JP2001524000A - Ｔｒａｐ被覆骨移植片及びプロテーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多孔性ヒドロキシアパタイト基質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を特徴とする、骨に対する整形外科用又は歯科用移植に適する組成物又はデバイス。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＲＡＰ被覆骨移植片及びプロテーゼ 本発明は米国立保健研究所によって授与された助成金ＡＲ 42657による米国政 府の支援でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有している。 本出願は、1997年4月22日に出願した米国仮出願番号60/044,033の利益を請求 している。 発明の分野 本発明は、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）が破骨細胞にするため の強力な分化因子であるという発見に根拠を置いている。本発明は本願で特許請 求した実施態様でＴＲＡＰ被覆骨移植片並びに移植可能で永久的な整形外科用及 び歯科用プロテーゼを提供する。 発明の背景 ウテロフェリン（12;添付の引用文献参照）、パープル酸性ホスファターゼ（1 3）、又はタイプ５酸性ホスファターゼ（14〜16）としても知られているＴＲＡ Ｐは約35ｋＤａの分子量を有する鉄含有陽イオン糖タンパク質である。骨、脾臓 、肺、胎盤、妊娠ブタ子宮及び或る種の白血病細胞を含む多様な器官がこの酵素 を発現する（12〜17）。ＴＲＡＰの酵素活性は血中で検出され、そして高い酵素 値は活発な骨のリモデリングを反映している（18、19）。骨においては、この酵 素は多核破骨細胞や破骨細胞又は破骨細胞前駆体と考えられる単核細胞によって 高度に発現される（15）。破骨細胞による高い発現値と、細胞質液胞、細胞外チ ャンネル、波状縁及び細胞−骨界面におけるＴＲＡＰ濃度はこの酵素が骨マトリ ックスの分解に関与していたことを示している（20）。しかしながら、ＴＲＡＰ の機能は依然として知られていない。ブタウテロフェリンの遮断抗体はインビト ロの酵素活性と破骨細胞による骨吸収の両方を顕著に阻害した（21）。数件の報 文で骨のリモデリングにおけるＴＲＡＰの役割が指摘されている。相同的組換え 技 術によって生まれ、ＴＲＡＰを欠いているノックアウトマウスは骨の異常な軟骨 内骨化並びに軽度の大理石骨病の異常な形態を示した（22）。多数の研究によっ てＭ-ＣＳＦがマクロファージや破骨細胞の成熟化と機能の両方で重要な役割を 果たしていることが示されている（3）。 破骨細胞、即ち骨を吸収する細胞は正常な骨格の成長とリモデリングに必須で ある。破骨細胞は顆粒球／マクロファージ系譜の造血前駆体／幹細胞に由来して いるが、これらの正確な分岐点には異論がある（1、2）。最近の研究で破骨細胞 機能の発達において細胞と細胞の相互作用に関与する幾つかの因子が明らかにな った（3、4）が、破骨細胞前駆体の分化と吸収のための骨表面への補充の調節は 依然として殆ど理解されていない。破骨細胞の分化と補充の分子メカニズムを更 に良く理解することが、骨粗鬆症、即ち、成人骨格における骨吸収と骨形成間の 正味不均衡から生じる通常の疾病の防止と管理に使用される新規な診断法と治療 法になり得るであろう。この不均衡は、破骨細胞数と吸収活性の増加に関係して いる閉経期後に吸収が加速するとき、大きくなる可能性がある。或る種の癌腫は 骨に転移しがちであり、そして／又は骨溶解（骨吸収）を促進する因子を局部的 にか又は全身的に放出し得ることも知られている。このような腫瘍の特性に関す る分子や細胞の基礎は十分には理解されていない。 発明の要約 本発明は、本願で特許請求した実施態様で、多孔質のヒドロキシアパタイト基 質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を特徴とする、骨に 対して整形外科的又は歯科的移植に適する組成物又はデバイスを提供する。この ようなインプラントには、自己由来骨移植片、死体骨同種移植片、ヒドロキシア パタイト含有骨セメント、ヒドロキシアパタイトで被覆した骨アタッチメント表 面を有する人工関節や義歯のようなプロテーゼデバイス、及びヒドロキシアパタ イトで被覆した骨接触表面を有するステープルやプレートのような整形外科用ア タッチメントデバイスが含まれる。 移植によって、ＴＲＡＰコーティングは骨髄又は血流から骨インプラント又は プロテーゼ若しくはアタッチメントデバイスのヒドロキシアパタイト表面に破骨 細胞前駆細胞を補充するか又は誘引するように作用する。補充された破骨細胞集 団はインプラントの骨ミネラル又はヒドロキシアパタイト表面を腐食し、そして それによって骨芽細胞を補充する天然のシグナルを提供して、移植片又はプロテ ーゼ表面と境を接しておりそして同化する新しい骨を沈着させ、そしてこれは破 骨細胞が吸収した骨表面に骨が沈着する天然の過程を模擬している。