、溶液中に混入してしまうという課題がある。
吸着を防ぐ方法として、容器をシリコン等であらかじめ
コーティングする方法が知られている。しかしながらこ
の方法では、コーティング操作が煩雑であることや、最
悪の場合、コーティングしたシリコンが容器から剥が
れ、溶液中に混入してしまうという課題がある。
【０００４】蛋白質の容器への吸着を防ぐ別の方法とし
て、性状が明らかな別の蛋白質、糖質又は脂質を溶液中
に添加する方法も知られている。この方法で通常使用さ
れる蛋白質はアルブミンであり、糖質はブドウ糖、ガラ
クトース、フルクトース、サッカロース、ラクトース、
マルトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトー
ル等であり、脂質では各種脂肪酸エステル（脂肪酸エス
テルを構成する脂肪酸としては炭素数６〜１８の飽和脂
肪酸や炭素数６〜２２のモノエン酸、アルコールとして
は炭素数１〜４の１価アルコールや炭素数２あるいは３
の多価アルコール）である（例えば特願平１０−１２８
４０７号、特願平９−８０９１４号等を参照）。しかし
ながらこの方法には、精製しようとする蛋白質と同等モ
ル数以上の蛋白質、糖質又は脂質を添加する必要があ
り、その結果、目的とする蛋白質の精製度（純度）が低
下してしまうという課題がある。
て、性状が明らかな別の蛋白質、糖質又は脂質を溶液中
に添加する方法も知られている。この方法で通常使用さ
れる蛋白質はアルブミンであり、糖質はブドウ糖、ガラ
クトース、フルクトース、サッカロース、ラクトース、
マルトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトー
ル等であり、脂質では各種脂肪酸エステル（脂肪酸エス
テルを構成する脂肪酸としては炭素数６〜１８の飽和脂
肪酸や炭素数６〜２２のモノエン酸、アルコールとして
は炭素数１〜４の１価アルコールや炭素数２あるいは３
の多価アルコール）である（例えば特願平１０−１２８
４０７号、特願平９−８０９１４号等を参照）。しかし
ながらこの方法には、精製しようとする蛋白質と同等モ
ル数以上の蛋白質、糖質又は脂質を添加する必要があ
り、その結果、目的とする蛋白質の精製度（純度）が低
下してしまうという課題がある。
【０００５】蛋白質の容器への吸着を防ぐ別の方法とし
て、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を添
加することも知られている。しかしながら、後述する実
施例に示したように、本願発明者の知見によれば、ポリ
オキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を添加すると
蛋白質が修飾され、変性してしまうという課題がある。
て、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を添
加することも知られている。しかしながら、後述する実
施例に示したように、本願発明者の知見によれば、ポリ
オキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を添加すると
蛋白質が修飾され、変性してしまうという課題がある。
【０００６】本願発明は上記従来技術の課題に鑑み、コ
ーティング操作等の複雑な操作が不要でしかもコーティ
ング剤が容器から剥がれて蛋白質溶液中に混入する恐れ
や目的とする蛋白質の精製度（純度）の低下を招く恐れ
がなく、そして蛋白質の修飾等の変性を生じることのな
い吸着防止剤を提供することを目的とする。
ーティング操作等の複雑な操作が不要でしかもコーティ
ング剤が容器から剥がれて蛋白質溶液中に混入する恐れ
や目的とする蛋白質の精製度（純度）の低下を招く恐れ
がなく、そして蛋白質の修飾等の変性を生じることのな
い吸着防止剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に成された本願請求項１の発明は、還元剤及びポリオキ
シエチレン系の非イオン性界面活性剤より成る蛋白質の
吸着防止剤である。そして本願請求項２の発明は前記請
求項１の発明に係り、前記還元剤が２−メルカプトエタ
ノールであることを特徴とする。
に成された本願請求項１の発明は、還元剤及びポリオキ
シエチレン系の非イオン性界面活性剤より成る蛋白質の
吸着防止剤である。そして本願請求項２の発明は前記請
求項１の発明に係り、前記還元剤が２−メルカプトエタ
ノールであることを特徴とする。
【０００８】本願請求項３の発明は、特にＩＬ−６レセ
プターとＩＬ−６との融合蛋白質の吸着防止剤に関する
ものであり、還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成る吸着防止剤である。そして本願
請求項４の発明は前記請求項３の発明に係り、前記還元
剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
プターとＩＬ−６との融合蛋白質の吸着防止剤に関する
ものであり、還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成る吸着防止剤である。そして本願
請求項４の発明は前記請求項３の発明に係り、前記還元
剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本願発明で使用されるポリオキシエチレン
系の非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレ
ンソルビタンアシルエステル（Ｔｗｅｅｎ）系のもの、
ポリオキシエチレンアルコールエーテル（Ｂｒｉｊ）系
のもの、そしてポリオキシエチレンアシルエステル（Ｍ
ｙｒｊ）系のものを例示できる。その種類や濃度は、吸
着を防止しようとする目的蛋白質や界面活性剤の種類に
より異なるが、後の実施例に示す方法を参照しつつ、決
定すれば良い。参考までに述べれば、界面活性剤として
Ｔｗｅｅｎ２０であれば０．０１％から０．２％の範囲
で使用することを例示できる。
系の非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレ
ンソルビタンアシルエステル（Ｔｗｅｅｎ）系のもの、
ポリオキシエチレンアルコールエーテル（Ｂｒｉｊ）系
のもの、そしてポリオキシエチレンアシルエステル（Ｍ
ｙｒｊ）系のものを例示できる。その種類や濃度は、吸
着を防止しようとする目的蛋白質や界面活性剤の種類に
より異なるが、後の実施例に示す方法を参照しつつ、決
定すれば良い。参考までに述べれば、界面活性剤として
Ｔｗｅｅｎ２０であれば０．０１％から０．２％の範囲
で使用することを例示できる。
【００１０】ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活
性剤のみを用いて蛋白質の容器への吸着を防止しようと
すると、後の実施例に示したように、蛋白質が酸化され
ることが明らかとなった。そこで本願発明の吸着防止剤
では、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤に
よる蛋白質の酸化を防止するための還元剤を必須の成分
とする。還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトール、システイン塩酸塩等を例示
できる。還元剤の至適濃度範囲は還元剤の種類や吸着を
防止しようとする蛋白質の種類により異なる。還元剤と
して２−メルカプトエタノールを使用する場合、一般的
には０．１ｍＭから２ｍＭの範囲で使用することが例示
できるが、後述の方法により使用する還元剤の効果を目
的蛋白質との関係で実験的に調べ、至適濃度を把握して
使用すると良い。なお還元剤の濃度が至適濃度より低い
場合は酸化を防止できないために蛋白質の吸着を防止で
きてもその変性が生じる可能性を否定できず、また逆に
至適濃度よりも高いと蛋白質が還元されてしまうという
問題を生じることがある。
性剤のみを用いて蛋白質の容器への吸着を防止しようと
すると、後の実施例に示したように、蛋白質が酸化され
ることが明らかとなった。そこで本願発明の吸着防止剤
では、ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤に
よる蛋白質の酸化を防止するための還元剤を必須の成分
