JP2001518806A - 代替的にターゲッティングされるアデノウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、それぞれがアデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且つそれぞれが三量体化ドメインを有する３つの単量体を含む三量体を提供する。該三量体は、天然のアデノウイルスファイバー蛋白質よりも天然の基質に対するアフィニティーが低下している。さらに本発明は、本発明の三量体を一部として包含するアデノウイルスを提供する。本発明はまた、それに対するリガンドを有するアデノウイルスに結合する非天然の細胞表面受容体を発現する細胞株、並びに該細胞株を用いたアデノウイルスの繁殖方法を提供する。本発明はまた、アデノウイルス含有組成物からある基質に対するリガンドを有するアデノウイルスを精製する方法を提供する。該方法は、リガンドが基質に選択的に結合するのを促進する条件下で、該基質に該組成物を曝露することを含む。続いて、基質に結合していない組成物を該基質から分離した後、結合したアデノウイルスを該基質から溶出させる。さらに本発明は、血液またはリンパ液由来の基質を認識するリガンドを有するアデノウイルスを、該基質に該ウイルスを曝露することによって不活化する方法を提供する。血液またはリンパ液中で該リガンドはその基質に結合し、それによって血液またはリンパ液から遊離のウイルスを吸着する。さらに本発明は、アデノウイルスファイバーに対する基質を含むキメラブロッキング蛋白質、並びに、溶液中でアデノウイルスをこのようなキメラブロッキング蛋白質とともにインキュベートして該キメラブロッキング蛋白質をファイバーに結合させることにより、アデノウイルス受容体が結合するのを妨害する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 代替的にターゲッティングされるアデノウイルス 発明の技術分野 本発明は代替的にターゲッティングされるアデノウイルスに関し、そのような ウイルスの製造および精製方法、並びに代替的なターゲッティングを仲介する蛋 白質の改変を包含する。 発明の背景 アデノウイルス感染は標的細胞へのビリオンの接着から始まる。アデノウイル スは、標的細胞が該ウイルスに感染するためにはその両方が存在しなければなら ない、２つの細胞表面蛋白質に接着する(Wickhamら，Cell，73，309-19(1993)) 。野生型アデノウイルスはまず、細胞のアデノウイルス受容体（ＡＲ）によって 細胞表面に結合する。このようなＡＲの１つは最近同定されたコクサッキーウイ ルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）であり(Bergelsonら，Science，275 ，1320-23(1997);Tanakoら，Proc．Nat．Acad．Sci.，U.S.A.，94，3352-56(199 7))、ＭＨＣクラスＩ受容体もまたＡＲである(Hongら，EMBO J.，16(9)，2294-0 6(1997))。ＡＲに接着した後、ウイルスは、細胞外マトリックスとの相互作用を 仲介し、細胞シグナル伝達に重要な役割を果たすヘテロ二量体の細胞表面受容体 ファミリーであるα_Vインテグリンに接着する(Hynes，Cell，69，11-25(1992)) 。 細胞表面に接着した後、感染は受容体が介在するウイルスのエンドサイトーシ ス小胞へのインターナリゼーションによって進行する(Svenssonら，J．Virol.， 51，687-94(1984);Chardonnetら，Virology，40，462-77(1970))。細胞内でビリ オンはばらばらになり(Greberら，Cell，75，477-86(1993))、エンドソームが壊 れて(Fitzgeraldら，Cell，32，607-17(1983))、ウイルス粒子が核孔複合体を経 て核に輸送される(Dalesら，Virology，56，465-83(1973))。 アデノウイルスビリオンは、エンベロープのない直径約６５〜８０ｎｍの正二 十面体である(Horneら，J．Mol．Biol.，1，84-86(1959))。アデノウイルスキャ プシドは、２５２のキャプソメア--２４０のヘキソンと１２のペントンを含む(G insbergら，Virology，28，782-83(1966))。ヘキソンおよびペントンは３つのウ イルス蛋白質に由来する(Maizelら，Virology，36，115-25(1968);Weberら，Vir ology，76，709-24(1977))。ヘキソンは、それぞれ９６７アミノ酸の３つの同一 の蛋白質、すなわちポリペプチドIIを含む(Robertsら，Science，232，1148-51( 1986))。ペントンは、キャプシドに結合したベースと、ペントンベースと非共有 結合しそこから突出するファイバーを含む。プロテインIX、VIおよびIIIａもま たアデノウイルスのコート中に存在し、ウイルスキャプシドを安定化させると考 えられている(Stewartら，Cell，67，145-54(1991);Stewartら，EMBO J.，12(7) ，2589-99(1993))。 ペントンベースはアデノウイルスの血清型間で高度に保存されており、（腸ア デノウイルスであるＡｄ４０を除いて）５つのＲＧＤトリペプチドモチーフを有 している(Neumannら，Gene，69，153-57(1988))。アデノウイルスにおいて、Ｒ ＧＤトリペプチドは、アデノウイルスのａ_Vインテグリンへの結合とビリオンの エンドサイトーシスを仲介しているらしい(Wickhamら(1993)，上述;Baiら，J．V irol.，67，5198-3205(1993))。 アデノウイルスファイバーは、アデノウイルスポリペプチドIVのホモ三量体で ある(Devauxら，J．Molec．Biol.，215，567-88(1990))。構造的には、ファイバ ーは３つの分離したドメインを有する。アミノ末端のテールドメインはペントン ベースに非共有的に接着する。βシートを形成する数が可変の反復する１５アミ ノ酸残基を含む比較的長いシャフトドメインは、ウイルス粒子の頂点から外側に 伸びている(Yehら，Virus Res.，33，179-98(1991))。最後に、カルボキシ末端 のおよそ２００アミノ酸残基がノブドメインを形成する。機能的には、ノブは細 胞のＡＲへのウイルスの最初の結合とファイバーの三量体化を仲介する (Henryら，J．Virol.，68(8)，5239-46(1994))。したがって、ファイバーの三量 体化ドメインは、そのアデノウイルス血清型の天然の細胞表面受容体に対するリ ガンドである。三量体化ドメインはまた、ファイバーのテールがペントンベース と正しく結びつくのにも必要であるらしい(Novelliら，Virology，185，365-76( 1991))。細胞のＡＲを認識し、ペントンベースに結合するのに加えて、ファイバ ー蛋白質は血清型の完全性に寄与し、核局在化を仲介する。 異なるアデノウイルス血清型由来のファイバー蛋白質はかなり相違する。例え ば、１５アミノ酸βシート反復の数はアデノウイルス血清型間で異なる(Greenら ，EMBO J.，2，1357-65(1983))。さらに、密接に関連したＡｄ２とＡｄ５血清型 由来のノブ領域は、アミノ酸レベルで６３％しか類似しておらず(Chroboczekら ，Virology，186，280-85(1992))、Ａｄ２とＡｄ３のファイバーノブは２０％が 同一であるにすぎない(Signasら，J．Virol.，53，672-78(1985))。対照的に、 ペントンベース配列は９９％同一である。ノブ領域におけるこのような違いにも 関わらず、Ａｄ２とＡｄ３のファイバー遺伝子ですら、配列比較によりはっきり と区別される保存領域が明らかとなり、そのほとんどが他のヒトアデノウイルス ファイバー遺伝子間でも保存されている。 多くの要素が、種々の遺伝子導入応用（例えば、細胞蛋白質の生産、治療、学 術研究など）における使用にアデノウイルスをベクターとして選択することを魅 力的なことにしている。例えば、アデノウイルスは優れた発現ベクターである。 組換えウイルスを高力価（例えば、約１０¹³ウイルス粒子／ｍｌ）で生産するこ とができ、また、アデノウイルスベクターは、(レトロウイルスベクターとは対 照的に)複製しない細胞にも複製する細胞にも遺伝的材料を導入することができ る。アデノウイルスゲノムは大量の外因性ＤＮＡ（約７．５ｋｂまで）を担持す るよう操作することができ、アデノウイルスキャプシドはいっそう長い配列を導 入する力を増し得る(Curielら，Hum．Gene Ther.，3，147-54(1992))。さらに、 いくつかの特徴が、アデノウイルスが遺伝子導入に安全な選択であり、治療応用 に 特別に関心を引く代表的なものであることを示唆している。例えば、アデノウイ ルスは宿主細胞の染色体中にインテグレートせず、したがって、アデノウイルス ベクターが通常の細胞機能を妨げる可能性は最小限である。さらに、アデノウイ ルス感染はヒトへの悪影響と関係がなく、また、アデノウイルスゲノムの組換え は稀である。これらの利点により、臨床医はアデノウイルスベクターをヒトのワ クチンとして、また遺伝子治療に、多年にわたって安全に使用している。 アデノウイルスベクターの人気に基づいて、アデノウイルスがある特定の細胞 、例えばアデノウイルスに感染しない少数の細胞に、侵入する能力を増大させる ための努力、すなわち「ターゲッティング」と呼ばれるアプローチがなされてき た(例えば、国際特許出願WO 95/26412(Curielら)，国際特許出願WO 94/10323(Sp oonerら)，合衆国特許第5,543,328号(McClellandら)，国際特許出願WO 94/24299 （Cottenら）を参照)。もちろん、アデノウイルスを特定の細胞種にターゲッテ ィングする能力は重要な目標であるが、所望の細胞種のみが感染するアデノウイ ルス、すなわち「排他的ターゲッティング」と呼ばれるアプローチがはるかに望 ましい。しかしながら、ウイルスを排他的にターゲッティングするには、天然の アデノウイルス標的細胞の完全なセットに生産的に感染ることができない組換え アデノウイルスを製造して、宿主細胞のＡＲに対するウイルス生来のアフィニテ ィーをまず排除しなければならない。天然のアデノウイルスの細胞アフィニティ ーを排除することを狙った努力は、必然的にファイバーノブを変化させることに 焦点を当ててきた。これらの努力は、主として安定な三量体化およびペントンベ ースとの結合という重要なファイバー蛋白質の機能を保存できないせいで、期待 を裏切っている(Spoonerら，上述)。さらに、ファイバーノブを細胞表面リガン ドで置換すると(McClellandら，上述)、そのリガンドを有する細胞種に感染する のにのみ適切なウイルスが生じる。このような戦略では、野生型アデノウイルス （それにおいては、ファイバーの三量体化および細胞指向性が同じ蛋白質ドメイ ンによって仲介される）に付随するのと同じターゲッティングの問題の多 くを有するウイルスが生じ、したがって、ベクターのフレキシビリティーが低減 する。さらに、宿主細胞を有する必要があることと、ファイバーの三量体化機能 とターゲッティング機能との間の絶対不可分な関係のせいで、ターゲッティング が置換された変異ウイルスを得ることは困難である。例えば、ファイバーノブを 除去してそれを三量体化しないリガンド（例えば、McClellandら，上述）で置き 換えると、結果として検知できるファイバー蛋白質を欠いたウイルスが生じる。 このように、現在、天然のＡＲに対するアフィニティーは低下しているが、ファ イバーの三量体化およびペントンベースとの結合機能を保持したアデノウイルス ファイバーが必要とされている。 