ＴＲＡＰで 誘導される破骨細胞補充刺激は骨の同化をもたらし、そして患者の骨に対する移 植片又はプロテーゼの結合を増強する。これによって手術後の回復時間が減少し そして数年間でゆるくなるというインプラントの良く証明された傾向が低下して インプラントの寿命が延長される。骨移植片はインプラント部位の生存骨に対し ても機械的に且つ生物学的に一層効果的に同化される。 図面の簡単な説明 本発明の上記の態様及び多数の付随する利点は、これらが以下の詳細な説明を 添付図面と関連付けて参照することによってより良く理解されるようになるので 、一層容易に評価されるようになろう。 図１は、実施例に記載したヘパリン-セファロースクロマトグラフィーによる 初期ＣＥＳＪ培地のタンパク質精製結果を示す。この図のデータ表示では、１ウ ェル当たりＴＲＡＰ陽性細胞に基づく生物学的活性（陰影付き棒）と280nmでの 吸光度で測定したタンパク質含有量（点線）は共に縦軸にプロットされ;そして 溶出したカラムフラクションは横軸に示されている。 図２は、ヒドロキシアパタイトカラム上でのＴＲＡＰ陽性活性の更なる精製を 示す、データはこの図でも図１と同じように縦軸と横軸にプロットされており； そして 図３は、サイズ排除カラムＨＰＬＣによるＴＲＡＰの最終単離を示す。この図 では、１ウェル当たりＴＲＡＰ陽性細胞に基づく生物学的活性（陰影付き棒）と 220nmでの吸光度で測定したタンパク質含有量（実線）は共に上方図（図３Ａ） の縦軸にプロットされ、そしてp-ニトロフェニルホスフェート開裂で測定したＴ ＲＡＰ酵素活性はミリ単位のＴＲＡＰ/mlに基づいて下方図（図３Ｂ）の縦軸に プロットされている（点線）;溶出量（ml）は共通の横軸に示されている。好ましい実施態様の詳細な説明 ここで、本発明者はマウス乳癌細胞系、ＣＥＳＪの強力な破骨細胞補充特性に 主として寄与する特有の因子の単離と特徴決定について記載する。生物学的活性 は逐次的なヘパリンアフィニティ、ヒドロキシアパタイト及びモレキュラーシー ブクロマトグラフィーによって単離された。この分子は、Ｎ末端配列及び酵素活 性分析によって酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）であることが証明さ れたが、これは予期されていなかった。組換えＴＲＡＰが調製されそして、ＣＥ ＳＪ腫瘍細胞ならし培地から単離された分子に関する所見と同様に、マウス骨髄 幹細胞からの破骨細胞コロニー形成をインビトロで促進することが示された。本 発明者は、ＴＲＡＰは多分ホスファターゼ又は酸素由来遊離基の発生器としての 酵素活性によって、破骨細胞にするための強力な分化因子として作用すると結論 する。 本発明者は、吸収用に標的化された特別の骨表面に破骨細胞を補充しそしてま た、存在する破骨細胞による吸収活性部位への新規破骨細胞の局部的補充を継続 するという正常な骨生物学におけるＴＲＡＰの役割を提案する。網状骨、産卵期 トリの一時的な髄様骨並びに吸収される運命の骨領域及び石灰化軟骨のマトリッ クスにおける未説明のＴＲＡＰと骨細胞の関係に関する従来の報告は、破骨細胞 補充作用剤としての役割と一致している、髄様骨は卵殻形成用に迅速に利用でき るカルシウム源として産卵期トリの長骨幹内に蓄えられている（Roach，H.I．(1 997年)J．Bone Miner．Res．12、795〜805）。この骨は産卵周期と一致して形成 され、そして急速に吸収される。エストロゲンを投与された雄トリ（ウズラ）も 同様に髄様骨を蓄えるであろう。髄様骨のマトリックスは、永久骨とは異なって 、ＴＲＡＰに関して陽性に染色する（Yamamoto，T.及びNagai，H．（1992年）J ．Bone Miner．Res．7、1267〜1273及び（1994年）9、1153〜1157）。骨芽細胞 は、たとえこの細胞自体はＴＲＡＰに関して染色しないとしても、ＴＲＡＰの上 記マトリックス蓄積に関係していると結論された。これらの所見は、ＴＲＡＰが 破骨細胞にするための強力な分化因子であるという本発明の発見と一致し、そし て骨組織の特別の領域を吸収するように破骨細胞を標的化する局部的補充作用剤 とし て提案されたＴＲＡＰの役割と一致している。骨の一定の局部領域における骨細 胞と骨芽細胞は、マトリックスのヒドロキシアパタイトミネラル相に結合するよ うになるＴＲＡＰを発現することによって、吸収及びリモデリング用に組織を標 的化できることが予測される。ＴＲＡＰとヒドロキシアパタイトの観察された結 合親和性は、吸収用に標的化されたミネラル化組織領域に破骨細胞を局部的に補 充する上記提案の役割において生物学的な意義を有している可能性があろう。 本発明の研究結果によって、ＴＲＡＰが造血幹細胞から得られる破骨細胞の補 充において局部因子として直接的な役割を有していることが明らかにされている 。かくして、正常な骨生理学では、破骨細胞によって分泌されるＴＲＡＰは破骨 細胞を更に補充するためにマクロファージ／破骨細胞系譜に関して髄の幹細胞か らか又は循環中の前駆細胞から分化させるように局部的に作用するものと思われ る。このシグナリング作用はリガンド／細胞表面レセプターメカニズムによるリ ガンドとしてのＴＲＡＰ分子の作用によってか或いは多分ＴＲＡＰ触媒活性、即 ちホスファターゼ活性か又は酸素ラジカル若しくは他の反応性酸素種の産生のど ちらかの結果によって介在されるものと思われる。