とする。還元剤としては、例えば２−メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトール、システイン塩酸塩等を例示
できる。還元剤の至適濃度範囲は還元剤の種類や吸着を
防止しようとする蛋白質の種類により異なる。還元剤と
して２−メルカプトエタノールを使用する場合、一般的
には０．１ｍＭから２ｍＭの範囲で使用することが例示
できるが、後述の方法により使用する還元剤の効果を目
的蛋白質との関係で実験的に調べ、至適濃度を把握して
使用すると良い。なお還元剤の濃度が至適濃度より低い
場合は酸化を防止できないために蛋白質の吸着を防止で
きてもその変性が生じる可能性を否定できず、また逆に
至適濃度よりも高いと蛋白質が還元されてしまうという
問題を生じることがある。
【００１１】ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活
性剤による酸化を防止するための還元剤の至適濃度は以
下のようにして知ることができる。第１の方法は、蛋白
質を含む溶液を当該蛋白質の等電点より高いｐＨの溶液
で平衡化した陰イオン交換クロマトに供し、緩やかな塩
濃度勾配によって等電点の高い成分から順に溶出させる
方法である。第２の方法は、蛋白質を含む溶液を当該蛋
白質の等電点より低いｐＨの溶液で平衡化した陽イオン
交換クロマトに供し、緩やかな塩濃度勾配によって等電
点の低い成分から順に溶出させる方法である。組換え蛋
白質のようにその等電点が均一でない場合は、前者の方
法では最も高い等電点、後者の方法では最も低い等電点
を基準に平衡化けのための溶液のｐＨを決めれば良い。
前者のより具体的な例としては、等電点の範囲が５．６
から６．７である組換え蛋白質を、ｐＨ７．６の溶液で
平衡化されたＤＥＡＥカラムにかけ、０から５０ｍＭの
ＮａＣｌ濃度勾配で溶出することにより、等電点の高い
成分から順に溶出することが例示できる。
性剤による酸化を防止するための還元剤の至適濃度は以
下のようにして知ることができる。第１の方法は、蛋白
質を含む溶液を当該蛋白質の等電点より高いｐＨの溶液
で平衡化した陰イオン交換クロマトに供し、緩やかな塩
濃度勾配によって等電点の高い成分から順に溶出させる
方法である。第２の方法は、蛋白質を含む溶液を当該蛋
白質の等電点より低いｐＨの溶液で平衡化した陽イオン
交換クロマトに供し、緩やかな塩濃度勾配によって等電
点の低い成分から順に溶出させる方法である。組換え蛋
白質のようにその等電点が均一でない場合は、前者の方
法では最も高い等電点、後者の方法では最も低い等電点
を基準に平衡化けのための溶液のｐＨを決めれば良い。
前者のより具体的な例としては、等電点の範囲が５．６
から６．７である組換え蛋白質を、ｐＨ７．６の溶液で
平衡化されたＤＥＡＥカラムにかけ、０から５０ｍＭの
ＮａＣｌ濃度勾配で溶出することにより、等電点の高い
成分から順に溶出することが例示できる。
【００１２】カラムクロマトによる蛋白質の溶出パター
ンは、蛋白質の純度が高い場合は２８０ｎｍの吸収によ
り、蛋白質の純度が低い場合は例えば蛋白質に対する抗
体を用いたＥＬＩＳＡ等により求めれば良い。蛋白質が
ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤によって
酸化されると等電点が変化するため、陰イオン交換クロ
マトの場合は溶出が遅くなり、陽イオン交換クロマトの
場合は溶出が早くなる等、溶出パターンに差が生じる。
従って、蛋白質溶液にポリオキシエチレン系の非イオン
性界面活性剤及び還元剤を添加した場合の溶出パターン
と、これらを添加していない場合の溶出パターンとの間
に差が生じないように還元剤濃度を決定すれば良いので
ある。
ンは、蛋白質の純度が高い場合は２８０ｎｍの吸収によ
り、蛋白質の純度が低い場合は例えば蛋白質に対する抗
体を用いたＥＬＩＳＡ等により求めれば良い。蛋白質が
ポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤によって
酸化されると等電点が変化するため、陰イオン交換クロ
マトの場合は溶出が遅くなり、陽イオン交換クロマトの
場合は溶出が早くなる等、溶出パターンに差が生じる。
従って、蛋白質溶液にポリオキシエチレン系の非イオン
性界面活性剤及び還元剤を添加した場合の溶出パターン
と、これらを添加していない場合の溶出パターンとの間
に差が生じないように還元剤濃度を決定すれば良いので
ある。
【００１３】本願発明において、還元剤及びポリオキシ
エチレン系の非イオン性界面活性剤を共存させることに
より、容器への蛋白質の吸着を防止することができる。
従って、蛋白質に関する精製操作等に対して影響がない
ならば、精製操作中での蛋白質の容器への吸着を防止す
るためにポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤
及び還元剤を添加しておくことが好ましく、また更に
は、精製後の蛋白質溶液に引き続きこれらを共存させ、
保存容器への蛋白質の吸着を防止することが好ましい。
エチレン系の非イオン性界面活性剤を共存させることに
より、容器への蛋白質の吸着を防止することができる。
従って、蛋白質に関する精製操作等に対して影響がない
ならば、精製操作中での蛋白質の容器への吸着を防止す
るためにポリオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤
及び還元剤を添加しておくことが好ましく、また更に
は、精製後の蛋白質溶液に引き続きこれらを共存させ、
保存容器への蛋白質の吸着を防止することが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下に、発明を更に詳細に説明す
るために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限
定されるものではない。
るために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限
定されるものではない。
【００１５】実施例１ ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合
蛋白質発現ピキア酵母の樹立、培養、精製 メタノール資化性酵母であるピキア・パストリス、メタ
ノール誘導性プロモーターであるアルコールオキシダー
ゼ１のプロモーター（以下ＡＯＸ１と略す）を用いて、
非天然蛋白質であるヒトＩＬ−６ＲとヒトＩＬ−６との
融合蛋白質を発現させた。
蛋白質発現ピキア酵母の樹立、培養、精製 メタノール資化性酵母であるピキア・パストリス、メタ
ノール誘導性プロモーターであるアルコールオキシダー
ゼ１のプロモーター（以下ＡＯＸ１と略す）を用いて、
非天然蛋白質であるヒトＩＬ−６ＲとヒトＩＬ−６との
融合蛋白質を発現させた。
【００１６】本例で用いたＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融
合蛋白質は、Ｎ末端側にヒトＩＬ−６ＲのＮ末端１１２
番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの
部分を有し、このアラニン残基のＣ末端側にヒトＩＬ−
６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸からＣ末端までの
部分がリンカーを介することなく直接結合したものであ
る（該融合蛋白質を以下１１２ＶＡＤと略す；特願平１
１−１８８６５０号参照）。
合蛋白質は、Ｎ末端側にヒトＩＬ−６ＲのＮ末端１１２
番目のバリン残基から３３３番目のアラニン残基までの
部分を有し、このアラニン残基のＣ末端側にヒトＩＬ−
６のＮ末端３８番目のアスパラギン酸からＣ末端までの
部分がリンカーを介することなく直接結合したものであ
る（該融合蛋白質を以下１１２ＶＡＤと略す；特願平１
１−１８８６５０号参照）。
【００１７】クローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（東洋紡（株）製）を制
限酵素ＫｐｎＩで切断し、クレノウフラグメントで処理
した後、ライゲーション反応を行ってＫｐｎＩサイトが
消失したプラスミドｐＢＳを作製した。次に、配列番号
１のプライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌと配列番号２のプライ
マーｐ６ＲＦ３２０Ｓを用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤ
ＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩで切断した。これを、予めＸ
ｈｏＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳに挿入することに
より、プラスミドｐＢＳ６Ｒを得た。
ｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（東洋紡（株）製）を制
限酵素ＫｐｎＩで切断し、クレノウフラグメントで処理
した後、ライゲーション反応を行ってＫｐｎＩサイトが
消失したプラスミドｐＢＳを作製した。次に、配列番号
１のプライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌと配列番号２のプライ
マーｐ６ＲＦ３２０Ｓを用いてＩＬ−６Ｒ遺伝子（ｃＤ
ＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩで切断した。これを、予めＸ
ｈｏＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳに挿入することに
より、プラスミドｐＢＳ６Ｒを得た。
【００１８】次に配列番号３のプライマーｐＩＬ６Ｂ２
と配列番号４のプライマーｐＩＬ６Ｆ２を用いてＩＬ−
６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｂｇｌ ＩＩとＮｏｔ
Ｉで切断した。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで
切断したｐＢＳ６Ｒに挿入することにより、プラスミド
ｐＢＳ６Ｒ６Ｓを得た。プラスミドｐＢＳ６Ｒ６ＳをＢ
ｇｌ ＩＩとＫｐｎＩで切断し、配列番号５及び配列番
号６の２種類のオリゴヌクレオチドをアニールし挿入
し、ｐＢＳ６Ｒ６Ｌを得た。
と配列番号４のプライマーｐＩＬ６Ｆ２を用いてＩＬ−
６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｂｇｌ ＩＩとＮｏｔ
Ｉで切断した。これを、予めＢｇｌ ＩＩとＮｏｔＩで
切断したｐＢＳ６Ｒに挿入することにより、プラスミド
ｐＢＳ６Ｒ６Ｓを得た。プラスミドｐＢＳ６Ｒ６ＳをＢ
ｇｌ ＩＩとＫｐｎＩで切断し、配列番号５及び配列番
号６の２種類のオリゴヌクレオチドをアニールし挿入
し、ｐＢＳ６Ｒ６Ｌを得た。
【００１９】ｐＢＳ６Ｒ６Ｌから配列番号７のプライマ
ーｐＫＮ６Ｂ３８Ｄと配列番号４のプライマーｐＩＬ６
Ｆ２を用いてＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｎ
ｒｕＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＥｃｏ４７
ＩＩＩとＮｏｔＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに挿入する
ことにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８Ｄを得
た。
ーｐＫＮ６Ｂ３８Ｄと配列番号４のプライマーｐＩＬ６
Ｆ２を用いてＩＬ−６遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、Ｎ
ｒｕＩとＮｏｔＩで切断した。これを、予めＥｃｏ４７
ＩＩＩとＮｏｔＩで切断したｐＢＳ６Ｒ６Ｌに挿入する
ことにより、プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８Ｄを得
た。
【００２０】プラスミドｐＢＳ６Ｒ６Ｌ−３８ＤをＸｈ
ｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融
合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩと
ＮｏｔＩで切断した発現ベクターｐＰＩＣ９（インビト
ロジェン社製）に挿入して、プロテアーゼ抵抗性を有す
るＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質をコードする発
現プラスミドｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤを調製した。
ｏＩとＮｏｔＩで切断してＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融
合蛋白質をコードする遺伝子を取得し、予めＸｈｏＩと
ＮｏｔＩで切断した発現ベクターｐＰＩＣ９（インビト
ロジェン社製）に挿入して、プロテアーゼ抵抗性を有す
るＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質をコードする発
現プラスミドｐＰＩＣ９−２０ＬＡＤを調製した。
【００２１】配列番号８のプライマーｐ６ＲＡＢ１１２
Ｖと配列番号９のプライマーｐ３４４Ｆを用いてＩＬ−
６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩ
で切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断し
たｐＰＩＣ９に挿入することにより、プラスミドｐＰＩ
Ｃ９−１１２ＶＬを得た。プラスミドｐＰＩＣ９−１１
２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片
を、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−
２０ＬＡＤに挿入することにより、融合蛋白質１１２Ｖ
ＡＤをコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２Ｖ
ＡＤを調製した。
Ｖと配列番号９のプライマーｐ３４４Ｆを用いてＩＬ−
６Ｒ遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅し、ＸｈｏＩとＸｂａＩ
で切断した。これを予めＸｈｏＩとＡｖｒＩＩで切断し
たｐＰＩＣ９に挿入することにより、プラスミドｐＰＩ
Ｃ９−１１２ＶＬを得た。プラスミドｐＰＩＣ９−１１
２ＶＬをＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断して得られた断片
を、予めＸｈｏＩとＰｍａＣＩで切断したｐＰＩＣ９−
２０ＬＡＤに挿入することにより、融合蛋白質１１２Ｖ
ＡＤをコードする発現プラスミドｐＰＩＣ９−１１２Ｖ
ＡＤを調製した。
【００２２】ピキア・パストリス（インビトロジェン社
製、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株）
から市販試薬（インビトロジェン社製、ＥａｓｙＣｏｍ
ｐＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてコ
ンピテントセルを調製し、Ｂｇｌ ＩＩによって線状化
したｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤで酵母を形質転換し、得
られた酵母を最小栄養培地で培養してヒスチジン要求性
を失った形質転換体を選別した。
製、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株）
から市販試薬（インビトロジェン社製、ＥａｓｙＣｏｍ
ｐＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてコ
ンピテントセルを調製し、Ｂｇｌ ＩＩによって線状化
したｐＰＩＣ９−１１２ＶＡＤで酵母を形質転換し、得
られた酵母を最小栄養培地で培養してヒスチジン要求性
を失った形質転換体を選別した。
【００２３】上記のようにして得られた形質転換体をＭ
Ｄプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ、０．０００
０４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、２％（Ｗ／Ｖ）グルコー
ス）とＭＭプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ、
０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、０．５％（Ｖ／
