JP2002000300A - 簡易塩基配列確認法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞・細菌に含まれる目的遺伝子の核酸塩基
配列を簡易に確認する方法を提供する。 【解決手段】 検査試薬中に１個以上の核酸増幅用プラ
イマーと１個以上の核酸塩基配列確認用プローブを存在
させ、核酸増幅反応と同時に、あるいは連続して核酸塩
基配列確認反応を行う操作と、核酸塩基配列確認用プロ
ーブの分子運動の自由度を高める手段として該プローブ
を糸様あるいは網目様構成物に固定あるいは半固定にし
て反応容器に入れる、又は反応容器に設けられたディン
プル内に該プローブを固定して核酸塩基配列確認反応を
行うことにより達成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸塩基配列確認
反応（ハイブリダイゼーション）を応用して目的核酸の
塩基配列を簡易に確認する簡易塩基配列確認法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】細胞・細菌の核酸塩基配列の確認法は、
細胞・細菌より核酸を抽出し、目的とする核酸をＰＣＲ
法などの核酸増幅法で核酸を増幅後、あるいはベクター
にクローニングし、これを宿主大腸菌内で増幅精製後、
サンガーらのジデオキシチェーンターミネーター法など
の塩基配列決定法により塩基配列を確認するか、または
特定の１本鎖の塩基配列（プローブ）が特定の１本鎖の
塩基配列を認識し融合して２重鎖を形成（ハイブリダイ
ズ）するハイブリダイゼーション法を応用し、複数のプ
ローブを配置して塩基配列を確認しており、決定には長
時間を要した。

【０００３】ハイブリダイゼーション法は、サザンブロ
ット法を応用して複数の標識したプローブをあらかじめ
マイクロチップ上に配置し、目的核酸とハイブリダイズ
させることにより目的核酸の塩基配列を確認することに
使用されるＤＮＡチップなどが実用化されている。

【０００４】長いＤＮＡの塩基配列を効率よく決定する
方法としては特開平６−２２７９８に種々の配列を持っ
たＤＮＡオリゴマーを区分して保持したＤＮＡプローブ
素子と、それらオリゴマーのセットの夫々を種々蛍光体
で標識した蛍光体標識オリゴマーセットを用いて長いＤ
ＮＡの複数個所あるいは複数のＤＮＡの塩基配列を決定
する方法が開示されている。

【０００５】特開２０００−８３６４７には検出すべき
目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の
核酸プローブを電極表面に固定化し、一本鎖に変性され
た遺伝子を含む検体と反応させた後、遺伝子とハイブリ
ダイズした核酸プローブに二本鎖認識体を結合し、これ
を電気化学測定によって検出することによる、簡便で高
感度の遺伝子検出方法を開示している。

【０００６】人の全ゲノム等のように大規模な塩基配列
を決定するための効率の良い核酸塩基配列決定法とし
て、特開平７−２０３９９８にはキャピラリープレート
の各コラム内にプライマーとして全てのｋ塩基配列を含
むオリゴヌヌクレオチドを固定し、該コラムに未知の１
本鎖被検核酸を加えてプライマーとハイブリダイズさせ
た後、各コラムに４種類のｄＮＴＰを、ＤＮＡポリメラ
ーゼを触媒として同時に加えてＰＣＲを行ない、結合し
たプライマー及びプライマーと被検核酸との結合位置を
同定する方法が開示されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記塩基配列確認法は
いずれもＰＣＲ法等の核酸増幅反応終了後、その一部あ
るいは全部を用いた別の反応系で塩基配列を決定してお
り、簡易な方法とは言えない。サンガー法や特開２００
０−８３６４７の方法は目的核酸の標識、電気泳動など
を必要とし、更に、通常のハイブリダイゼーション法は
ハイブリダイズ反応を必要とするために数時間乃至十数
時間を要し、必ずしも短時間で塩基配列を決定する簡易
な方法とは言えない。