排他的アデノウイルスターゲッティングは天然の細胞指向性を低減させること を必要とするが、天然のターゲッティングを排除すると、ウイルスがその繁殖の ために通常使用される細胞株（例えば、２９３細胞）を感染させる能力もまた低 下する(Curielら，上述，を参照)。この障壁を乗り越えようとした１つの発表さ れた試みでは、適切な細胞表面結合部位を発現する細胞株を偶然使用したため(M cClellandら，上述)、この中心的な関心事は取り扱われなかった。しかしながら 、多くの細胞株は重要な細胞受容体を発現していない。さらに、潜在的に有用な 細胞表面結合部位を発現する多くの入手可能な細胞株は、組換えアデノウイルス 、特に臨床応用に有用なウイルスの産生に適当ではない(例えば、ゲノムのＥ１ 、Ｅ２および／またはＥ４領域由来の必須のアデノウイルス前初期遺伝子を担持 し発現する細胞株)。したがって、天然のＡＲを介して細胞に生産的に感染する ことが実質的にできない組換えアデノウイルスを繁殖しパッケージングすること ができる細胞株、並びにそのような細胞株の製造方法が必要とされている。 パッケージング細胞ライセートからウイルスベクターを精製する通常の方法は 、ウイルスを１回または２回以上ＣｓＣｌ₂勾配により遠心分離することを含む 。このような方法はウイルスを適切に単離するが、それらは一般にかなりの材料 (ＣｓＣｌ₂)を必要とし、それ故、比較的非効率である。さらに、このようなプ ロト コールは高処理量の応用が容易にはできず、商業規模でのウイルスベクターの経 済的な開発にとって重大な障害を呈示している。カラム精製を含む他の方法はウ イルスを特異的に結合せず(Shabramら，Hum．Gene Ther.，8，453(1997);Huyghe ら，Hum．Gene Ther.，6，1403(1995))、しばしば、他の材料のアフィニティー 精製において得られ得る純度に比べて許容されない量の夾雑物を結果として生じ る。したがって、組換えウイルスベクターを精製および単離する効率的な方法が 必要とされる。 ウイルスベクターのインビボ（in vivo）送達を含む多くの応用において、目 的の組織への感染（および遺伝子送達）を含むことが望ましい。例えば、生物学 的に活性な遺伝子の全身性の感染および送達のおそれは、遺伝子治療応用への重 大な懸念を表している。さらに、導入遺伝子が正規の場所以外で発現すれば、多 くの実験的応用が台無しになるだろう。理論上、宿主血液細胞はアデノウイルス のような外来物質を一掃するのを仲介する蛋白質を発現することができるが(New s and Comment，Science，275，744-45(1997))、このような細胞を工作して該宿 主内でそのような蛋白質を産生させることは、困難であり且つ立ち入ったことで ある。さらに、アデノウイルスヘキソンに対して指向性の抗体はウイルスを不活 性化することができるが(Toogoodら，J．Gen．Virol.，73，1429-35(1992))、正 規の場所以外でのウイルス感染を低減または防止すべき時期に、遺伝子を導入さ れるレシピエントに十分な量の抗ヘキソン抗血清を送達するのに効率のよいプロ トコールは未だに現れておらず、また、このような戦略は、実際には所望の組織 における感染をブロックすることによって遺伝子導入プロトコールを妨げ得る。 したがって、宿主動物内で、所望の送達場所を残して組換えウイルスベクターを 不活性化する方法が必要とされる。 発明の簡単な要約 本発明は、それぞれアデノウイルスファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且 つそれぞれ三量体化ドメインを有する３つの単量体を含む三量体を提供する。該 三量体は、天然のアデノウイルスファイバー三量体よりも天然の基質に対するア フィニティーが低下している。さらに本発明は、本発明の三量体を一部として包 含するアデノウイルスを提供する。本発明はまた、それに対するリガンドを有す るアデノウイルスが結合する、非天然の細胞表面受容体を発現する細胞株、並び に該細胞株を用いたアデノウイルスの繁殖方法を提供する。 本発明はまた、ある基質に対するリガンドを有するアデノウイルスを該アデノ ウイルス含有組成物から精製する方法を提供する。基質に選択的に結合する方法 である。続いて、基質に結合していない組成物を基質から分離した後、結合した アデノウイルスを基質から溶出させる。 さらに本発明は、血液またはリンパ液由来の基質を認識するリガンドを有する アデノウイルスを、該基質に該ウイルスを曝露することによって不活性化する方 法を提供する。血液またはリンパ液内で該リガンドはその基質に結合し、それに よって血液またはリンパ液から遊離のウイルスを吸着する。 さらに、本発明は、アデノウイルスファイバーに対する基質を含むキメラブロ ッキング蛋白質、並びに溶液中でアデノウイルスをこのようなキメラブロッキン グ蛋白質とともにインキュベートして該キメラブロッキング蛋白質をファイバー に結合させることによって、アデノウイルス受容体が結合するのを妨害する方法 を提供する。 本発明は、治療等のインビトロ（in vitro）およびインビボでの種々の応用に おいて、例えば、正規の場所以外での感染を最小限にして細胞に治療遺伝子を送 達するためのベクターとして有用である。特に、本発明によれば、遺伝子治療応 用により安全なベクターのより効率的な生産および構築が可能となる。本発明は また、アデノウイルスの接着および細胞感染の研究のための方法および試薬を提 供することにより、研究の道具として、並びに受容体−リガンド相互作用のアッ セイ方法において有用である。同様に、組換えファイバー蛋白質三量体を受容体 −リガンドアッセイに、またインビトロまたはインビボでの接着蛋白質として使 用することができる。さらに、本発明は、生物学者がウイルス増殖および感染の 細胞生物学を調査することを可能とする試薬および方法を提供する。したがって 、本発明のベクターは生物学研究において非常に有用である。 図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、アデノウイルスノブ蛋白質（血清型５）の三次元構造を 示している。図１Ａは、βシートおよび該シートと相互連結するループを表すリ ボン図である。図１Ｂは、アミノ酸残基の相対的サイズを考慮した充填図である 。 図２はアデノウイルス血清型間の配列比較である。 図３Ａ〜３Ｃは、非天然の三量体化ドメインを有する組換えアデノウイルスフ ァイバー三量体を創製するためのベクターを示している。図３Ａは、pAcT5S7GCN TS.PS.LS.Xを示す。図３Ｂは、pAcT5sigDel.TS.PS.LSを示す。図３Ｃは、pAcT5S 7sigDel.TS.PS.LSを示す。 図４は、ファイバー−ｓｉｇＤｅｌ−ＧＦＰキメラをコードする遺伝子を含む ベクター、pAcT5sigDel.GFP.TS.PS.LSを示している。 図５Ａ〜５Ｄは、非天然の三量体化ドメインを有するファイバー三量体を含有 する組換えアデノウイルスベクターの構築に有用なベクターを示している。図５ Ａは、pAS pGS HAAVを示す。図５Ｂは、pAS pGS pK7を示す。図５Ｃは、pAS T5S 7sigDelpGS.HAAVを示す。図５Ｄは、pAST5S7sigDel.GFP.pGS.pK7を示す。 図６Ａ〜６Ｄは、非天然の三量体化ドメインを有するファイバー三量体の構築 において使用されるベクターを表している。図６Ａは、pAcPig4KNを表す。図６ Ｂは、pAcPigKN D363Eを表す。図６Ｃは、pAcPigKN N437Dを示す。図６Ｄは、pA cPig4KN(FLAG)を示す。 図７Ａ〜７Ｂは、１つの非天然三量体化ドメインを有するファイバー三量体を 創製するのに使用されるベクターを表している。図７Ａは、PNS F5F2Kを示す。 図７Ｂは、pNS Pig4.SSを示す。 図８Ａ〜８Ｃは、天然の受容体に結合する能力を欠き、且つ機能的な非天然の リガンドを含む変異ＮＡＤＣ−１ノブを含有するキメラファイバー三量体を有す るアデノウイルスベクターを創製するのに有用なベクターを表している。図８Ａ は、pAcPig4KN D363E N437Dを示す。図８Ｂは、pAcPig4KN D363E N437D HAAVを 示す。図８Ｃは、pNS Pig4 D363E N437D HAAV SSを示す。 図９Ａ〜９Ｂは、天然のアデノウイルス受容体が結合するのを妨害し得る、本 発明のキメラブロッキング蛋白質を創製するのに有用なベクターを表している。 図９Ａは、pACSG2-sCARを示す。図９Ｂは、pACSG2-sCAR-HAAVを示す。 図１０Ａ〜１０Ｂは、天然のアデノウイルス受容体が結合するのを妨害する三 量体を形成し得るキメラブロッキング蛋白質を創製するのに有用なベクターを表 している。図１０Ａは、pAcSG2sCAR.sigDelを示す。図１０Ｂは、pAcSG2-sCARsi gDel(HAAV)を示す。 図１１Ａ〜１１Ｅは、特異的な非天然のリガンドを有するアデノウイルスベク ターの構築を生み出すのに有用なベクターを示している。図１１Ａは、pBSSpGS を示す。図１１Ｂは、pBSS pGS(RKKK)2を示す。図１１Ｃは、pNSF5F2K(RKKK)2を 示す。図１１Ｄは、pBSSpGS(FLAG)を示す。図１１Ｅは、pNSF5F2K(FLAG)を示す 。 図１２Ａ〜１２Ｅは、非天然の細胞表面結合部位基質を発現する細胞株を創製 するのに有用なベクターを表している。図１２Ａは、pHOOK3を示す。図１２Ｂは 、pRC/CMVp-Puroを示す。図１２Ｃは、pScHAHK。図１２Ｄは、pNSE4GLPを示す。 図１３Ａ〜１３Ｄは、ターゲッティングされるアデノウイルス粒子の生産のた めの、ファイバー発現細胞株を創製するのに有用なベクターを表している。図１ ３Ａは、pCR2.1-TOPO+fiberを示す。図１３Ｂは、pKSII Fiberを示す。図１３Ｃ は、pSMTZeo-DBPを示す。図１３Ｄは、pSMTZeo-Fiberを示す。 図１４Ａは、キメラファイバーをコードするゲノムを有するターゲッティング されるアデノウイルス粒子の構築に有用なプラスミド、pAdE1(Z)E3/E4(B)を示し ている。 図１５Ａ〜１５Ｅは、リガンドの結合を妨げる、アデノウイルスノブ内の変異 の位置を図示している。図１５Ａは、３Ｄ９変異の位置を図示する、ノブの上面 図、図１５Ｂは側面図、図１５Ｃは底面図である。図１５Ｄは、ＣＤループ変異 、ＦＧループ変異およびＩＪ変異の位置を図示する、図１５Ｅはノブの側面図、 図１５Ｆは底面図である。 図１６は、短シャフトファイバーおよび、天然の受容体に対するアフィニティ ーが低下している変異ファイバーノブを含む組換えアデノウイルスの構築に有用 なベクターを示している。 図１７Ａ〜１７Ｂは、天然の細胞との結合機能を欠く（しかし、偽受容体にタ ーゲッティングされる）アデノウイルスを複製することができる細胞株を構築す るのに有用なベクターを示している。図１７Ａは、pCANTAB5E(HA)を示す。図１ ７Ｂは、pScFGHAを示す。 発明の詳細な説明 定義 「アデノウイルス」とは、マストアデノウイルス属またはアビアデノウイルス 属の任意のウイルスであり、それらの属内のいかなる血清型のものであってもよ い。アデノウイルス、あるいはペントンベースおよび／またはファイバー蛋白質 等のアデノウイルスコート蛋白質のソースとして使用することができるアデノウ イルスストックは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC,Roc kville,MD）より現在入手可能なアデノウイルス血清型から、あるいは他のいか なるソースからも増幅させることができる。 「リガンド」とは、同定できる基質と選択的に結合する任意の種である。 「天然の(native)」とは、改変されていないウイルスまたは細胞の蛋白質また は性質をいう。したがって、非天然の蛋白質は、ウイルスまたは細胞内のその天 然のホモログとは異なる、改変されたあるいは変異した蛋白質であり得る。ある いは、非天然の蛋白質は、ウイルスまたは細胞内に天然のホモログを有しない蛋 白質であってよい。 