酸素由来の遊離基が骨培養物 中で破骨細胞の産生を刺激できることはこれまで報告されていたが、ＴＲＡＰは その供給源として含意されていなかった。 改善された骨移植片及びプロテーゼ ＴＲＡＰとヒドロキシアパタイトの観察された結合親和性又は吸着は改善され た骨や歯科用インプラントを提供するために重要な関係を有している。このよう なインプラントには自己由来骨移植片、死体骨同種移植片、ヒドロキシアパタイ ト含有骨セメント、ヒドロキシアパタイト被覆骨アタッチメント表面を有する人 工関節や義歯のようなプロテーゼデバイス、及びヒドロキシアパタイト被覆骨接 触表面を有するステープルやプレートのような整形外科用アタッチメントデバイ スが含まれる。本発明に従って、例えば組換え供給源から得られる酵素的に活性 のＴＲＡＰは移植前に骨移植片、骨セメント又はデバイスのヒドロキシアパタイ ト成分に吸着される。自己由来の骨インプラント又は埋め込まれた骨組織の場合 には、骨移植片は移植前に手術室で単に無菌ＴＲＡＰ溶液に浸漬するだけで良い 。 最終的に宿主の骨で完全に置換されることが望ましい手術部位に移植される骨の 同種移植片は、ＴＲＡＰで表面だけを被覆するというよりはむしろ、ＴＲＡＰを しみ込ませることができる。ヒドロキシアパタイト被覆プロテーゼデバイスは、 ミネラル化した組織切片中のＴＲＡＰ酵素活性分布を評価するために組織化学的 に使用される方法で品質管理のために測定するとき、例えば約10ミクロンのオー ダーの予め決定された浸透でＴＲＡＰを吸着させて製造することができる。いず れにしても、ＴＲＡＰは骨のミネラル（即ち、ヒドロキシアパタイト）と結合す るか又はインプラントのヒドロキシアパタイト表面と結合する。酵素的に活性の ＴＲＡＰか又はタンパク分解若しくは他の手段によって体内で活性化され得る潜 在的形態のどちらかを使用することができる。 移植によって、ＴＲＡＰコーティングは骨髄又は血流から骨インプラント又は プロテーゼ若しくはアタッチメントデバイスのヒドロキシアパタイト表面に破骨 細胞前駆細胞を補充するか又は誘引するのに寄与する。補充された破骨細胞集団 は骨のミネラル又はインプラントのヒドロキシアパタイト表面を腐食し、そして それによって骨芽細胞を補充する天然のシグナルを提供して、移植片又はプロテ ーゼ表面と境を接しそして同化する新しい骨を沈着させ、そしてこれは破骨細胞 が吸収した骨表面に骨が沈着する天然の過程を摸擬している、ＴＲＡＰで誘導さ れる破骨細胞補充刺激は骨の同化をもたらし、そして患者の骨に対する移植片又 はプロテーゼの結合を増強する。これによって手術後の回復時間が減少しそして 数年間でゆるくなるというインプラントの良く証明された傾向が低下してインプ ラントの寿命が延長される。骨移植片はインプラント部位の生存骨に対しても機 械的に且つ生物学的に一層効果的に同化される。 ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイト、カルシウムヒドロキシドホ スフェート、カルシウムトリホスフェート及びトリカルシウムホスフェートとし ても知られている）、Ca₅(PO₄)₃OHは骨の主要なミネラル成分である。本明細書 で使用するとき、用語「ヒドロキシアパタイト」は整形外科用及び歯科用インプ ラントで使用される誘導体のカルシウムホスフェート化合物も包含するものであ る。このような広範囲の誘導体化合物は、例えば、酸化カルシウムと五酸化リン 間の反応によって構成されている。得られたセラミックスは種々の微細構造 と密度を有する少なくとも８種の結晶形態で製造することができ、そして他の元 素も同様に含有することができる。（Campbell's Operative Orthopaedies、第 ８版、A.H．Crenshaw（編）、Mosby Year Book、382頁、1992年。）（例えば、 発明の名称「骨組織石灰化を高めるためのカルシウムホスフェートセラミックス 」の米国特許第5,171,326号及び発明の名称「ヒドロキシルアパタイトセラミッ ク」の米国特許第4,097,935号参照。）医療用途の多孔性ヒドロキシアパタイト はポライテスゴニオポーラ（Porites gonipora）サンゴ外骨格（コラリンヒドロ キシアパタイト）の変換によっても形成されている（Pro Osteon，Interpore In ternational）。機械的強度を提供しそして天然の細胞メカニズムによって時間 と共にリモデリングを生じさせるために、注射用及び骨折のインシトゥ(in situ )整復用製剤（例えば、ＳＲＳ海綿骨セメント、Norian Corporation）が利用で きる。 ヒドロキシアパタイトの多孔性コーティングは、永久骨プロテーゼの骨接触表 面にプラズマスプレー技術で慣用的に適用される。（例えば、発明の名称「イン プラントプロテーゼ及びその製造方法」の米国特許第5,397,362号及び発明の名 称「ヒドロキシアパタイトプロテーゼコーティング」の米国特許第5,279,831号 参照。）