【０００８】又、これらの技術を遂行するにはいずれも
専門的技術を要し、遺伝子治療など種々の用途が可能な
目的核酸の塩基配列を決定する方法としては簡易と言え
ない。

【０００９】所謂ＤＮＡチップの使用は専門的技術なし
に遂行を可能とするものであるが、核酸液配列確認反応
を前処理反応とは別の反応系で実行されねばならず、
又、ハイブリダイズ反応に数時間乃至十数時間を要し、
短時間で塩基配列を決定する簡易な方法とは言えない。

【００１０】

【課題を解決するための手段】係る事情に鑑み、発明者
らは鋭意研究の結果、ＰＣＲ法などの前処理反応と塩基
配列確認法を同時に、あるいは連続して実行することに
より短時間で細胞・細菌に含まれる目的核酸の核酸塩基
配列を確認する新規な簡易塩基配列確認法の発明に至っ
た。

【００１１】即ち、従来のハイブリダイズ反応では核酸
塩基配列確認用プローブの位置を固定することによって
塩基配列を特定するものであるが、このプローブ固定が
ハイブリダイズ反応に長時間を要する因子となっている
点に着目し、これを改良することによって短時間で目的
核酸の塩基配列を決定する簡易塩基配列確認法の発明に
至ったものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】ＰＣＲ法などの前処理反応と塩基
配列確認法を同時に、あるいは連続して実行する方法と
しては１個以上の核酸増幅プライマーと同時に１個以上
の核酸塩基配列確認用プローブを糸様構成物あるいは網
目様構成物に固定あるいは半固定したものを検査試薬中
に混在させた上、蛍光物質で標識した核酸増幅プライマ
ーを用いて目的核酸とのＰＣＲ反応終了後、標識された
ＰＣＲ産物と該核酸塩基配列確認用プローブとの間でハ
イブリダイゼーション反応を行うものであるが、この反
応中は核酸塩基配列確認用プローブが糸様構成物あるい
は網目様構成物に固定あるいは半固定の状態にあり、適
度に自由分子運動を行うことが出来るのでＤＮＡチップ
のような固定プローブに比べ反応効率が改善され、３０
分前後の短時間で反応が終了する。

【００１３】反応終了後、これらのプローブは糸様構成
物あるいは網目様構成物により位置が固定されているた
め、各プローブを狙って光学的に励起した場合、標識さ
れたＰＣＲ産物と２本鎖を形成したものからのみ蛍光を
検出し、これにより反応したプローブのみを特定して短
時間に簡易に目的核酸の塩基配列を特定することが出来
る。

【００１４】１個以上の核酸増幅プライマーと同時に各
々異なった蛍光物質で標識した１個以上の核酸塩基配列
確認用プローブを混在させるとＰＣＲ法などの前処理反
応と塩基配列確認法を同時に、あるいは連続して実行さ
れるハイブリダイゼーション反応においてＰＣＲ産物と
相補的なプローブは２本鎖を形成するが相補的でないプ
ローブは未反応のまま１本鎖を形成するのでハイブリダ
イゼーション反応終了後、カラムなどを用いで未反応の
プローブを除去してＰＣＲ産物とハイブリッドを形成し
た相補的なプローブに対し光学的に励起するとＰＣＲ産
物と２本鎖を形成したものからのみ蛍光を検出し、これ
により反応したプローブを特定し短時間に簡易に目的核
酸の塩基配列を特定することが出来る。

【００１５】もう一つの実施の形態は、核酸塩基配列確
認用プローブを個々に金属または磁性体などで標識し、
かつ反応容器の個別の窪み（ディンプル）に配置し、１
個以上の核酸増幅用プライマーおよび１個以上の核酸塩
基配列確認用プローブを同時に存在させ（１ディンプル
につき１個のプローブ）、核酸増幅反応と同時に、ある
いは連続して核酸塩基配列確認反応（ハイブリダイゼー
ション）を行う際に容器の外側に磁石などを配置し、ハ
イブリダイゼーション反応中はこれを隔離してプローブ
を自由分子運動させるとＰＣＲ産物とのハイブリダイゼ
ーション時間を３０分程度に短縮することが可能とな
る。