「ＡＲ」とは、アデノウイルス受容体をいう。特に、ＡＲはマストアデノウイ ルスのノブと結合するリガンドである。 第一の種は、それが第二の種よりも大きなアフィニティーで基質に結合するな らば、基質に「選択的に結合する」。第一の種は、それが第二の種と同じかあるい はそれよりも小さなアフィニティーで基質に結合するならば、たとえ第一の種が いくらかのアフィニティーを持って結合するとしても、基質に選択的には結合し ない。 三量体 本発明は、それぞれがアデノウイルスファイバー蛋白質由来のアミノ末端を有 し、且つそれぞれが三量体化ドメインを有する３つの単量体（例えば、３つのア デノウイルスファイバー単量体のそれぞれの少なくとも一部）を含む三量体を提 供する。本発明の二量体は、天然のアデノウイルスファイバー三量体と比較して 、抗体、細胞結合部位等のような天然の基質（すなわち、シャフト、特にアミノ 末端が引き出される血清型にとって天然の）に対するアフィニティーが低下して いる。該三量体はホモ三量体であっても、異なるファイバー単量体のヘテロ三量 体であってもよい。得られる三量体の、その天然の細胞表面結合部位（すなわち 、天然のＡＲ）に対するアフィニティーを低下させる、いかなる単量体単位の改 変も本発明の範囲内である。好ましくは、アフィニティーの低下は、対応する非 改変ファイバーに対する実質的なアフィニティーの低下（例えば、少なくとも１ オーダーの倍率、好ましくはそれよりも大きい）である。 記載されるように、三量体化ドメイン自体が天然の細胞表面結合部位に対する リガンドである場合、そのような三量体化ドメインを有する三量体は、天然のア デノウイルスファイバー三量体化ドメインと同じターゲッティングに関する問題 のいくつかを呈示する。したがって、本発明の三量体に包含される単量体の三量 体化ドメインは、ＣＡＲまたはＭＨＣ−１細胞表面ドメイン、あるいはファイバ ーを認識する抗体に対するリガンドでないことが好ましい。最も好ましくは、非 天然の三量体化ドメインは、その部位がＡＲであれ他の細胞表面結合部位であれ 、いかなる天然の哺乳動物細胞表面結合部位に対するリガンドでもない。本明細 書において考察するように、このような三量体を一部として包含するアデノウイ ルスは、それらの天然の宿主細胞を容易に感知できる程度に感染させる能力が低 下しており、選択的にターゲッティングされるベクターを工作するための効率の よいソースベクターとして役立ち得る。したがって、三量体化ドメインは細胞表 面結合部位に対するリガンドでないことが好ましいが、三量体全体はそのような リガンドであってもよい(本明細書において論じられるような非天然のリガンド なので)。さらに、三量体化ドメインは、天然の細胞表面結合部位以外の基質に 対するリガンドであってもよい−なぜなら、そのような三量体化リガンドは、細 胞表面結合部位に対するリガンドである三量体化ドメインが呈示するのと同じ細 胞ターゲッティングに関する懸念を与えないからである。したがって、例えば、 非天然の三量体化ドメインは、アフィニティーカラム上の基質に対するリガンド 、血液由来の分子上の基質に対するリガンドであってよく、あるいは天然の細胞 表面結合部位でなければ細胞表面上（例えば、改変されていない細胞種にとって 天然でない基質細胞表面蛋白質を発現するように工作された細胞上）の基質に対 するリガンドでさえあってよい。 三量体中に包含される単量体は、天然のアデノウイルスファイバー単量体蛋白 質の全部または一部であってよい。例えば、本明細書に記載されるように、改変 された単量体はかなりの数の残基、あるいは同定できるドメインすら欠くことが できる。例えば、単量体は天然のノブドメインを欠くことができ、１または２以 上のβシート反復を欠くことができ、あるいはそうでなければ、先端を切り詰め ることもできる。したがって、単量体は、それが三量体化する限りいかなる所望 の改変を有していてもよい。さらに、単量体は、得られる三量体がペントンベー スと正しく相互作用するのを確実にするために、アミノ末端において容易に感知 できる程度に改変されないことが好ましい(例えば、単量体のアミノ末端は天然 のファイバーアミノ末端から実質的になることが好ましい)。したがって、本発 明はまた、本発明の三量体およびアデノウイルスペントンベースを含むものの組 成物を提供する。該三量体と該ペントンベースは、野生型のファイバーとペント ンベースと同様によく結びついていることが好ましい。もちろん、三量体は改変 されたファイバー単量体を含むが、ペントンベースもまた、例えば合衆国特許第 5,559,099号に記載されるように、例えば非天然のリガンドを包含するように改 変されていてもよい。 変異ノブ 本発明の三量体中に一部として包含させるためのファイバー単量体は、天然の アデノウイルスファイバーよりも小さいアフィニティーで、天然の哺乳動物ＡＲ （すなわち、関心のあるアデノウイルス血清型にとって天然のＡＲ）と結合する 三量体化ドメインを有する。そのような単量体を一部として包含する三量体は、 それらの天然の細胞結合部位に対するリガンドでないことが好ましい。単量体は 、単量体が三量体化し得るようにしつつ天然のＡＲに対するファイバーのアフィ ニティーを低下させるのに適切ないかなる仕方によっても改変することができる 。例えば、一実施態様においては、三量体化ドメインは、天然の受容体に結合す るアミノ酸を欠く改変されたアデノウイルスファイバーノブドメインである。ノ ブと天然の細胞ＡＲとの間の相互作用において介在または補助するいかなる天然 のアミノ酸残基も、単量体から変異または欠失させるのにふさわしいアミノ酸で ある。さらに、凝集物中で単量体が結びついて本発明の三量体を形成する限り、 ノ ブドメインは、いかなる数の、そのような受容体に結合するアミノ酸を欠いても よい。 改変または欠失させる天然のアミノ酸残基は任意の方法により選択することが できる。例えば、異なるアデノウイルス血清型由来の配列を比較して、ＡＲとの 結合を仲介しそうな保存されている残基を推定することができる。その代わりに 、あるいは組み合わせて、(結晶構造のような)蛋白質の三次元画像上に配列をマ ッピングして、ＡＲとの結合に最も責任を担っていそうな残基を推定することが できる。蛋白質の構造的・機能的相互作用を推定するためのいかなる周知のアル ゴリズムまたはプログラムに頼っても、これらの解析を支援することができる。 あるいは、クローニングしたアデノウイルスファイバー発現カセット中にランダ ム変異を導入することができる。蛋白質中にランダム変異を導入する１つの方法 は、Ｔａｑポリメラーゼによるものである。例えば、ファイバーノブをコードす るクローン（例えば、配列番号９；Roelvinkら，J．Virol.，70，7614-21(1996) を参照）は、アデノウイルスファイバーノブまたはその一部をＰＣＲ増幅させる ための鋳型として役立ち得る。ＰＣＲ反応中の二価カチオンの濃度を変動させる ことによって、転写物のエラー率を概ね前もって決定することができる(例えば 、Weissら，J．Virol.，71，4385-94(1997);Zhouら，Nucl．Acid．Res.，19，60 52(1991)を参照)。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型ベクター中にサブクローニングし 直し、ＰＣＲ反応のソースとして使用したファイバーコード配列内の配列を置換 することができる。このようにしてファイバーのライブラリーが作製され、その いくつかは天然のＡＲとの結合を減少させるが三量体化能を保持する変異を持っ ているだろう。 本明細書に記載されるように、１または２以上のアミノ酸を欠く単量体は、失 くなる天然のアミノ酸に加えて、あるいはその代わりに、非天然の残基（例えば 、いくつかの非天然のアミノ酸）を任意に含むことができ、あるいは、もちろん 、天然のアミノ酸を単にノブから欠失させることもできる。好ましくは、アミノ 酸 は、トポロジー、特に三量体化を保存する別の非天然のアミノ酸で置換される。 さらに、もし置換されるのであれば、アミノ酸の置換により単量体に新規な性質 が付与されることが好ましい。例えば、天然のＡＲへの結合を最大限に除去する ために、天然のアミノ酸を異なる電荷を有する残基（または複数の残基）で置換 することができる。そのような置換は、天然のアデノウイルスノブドメインと細 胞ＡＲとの間の静電相互作用を最大限に妨害する。同様に、可能であれば、天然 のアミノ酸をより重い残基（または複数の残基）で置換してもよい。より重い残 基はより長い側鎖を有するので、そのような置換は、天然のアデノウイルスノブ ドメインと細胞ＡＲとの間の立体的相互作用を最大限に妨害する。 非天然の三量体化ドメイン 別の実施態様においては、三量体は、キメラアデノウイルスファイバーポリペ プチドである改変された単量体を包含する。適切なキメラ単量体は、ソースであ るアデノウイルス血清型にとって天然の三量体化ドメインの全部または一部を欠 く。そのような単量体の三量体化ドメインはウイルスから欠失させてもよいし、 あるいは該ドメイン中に非天然のアミノ酸を挿入または置換することによって、 三量体化ドメインを消散させてもよい。もちろん、天然の三量体化ドメインを欠 く単量体はまた、天然のノブ全体を欠くこともできる。天然の三量体化ドメイン は天然のＡＲに対するリガンドであるので、天然の三量体化ドメインを欠くキメ ラアデノウイルスファイバー単量体の三量体は、天然のアデノウイルスファイバ ーよりも小さなアフィニティーでその天然のＡＲに結合する。 キメラ単量体が本発明の三量体を形成するためには、それらが代替の（すなわ ち、非天然の）三量体化ドメインを包含しなければならない。ウイルスのターゲ ッティングを最大限に促進するために、非天然の三量体化ドメインは哺乳動物の 細胞表面受容体およびいかなる細胞表面受容体に対するリガンドでもないことが 好ましい。ホモ三量体を形成し得るいかなるドメインも、本発明の三量体中に包 含されるのにふさわしい三量体化ドメインであり、いくつかは当該技術分野で公 知である。例えば、キメラ単量体は、Ｋ．ラクティスの熱ショック因子（ＨＳＦ ）蛋白質(SorgerおよびNelson，Cell，59，807(1989))、マス軸索ダイニン(Garb erら，EMBO J.，8，1727(1989))、パラインフルエンザウイルス赤血球凝集素蛋 白質(Coelinghら，Virology，162，137(1988))、レオウイルス１型のシグマ１蛋 白質（Strongｔら，Virology，184，12(1991)）または他の適切な三量体由来の 三量体化ドメインを含むことができる。あるいは、キメラ単量体は改変されたロ イシンジッパーモチーフを含むことができる。ロイシンジッパーは二量体化を仲 介する、７個一組のロイシンの反復を含む。しかしながら、１または２以上のロ イシンをイソロイシンで置換すると、ドメインは安定に三量体化する。そのよう な改変されたロイシンジッパーモチーフの例は、３２アミノ酸のGCN4p-II三量体 である(Harburyら，Science，262，1401(1993))。 これらの三量体化ドメインのうち、レオウイルスのシグマ１三量体化ドメイン が好適である。この蛋白質は、前記変異イソロイシンジッパードメインのコイル ドコイル三量体構造を連想させる、７個一組のαヘリックス反復１７本を含む(H arburyら，Nature，371，80-83(1994))。したがって、シグマ１ドメインを含む ファイバーキメラは、より短い三量体化ドメインを含む対応のキメラよりも、ウ イルスから遠くに突き出すことができる。変異ロイシンジッパー(例えば、GCN4) ドメインよりもレオウイルスシグマ１三量体化ドメインが有利なのは、GCN4ドメ インが長さ５ｎｍしかないのに対して(Harburyら，上述)、シグマ１ドメインは ２２ｎｍの長さがあることである(Fraserら，J．Virol.，64，2990-3000(1990)) 。