Ｖ）メタノール）にそれぞれ接種し、各形質転換体に対
し、ｍｕｔ＋であるかｍｕｔsであるかを調べ、ｍｕｔs
のうち１株（Ｇ１と略す）を以後の実験に用いた。
Ｄプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ、０．０００
０４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、２％（Ｗ／Ｖ）グルコー
ス）とＭＭプレート（１．３４％（Ｗ／Ｖ）ＹＮＢ、
０．００００４％（Ｗ／Ｖ）ビオチン、０．５％（Ｖ／
Ｖ）メタノール）にそれぞれ接種し、各形質転換体に対
し、ｍｕｔ＋であるかｍｕｔsであるかを調べ、ｍｕｔs
のうち１株（Ｇ１と略す）を以後の実験に用いた。
【００２４】１００ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅ
ａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅ
ｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎＢａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
１．３４ｇ／ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．０、グリセロール１０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍ
ｇ／ｌ）培地に１００ｕｌの２０％グリセロール凍結株
Ｇ１を接種し、市販の培養装置（ＮＢＳ社製、Ｇ−２０
型）にて２８℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養
を行った。
ａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅ
ｐｔｏｎｅ ２０ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅ
ｎＢａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
１．３４ｇ／ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．０、グリセロール１０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍ
ｇ／ｌ）培地に１００ｕｌの２０％グリセロール凍結株
Ｇ１を接種し、市販の培養装置（ＮＢＳ社製、Ｇ−２０
型）にて２８℃、２００ｒｐｍの条件で２４時間前培養
を行った。
【００２５】８ｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ
Ｅｘｔｒａｃｔ １５ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏ
ｎｅ ３０ｇ／ｌ、その他は上記ＢＭＧＹと同一組成）
培地に前記培養液１００ｍｌを接種し、１６ｌのジャー
（ＮＢＳ社製、ＳＦ−１１６型）にて２８℃、３５０ｒ
ｐ、通気量１ｖｖｍの条件で溶存酸素濃度をモニタリン
グしつつ培養を行った。
Ｅｘｔｒａｃｔ １５ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏ
ｎｅ ３０ｇ／ｌ、その他は上記ＢＭＧＹと同一組成）
培地に前記培養液１００ｍｌを接種し、１６ｌのジャー
（ＮＢＳ社製、ＳＦ−１１６型）にて２８℃、３５０ｒ
ｐ、通気量１ｖｖｍの条件で溶存酸素濃度をモニタリン
グしつつ培養を行った。
【００２６】培養開始から１６時間後、溶存酸素濃度が
急激に上昇したことによりグリセロールの枯渇を確認
し、培地にメタノール３００ｍｌ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａ
ｓｔＥｘｔｒａｃｔ １５ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏ
ｎｅ ３０ｇの混合水溶液を２ｌ添加し、１１２ＶＡＤ
の発現を誘導した。そしてメタノール添加後２０時間で
培養を終了し、培養液を集めた。
急激に上昇したことによりグリセロールの枯渇を確認
し、培地にメタノール３００ｍｌ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａ
ｓｔＥｘｔｒａｃｔ １５ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏ
ｎｅ ３０ｇの混合水溶液を２ｌ添加し、１１２ＶＡＤ
の発現を誘導した。そしてメタノール添加後２０時間で
培養を終了し、培養液を集めた。
【００２７】培養液８ｌを水に対して５時間透析した
後、電気伝導度計でモニターしながら、２０ｍＭ酢酸塩
緩衝液（ｐＨ５．５）及び純水を添加し、ＮａＣｌ濃度
として約５０ｍＭとなるまで希釈した。更にｐＨメータ
ーをモニターしながら、５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐ
Ｈを５．５とし、これを精製原料とした。
後、電気伝導度計でモニターしながら、２０ｍＭ酢酸塩
緩衝液（ｐＨ５．５）及び純水を添加し、ＮａＣｌ濃度
として約５０ｍＭとなるまで希釈した。更にｐＨメータ
ーをモニターしながら、５０％酢酸水溶液を滴下し、ｐ
Ｈを５．５とし、これを精製原料とした。
【００２８】ＳＰ基を有する吸着体粒子を含む市販の装
置（商品名；吸着流動床ストリームライン−ＳＰ（カラ
ム；ＳＴＬＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５０；５ｃｍＩＤ×１
００ｃｍ、ゲル；ストリームライン用ＳＰ；３００ｍ
ｌ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に対し、
２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）を上方送液するこ
とにより平衡化し、上記のように調製した精製原料（６
リットル、１１２ＶＡＤ量が１０９ｍｇ、総蛋白質量が
２．４ｇ）を線速毎時３００ｃｍで送液した。精製原料
の送液後、平衡化緩衝液を引き続き上方送液することで
充分に洗浄し、カラム上部に純水を注入してアダプター
を下降させゲルをパック状態にした。次いで、７５ｍＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）
を線速毎時３００ｃｍで下方送液し夾雑物を除去した。
洗浄による夾雑物の除去後、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５
％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭ リン酸塩緩
衝液（ｐＨ６．５）を線速毎時１５０ｃｍで下方送液し
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分（２０２ミリリッ
トル、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量６５ｍｇ、総
蛋白質量１０３ｍｇ）を得た。
置（商品名；吸着流動床ストリームライン−ＳＰ（カラ
ム；ＳＴＬＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５０；５ｃｍＩＤ×１
００ｃｍ、ゲル；ストリームライン用ＳＰ；３００ｍ
ｌ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に対し、
２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）を上方送液するこ
とにより平衡化し、上記のように調製した精製原料（６
リットル、１１２ＶＡＤ量が１０９ｍｇ、総蛋白質量が
２．４ｇ）を線速毎時３００ｃｍで送液した。精製原料
の送液後、平衡化緩衝液を引き続き上方送液することで
充分に洗浄し、カラム上部に純水を注入してアダプター
を下降させゲルをパック状態にした。次いで、７５ｍＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）
を線速毎時３００ｃｍで下方送液し夾雑物を除去した。