例えば、人工腰プロテーゼでは、患者の大腿骨に挿入されるチタン合金 幹部は概ね50ミクロン厚のヒドロキシアパタイトセラミック層で被覆される。多 孔性ヒドロキシアパタイト表面は骨の成長及びインプラントと宿主間の同化を促 進し、アクリル骨セメントの必要性を軽減し、そして高い機械力伝達を提供する 。関節全置換の機能的な成果の改善が得られる。（例えば、発明の名称「ヒドロ キシルアパタイトで被覆されたプロテーゼインプラント及びヒドロキシルアパタ イトをプラズマスプレーされたプロテーゼインプラントの処理方法」の米国特許 第5,730,598号参照。） 要約すると、本発明のこの態様によって、骨に対する整形外科的又は歯科的移 植に適し、多孔性ヒドロキシアパタイト基質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスフ ァターゼ（ＴＲＡＰ）を特徴とする組成物又はデバイスが提供される。 本発明組成物には骨移植片組成物が含まれ、その際ヒドロキシアパタイト基質 は自己由来骨、死体同種移植片骨、コラリンヒドロキシアパタイト及び合成ヒド ロキシアパタイトブロックのなかから選択される。１つの実施態様では、ＴＲＡ Ｐは多孔性ヒドロキシアパタイト基質全体に吸着される。好ましい実施態様では 、ＴＲＡＰは多孔性ヒドロキシアパタイト基質の外部表面にだけ吸着される。 本発明組成物には骨セメント組成物も含まれ、その際酒石酸抵抗性酸ホスファ ターゼ（ＴＲＡＰ）は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のような自己硬 化性アクリルポリマー中に混合することができる微粒子ヒドロキシアパタイト基 質（例えば、ＩＲＣ骨セメント、ロンドン大学生物医学材料学際研究センター） に吸着されている。或いは、自己硬化してヒドロキシアパタイトになるカルシウ ムホスフェートセメント（例えば、米国特許第5,525,148号）を本発明に従って ＴＲＡＰと共に処方することができる。 本発明デバイスには、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）がヒドロキ シアパタイト基質に吸着されている少なくとも１つの外部骨アタッチメント表面 を有するプロテーゼデバイスが含まれる。好ましくは、ＴＲＡＰはヒドロキシア パタイト基質の外部に約10ミクロン吸着されており、そしてこの場合には該外層 はＴＲＡＰ吸着前に、比較的吸着性の低分子量ヒドロキシアパタイトでスプレー 被覆することができる。この目的で代表的なプロテーゼデバイスには、人工関節 及び義歯が含まれる。 本発明デバイスには、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）が多孔性ヒ ドロキシアパタイト基質に吸着されている少なくとも１つの骨接触表面を有する 整形外科用アタッチメントデバイスも含まれる。この目的で代表的なアタッチメ ントデバイスには、スクリュー、ステープル、ピン、ボルト及びプレートが含ま れる。例えば、ステンレス鋼プレートの骨と接触する下部表面はヒドロキシアパ タイトでフラズマスプレー被覆されており、そしてその後そこにＴＲＡＰを吸着 させる。 実施例 材料及び方法 腫瘍細胞ならし培地:ＣＥＳＪ、Bc66又はBc-ＴＲＡＰ細胞は、血清不含培地中 で培養した。培養上清液はＣＥＳＪ細胞培地では500倍に、そしてBc66又はBc-Ｔ ＲＡＰ細胞培地では100倍に濃縮した。 骨髄コロニーアッセイ:骨髄細胞は６匹のＣ57Blackマウスから得た。マウスは ワシントン大学の動物自然飼育室に収容し、そして動物の管理と動物実験はこの 施設の指針に従って実施した。骨髄細胞は、20％（ｖ/ｖ）のウシ胎児血清、0.3 ％の寒天又は0.25％のアガロース（アガロースはコロニーをｍＲＮＡ単離用に採 集する実験で使用した）及び種々の濃度の試験試料を含有する培養培地１ml当た り10⁵個の細胞で培養した。細胞培養物は５％ＣＯ₂を有する湿潤化した雰囲気中 37℃で14日間インキュベートし、そして（7）に記載されたようにして固定した 後にＴＲＡＰ活性に関して染色した。染色したスライドを顕微鏡下で、（7）で 以前に定義されたようにＴＲＡＰ陽性の単一細胞、クラスター（＞８個の細胞、 ＜50個の細胞）又はコロニー（＞50個の細胞）で評価した。 骨髄前駆細胞の豊富化:セファデックスＧ10カラムに通してマウスの全骨髄細 胞から付着細胞を除去し、そしてパーコール密度勾配法を使用して低密度細胞を 選択した。特定の系譜マーカーを発現する細胞は、ヤギ抗ラットIgGと抱合した 磁気ビーズを使用してＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec）上でマウスＢ細胞（Ｂ220） 、顆粒球（Gr-１）、マクロファージ（Mac-１）及び赤血球（ＹＷ25.12.7）に特 異的なモノクローナル抗体で除去し、そして上記系譜マーカーに陰性（Lin-）の 細胞を単離タンパク質の標的細胞集団として使用した。コロニー形成造血前駆体 と破骨細胞前駆体はLin-細胞集団に富んでいることが示されている（Muguruma及 びLee、Blood、91:1272〜1279:1998年）。 