レオウイルスシグマ１接着蛋白質を使用するさらなる利点は、アデノウイルス シャフト蛋白質とは異なって、それが固有の三量体化傾向を示すことである(Leo neら，Virology，182，336-45(1991))。ファイバーの長さは、アデノウイルス− 細胞接着の効率および特異性を増大させるらしいので(Roelvinkら，J．Virol.， 70，7614-21(1996))、シグマ１ドメインにより可能な、より長いファイ バーは、他のキメラファイバーよりも好適である。 あるいは、キメラ単量体は別のアデノウイルス血清型由来のノブドメインを含 むことができる。例えば、宿主種内で生産的に感染し得るアデノウイルス血清型 由来の変異ノブ（例えば、ＨＩループ中に変異を含むＡｄ３の変異ノブ）で、三 量体化ドメインを置換することができる。あるいは、宿主種内で生産的に感染し 得えない血清型由来のノブで、それを置換することもできる。例えば、哺乳動物 のアデノウイルス血清型のファイバーノブを、鳥類の血清型由来のノブで置換す ることができる。鳥類のノブはファイバー蛋白質の三量体化を仲介するが、哺乳 動物のＡＲを認識することはできないらしいので、そのようなキメラファイバー は天然の宿主ＡＲと結合する生来の能力を欠く。同様に、ある哺乳動物のアデノ ウイルス血清型のファイバーノブを、別の哺乳動物の血清型由来のノブで置換す ることができる。この点については、NADC-1ノブがよく特性解析されているので 、ブタアデノウイルスNADC-1ファイバー由来の改変または非改変ノブが好適なド メインである。NADC-1ノブは同定し得るリガンド、例えば、（ガラクトースと結 合する）ガレクチン、並びに（インテグリンと結合する）ＬＤＺおよびＲＧＤペ プチドを有する(例えば、Hirabayashiら，J．Biol．Chem.，266，13648-53(1991 )を参照)。したがって、このような変異を含むNADC-1ノブを有するキメラヒトア デノウイルスファイバーは、三量体を形成し、且つペントンベースと結びつくこ とができるが、それらが天然の細胞表面受容体と結合するアフィニティーは低下 している。 単量体が正しく三量体化し得る（すなわち、アデノウイルスペントンベースと 相互作用し得る）限り、非天然の三量体化ドメインは、いかなる適切な部位でで も天然のファイバー単量体に連結することができる。例えば、該ドメインを天然 のノブ中に挿入してノブのトポロジーを破壊することができる。あるいは、任意 の１５アミノ酸のシャフト反復の後に、好ましくは７番目、１５番目または２２ 番目の反復の後に三量体化ドメインを挿入して、天然のアデノウイルスのシャフ トサイズに似せることができる。非天然の三量体化ドメインをアデノウイルスシ ャフト中に挿入する場合、それはキメラ蛋白質のカルボキシ末端を形成するか、 あるいはアミノ酸配列の中央に挿入することができる。さらに、得られる三量体 がペントンベースと正しく結びつく限り、いかなる数の三量体化ドメインをファ イバー単量体中に挿入してもよい。 ブロッキングドメイン 別の適切なキメラ単量体は、天然の宿主ＡＲに対するリガンドをブロックする 新規なドメインを有する。ブロッキングドメインは、天然のリガンドに強固に結 合し得る任意のペプチドである。(例えば、Hongら，ENBO J.，16，2294-2306(19 97)を参照)。言い換えれば、ブロッキングドメインは、（天然の、または改変さ れた）ファイバー単量体リガンドが選択的に結合する基質である。リガンド−基 質相互作用は少なくともウイルス産生の直後に起こり、ファイバー三量体が壊れ るまで有効に持続することが望ましい。天然のリガンドはブロッキングドメイン に結合するので、リガンドは細胞表面上のその天然の基質に結合することができ ない。天然の三量体化ドメインは天然のＡＲに対するリガンドであるから、その ようなブロッキングドメインを有するキメラアデノウイルスファイバー単量体か らなる三量体は、天然のアデノウイルスファイバーよりも小さなアフィニティー で天然のＡＲに結合する。 ブロッキングドメインは、三量体化やペントンベースとの相互作用に容易に感 知できる程度に影響を与えることなく天然のリガンドと結合する、アデノウイル ス上のいかなる位置にあってもよい。例えば、ブロッキングドメインは、リーデ ィングフレーム内での融合、翻訳後の共有結合的な修飾等のいずれかによって、 前述のβシートまたはループに添えることができる。あるいは、ブロッキングド メインをシャフトのような単量体の別の部分に添えることもできる。ブロッキン グドメインはまた、該ブロッキングドメインが天然のリガンドと相互作用する機 会を与えるリンカーまたはスペーサーポリペプチドを含むことができる。本明細 書に記載されるように、もしブロッキングドメインをそのようなスペーサーを介 して添え付ける場合、スペーサーはその後の開裂のためのプロテアーゼ認識部位 を含むことができる。 調製 本発明の三量体中に包含させるための単量体は、いかなる適切な方法によって も製造することができる。例えば、固相合成（例えば、Merrifield，J．Am．Che m．Soc.，85，2149-54(1963);Baranyら，Int．J．Peptide Protein Res.，30，7 05-739(1987);および合衆国特許第5,424,398号を参照）による等の標準的な直接 ペプチド合成技術（例えば、Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis(Spr inger-Verlag，Heidelberg:1984)に要約されるような）を用いて、変異ファイバ ー蛋白質を合成することができる。あるいは、改変部位を含む合成オリゴヌクレ オチドを発現ベクターに連結することによって、（本明細書に記載されるように 、ノブを非天然の三量体化ドメインで置換する、ＡＲと結合する残基を除去、置 換するか変異させる、あるいはブロッキングドメインを付加する等の）部位特異 的変異を単量体中に導入することができる。あるいは、所望の変異をコードする プラスミド、オリゴヌクレオチドまたは他のベクターを、アデノウイルスゲノム または単量体をコードする発現ベクターと組み換えて、該所望の変異を導入する ことができる。オリゴヌクレオチド−部位特異的変異誘発手順もまた適当である (例えば、Walderら，Gene，42，133(1986);Bauerら，Gene，37，73(1985);Craik ，Biotechniques，12-19(1995);合衆国特許第4,518,584号および第4,737,462号) 。どのように工作されようとも、改変された単量体をコードするＤＮＡ断片は、 周知の分子遺伝学的技術を用いて適当なベクター中にサブクローニングすること ができる。次いで、該断片は、宿主細胞内で、転写され続いてペプチドがインビ トロで翻訳される。任意の適当な発現ベクター（例えば、Pouwels ら，Cloning Vectors:A Laboratory Manual(Elsevior，NY:1985)）および対応す る適切な宿主細胞を、組換えペプチドの製造のために使用することができる。発 現宿主としては、細菌種、バキュロウイルス系（例えば、Luckowら，Bio/Techno logy，6，47(1988)）を含む哺乳動物または昆虫の宿主細胞系、並びに２９３、 ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ等のような樹立細胞 株が挙げられるが、それらに限定されない。高レベルの組換え蛋白質の生産が可 能であるので、本発明の改変ファイバーを調製するのに特に好適な発現系はバキ ュロウイルス発現系である(Wickhamら，J．Virol.，70，6831-38(1995))。もち ろん、発現宿主の選択は、主として翻訳後の修飾のために、生産されるペプチド のタイプに派生をもたらす。 いったん生産されると、単量体はファイバー蛋白質活性についてアッセイされ る。詳細には、単量体の三量体形成能、ペントンベースと相互作用する能力およ び天然のＡＲと相互作用する能力が調べられる。これらのパラメーターを測定す るのにいかなる適切なアッセイも使用することができる。例えば、正しくフォー ルディングされていない単量体は一般に不溶性なので(Scopes，“Protein Purif ication”(第３版，1994)，第９章，第270-82頁(Springer-Verlag，New York)) 、三量体化アッセイの１つは組換えファイバーが可溶性であるかどうかである。 ファイバーの溶解度は、合成の間にある量の放射性アミノ酸が蛋白質中に取り込 まれるかを助けとして測定する。組換えファイバー蛋白質を発現する宿主細胞由 来のライセートを遠心分離し、上清とペレットをシンチレーションカウンターま たはウェスタン分析によってアッセイすることができる。その後、ペレットおよ び上清中の蛋白質を（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル上に）分離してファイバ ー蛋白質をさらなるアッセイのために単離する。上清から単離されたファイバー 蛋白質に対する、ペレットから単離されたファイバー蛋白質中の放射活性量の比 較から、変異蛋白質が可溶性であるかどうかがわかる。あるいは、三量体化は、 ファイバーの三量体形態のアミノ部分のみを認識するモノクローナル抗体 を用いることにより(例えば、免疫沈降、ウェスタンブロッティング等により)、 アッセイすることができる。そのような抗体の１つは国際特許出願WO 95/26412 に記載されており、また、当該分野で知られているものもある。ファイバー三量 体のみがそのように相互作用し得るので、三量体化の第三の測定は、組換えファ イバーがペントンベースと複合体を形成する能力である(NovelliおよびBoulange r，Virology，185，1189(1995))。この性向は、共免疫沈降、ゲル移動度シフト アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(煮沸試料は単量体として流れるか、そうでなけれ ば、より大きな蛋白質として流れる)等によってアッセイすることができる。三 量体化の第四の測定は、単量体に対する三量体の分子量における差異を検出する ことである。例えば、煮沸または変性した三量体は、変性していない安定な三量 体よりも低分子量として流れるだろう(HongおよびAngler，J．Virol.，70，7071 -78(1996))。 三量体組換えファイバーはまた、その天然のＡＲとの結合能についてもアッセ イされなければならない。このことを検知し得るいかなる適切なアッセイも、本 発明において十分使用することができる。好適なアッセイは、天然のＡＲを発現 する細胞（例えば、２９３細胞）を、標準的な感染条件下で組換えファイバー三 量体に曝露することを含む。その後、該細胞を天然のアデノウイルスに曝露して ウイルスの細胞との結合能をモニタリングする。モニタリングは、オートラジオ グラフィー(例えば、放射性ウイルスを使用して)、免疫細胞化学によって、ある いは感染や遺伝子送達のレベルを測定する（例えば、リポーター遺伝子を用いて ）ことによって行うことができる。その後の２９３細胞へのウイルスの結合を減 少させるか実質的に排除する天然の三量体とは対照的に、その後天然のアデノウ イルスが細胞に結合する能力を実質的に低下させない三量体が、本発明の三量体 である。その後のウイルス結合の妨害が減少するということは、三量体がそれ自 体天然の哺乳動物ＡＲに対するリガンドでないか、少なくとも低下したアフィニ ティーで結合することを示している。 あるいは、変異ファイバー（または、本明細書に記載されるような推定変異フ ァイバーのライブラリー）をコードする配列を含むベクターを適切な宿主細胞株 に導入して、該ファイバー蛋白質を発現させることができる。高い効率でスクリ ーニングするためには、宿主細胞は細菌であることが好ましい。