洗浄による夾雑物の除去後、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５
％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２０ｍＭ リン酸塩緩
衝液（ｐＨ６．５）を線速毎時１５０ｃｍで下方送液し
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分（２０２ミリリッ
トル、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量６５ｍｇ、総
蛋白質量１０３ｍｇ）を得た。
【００２９】回収した１１２ＶＡＤ画分をゲルろ過クロ
マトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理により濃
縮した。市販の限外ろ過膜（商品名；ペリコンＸＬ、日
本ミリポア社製）に０．４５マイクロメーターのメンブ
ランフィルター（日本ミリポア社製）でろ過した回収画
分を供した。
マトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理により濃
縮した。市販の限外ろ過膜（商品名；ペリコンＸＬ、日
本ミリポア社製）に０．４５マイクロメーターのメンブ
ランフィルター（日本ミリポア社製）でろ過した回収画
分を供した。
【００３０】引き続き限外ろ過膜処理後の画分をゲルろ
過クロマトグラフィー工程に供した。限外ろ過膜濃縮液
（２１ミリリットル）を１００ｍＭ ＮａＣｌの２０ｍ
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したゲルろ過
クロマトグラフィーカラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｇ
３０００ＳＷ（２１．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、東ソー
（株）製）に、毎分５．０ミリリットルで送液、添加
し、２８０ｎｍにおける吸収のモニター結果と標準蛋白
質の保持時間を指標として１１２ＶＡＤ画分を回収し
た。
過クロマトグラフィー工程に供した。限外ろ過膜濃縮液
（２１ミリリットル）を１００ｍＭ ＮａＣｌの２０ｍ
Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したゲルろ過
クロマトグラフィーカラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｇ
３０００ＳＷ（２１．５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ、東ソー
（株）製）に、毎分５．０ミリリットルで送液、添加
し、２８０ｎｍにおける吸収のモニター結果と標準蛋白
質の保持時間を指標として１１２ＶＡＤ画分を回収し
た。
【００３１】次に回収した１１２ＶＡＤ画分を陽イオン
交換クロマトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理
により緩衝液を交換した。限外ろ過膜に０．４５マイク
ロメーターのメンブランフィルターでろ過した回収画分
を供した。限外ろ過膜処理の間、適宜、５％（ｖ／ｖ）
グリセロールを含む２０ｍＭ 酢酸塩緩衝液を保持液で
ある１１２ＶＡＤ溶液に添加することにより、緩衝液の
交換を行った。緩衝液交換はｐＨおよび電気伝導度の測
定値を目安として行った。
交換クロマトグラフィーに供するため、限外ろ過膜処理
により緩衝液を交換した。限外ろ過膜に０．４５マイク
ロメーターのメンブランフィルターでろ過した回収画分
を供した。限外ろ過膜処理の間、適宜、５％（ｖ／ｖ）
グリセロールを含む２０ｍＭ 酢酸塩緩衝液を保持液で
ある１１２ＶＡＤ溶液に添加することにより、緩衝液の
交換を行った。緩衝液交換はｐＨおよび電気伝導度の測
定値を目安として行った。
【００３２】引き続き限外ろ過膜処理後の画分を、陽イ
オン交換クロマトグラフィー工程に供した。陽イオン交
換クロマトグラフ用カラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｓ
Ｐ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ×１５ｃｍ、東ソー
（株）製）を５％（ｖ／ｖ）グリセロールの２０ｍＭ
酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）で充分に平衡化し、調製液
を流速８．０（ミリリットル／分）で前記画分を送液し
た。送液後、前記平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、平衡
化緩衝液と１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸
塩緩衝液を用いて９５〜１９５ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配
により１１２ＶＡＤ画分を流速毎分８．０ミリリットル
で溶出させ、１１２ＶＡＤ画分７５ミリリットルを回収
した。これにより最終的に３０ミリグラムの精製１１２
ＶＡＤが回収された。なお、蛋白質の定量は、市販の定
量キット（商品名；プロテインアッセイキット、日本バ
イオ・ラッドラボラトリー社製）を使用した。また、１
１２ＶＡＤの定量は、担体に結合したｇｐ１３０蛋白
質、ラビット抗ＩＬ−６抗体及びアルカリフォスファタ
ーゼで標識したヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体を用いる測定
法（特願２０００−１９４９１９号参照）により行っ
た。
オン交換クロマトグラフィー工程に供した。陽イオン交
換クロマトグラフ用カラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｓ
Ｐ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩＤ×１５ｃｍ、東ソー
（株）製）を５％（ｖ／ｖ）グリセロールの２０ｍＭ
酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）で充分に平衡化し、調製液
を流速８．０（ミリリットル／分）で前記画分を送液し
た。送液後、前記平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、平衡
化緩衝液と１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸
塩緩衝液を用いて９５〜１９５ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配
により１１２ＶＡＤ画分を流速毎分８．０ミリリットル
で溶出させ、１１２ＶＡＤ画分７５ミリリットルを回収
した。これにより最終的に３０ミリグラムの精製１１２
ＶＡＤが回収された。なお、蛋白質の定量は、市販の定
量キット（商品名；プロテインアッセイキット、日本バ
イオ・ラッドラボラトリー社製）を使用した。また、１
１２ＶＡＤの定量は、担体に結合したｇｐ１３０蛋白
質、ラビット抗ＩＬ−６抗体及びアルカリフォスファタ
ーゼで標識したヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体を用いる測定
法（特願２０００−１９４９１９号参照）により行っ
た。
【００３３】実施例２ ＤＥＡＥ５ＰＷによる精製１１
２ＶＡＤの溶出パターンの解析 実施例１のようにして得られた精製１１２ＶＡＤを０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０ｍＭ ２−メルガプトエタ
ノール（２−ＭＥ）を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（Ｐｈ７．６）で１２倍に希釈し、同じ緩衝液で十分に
平衡化した陰イオン交換クロマトグラフ用カラム（商品
名；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５ｃｍ、東ソー（株）製）に流速４．０（ミリリ
ットル／分）で送液した。送液後、前記平衡化緩衝液で
カラムを洗浄し、平衡化緩衝液と１００ｍＭ ＮａＣｌ