予備的観察 ＣＦ乳癌を有しているマウスの骨は破骨細胞数の顕著な増加を示し、過剰の骨 吸収の徴候を有している（5）。この腫瘍のクローン化した細胞系（ＣＥＳＪ） の血清不含培養上清液は、半固形培地中で培養したマウス骨髄細胞中で強度のＴ ＲＡＰ活性を示す細胞コロニーを誘導する特有の能力を有していた。この活性は 、骨髄から単離したクローン原性前駆細胞もＣＥＳＪ培地に応答しそしてＴＲＡ Ｐ陽性コロニーを形成したので、補助細胞によって介在されるか又は補助細胞と 共同してというよりは、むしろ前駆体に直接影響を与えた（8）。更に、ＣＥＳ Ｊ培地によって単離した前駆体から誘導されたＴＲＡＰ陽性コロニーは、破骨細 胞マ ーカー:ビトロネクチンレセプターα_vβ3、ρρ^c-src及びカルシトニンレセプタ ーを発現し、そして適当な培養条件下で更に培養している間に吸収ピットを形成 した（8）。 対照的に、もう１つの乳癌細胞系Bc66（6、7）の培養上清液は、マクロファー ジコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）を含有しているにも拘わらず、上記の破骨細 胞誘導活性を有していなかったので、親腫瘍はマウスでは骨溶解性ではなかった 。更に、同様なアッセイ条件下でマクロファージコロニーを誘導するために組換 えマウスＭ-ＣＳＦを使用するとき、コロニーは1,25(ＯＨ)₂Ｄ₃（10^-8Ｍ）及び ヒドロコルチゾン（10⁵Ｍ）の存在下であってもＴＲＡＰ染色に対して常に陰性 であった（データは示されていない）。 以前の研究で、１つの活性成分がＣＥＳＪ培地から精製され、そして破骨細胞 コロニー刺激因子（Ｏ-ＣＳＦ）であることが示された（6）。ＣＥＳＪ培地の破 骨細胞刺激活性を更に分析している間に、この培地中には、培養中の骨髄細胞か らＴＲＡＰ陽性細胞が分化するように誘導するもう１つの強力な因子が存在する ことが明らかになった。 破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）の単離 ＣＦＳＪクローン培養物（8）から得られる血清不含ならし培地100Ｌ以上を使 用して、上記因子を単離しそして特徴を決定した。ＣＥＳＪ細胞のならし培地は 、ヘパリン-セファロース、ヒドロキシアパタイト及びモレキュラーシーブＨＰ ＬＣ（Toso Haas TSKゲル、G3000 SW）による逐次的なカラムクロマトグラフィ ーで分画した、破骨細胞誘導性活性は、マウス骨髄細胞を半固形寒天中で14日間 培養するアッセイ（6、7）によってモニターした。破骨細胞前駆体から誘導され るコロニー、クラスター又は単一細胞は、ＴＲＡＰ活性に関する染色で明赤色出 現により検出された、 図１は、ヘパリン-セファロースカラムクロマトグラフィーによる初期培地の タンパク質精製の結果を示す。エコノ-パク（Econo-Pac）カラム（Bio-Rad;1.5 ×4cm）に充填したヘパリンセファロースＣＬ-6Ｂ（Pharmacia Biotech）は、0. 1Ｍ NaClを含有する20ｍＭのトリス-HCl、ｐＨ7.2で平衡化させた。100倍に濃 縮したＣＥＳＪ培地の各40ml分画を上記緩衝液中に平衡化させ、そして各操作用 にカラムに適用した。280nmでのＵＶ吸光度で概算したとき、約95％の総タンパ ク質がカラムを通過した。カラムを同じ緩衝液で一夜洗浄した後、カラムに結合 したタンパク質を20ｍＭトリス-HCl（ｐＨ7.2）中0.1〜0.7Ｍの直線的NaCl勾配 で22℃、0.7ml／分の流速度で溶出した。集めた各フラクションの一部は、20ｍ Ｍのトリス-HCl緩衝液（ｐＨ7.2）中に再度平衡化させそしてろ過（0.22μＭ、M illipore）した後に、骨髄培養アッセイでＯＤＦ活性について試験した。 図１は、ヘパリンカラムクロマトグラフィーによって、ＯＤＦ活性が約0.47Ｍ のNaClで溶出した結合フラクション中に一定して回収されたことを示している。 対照的に、Ｍ-ＣＳＦと顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）は共にＣＥＳＪ培地中に存 在しており（9）、ヘパリンと結合しなかった。以前に記載されたＯ-ＣＳＦ活性 （6）も結合しなかった。ヘパリン結合ＯＤＦ活性は、骨髄培養アッセイでＴＲ ＡＰ陽性である単一細胞又は４〜８個の細胞からなるクラスターを強く誘導した が、50個より多くの細胞からなるＴＲＡＰ陽性コロニーが全ＣＥＳＪ培地で誘導 されることはかなり稀であった。ヘパリン結合活性フラクションと非結合プール を組み合わせると、ＣＥＳＪ培地の元々のＴＲＡＰ陽性コロニー刺激活性を回復 した。 ヘパリンカラムから得られるＯＤＦ活性はヒドロキシアパタイトカラムに結合 され、そして約170ｍＭのホスフェートで溶出された(図２)：ヘパリン-セファロ ースから得られたＯＤＦ活性を含有するフラクションを集め、セントリコン（Ce ntricon）膜から10ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0に遠心ろ過して濃縮平衡化 させ、そしてヒドロキシアパタイトカラム（Econo-Pac、CHT-11 Cartridge、Bio -Rad）に適用した、このカラムを10ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ7.0で洗浄し た。