細菌を宿主細胞 として使用する場合、可溶性のＣＡＲ蛋白質との結合能をアッセイすることによ って変異体を同定することができる。例えば、細菌平板のレプリカ（例えば、ニ トロセルロースフィルターリフト上の）を適切な培地中で培養してベクターから の発現を誘導することができる。その後、フィルターを、それに付着する細菌を 溶解するのに適した溶液に晒し、放射標識したＣＡＲ蛋白質で探索する。フィル ターへのＣＡＲプローブの非特異的付着を最小限にするために、フィルターをま ず高蛋白溶液で「ブロッキング」することが好ましい。ハイブリダイゼーション の後、フィルターをフィルムに露出してＣＡＲと結合するファイバー蛋白質を発 現するコロニーを同定する。放射標識したＣＡＲプローブにハイブリダイズしな い（またはより弱いシグナルによって示されるように、低下したアフィニティー で結合する）コロニーは、本発明のファイバー単量体を発現する可能性がある。 ＣＡＲとの結合の減少は、リガンドの選択的な排除か三量体化に影響を及ぼす構 造上の改変のいずれかによるだろうから、このような細菌のライブラリーをスク リーニングすることによって非ＣＡＲ結合性であると同定される変異ファイバー は、上述のようにして三量体化能を調べなければならない。 ブロッキング蛋白質 天然のウイルスの指向性を低減させる代替的な手段として、本発明は、アデノ ウイルスファイバーに対する基質を含むキメラブロッキング蛋白質を提供する。 キメラブロッキング蛋白質は、アデノウイルスファイバー上のリガンドによって 認識される基質を有するいかなる適切なドメインを含んでいてもよい。例えば、 野生型アデノウイルスの受容体との結合を妨害するために、キメラブロッキング 蛋白質は、ＣＡＲ細胞表面蛋白質の細胞外ドメイン(Bergelsonら，Science，275 ，1320-23(1997);Tomkoら，Proc．Nat．Acad．Sci．U.S.A.，94，3352-56(1997) )、ＭＨＣクラスＩ受容体の細胞外ドメイン（Hongら，EMBO J.，16(9)，2294-06 (1997)）またはＡＲの他の類似の細胞外基質ドメインを含むことができる。さら に、本明細書に記載されるようなキメラファイバー三量体を有するアデノウイル ス等の組換えアデノウイルスの基質との結合を妨害するために、ブロッキング蛋 白質は三量体上に存在するリガンドによって認識される基質を含むことができる 。記載されるように、キメラブロッキング蛋白質は細胞表面蛋白質由来のドメイ ンを含むことができるが、通常はそれ自体は細胞表面蛋白質ではない。その代わ りに、キメラブロッキング蛋白質は、溶液中でアデノウイルスと相互作用し得る 遊離の可溶性蛋白質であることが好ましい。 本発明のキメラブロッキング蛋白質は、溶液中でアデノウイルスを該キメラブ ロッキング蛋白質とともにインキュベートして、該キメラブロッキング蛋白質を アデノウイルスファイバー上に存在するリガンドに結合させることによって、ア デノウイルス受容体との結合を妨害する方法を提供する。ファイバー上のリガン ドがキメラブロッキング蛋白質上の基質に結合するのを促進するために、ウイル スおよびキメラブロッキング蛋白質を任意の時間、任意の適切な条件下でインキ ュベートすることができる。ファイバーリガンドとキメラブロッキング蛋白質基 質との間の選択的結合を促進するのに適した時間、温度および溶液化学といった パラメーターは、リガンドが基質に選択的に結合するアフィニティーに応じて変 化させることができる。一般に、公知のリガンド−基質系を使用する場合には、 これらのパラメーターもまた公知である。しかしながら、新規なリガンド−基質 系を使用する場合は、(例えば、新規なリガンド−基質相互作用について蛋白質 ライブラリーをスクリーニングする時のような条件を用いることにより、)本明 細書において論じるように、結合条件を概ね前もって決定することができる。し かしながら、キメラブロッキング蛋白質の濃度は、インキュベーションの間、ア デノ ウイルスのファイバー上に存在する細胞表面リガンドを飽和させるのに十分なも のであることが好ましい。 アデノウイルスファイバー上のリガンドによって認識される基質を有するドメ インを包含するのに加え、キメラブロッキング蛋白質はまた他のドメインを有す ることもできる。例えば、該蛋白質は分泌を促進するドメインを含むことができ (例えば、Suterら，EMBO，J.，10，2395-2400(1991);Beutlerら，J．Neurochem. ，64，475-81(1995))、そのため、該蛋白質を生産する細胞からの遊離のキメラ ブロッキング蛋白質の回収が助けられる。加えて、キメラブロッキング蛋白質は 、さらに本明細書に記載されるリガンドのようなリガンドドメイン(すなわち、 ウイルスノブに対する基質に加えてリガンド)を含むことが好ましい。キメラブ ロッキング蛋白質上にリガンド、特にペプチドタグおよび他の類似の配列が存在 すると、生産後のキメラブロッキング蛋白質の精製および同定が容易になる。よ り好適なリガンドは、本明細書に記載されるような、細胞表面結合部位または他 の基質を認識するものである。そのようなブロッキング蛋白質は、アデノウイル スの受容体との結合を変化させるための「二重特異的」分子として機能する。例 えば、キメラブロッキング蛋白質が細胞表面結合部位に対するリガンドを含む場 合、該ブロッキング蛋白質は、ファイバーが介在する受容体との結合を妨害する 一方で、該キメラブロッキング蛋白質上に存在するリガンドを通じて新規なター ゲッティングを指示することによって、アデノウイルスの選択的なターゲッティ ングを達成することができる。したがって、本発明は、溶液中で、アデノウイル スを、細胞表面結合部位上に存在する基質を認識するリガンドを有するキメラブ ロッキング蛋白質とともにインキュベートして、該キメラブロッキング蛋白質を アデノウイルスファイバーに結合させて複合体を形成させた後、該複合体を該リ ガンドに対する基質を有する細胞に曝露することによって、アデノウイルスのタ ーゲッティングを指示する方法を提供する。 アデノウイルスファイバー上のリガンドによって認識される基質を有するドメ イン（ことによると非アデノウイルスリガンドドメインも）を包含するのに加え て、キメラブロッキング蛋白質はまた、本明細書において論じられる三量体化ド メインのような三量体化ドメインを含むことができる。そのような三量体化ドメ インが存在すると、キメラブロッキング蛋白質の単量体の三量体形成が可能とな る。キメラブロッキング蛋白質は、単量体として、ファイバー上に存在するリガ ンドを飽和させることができるが、もちろん、そのような結合は、リガンド−基 質相互作用のカイネティックスによってはある比率での解離を余儀なくされる。 しかしながら、三量体ファイバーと三量体ブロッキング蛋白質との間の３つのリ ガンド／基質結合がすべて同時に切断されるであろう可能性は、そのような結合 のいずれか１つが壊れるであろう可能性よりも顕著に小さいので、三量体ブロッ キング蛋白質は、ファイバー上に存在する利用可能なリガンドをより容易に飽和 させる。要するに、三量体構造は、ファイバーノブリガンドに対する各々の基質 を効果的に保持し、それによって各々のリガンドがブロックされる可能性を増大 させる。 キメラブロッキング蛋白質は、直接蛋白質合成、細胞による生産、インビトロ での翻訳または他の当該分野で公知の方法による等のいかなる適切な方法によっ ても製造することができる。蛋白質製造のための多くの適切な方法は、本明細書 の他の部分に記載されており、また、そうでなければ当該分野で知られている。 ウイルス 本発明は、本発明の組換えファイバー三量体を一部として包含するアデノウイ ルスを提供する。ウイルスコート中に存在するファイバー三量体のアフィニティ ーが上述のように低下するために(例えば、本明細書に記載されるような、三量 体化ドメインの非三量体化ドメインでの置換、責任を担う残基の選択的変異また はブロッキングドメインの組込みによって)、本発明のアデノウイルスは、野生 型の血清型ほど容易には天然のＡＲを介してその天然の宿主細胞に感染しない。 し たがって、好ましくは、該アデノウイルスはその繁殖、単離および／またはター ゲッティングを容易にする非アデノウイルス性のリガンドを一部として包含する 。 該ウイルスは、いかなる適切なリガンド（例えば、基質に特異的に結合するペ プチド）も含むことができる。例えば、自然に感染する細胞種以外の細胞種（す なわち、天然の宿主細胞域または宿主細胞セット以外の細胞種の群）にアデノウ イルスをターゲッティングするために、リガンドを、その天然のＡＲ以外の、あ るいはいかなる天然のＡＲですらない細胞表面結合部位（例えば、アデノウイル スが相互作用して細胞に結合し、それによって細胞侵入を促進することができる 、細胞表面上に存在する任意の部位）に結合させることができる。細胞表面結合 部位はいかなる適切な分子種であってもよいが、通常は、蛋白質(改変された蛋 白質を含む)、炭水化物、糖蛋白質、プロテオグリカン、脂質、ムチン分子もし くはムコ蛋白質、または他の類似の分子である。可能性のある細胞表面結合部位 の例としては、グリコサミノグリカン上に見られるヘパリンおよびコンドロイチ ン硫酸モチーフ；ムチン、糖蛋白質およびガングリオシド上に見られるシアル酸 モチーフ；マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコ サミン、フコースおよびガラクトースを含めて、膜糖蛋白質中に見られる共通の 炭水化物分子；ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、セレクチン（例えば、Ｅ−セレクチン 、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン等）およびインテグリン分子のような糖蛋白 質；並びに、例えば、ＭＵＣ−１腫瘍特異的エピトープのような、癌細胞上に存 在する腫瘍特異的抗原が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、蛋 白質を狭いクラスの細胞種（例えば、心筋、骨格筋、平滑筋等）で発現させるこ とも、また、いくつかの細胞種を包含するより広い群内で発現させることもでき る。 他の態様において(例えば、特定の工作された細胞種における精製または繁殖 を容易にするために)、非天然のリガンドを、天然の細胞表面蛋白質以外の化合 物に結合させることができる。すなわち、血液および／またはリンパ液由来の蛋 白質(例えば、アルブミン)、ポリアミノ酸のような合成ペプチド配列(例えば、 ポ リリジン、ポリヒスタジン等)、人工ペプチド配列（例えば、ＦＬＡＧ 配列番 号１６）およびＲＧＤペプチド断片（Pasqualiniら，J．Cell．Biol.，130，118 9(1995)）に、リガンドを結合させることができる。あるいは、プラスチック(例 えば、Adeyら，Gene，156，27(1995))、ビオチン(Saggioら，Biochem．J.，293 ，613(1993))、ＤＮＡ配列(Chengら，Gene，171，1，(1996);Krookら，Biochem ．Biophys.，Res．Commun.，204，849(1994))、ストレプトアビジン(Geibelら， Biochemistry，34，15430(1995);Katz，Biochemistry，34，15421(1995))、ニト ロストレプトアビジン(Balassら，Anal．Biochem.，243，264(1996))、ヘパリン (Wickhamら，Nature Biotechnol.，14，1570-73(1996))、カチオン性支持体、ニ ッケルおよび亜鉛のような金属（例えば、Rebarら，Science，263，671(1994);Q uiら，Biochemistry，33，8319(1994)）または他の可能性のある基質などの非ペ プチド性基質に、リガンドを結合させることができる。