を含む平衡化緩衝液を用いて０〜１００ｍＭのＮａＣｌ
濃度勾配により１１２ＶＡＤ画分を毎分４．０ミリリッ
トルで溶出させた。各フラクションの２８０ｎｍの吸収
を調べた結果、図１に示すような溶出パターンが得られ
た。更に、一部のフラクションを等電点電気泳動で調べ
た結果、図２が得られた。これは、図１に示す溶出パタ
ーンにおいて、６４．５分のピークの等電点は６．７、
７２．４分のピークと７７．１分のピークの等電点は
６．４、８３．１分のピークの等電点は６．１、９０．
６分のピークの等電点は５．９、１０１．４分のピーク
の等電点は５．６であることを示す。一方、精製１１２
ＶＡＤを、１０ｍＭ ２−ＭＥを含まない０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）で１２倍に希釈し、同様にＤＥＡＥ−５ＰＷで溶出
させると、図３に示すように、２−ＭＥを含む場合（図
１）と全く異なる溶出パターンが得られた。ピークがブ
ロードであること、及びピークの溶出位置が遅くなって
いることから１１２ＶＡＤが酸化され、不均一化したこ
とがわかる。
２ＶＡＤの溶出パターンの解析 実施例１のようにして得られた精製１１２ＶＡＤを０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０ｍＭ ２−メルガプトエタ
ノール（２−ＭＥ）を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（Ｐｈ７．６）で１２倍に希釈し、同じ緩衝液で十分に
平衡化した陰イオン交換クロマトグラフ用カラム（商品
名；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５ｍｍＩ
Ｄ×１５ｃｍ、東ソー（株）製）に流速４．０（ミリリ
ットル／分）で送液した。送液後、前記平衡化緩衝液で
カラムを洗浄し、平衡化緩衝液と１００ｍＭ ＮａＣｌ
を含む平衡化緩衝液を用いて０〜１００ｍＭのＮａＣｌ
濃度勾配により１１２ＶＡＤ画分を毎分４．０ミリリッ
トルで溶出させた。各フラクションの２８０ｎｍの吸収
を調べた結果、図１に示すような溶出パターンが得られ
た。更に、一部のフラクションを等電点電気泳動で調べ
た結果、図２が得られた。これは、図１に示す溶出パタ
ーンにおいて、６４．５分のピークの等電点は６．７、
７２．４分のピークと７７．１分のピークの等電点は
６．４、８３．１分のピークの等電点は６．１、９０．
６分のピークの等電点は５．９、１０１．４分のピーク
の等電点は５．６であることを示す。一方、精製１１２
ＶＡＤを、１０ｍＭ ２−ＭＥを含まない０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６）で１２倍に希釈し、同様にＤＥＡＥ−５ＰＷで溶出
させると、図３に示すように、２−ＭＥを含む場合（図
１）と全く異なる溶出パターンが得られた。ピークがブ
ロードであること、及びピークの溶出位置が遅くなって
いることから１１２ＶＡＤが酸化され、不均一化したこ
とがわかる。
【００３４】実施例３ Ｔｗｅｅｎ２０による１１２Ｖ
ＡＤの容器への吸着防止効果 実施例１で得られた精製１１２ＶＡＤに対する各種添加
物質の容器への吸着防止効果を調べた。精製１１２ＶＡ
Ｄを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８あるいは
７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、６２．５、１
２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌとなるよう
に調製し、２ミリリットルのポリプロピレン製チューブ
（エッペンドルフ製フロックチューブ）に１ミリリット
ルずつ加えた。比較のため、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の
代わりに、何も加えてないもの、０．５％ウシ血清アル
ブミンを含むもの、１０％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）２００００を含むもの、１０％ＰＥＧ８０００を
含むもの、１０％ＰＥＧ４０００を含むもの、０．１％
Ｔｒｉｔｏｎを含むものについても、同様にＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質の各種濃度の溶液を調製した。
ＡＤの容器への吸着防止効果 実施例１で得られた精製１１２ＶＡＤに対する各種添加
物質の容器への吸着防止効果を調べた。精製１１２ＶＡ
Ｄを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８あるいは
７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、６２．５、１
２５、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌとなるよう
に調製し、２ミリリットルのポリプロピレン製チューブ
（エッペンドルフ製フロックチューブ）に１ミリリット
ルずつ加えた。比較のため、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の
代わりに、何も加えてないもの、０．５％ウシ血清アル
ブミンを含むもの、１０％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）２００００を含むもの、１０％ＰＥＧ８０００を
含むもの、１０％ＰＥＧ４０００を含むもの、０．１％
Ｔｒｉｔｏｎを含むものについても、同様にＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質の各種濃度の溶液を調製した。
【００３５】そのまま２５℃で一晩放置した後、前述の
測定法（特願２０００−１９４９１９号に記載した方
法）を用いて１１２ＶＡＤを定量し、残存率を求めた。
測定法（特願２０００−１９４９１９号に記載した方
法）を用いて１１２ＶＡＤを定量し、残存率を求めた。
【００３６】図４及び図５から明らかなように、添加剤
を含まない溶液では１１２ＶＡＤの濃度が５００ｎｇ／
ｍｌ以下になると残存率はほぼ０％になる。一方、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液では、残存率は濃度に関
係なく１００％であった。０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含む
溶液、及びＰＥＧを含む溶液では、残存率は１００％に
はならなかった。以上の結果は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０のみが容器への高い吸着防止効果を有することを示
す。
を含まない溶液では１１２ＶＡＤの濃度が５００ｎｇ／
ｍｌ以下になると残存率はほぼ０％になる。一方、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液では、残存率は濃度に関
係なく１００％であった。０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含む
溶液、及びＰＥＧを含む溶液では、残存率は１００％に
はならなかった。以上の結果は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０のみが容器への高い吸着防止効果を有することを示
す。
【００３７】実施例４ Ｔｗｅｅｎ２０及び各種濃度の
２−ＭＥ存在下で置いたときの、１１２ＶＡＤの溶出パ
ターン実施例１の方法で得られた精製１１２ＶＡＤを３
７μｇ／ｍｌ含む、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０〜１００ｍＭ２
−ＭＥを４℃で２０時間程度放置した。その後、２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフ用カ
ラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．
６ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ、東ソー（株）製）に供した。
１１２ＶＡＤを供した後、２０分から７０分間にかけ