【００１６】ハイブリダイゼーション反応終了後、この
磁石を容器外側に近接させることによりプローブおよび
これと反応し２本鎖を形成したＰＣＲ産物をディンプル
下部に固定することが出来るので該ＰＣＲ産物をＳｙＧ
ｒｅｅｎなど、２本鎖核酸に特異的な核酸染色色素で反
応させると、目的核酸と相補的なプローブの入っていた
ディンプルのみが蛍光を発することにより簡易に目的核
酸の塩基配列を特定することが出来る。

【００１７】糸様構成物としては繊維、金属、核酸など
あらゆる素材を意味し、糸状形態の物質ならば何れでも
良い。特に核酸を糸として利用する場合は、プローブを
組み込んだ状態で幾億本でも簡単に増幅できるので核酸
の製造が容易となる。

【００１８】ポストＤＮＡチップを意味するディンプル
構造の利用は、この小さなディンプルの中でＰＣＲに引
き続きハイブリダイゼーションを行なうために使用され
るものである。

【００１９】プローブに金属などを付けておき、外から
磁石で該プローブを動かないように固定させ、続いて目
的のサンプルを空気の巻き込みなくディンプル内に注ぐ
方法としては、上からピペットで注ぐ方法、ディンプル
間に細い溝を作りこれに蓋をして密封し、ゆっくり上か
ら吸う方法などがあり、何れの方法でも良い。

【００２０】本発明の方法では、磁石をはずした後、容
器を熱したり冷やしたりしてＰＣＲを行ない、その後一
定温度に保てばハイブリダイゼーションが起こり、２４
時間以上要していたＤＮＡチップの診断時間を３０分か
ら１時間程度まで短縮出来る。

【００２１】

【発明の効果】本発明は、試薬中に核酸増幅用プライマ
ーと核酸塩基配列確認用プローブを同時に存在させて核
酸増幅反応と同時に、あるいは連続して行う操作と、該
核酸塩基配列確認用プローブの分子運動の自由度を高め
る方法の導入によって極めて短時間に目的核酸の塩基配
列を決定することが出来る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞・細菌に含まれる目的核酸の核酸塩
   基配列の確認法であって、検査試薬中に１個以上の核酸
   増幅用プライマーと１個以上の核酸塩基配列確認用プロ
   ーブを存在させ、核酸増幅反応と同時に、あるいは連続
   して核酸塩基配列確認反応（ハイブリダイゼーション）
   を行うことを特徴とする目的核酸の簡易塩基配列確認
   法。
2. 【請求項２】 前記の核酸塩基配列確認反応（ハイブリ
   ダイゼーション）において、１個以上の核酸塩基配列確
   認用プローブを無固定状態に、あるいは半固定状態に維
   持し、反応終了後、これらの位置を固定して該プローブ
   と反応した目的核酸の核酸塩基配列を特定することを特
   徴とする請求項１に記載の簡易塩基配列確認法。
3. 【請求項３】 前記の核酸塩基配列確認用プローブが、
   蛍光物質などの標識物質で標識されていることを特徴と
   する請求項２に記載の簡易塩基配列確認法。
4. 【請求項４】 前記の１個以上の核酸塩基配列確認用プ
   ローブが、１本以上の糸様構成物あるいは網目様構成物
   に固定され、あるいは半固定されていることを特徴とす
   る請求項２に記載の簡易塩基配列確認法。
5. 【請求項５】 前記の核酸塩基配列確認用プローブが、
   個々に金属または磁性体などで標識され、かつ反応容器
   の個別の窪み（ディンプル）に配置されていることを特
   徴とする請求項２に記載の簡易塩基配列確認法。