本発明の方法に使用する のに適したリガンドおよびその基質の例としては、アミノ酸残基接着配列に結合 するＣＲ２受容体、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＶ３ループを認識するＣＤ４受容体、 トランスフェリン受容体とそのリガンド(トランスフェリン)、低密度リポ蛋白質 受容体とそのリガンド、肺上皮および内皮細胞上のＩＣＡＭ−１受容体とそのリ ガンド、ストレプトアビジンまたはニトロストレプトアビジンに対する直鎖状ま たは環状ペプチドリガンド(Katz，Biochemistry，34，15421(1995))、ラクトー ス、ガラクトースおよび他のガラクトース含有化合物に結合するガラクチン配列 および脱グリコシル化された蛋白質リガンドを認識するアシアロ糖蛋白質が挙げ られるが、それらに限定されない。さらに、さらなるリガンドおよびその結合部 位として、(それらに限定されないが)インテグリンによって認識される短い（例 えば、６アミノ酸以下の）アミノ酸の直線区分、並びにポリリジン、ポリアルギ ニン等のようなポリアミノ酸が挙げられる。多数のリジンおよび／またはアルギ ニンを挿入することにより、ヘパリンおよびＤＮＡを認識することができるよう になる。また、リガンドは、シストソーマ・マノシ（Shistosoma manosi） 由来グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、チオレドキシンβ−ガラ クトシダーゼまたは大腸菌由来マルトース結合蛋白質（ＭＰＢ）由来の配列、ヒ トアルカリホスファターゼ、ＦＬＡＧオクタペプチド(配列番号１６)、赤血球凝 集素（ＨＡ）(Wickhamら，1996，上述)、ポリオーマウイルスペプチド、ＳＶ４ ０ラージＴ抗原ペプチド、ＢＰＶペプチド、Ｃ型肝炎コアおよびエンベロープＥ ２ペプチドおよびそれらを認識する一本鎖抗体(Chan，J．Gen．Virol.，77，253 1(1996))、ｃ−ｍｙｃペプチド、アデノウイルスペントンベースエピトープ(Stu artら，EMBO J.，16，1189-98(1997))、Ｃ型肝炎のＥ２エンベロープ中に存在す るエピトープである配列番号１７および配列番号１８(例えば、Chanら，1996， 上述，を参照)、並びに他のよく用いられるタグのような、よく用いられるペプ チドタグ（例えば、入手可能な抗血清によって認識されることが知られている短 いアミノ酸配列）を含むことができる。タグリガンドに対する好適な基質は、そ れに対して指向性の抗体、そのような抗体の誘導体（例えば、ＦＡＢフラグメン ト、一本鎖抗体(ＳｃＡｂ)）または他の適切な基質である。 記載されるように、適切なリガンドは、本明細書に記載されるか、そうでなけ れば当該分野で知られているもののような、いかなる所望の基質に特異的であっ てよい。しかしながら、アデノウイルスベクターは、まず、あるペプチドが所定 の基質と相互作用し得ることを調べることによって、新規なリガンドを含むよう に工作することもできる。一般に、可能性のあるリガンドを含むランダムまたは セミランダムなペプチドライブラリーを製造することができ、それは本質上発現 ベクター系内のライブラリーである。発現した蛋白質（すなわち、推定上のリガ ンド）を所望の基質に曝露することにより、そのようなライブラリーをスクリー ニングすることができる。ライブラリー内の種が明確に基質と選択的に結合する ということは、少なくともアッセイ条件下ではその基質に対するリガンドである ことを示す。そのようなペプチドライブラリーをスクリーニングするために、蛋 白質と基質との間の相互作用を検出することができるいかなるアッセイも適当で あり、多くは当該分野で知られている。しかしながら、蛋白質ライブラリーをス クリーニングするための好適なアッセイの１つは、該ライブラリーを発現するバ クテリオファージを使用するファージディスプレイシステムである(例えば、Koi vunenら，Bio/Technology，13，265-70(1995);Yanofskyら，Proc．Nat．Acad．S ci．U.S.A.，93，7381-86(1996);Barryら，Nature Med.，2(3)，299-305(1996)) 。ファージを基質に曝露し、基質をリンスして、基質に結合して残っているファ ージを選択することによって、基質に対するファージの結合をアッセイする。そ の後、ファージを限界希釈することにより、推定上のリガンドを発現する個々の クローンを同定することができる。もちろん、そのようなクローン中に存在する インサートをシーケンシングしてリガンドを同定することができる。 ファージディスプレイはウイルスと微小環境との相互作用を最もよく擬態する ので、可能性のあるリガンドを同定するのに好適である。特に、ファージディス プレイは細胞外の系であり(ウイルス感染の最初の段階のように)；さらに、ファ ージディスプレイは、実際の可能性あるリガンドを提示する実際のウイルス（フ ァージ）が一部として組み込まれている。ファージディスプレイはまた、他の蛋 白質結合アッセイ（特に、細胞内アッセイ）よりも、顕著によりフレキシビリテ ィーを提供する。特に、ファージディスプレイは、特定の基質に結合する蛋白質 （リガンド）を同定するだけでなく、前もって決められた条件下で結合するもの を同定もする。したがって、ファージディスプレイを使用すると、精製を容易に する、アデノウイルスへの組込みに有用なリガンドを、概ね前もって決められた 条件下で同定することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーは 、特定のプラスチック、樹脂またはアフィニティーカラムに使用される他の所望 の基質に曝露することによってスクリーニングすることができる。特定の条件も しくは特定の範囲の条件（例えば、高塩もしくは低塩、高ｐＨもしくは低ｐＨ、 高温もしくは低温）下では基質と結合するか、あるいは基質から溶出するが、他 の条件下ではそのように結合も溶出もしないペプチドを発現するファージを、容 易 に同定することができる。その後、リガンドを一部として組み込んだアデノウイ ルスは、本明細書において論じられるように、同様の条件下でそれを基質に曝露 することによって精製することができる。 いったん所定のリガンドが同定されれば、基質と相互作用し得る任意のウイル スの位置（すなわち、ウイルス表面）にそれを組み込むことができる。例えば、 リガンドをファイバー、ペントンベース、ヘキソンまたは他の適切な位置に組み 込むことができる。リガンドをファイバー蛋白質に結びつける場合、それがウイ ルス蛋白質間または単量体間の相互作用を妨げないことが好ましい。したがって 、リガンド自体はオリゴマー化ドメインではないことが好ましい−というのも、 上述のように、そのようなものは三量体化ドメインと不利に相互作用し得るから である。さらに、リガンドはファイバー蛋白質の一部を置換しないことが好まし い−というのも、そのような撹乱は三量体化およびペントンとの相互作用に悪影 響を及ぼし得るからである。むしろ、リガンドをファイバー蛋白質に付加し、そ れが容易に基質に晒されるような様式で（例えば、該蛋白質のカルボキシ末端に 、基質に面した残基に結びけて、基質に接触させるためのペプチドスペーサー上 に位置させて等）組み込んで、リガンドを基質に最大限提示することが好ましい 。リガンドをペントンの一部に結びつけるかもしくはそれと置換する場合、リガ ンドは基質との接触を確実にするために超可変領域内にあることが好ましい。さ らに、リガンドをペントンに結びつける場合、組換えファイバーは、リガンドを 基質に最大限に提示するように先端が切り詰められる、すなわち短い（例えば、 ０〜約１０のシャフト反復）(例えば、合衆国特許第5,559,099号（Wickhamら） を参照)。リガンドをヘキソンに結びつける場合、それは超可変領域内にあるこ とが好ましい(Mikszaら，J．Virol.，70(3)，1836-44(1996))。 アデノウイルス蛋白質（またはブロッキング蛋白質）中に工作する場合、リガ ンドは幾分は天然の配列の一部を、また幾分は非天然配列の一部を含むことがで きる。同様に、蛋白質中のリガンドを含む（天然および／または非天然の）配列 は、該蛋白質を含むアミノ酸の鎖の中で、必ずしも隣接している必要はない。言 い換えれば、蛋白質の特定のコンフォーメーションによって、例えば、隣接する 、および／または隣接しない配列が相互に近接するに至るような様式の蛋白質の フォールディングを通じて、リガンドを生じさせることができる。もちろん、本 発明のアデノウイルス（またはブロッキング蛋白質）は、それぞれ異なる基質に 結合する複数のリガンドを含むことができる。例えば、ウイルスは、本明細書に 記載されるようなアフィニティー精製を可能にする第一のリガンド、本明細書に 記載されるような細胞表面部位に選択的に結合する第二のリガンド、および／ま たはやはり本明細書に記載されるようなウイルスを不活性化するための第三のリ ガンドを含むことができる。 リガンドを含む蛋白質は、さらに他の非天然の要素を含むことができる。例え ば、非天然のユニークなプロテアーゼ部位をアミノ酸配列中に挿入することもで きる。プロテアーゼ部位は、ファイバーの三量体化およびファイバーリガンドの 基質特異性に影響しないことが好ましい。多くのそのようなプロテアーゼ部位が 当該分野で知られている。例えば、トロンビンは公知のアミノ酸配列を認識して 開裂させる(Stenfloら，J．Biol．Chem.，257，12280-90(1982))。本明細書にお いて論じられるように、そのようなプロテアーゼ認識配列が存在すると、いくつ かのプロトコールにおいてウイルスの精製が容易になる。蛋白質に変異を導入す るための上述の方法など、いかなる適切な方法によっても蛋白質がリガンドを含 むように工作することができる。 三量体およびリガンドに加えて、本発明のウイルスは、さらに１または２以上 のパッセンジャー遺伝子を含むことができる。「パッセンジャー遺伝子」はいかな る適切な遺伝子であってよく、望ましくは治療遺伝子（すなわち、細胞レベルで 、あるいは全身に、生物学的、好ましくは治療的応答をもたらす産物をコードす る核酸配列）またはリポーター遺伝子（すなわち、何らかのやり方で細胞内で検 出することができる産物をコードする核酸配列）のいずれかである。パッセンジ ャ ー遺伝子は、ベクターがインターナリゼーションした細胞内で発現し得ることが 好ましい。好ましくは、パッセンジャー遺伝子はＲＮＡまたは蛋白質のレベルで その効果を発揮する。例えば、導入される治療遺伝子にコードされる蛋白質は、 例えば、嚢胞性線維症の治療のための嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因 子ｃＤＮＡのように、遺伝病の治療に使用することができる。あるいは、治療遺 伝子にコードされる蛋白質は、細胞死をもたらすことによってその治療効果を発 揮することができる。例えば、ジフテリア毒素の発現のように、遺伝子発現その ものが殺細胞を導くことができる。あるいは、遺伝子もしくは遺伝子発現によっ て、細胞をある特定の薬物の殺作用に選択的に感受性となるようにすることがで きる−例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子の発現により、細胞はアシクロビ ル、ガンシクロビルおよびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β− Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）を含めた抗ウイルス性化合物 に感受性となる。さらに、治療遺伝子は、例えばアンチセンスメッセージもしく はリボザイム、スプライシングや３’プロセッシング（例えば、ポリアデニル化 ）に影響する蛋白質または細胞内での別の遺伝子の発現レベルに影響する蛋白質 をコードすることによって(すなわち、ここでは遺伝子発現は、転写開始からプ ロセッシングされた蛋白質の生産までのすべての工程を含めるものと広く解釈さ れている)、おそらくはとりわけｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化 および／または翻訳後調節の変化を仲介することによって、ＲＮＡレベルでその 効果を発揮することができる。