て、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０から５０ｍＭ）をか
け、１１２ＶＡＤ画分を溶出させた。２８０ｎｍの吸収
を測定することにより得られた溶出パターンを図６に示
す。
２−ＭＥ存在下で置いたときの、１１２ＶＡＤの溶出パ
ターン実施例１の方法で得られた精製１１２ＶＡＤを３
７μｇ／ｍｌ含む、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０〜１００ｍＭ２
−ＭＥを４℃で２０時間程度放置した。その後、２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフ用カ
ラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．
６ｍｍＩＤ×７．５ｃｍ、東ソー（株）製）に供した。
１１２ＶＡＤを供した後、２０分から７０分間にかけ
て、ＮａＣｌの直線濃度勾配（０から５０ｍＭ）をか
け、１１２ＶＡＤ画分を溶出させた。２８０ｎｍの吸収
を測定することにより得られた溶出パターンを図６に示
す。
【００３８】図６から明らかなように、２−ＭＥ非存在
下（Ａ）及び１ｍＭ存在下（Ｂ）では、図１の溶出パタ
ーンと比較して、ピークがブロードであること、及びピ
ークの溶出位置が遅くなっていることから、１１２ＶＡ
Ｄが酸化され、不均一化したことがわかる。これは、
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含み、２−ＭＥを含まない溶
液は吸着防止効果は有するものの、酸化防止効果をもた
ないことを示す。さらに、１１２ＶＡＤのようなＩＬ−
６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質の場合では、２−ＭＥの
濃度は２〜５０ｍＭ（Ｃ〜Ｆ）、特に１０ｍＭ（Ｄ）が
至適であることを示す。一方、２−ＭＥが１００ｍＭに
なると（Ｇ）、ピークの形状が大きく変わった。
下（Ａ）及び１ｍＭ存在下（Ｂ）では、図１の溶出パタ
ーンと比較して、ピークがブロードであること、及びピ
ークの溶出位置が遅くなっていることから、１１２ＶＡ
Ｄが酸化され、不均一化したことがわかる。これは、
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含み、２−ＭＥを含まない溶
液は吸着防止効果は有するものの、酸化防止効果をもた
ないことを示す。さらに、１１２ＶＡＤのようなＩＬ−
６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質の場合では、２−ＭＥの
濃度は２〜５０ｍＭ（Ｃ〜Ｆ）、特に１０ｍＭ（Ｄ）が
至適であることを示す。一方、２−ＭＥが１００ｍＭに
なると（Ｇ）、ピークの形状が大きく変わった。
【００３９】
【発明の効果】本願発明の吸着防止剤は、還元剤及びポ
リオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を成分とす
ることにより、特に疎水性の高い蛋白質の精製操作中や
精製後の保存時に、蛋白質の変性を招くことなく、当該
蛋白質の容器への吸着を防止することができる。本願発
明の方法は、分子量的だけでなく等電点的にも均一性が
要求される医薬品原体の工業的な製造に特に有用であ
る。
リオキシエチレン系の非イオン性界面活性剤を成分とす
ることにより、特に疎水性の高い蛋白質の精製操作中や
精製後の保存時に、蛋白質の変性を招くことなく、当該
蛋白質の容器への吸着を防止することができる。本願発
明の方法は、分子量的だけでなく等電点的にも均一性が
要求される医薬品原体の工業的な製造に特に有用であ
る。
【００４０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 蛋白質の吸着防止剤 <130> PA211-0216 <160> 9 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐ６ＲＡＢ２０Ｌ <400> 1 ctcgagaaga ggctggcccc aaggcgctgc cc 32 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐ６ＲＦ３２０Ｓ <400> 2 agatctggat tctgtccaag gcgtgcccat ggc 33 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐＩＬ６Ｂ２ <400> 3 agatctggta cccccaggag aagattcc 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐＩＬ６Ｆ２ <400> 4 atgcggccgc tacatttgcc gaagagccc 29 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> アニール用オリゴヌクレオチド <400> 5 gatcccctcc agctgagaac gaggtgtcca cccccatgca agcgctggta c 51 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> アニール用オリゴヌクレオチド <400> 6 cagcgcttgc atgggggtgg acacctcgtt ctcagctgga ggg 43 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐＫＮ６Ｂ３８Ｄ <400> 7 tctcgcgatg tagccgcccc acac 24 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐ６ＲＡＢ１１２Ｖ <400> 8 ctcgagaaga gggttccccc cgaggagccc cag 33 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマーｐ３４４Ｆ <400> 9 tctctagag atattatcat cg 22
【図１】図１は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び１０ｍＭ
２−ＭＥ存在下で、実施例２に記載する条件でＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷにかけたときの、１１２ＶＡＤの溶出パター
ンを示す。図中、６４．５、７２．４、７７．１、８
３．１、９０．６、１０１．４は、各ピークの溶出時間
（分）を示す。また、図２で示す結果から求められた、
各ピークに含まれる１１２ＶＡＤの等電点を記した。
２−ＭＥ存在下で、実施例２に記載する条件でＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷにかけたときの、１１２ＶＡＤの溶出パター
ンを示す。図中、６４．５、７２．４、７７．１、８
３．１、９０．６、１０１．４は、各ピークの溶出時間
（分）を示す。また、図２で示す結果から求められた、
各ピークに含まれる１１２ＶＡＤの等電点を記した。
【図２】図２は、図１の２７〜７９までの奇数のフラク
ションを等電点電気泳動にかけたときのパターンを示
す。図中、Ｍはマーカーを示し、７．３５、６．８５、
６．５５、５．８５はマーカーに含まれる各バンドの等
電点を示す。また図中、Ａｐｐｌｙは、実施例１に記載
の方法で得られた１１２ＶＡＤを供したレーンであるこ
とを示す。
ションを等電点電気泳動にかけたときのパターンを示
す。図中、Ｍはマーカーを示し、７．３５、６．８５、
６．５５、５．８５はマーカーに含まれる各バンドの等
電点を示す。また図中、Ａｐｐｌｙは、実施例１に記載
の方法で得られた１１２ＶＡＤを供したレーンであるこ
とを示す。
【図３】図３は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０存在下、２−
ＭＥ非存在下で、実施例２に記載する条件でＤＥＡＥ−
５ＰＷにかけたときの、１１２ＶＡＤの溶出パターンを
示す。図中、５４．９、５６．６、６６．２、６９．９
は、各ピークの溶出時間（分）を示す。
ＭＥ非存在下で、実施例２に記載する条件でＤＥＡＥ−
５ＰＷにかけたときの、１１２ＶＡＤの溶出パターンを
示す。図中、５４．９、５６．６、６６．２、６９．９