結合したタンパク質を10〜300ｍＭの直線的リン酸ナトリウム勾配（ｐＨ7.0 ）で溶出した，各フラクションの一部分をＯＤＦ活性についてアッセイし、そし て14％のＳＤＳ-ＰＡＧＥでタンパク質について分析した。約170ｍＭのホスフェ ートで溶出したフラクション中の物質は、骨髄培養アッセイでＴＲＡＰ陽性単核 細胞を誘導したが、組換えマウスＭ-ＣＳＦと組み合わせたとき、ＴＲＡＰ陽性 コロニー形成を誘導した。 幾つかのヒドロキシアパタイトカラムの操作から得られた活性フラクションを 組み合わせ、そして30％（ｖ/ｖ）のアセトニトリルを含有する0.1Ｍリン酸緩衝 液（ｐＨ6.8）中のサイズ排除カラムＨＰＬＣ（ＳＥＣ-ＨＰＬＣ）に流した（図 ３）。ＳＤＳ-ＰＡＧＦで、ＯＤＦ活性は35ｋＤａのタンパク質の溶出位置と一 致しているように見えた。 詳細には、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーから得られる活性 フラクションを集め、セントリコン限外ろ過で濃縮し、30％（ｖ/ｖ）アセトニ トリルに調整し、そして試料は、30％（ｖ/ｖ）のアセトニトリルを含有する0.1 Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ6.8で平衡化させたサイズ排除ＨＰＬＣ（連 続した7.5mm×60cmの２つのToso-Haas G3000SW）で分画した。溶出液は220nmで のタンパク質吸光度についてモニターした。フラクション（0.5ml）は、0.02％ （ｗ/ｖ）ＣＨＡＰＳ（Calbiochem）を含有している管に集めた。10フラクショ ン毎に集めた試料は、ＴＲＡＰ陽性細胞刺激活性について試験した。 破骨細胞分化因子の同定 ＳＥＣ-ＨＰＬＣで同様に溶出したヒドロキシアパタイトプールの別の分画か ら得られた生物学的活性領域に対応するフラクションを集めて、アミノ末端配列 分析（フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体のオンラインHPLC分析を備えた Porton 2090E）用に乾燥した。24〜32mlの溶出量間のフラクション中で明らかな 唯一のＮ末端配列は、マウスＴＲＡＰのＮ末端に相当するＡＰＴＰＴＬＲＦＶＡ Ｖからそのシグナルペプチドを差し引いたものであった（23）。この領域のカラ ム溶出液と、これも生物学的活性が検出されたそれ以前のフラクション中では、 35ｋＤａのタンパク質バンドが明らかであった。大きさと配列はＴＲＡＰタンパ ク質（バンド５ ＴＲＡＰイソ酵素；ＥＣ3.1.3.2）と一致していた。他の遺伝子 との他の適合性又は近似する相同性は、ゲノム又はタンパク質データベース検索 では見出されなかった。 それ故、ＴＲＡＰ活性は96ウェルのマイクロタイタープレート中で測定した。 酒石酸塩の存在下で基質としてｐ-ニトロフェノールホスフェートを使用するＴ ＲＡＰ酵素活性のアッセイによって、種々のカラムフラクション中及び元のＣＥ ＳＪ培養培地中に活性酵素の存在が確認された。100μl試料（20μlのカラムフ ラク ション＋80μlのＨ₂Ｏ）を100μlの0.2Ｍ酢酸ナトリウム、40ｍＭの酒石酸ナト リウム、16ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、５ｍＭのジチオスレイトー ル、ｐＨ5.7に加えた。37℃で１時間インキュベートした後、20μlの0.5Ｍ NaOH を加え、そして405nmで吸光度を測定した。ＳＥＣ-ＨＰＬＣの操作から得られた カラムフラクションを、銀で染色してＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した。対照的に、B c66培地は酵素活性を示さなかった。この活性はＴＲＡＰの既知のインヒビター 、モリブデン酸塩で阻害されることが示された。 確認実験 ＴＲＡＰがＯＤＦ活性に寄与していることを確認するために、組換え酵素を２ 種の細胞系、Bc66及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させ た、Bc66細胞はレトロウイルスベクターによって形質導入されて、ラットＴＲＡ Ｐ（10）を発現した。形質導入された細胞（ＢｃＴＲＡＰ）のならし培地は豊富 なＴＲＡＰ酵素活性を示し、そしてＴＲＡＰ陽性コロニーを強く刺激した。対照 的に、対照Bc66細胞の培地は、ＴＲＡＰ陰性コロニーしか刺激しなかった。Bc66 細胞はＭ-ＣＳＦを産生することが知られている。それ故、Ｍ-ＣＳＦを産生しな いＣＨＯ細胞は、ラットＴＲＡＰ遺伝子（11）を含有するベクターでトランスフ ェクションさせた。トランスフェクションされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ-ＴＲＡＰ ）のならし培地はＴＲＡＰ陽性コロニーを刺激し、一方対照ＣＨＯ細胞培地はＴ ＲＡＰ誘導性又はコロニー刺激性能力を何も示さなかった。