もちろん、所定のパッセンジャー遺伝子を送達す るのに遺伝子導入技術を使用することが所望される場合、その配列は当該分野で 知られているだろう。 改変された蛋白質（例えば、リガンドを有する三量体またはコート蛋白質）お よび（存在する場合）パッセンジャー遺伝子は、いかなる適切な方法でアデノウ イルス中に組み込んでもよく、その多くは当該分野で知られている。本明細書に 記載されるように、蛋白質は、好ましくは発現ベクター（例えば、バキュロウイ ルスベクター）中の遺伝子から高容量で生産された産物をアッセイすることによ って同定される。所望の変異を有するベクター由来の遺伝子は、容易にプラスミ ド中にサブクローニングすることができ、次いで、それらを適切なパッケージン グ細胞（例えば、２９３細胞）にトランスフェクトする。次に、トランスフェク トされた細胞を感染に適した条件下でアデノウイルスとともにインキュベートす る。ベクターとウイルスとの間の相同組換えにより、細胞内である頻度で、所望 の変異を有するアデノウイルスゲノムが生産されるだろう。 本発明のアデノウイルスは複製能があってもよいし、複製欠損であってもよい 。好ましくは、アデノウイルスベクターは、その中に、ウイルスが複製欠損とな るようにする少なくとも１つの改変を有するゲノムを含む(例えば、国際特許出 願WO 95/34671を参照)。アデノウイルスゲノムに対する改変としては、ＤＮＡセ グメントの付加、ＤＮＡセグメントのリアレンジメント、ＤＮＡセグメントの欠 失、ＤＮＡセグメントの置換またはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるが、それらに 限定されない。ＤＮＡセグメントは小さいもので１ヌクレオチド、大きいもので アデノウイルスゲノム（例えば、約３６ｋｂ）であってよく、あるいはアデノウ イルスビリオン中にパッケージングされ得る最大量と同等（すなわち、約３８ｋ ｂ）であってもよい。アデノウイルスゲノムに対する好適な改変としては、Ｅ１ 、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４領域における改変が挙げられる。アデノウイル スはまた、共組込み体、すなわちアデノウイルスゲノム配列と他の配列、例えば 他のウイルス配列、ファージ配列またはプラスミド配列との連結物であっても好 ましい。 本発明のアデノウイルスは、それを遺伝子導入並びに他の応用における使用の 魅力ある選択肢とする多くの性質を有する。例えば、該アデノウイルスは、変異 ファイバー三量体（例えば、本明細書に記載されるような、ＡＲとの結合に責任 を負う残基の選択的変異、三量体化ドメインの置換またはブロッキングドメイン の付加）のせいで、野生型アデノウイルスがそうする程容易には、その天然の宿 主細胞に感染しない。さらに、該アデノウイルスは、本明細書において論じられ るように、ウイルスの繁殖、ターゲッティング、精製および／または不活性化を 容易にする、基質に特異的な非天然のリガンドを少なくとも１つ有する。クロー ニングを容易にするには、リガンドと三量体化ドメインは分離したドメインであ ることが好ましく、そうすると、ファイバーの三量体化を妨げることなく、異な るリガンドを組み込むようにウイルスを容易に再工作することが可能である。あ るいは、ファイバー三量体が変異ファイバーノブを一部として包含するならば、 本明細書に記載されるように、ノブにリガンドを組み込むことができる。 もちろん、（動物のような）宿主に送達するために、本発明のウイルスを適切 な担体に組み込むことができる。本発明はそのように、本発明のアデノウイルス および薬理学上許容される担体を含む組成物を提供する。いかなる適切な製剤も 本発明の範囲内であり、もちろん、厳密な調剤は所望される適用の性質（例えば 、細胞種、投与形態等）に依存し、多くの適切な製剤が合衆国特許第5,559,099 号（Wickhamら）に示されている。 細胞株 本明細書に記載されるように、本発明のアデノウイルスは、（本発明のキメラ 三量体の組込みのせいで）そのＡＲとの結合能が顕著に低減しているので、その 天然の宿主細胞に天然のＡＲを介して容易には感染しない。したがって、本発明 は、本発明のアデノウイルスを繁殖させることができる細胞株を提供する。好ま しくは、該細胞株は、少なくとも約１０継代(例えば、約１５継代)、より好まし くは少なくとも約２０継代(例えば、約２５継代)、あるいは３０継代以上ですら ウイルス増殖を支援する。 例えば、アデノウイルスをまず、天然のファイバー蛋白質遺伝子を発現するパ ッケージング細胞株内で増殖させることができる。したがって、得られるウイル ス粒子は、おそらく相補細胞株にコードされろ天然ファイバーとアデノウイルス ゲノムによってコードされる非天然ファイバー（本明細書に記載されるファイバ ーような）の両方を含むだろう。したがって、結果的に得られるそのようなウイ ルス集団は両方のファイバー種を含むだろう。そのような粒子は、天然のファイ バー分子を欠く粒子よりも効率よく天然ファイバーを介してパッケージング細胞 株に結合し、その中に入ることができるだろう。したがって、そのようなファイ バーをコードする細胞株を使用すると、キメラな、ターゲッティングされるアデ ノウイルスファイバーをコードするアデノウイルスゲノムを増殖させ、適切に高 力価に増幅させることが可能となる。天然のファイバー分子をコードする細胞株 から生産される、アデノウイルスの結果的に「混合した」ストックは、天然およ びキメラの両方のアデノウイルスファイバー分子を含むだろう。しかしながら、 該粒子はキメラアデノウイルスファイバーのみをコードするゲノムを含む。した がって、キメラアデノウイルスファイバー分子のみを有するアデノウイルスの純 粋なストックを生産するために、「混合した」ストックを用いて天然のファイバー を生産しないパッケージング細胞株（Ｅ１欠失ウイルスについては２９３のよう な）を感染させる。得られるアデノウイルスは、ゲノムにコードされるファイバ ー分子（すなわち、キメラファイバー分子）のみを含む。 同様のファイバー相補的細胞株が製造され、ファイバー遺伝子を欠く変異アデ ノウイルスを増殖させるのに使用されている。しかしながら、一般に、これらの 細胞株の生産比率は、ファイバーを発現するアデノウイルス粒子のアデノウイル ス力価に匹敵するアデノウイルス力価をファイバーを欠失したアデノウイルスが 生じるには十分高くない。このような変異体によりもたらされるより低い力価は 、天然のファイバーの発現を一時的に制御して変異アデノウイルスゲノムをより 十分に相補することによって改善することができる。このように改良された細胞 株を製造するための１つの戦略は、誘導プロモーター（例えば、メタロチオネイ ンプロモーター）を使用して、いったん細胞がアデノウイルスに感染するとファ イバーの生産が制御され、活性化され得るようにすることである。あるいは、相 補 細胞株内のファイバー遺伝子に効率のよいｍＲＮＡスプライス部位を導入するこ とにより、細胞株内でのファイバー蛋白質の生産レベルを向上させる。 所定の細胞表面結合部位に特異的なリガンドを含むようにアデノウイルスを工 作する場合、その受容体を発現し、且つアデノウイルスの増殖を支援し得るいか なる細胞株も適切な宿主細胞株である。しかしながら、多くのリガンドは細胞表 面結合部位に結合しないので(特に、本明細書において論じられる新規リガンド) 、リガンドに対する基質を発現するように細胞株を工作することができる。 本発明は、受容体に対するリガンドを有するアデノウイルス（または二重特異 的ブロッキング蛋白質）が結合する非天然の細胞表面結合部位を発現する細胞株 を提供する。アデノウイルスの増殖を支援し得るいかなる細胞株も、本発明にお ける使用に適した細胞株である。アデノウイルスがウイルス複製に必須の遺伝子 を欠く場合、細胞株は該遺伝子産物を相補的なレベルで発現することが好ましい 。２９３細胞はアデノウイルスの増殖を支援するのに優れており、本発明の細胞 株は、好ましくは２９３細胞に由来する。 非天然の細胞表面結合部位は、本明細書に記載されるもののような基質分子で あり、その基質に選択的に結合するリガンドを有するアデノウイルス（または二 重特異的ブロッキング蛋白質）が細胞に結合し、それによって細胞侵入を促進す る。リガンドがアデノウイルス上にある場合、結合部位はアデノウイルスコート 中に組み込まれた非天然のリガンドまたはウイルスにとって天然のリガンドを認 識することができる。例えば、非天然のウイルスリガンドがタグペプチドであれ ば、結合部位は該タグを認識する一本鎖抗体（ＳｃＡｂ）受容体であり得る。あ るいは、ＳｃＡｂは（存在すれば）変異ファイバーノブの領域内に存在するエピ トープ、あるいは天然のアデノウイルスコート蛋白質上（例えば、ファイバー上 、ペントン上、ヘキソン上等）に存在するエピトープさえも認識することができ る。あるいは、非天然のリガンドが細胞表面の基質（例えば、膜結合蛋白質）を 認識する場合、結合部位はその基質を含むことができる。基質結合部位が細胞表 面受 容体にとって天然である場合、細胞株は、細胞のシグナル伝達経路と相互作用す る能力が低下するか(例えば、ＮＭＤＡ（Liら，Nat．Biotech.，14，989(1996) ）のような切り詰められた受容体)、イオンチャンネルとして作用する能力が低 減するか、あるいは他の改変がなされた変異受容体を発現することができる。そ のような改変蛋白質を介した感染は、細胞内伝令経路およびその種々の応答エレ メントの活性化を減少させることによって、宿主細胞の代謝に及ぼすウイルス感 染の二次的影響を最小限にする。簡単に云えば、結合部位の選択は問題のアデノ ウイルスの性質に大きく依存する。しかしながら、ウイルスに対する細胞種の特 異性を増進させるには、結合部位は天然の捕乳動物ＡＲでないことが好ましい。 さらに、結合部位はウイルスに接近することができる細胞の表面上で発現しなけ ればならない。したがって、結合部位が蛋白質であれば、膜への正しい組込みを 促進するために、それはリーダー配列と膜束縛配列（例えば、Davitzら，J．Exp ．Med．163，1150(1986)を参照）を有することが好ましい。 細胞株はいかなる標準的な方法によっても製造することができる。例えば、非 天然の受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、オリゴヌクレオチド 、プラスミド、ウイルスまたは他のベクター）を、標準的な手段によりソースと なる細胞株に導入することができる。該ベクターはまた、それを有する細胞の選 択を可能にする薬剤をコードすることが好ましい(例えば、ベクターは該プラス ミドを持たない細胞を殺す抗生物質に対する抵抗性をコードすることができる) 。ある頻度で、ベクターは細胞のゲノムと組換えを起こして、結合部位を発現す る形質転換細胞株が生産される。 繁殖方法 非天然のアデノウイルス細胞表面結合部位を発現する細胞株に関連して、本発 明は、本発明のアデノウイルスの繁殖方法を提供する。本発明の方法は、受容体 に選択的に結合する非天然のリガンドを有するアデノウイルスに細胞を感染させ 、 該細胞をインキュベートし、該細胞内で生産されたアデノウイルスを回収するこ とを含む。細胞から回収したアデノウイルスを再度繁殖させて(すなわち、増幅 させて)、非常に高力価のウイルスストックを生産することができる。アデノウ イルス上のリガンドは、本明細書に記載されるようないかなるリガンドであって よい。本発明の細胞は、細胞株の効率よい感染を促進するいかなる適切なm.o.i. でも（例えば、約１m.o.i.〜約１０m.o.i.）ウイルスに感染する。