は、各ピークの溶出時間（分）を示す。
【図４】図４は、１１２ＶＡＤを６２．５、１２５、２
５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌ含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で添加剤を含まないもの（白
ひし形）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むもの（プラ
ス）、０．５％ウシ血清アルブミンを含むもの（バ
ツ）、１０％ＰＥＧ２００００を含むもの（白三角）、
１０％ＰＥＧ８０００を含むもの（黒丸）、１０％ＰＥ
Ｇ４０００を含むもの（白丸）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
を含むもの（黒三角）について、実施例３に示す方法に
より一晩放置した後の残存率を示す。
５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌ含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で添加剤を含まないもの（白
ひし形）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むもの（プラ
ス）、０．５％ウシ血清アルブミンを含むもの（バ
ツ）、１０％ＰＥＧ２００００を含むもの（白三角）、
１０％ＰＥＧ８０００を含むもの（黒丸）、１０％ＰＥ
Ｇ４０００を含むもの（白丸）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
を含むもの（黒三角）について、実施例３に示す方法に
より一晩放置した後の残存率を示す。
【図５】図５は、１１２ＶＡＤを６２．５、１２５、２
５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌ含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で添加剤を含まないもの（白
ひし形）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むもの（プラ
ス）、０．５％ウシ血清アルブミンを含むもの（バ
ツ）、１０％ＰＥＧ２００００を含むもの（白三角）、
１０％ＰＥＧ８０００を含むもの（黒丸）、１０％ＰＥ
Ｇ４０００を含むもの（白丸）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
を含むもの（黒三角）について、実施例３に示す方法に
より一晩放置した後の残存率を示す。
５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌ含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で添加剤を含まないもの（白
ひし形）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むもの（プラ
ス）、０．５％ウシ血清アルブミンを含むもの（バ
ツ）、１０％ＰＥＧ２００００を含むもの（白三角）、
１０％ＰＥＧ８０００を含むもの（黒丸）、１０％ＰＥ
Ｇ４０００を含むもの（白丸）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
を含むもの（黒三角）について、実施例３に示す方法に
より一晩放置した後の残存率を示す。
【図６】図６は実施例４に示すように、２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）（Ａ〜Ｇ）、２−ＭＥ非存在
下（Ａ）、１ｍＭ ２−ＭＥ存在下（Ｂ）、２ｍＭ ２
−ＭＥ存在下（Ｃ）、１０ｍＭ ２−ＭＥ存在下
（Ｄ）、２０ｍＭ ２−ＭＥ存在下（Ｅ）、５０ｍＭ
２−ＭＥ存在下（Ｆ）、１００ｍＭ ２−ＭＥ存在下
（Ｇ）で、４℃２０時間放置した後に、ＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗにかけることにより得られたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質の溶出パターンを示す。
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）（Ａ〜Ｇ）、２−ＭＥ非存在
下（Ａ）、１ｍＭ ２−ＭＥ存在下（Ｂ）、２ｍＭ ２
−ＭＥ存在下（Ｃ）、１０ｍＭ ２−ＭＥ存在下
（Ｄ）、２０ｍＭ ２−ＭＥ存在下（Ｅ）、５０ｍＭ
２−ＭＥ存在下（Ｆ）、１００ｍＭ ２−ＭＥ存在下
（Ｇ）で、４℃２０時間放置した後に、ＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗにかけることにより得られたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質の溶出パターンを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA26 BA63 CA04 CA07 CA09 DA12 FA02 GA11 HA03 4B064 AG03 AG20 CA06 CA19 CC09 CC12 CC24 CD06 CD12 CE06 CE07 CE11 DA01 4B065 AA77X AA93Y AB01 BA02 BB06 BB12 BC14 BD17 BD18 CA24 CA44 4D077 AA02 BA15 DC19X
Claims (4)
- 【請求項１】還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成る蛋白質の吸着防止剤。 - 【請求項２】前記還元剤は２−メルカプトエタノールで
あることを特徴とする、請求項１に記載の吸着防止剤。 - 【請求項３】還元剤及びポリオキシエチレン系の非イオ
ン性界面活性剤より成るＩＬ−６レセプターとＩＬ−６
との融合蛋白質の吸着防止剤。 - 【請求項４】前記還元剤は２−メルカプトエタノールで
あることを特徴とする、請求項３に記載の吸着防止剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000205581A JP2002018265A (ja) | 2000-07-03 | 2000-07-03 | 蛋白質の吸着防止剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000205581A JP2002018265A (ja) | 2000-07-03 | 2000-07-03 | 蛋白質の吸着防止剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002018265A true JP2002018265A (ja) | 2002-01-22 |
Family
ID=18702642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000205581A Pending JP2002018265A (ja) | 2000-07-03 | 2000-07-03 | 蛋白質の吸着防止剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002018265A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008275412A (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Hitachi High-Technologies Corp | 試料分析システム及び試料搬送方法 |
-
2000
- 2000-07-03 JP JP2000205581A patent/JP2002018265A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008275412A (ja) * | 2007-04-27 | 2008-11-13 | Hitachi High-Technologies Corp | 試料分析システム及び試料搬送方法 |
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