Ｍ-ＣＳＦ単独では ＴＲＡＰ陰性コロニーしか刺激しなかったが、Ｍ-ＣＳＦとＴＲＡＰは一緒にな って大きなＴＲＡＰ陽性コロニーを刺激し、細胞増殖におけるＴＲＡＰとＭ-Ｃ ＳＦの相乗効果を示唆した。この発見によって、ＴＲＡＰとＭ-ＣＳＦの両者が 一緒になって作用して、この系譜をＴＲＡＰ誘導性分化及びＭ-ＣＳＦ増殖を有 する破骨細胞に誘導し得ることが示唆される。 外来性ＴＲＡＰが骨髄培養物中の細胞の観察されたＴＲＡＰ陽性染色に直接寄 与している可能性を排除するために、ＴＲＡＰ ｍＲＮＡ発現を評価した。系譜 マーカー陰性（Lin-）であること、及び破骨細胞前駆体に富んでいることが示さ れていることに基づいて選択した、マウス骨髄細胞フラクション（8）を使用し た。 単離したLin-細胞は、ＣＨＯ-ＴＲＡＰ又はＣＨＯ対照細胞から得られる濃縮な らし培地の存在下、半固形培地中で培養した。７日目及び14日目に単離したｍＲ ＮＡは、ＴＲＡＰ陽性コロニー中で内在性ＴＲＡＰの発現を示した。 骨髄前駆体アッセイにＴＲＡＰを添加する時期は、種々の培養日数で精製ＴＲ ＡＰをLin-細胞及びＭ-ＣＳＦ含有寒天培地に上積みし、そして上積み14日後に 形成されたコロニーを評価して試験した。ＴＲＡＰ陽性コロニーの形成は、精製 ＴＲＡＰを培養の最初の48時間中に添加したときにだけ観察された。培養物中で の以後のＴＲＡＰ添加では、マクロファージコロニーの増殖がもたらされた。一 緒にして考えると、これらの実験データは、破骨細胞分化におけるＴＲＡＰの重 要な役割を強く示唆している。この酵素は単球−マクロファージ経路の未成熟前 駆体に対して作用し、そしてこれらがマクロファージに拘束される前に破骨細胞 分化を誘導するように思われる。 形質導入したBcTRAP細胞とBc66細胞をBalb/ｃヌードマウス中に皮下移植して 、ＴＲＡＰ産生腫瘍のインビボ効果も評価した。種々の組織の顕微鏡検査によっ て、骨だけに顕著な変化が明らかにされた。腫瘍を有するマウスから得られる骨 の形態学分析によって、正常なBc66細胞を移植したマウスと比較したとき、BcTR APを移植したマウスでは、破骨細胞活性の上昇と長骨皮質壁の浅薄化が明らかに された。これらの結果は本質的に、ＣＥ腫瘍を有するマウスによる最初の知見を 再現した。それ故、ＴＲＡＰはＣＥ乳癌細胞の特有の破骨細胞誘導特性に寄与す る重要な因子であるように思われる。 インビボでのインプラント有効性の確認 マウス又はヒトＴＲＡＰは、組換え手段によって例えば組換えバクロウイルス ベクター構築物（Hayman，A.R.及びCox，T.M.（1994年）、J．Biol．Chem．269: 1294〜1300;Ek-Rylander，B.等（1997年）Biochem．J．321:305〜311）から、Sf 9昆虫細胞中で発現することができる。１分子当たり２個の鉄原子を含有する酵 素的に活性のＴＲＡＰは、培養培地からmg/Lの量で精製することができる。ホス ファターゼと酸素ラジカルを産生する活性は共に、それぞれｐ-ニトロフェニル ホスフェートの開裂又はルミノールの過酸化水素処理と化学ルミネセンス放出に よ って証明することができる。 ＴＲＡＰ（組換え体又はＣＥＳＪならし培地のような天然源から製造されたも の）がインプラント表面に対して破骨細胞補充を促進する能力は、インビボの動 物で評価することができる。１つの方法では、酵素的に活性であることが示され ている精製ＴＲＡＰ調製物を、低いイオン強度の中性緩衝液に溶解する。ヒドロ キシアパタイトの固相調製物（又は他のカルシウム塩固相、例えば生物学的に不 活性の膜若しくは独立ブロック上に被覆された薄層）をＴＲＡＰ溶液に浸漬して 、ヒドロキシアパタイトの表面層にＴＲＡＰ分子を結合又は吸着させる。ＴＲＡ Ｐ活性用の切片を切断しそしてアゾ色素又は鉛塩法（Yamamoto，T.及びNagai，H .（1992年）J．Bone Miner．Res．7:1267〜1273）を使用して組織化学的に染色 することによって、ＴＲＡＰの特定の厚さを吸着するのに必要な時間の長さと活 性を制御することができる。先行の組織学的技術に従ってＴＲＡＰ用基質を使用 して、調製物全体を染色することができる。次いで、適切にＴＲＡＰで被覆した ヒドロキシアパタイト調製物を、実験動物に皮下的にか又は筋肉内的に外科的に 移植する。１つの例では、マウスＴＲＡＰを実験動物としてのマウスで使用する 。ヒドロキシアパタイトビークル（ＴＲＡＰを欠いているヒドロキシアパタイト 被覆膜又は固形ブロック）は、対照として使用するために、同じ動物の近接して いるが別個の部位に移植する。循環中の破骨細胞前駆体数を増加させるために、 実験動物は、骨髄から血流への幹細胞移動を高める因子、例えばＧ-ＣＳＦでプ ライミングすることができる（Purton，L.E.等、Blood 87.1802〜1808、1996年; Matayoshi，A.等、Proc Natl Acad Sci USA 93:10785〜10790、1996年）。 或いは、ミネラル化した骨又は象牙質粒子若しくはスライスをＴＲＡＰで被覆 し、そして比較用対照として非被覆材料を再度使用して、同様に移植することが できる。 ７〜14日後、動物を屠殺しそして回収したインプラントは、確立された方法を 使用して破骨細胞付着について組織学的に試験する。このようにして、ＴＲＡＰ 被覆ヒドロキシアパタイト表面の破骨細胞補充活性を証明することができる。こ の方法の変法では、固形ヒドロキシアパタイト表面の別個の領域をＴＲＡＰで選 択的に処理することができ、そして動物から回収した後に、組織学的試験によっ て、破骨細胞のＴＲＡＰ被覆表面への優先的誘引を確認することができる。 骨に設置される関節代替物又は歯科用プロテーゼデバイスに使用される金属（ 又はセラミック若しくは他の組立て物）インプラント表面内又は上への骨の同化 を促進するＴＲＡＰの能力も、動物で研究することができる。ヒドロキシアパタ イト被覆チタン合金（棒、フレート又は他の適当な大きさの組立て物）の調製物 をＴＲＡＰで被覆し、そして実験動物の骨表面内又は上に移植する。ここで、こ の目的は、金属インプラントの平らな表面に対する又は多孔性表面内への骨床の 骨同化の、より長期間の評価である。平滑表面と多孔性被覆表面の両方のデザイ ンが金属プロテーゼ、例えば総腰代替物で使用される大腿骨幹コンポーネント中 で使用される。骨の内方成長用の代表的な多孔性金属コーティングには、コバル トクロム粉末又はビーズ（Porocoat表面、DePuy;PCA、Howmedica）及びチタンワ イヤーメッシュの拡散結合物（Zimmer）が含まれる。このような多孔性金属表面 は好ましくは、ＴＲＡＰで被覆する前に、先ずプラズマスプレー技術によってヒ ドロキシアパタイトで被覆する。骨の同化は、放射線透過性を、そしてそれ故金 属と骨の間の間隙の程度を評価するために、Ｘ線画像化によって、そしてインプ ラントの回収、切断及び金属／骨界面の顕微鏡検査によって、手術後１〜12カ月 の間隔で個々の動物で判断する。このような方法は、通常インプラント製造者が フロテーゼデザインの新しい材料、組立て物及び他の態様を評価するために使用 される。このようにして、骨の同化を促進するＴＲＡＰ被覆表面の利点が確立さ れ、そしてコーティングプロトコールが種々の臨床的適用に最適化される。 骨の付着を促進するために、ミネラル相基質内にＴＲＡＰと共に他の生物学的 材料を含め得ることが更に意図されている。この目的で代表的な生物学的材料に はサイトカイン又は他のシグナル形成分子及びコラーゲンが含まれ、その際後者 は新しい骨マトリックスと、移植した組成物又はデバイスとの機械的な結合を高 める。 本発明は好ましい実施態様に関連して記載したが、通常の技側を有する者は上 記の明細書を読んだ後に、本明細書で述べた本発明に対する種々の変更、均等物 による置換及び改変を行い得るであろう。それ故、本発明は本明細書に特定的に 記載した方法以外の方法で実施することができる。それ故、本願に基づく特許で 認められる保護は、下記請求の範囲及びその均等物によってだけ制限されるよう に意図されている。 本特許出願で引用した先行刊行物及び特許の開示は全て本明細書で参照して組 み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ワイス，メリー アン イー. アメリカ合衆国，98208 ワシントン州, エバレット，1019―109 ストリート サ ウスイースト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．多孔性ヒドロキシアパタイト基質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファタ ーゼ（ＴＲＡＰ）を含有する医療用移植に適する組成物。 ２．請求項１に記載の骨移植片組成物。 ３．上記ヒドロキシアパタイト基質が自己由来骨、死体同種移植片骨及びコラ リンヒドロキシアパタイトのなかから選択されたものである請求項２に記載の骨 移植片組成物。 ４．上記ＴＲＡＰが多孔性ヒドロキシアパタイト基質全体に吸着されている請 求項２に記載の骨移植片組成物。 ５．上記ＴＲＡＰが多孔性ヒドロキシアパタイト基質の外部表面だけに吸着さ れている請求項２に記載の骨移植片組成物。 ６．硬化性アクリルポリマー中に混合された微粒子ヒドロキシアパタイト基質 に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を含有する請求項１に 記載の骨セメント組成物。 ７．ヒドロキシアパタイト基質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ ＴＲＡＰ）を含有する外部骨アタッチメント表面を有するプロテーゼデバイス。 ８．上記ＴＲＡＰがヒドロキシアパタイト基質の外部に概ね10ミクロン吸着さ れている請求項７に記載のプロテーゼデバイス。 ９．人工関節及び義歯のなかから選択されたものである請求項７に記載のプロ テーゼデバイス。 １０．多孔性ヒドロキシアパタイト基質に吸着された酒石酸抵抗性酸ホスファ ターゼ（ＴＲＡＰ）を含有する骨接触表面を有する整形外科用アタッチメントデ バイス １１．スクリュー、ステープル、ピン、ボルト及びプレートのなかから選択さ れたものである請求項１０に記載の整形外科用アタッチメントデバイス。