細胞の培養条 件は主として宿主細胞の性質に依存する。しかしながら、当業者であれば所定の 細胞種に適した培養条件を選択することができる。ウイルスは細胞溶解のような 標準的な手段により細胞から回収される。その後、ウイルスは標準的な方法もし くは本発明の方法により精製することができる。 精製方法 記載されるように、アデノウイルス中に工作されたリガンドに対する基質は、 細胞の表面上に存在する必要はない。例えば、基質は支持体、例えば、プラスチ ック、ガラス、金属、樹脂またはクロマトグラフィー分離やアフィニティー分離 によく用いられる他の材料のような無生物の支持体上に位置していてもよい。こ のような支持体の例としては、金属、天然高分子性炭水化物および合成により修 飾、架橋もしくは置換されたそれらの誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋さ れたアルギン酸、置換もしくは架橋されたガーゴム、特に硝酸およびカルボン酸 との−セルロースエステル、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテル ；架橋もしくは修飾されたゼラチンを含めた、蛋白質および誘導体などの窒素含 有天然高分子；ラテックスやゴムなどの天然炭化水素高分子；ポリエチレン、ポ リプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分 加水分解された誘導体を含むビニルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリメタク リレート、ポリエステルなどの上記重縮合物の共重合体およびターポリマー、ポ リアミド、並びにポリウレタンやポリエポキシドなどの他のポリマーのような、 適度に多孔性の構造をもって調製し得る合成高分子；硫酸バリウム、硫酸カルシ ウム、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩また は炭酸塩、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウム のケイ酸塩等の多孔性の無機材料；および粘土、アルミナ、タルク、カオリン、 ゼオライト、シリカゲル、またはガラス等のアルミニウムまたはケイ素の酸化物 または水和物(これらの材料は上記高分子材料とともにフィルターとして使用し 得る);並びにクロマトグラフィー分離またはアフィニティー分離によく使用され る他の材料のグラフト共重合体等の、上記クラスの混合物または共重合体が挙げ られる。そのような支持体は、ビーズ、フィルム、シート、プレート等に成形す ることができ、あるいはペーパー、ガラス、高分子フィルム、織布などのような 適当な不活性な担体にコーティング、接着、ラミネートまたはそうでなければ連 結することができる。 本発明のアデノウイルスの表面上のリガンドに対する基質が存在すると、アデ ノウイルスを高アフィニティーで且つ高い忠実性で容易に精製することが可能と なる。したがって、本発明は、基質に対するリガンドを有するアデノウイルスを 、該アデノウイルスを含有する組成物から精製する方法を提供する。該方法は、 アデノウイルス上に存在するリガンドが基質に選択的に結合するのを促進する条 件下で、該組成物を該基質に曝露することを含む。続いて、基質に選択的に結合 していない組成物（例えば、少なくとも該組成物の有意な一部）を該基質から除 去した後、基質に結合したアデノウイルスを基質から溶出させる。この方法を用 いると、リガンドを有するアデノウイルスを種々の組成物（例えば、溶液、分散 液、懸濁液、ゲル等）から精製することができる。アデノウイルスは種々の組成 物中に存在し得るが、アデノウイルスを含む一般的な組成物は、アデノウイルス を繁殖させる間にパッケージング細胞から製造されるような細胞ライセートであ る。 先に記載されるように、一般に、基質は支持体に結合される。適切な支持体材 料に所望のリガンド−基質を融合させることは当該分野で知られており、本発明 は基質を有する支持体を工作するいかなる適切な方法も意図している。実際、記 載されるように、基質それ自体がプラスチック、ガラス、金属、樹脂等のような ものであってもよい。アデノウイルス含有組成物を基質に曝露するいかなる方法 も、本発明の方法における使用に適している。例えば、該組成物を基質がその上 に結合した支持体を含むカラムに通すことができる。もちろん、該組成物を、そ のような支持体のスラリー（例えば、ビーズまたは支持体に結合した基質を含む 他の調製物）と混合するか、基質をコーティングした容器（例えば、チューブ、 ディッシュのウェル等）中におくか、そうでなければ基質に曝すかしてもよい。 選択的結合を促進するのに必要な、時間、温度および溶液の化学といったパラ メーターは、リガンドが基質に選択的に結合するアフィニティーに応じて変動し 得る。一般に、公知のリガンド−基質系を使用する場合、これらのパラメーター もまた公知である。しかしながら、新規のリガンド−基質系を使用する場合、本 明細書において論じられるように、結合条件は概ね前もって決定することができ る(例えば、新規のリガンド−基質相互作用について蛋白質ライブラリーをスク リーニングする時のような条件を用いて)。好ましくは、選択的結合のための条 件下では、組成物の他の構成成分は基質に選択的に結合できない。組成物の他の 構成成分が基質に選択的に結合しなければ、基質との会合によって顕著な量のア デノウイルスを組成物から除去することができる。 選択的結合の工程の後、アデノウイルスを奪われた組成物を基質の存在から除 去する(例えば、選択的に溶出させる)。アデノウイルスが基質に選択的に結合し て残るのであれば、アデノウイルスを奪われた組成物をそのように基質から除去 するいかなる適切な方法も使用することができる。言い換えれば、アデノウイル スを奪われた組成物を基質から除去するのに使用される条件は、一般に、アデノ ウイルスを基質から溶出させるのには不十分である。アデノウイルスを奪われた 組成物の除去方法は、主として基質と支持体の種類の関数である。例えば、アデ ノウイルスを奪われた組成物は、いろいろな容量の適切な溶液でカラムをリンス することによって、基質を含むカラムから除去することができる。さらに、アデ ノウイルスを奪われた組成物は、遠心分離、適切な溶液中での再懸濁および再遠 心を繰り返すことによって、基質を含む支持体のスラリーから除去することがで きる。あるいは、支持体が磁性のある材料であれば、溶液を含む容器を磁石に晒 し、磁性のある支持体をリンスすることによって、それを溶液から物理的に除去 することができる。さらに、基質がディッシュまたはウェルに結合している場合 、ディッシュをいろいろな容量の適切な溶液でリンスするだけでよい。 アデノウイルスを奪われた組成物を基質から除去した後、アデノウイルスを基 質から溶出させる。アデノウイルスを基質から分離するいかなる方法も本発明の 方法における使用に適している。多くの応用において、アデノウイルスは、リガ ンド−基質結合に不適合な溶出溶液に支持体−アデノウイルス複合体を曝露する ことによって遊離させることができる。支持体からのウイルスの選択な溶出を促 進するのに必要な、時間、温度および溶液化学といったパラメーターは、リガン ドが基質に選択的に結合するアフィニティーに応じて変動し得る。一般に、公知 のリガンド−基質系を使用する場合、これらのパラメーターもまた公知である。 しかしながら、新規のリガンド−基質系を使用する場合、溶出条件は、例えば、 本明細書において論じられるように、蛋白質ライブラリーをスクリーニングする 時の条件を調整することによって、概ね前もって決定することができる。さらに 、記載されるように、リガンドがスペーサーまたは他のペプチド上でアデノウイ ルスに組み込まれる場合、スペーサーはペプチダーゼ認識配列または他の特異的 開裂モチーフを含むことができる。そのような開裂配列を含むアデノウイルスは 、エンドプロテアーゼや他の薬剤のような開裂をもたらす薬剤に支持体を曝露す ることによって、支持体から遊離させることができる。該開裂方法はアデノウイ ルスからリガンドを切断するが、多くの応用においてこのことは好適である。例 えば、ウイルス精製のためのリガンドは、特定の細胞種にウイルスをターゲッテ ィングするための第二のリガンドを妨害するかもしれない。したがって、精製リ ガ ンドを除去することにより、単離されたウイルスに目的の細胞種をより容易に感 染させることが可能となる。 いかなる適切な結合または溶出条件も使用することができるが、アデノウイル スがその条件で生き残れるかによって実用上の制限がある。しかしながら、アデ ノウイルスは、高塩、高浸透圧および塩基性条件のような広範多様な環境の変化 によく耐え得るので、本法は広範囲の条件下で使用することができる。とにかく 、そのような条件は当業者に知られている。 本発明のアデノウイルス精製方法は、溶液からすべてのウイルスを除去する必 要はなく、大部分のウイルスを除去する必要すらない。実際、多くの応用におい て、最初の組成物中に存在するウイルスの量は支持体上に存在する基質の量を飽 和させ得る。さらに、アデノウイルス上のリガンドは基質に選択的に結合するが 、そのような選択的結合はいかなるアフィニティーを有するものであってもよい 。そのため、たくさんの量の基質が分離工程で利用可能なリガンドと結合できな い。したがって、最初の組成物からできる限り多くのアデノウイルスを取得する ために、本明細書に記載されるように、支持体から除去された、アデノウイルス を奪われた組成物を連続的な精製ラウンドにかけて、各ラウンドから得られるウ イルスを１つのストックに合わせることができる。同様に、最初の組成物の他の 構成成分は樹脂に選択的に結合しないことが好ましいが、少なくとも精製の早い ラウンドで誤った結合が全くないことは稀である。バックグラウンドレベルの誤 った結合が存在すると、得られる最初のウイルスストックには必ず何らかの夾雑 が生じる。そのようなバックグラウンドの夾雑を減少または実質的に排除するた めに、バックグラウンドレベルの夾雑物がゼロに近づくまで、ウイルスストック を連続的な精製ラウンドにかけることができる。したがって、本発明は、公知の リガンドを有するアデノウイルスの、経済的、効率的且つ信頼できる精製手段を 提供する。さらに、スラリーおよびカラムの使用は工業的応用においてありふれ ており、本法を高処理量あるいは商業規模での応用に耐え得るようにしている。 細胞の感染方法 記載されるように、本発明のウイルス上（またはウイルス／ブロッキング蛋白 質複合体上）に存在する非天然のリガンドは、細胞表面結合部位内に存在する基 質を認識することができる。したがって、本発明は、非天然リガンドに対する基 質を含む細胞表面結合部位を有する細胞の感染方法を提供する。該方法は、細胞 にアデノウイルスを接触させてアデノウイルス（またはウイルス／ブロッキング 蛋白質複合体上）の非天然リガンドを、特定の細胞表面結合部位に結合させ、そ れによってアデノウイルスの侵入をもたらすことを含む。本発明のウイルスは天 然の哺乳動物ＡＲに結合する能力が低下したファイバー三量体を一部として包含 するので、該アデノウイルスは主として該非天然リガンドにより細胞にインター ナリゼーションする。したがって、本発明の方法は、天然の哺乳動物ＡＲを介し て細胞を有意に感染させることなく、リガンドに対する基質を含む結合部位を発 現する細胞種への、該リガンドを含むウイルスの選択的なターゲッティングを達 成する。リガンドがペントンベース（改変または非改変ペントンベースのような ）上にある場合、ウイルスはペントン上のリガンドを介してインターナリゼーシ ョンする。 リガンドに対する基質を含む細胞表面結合部位を発現するいかなる細胞も、本 発明にしたがって選択的にターゲッティングされ得る。細胞は単独で存在しても よいし、より大きな細胞集団−例えば、細胞培養(混合または純粋)、腫瘍、組織 (例えば、上皮、筋肉または他の組織)、器官、器官系(例えば、循環器系、呼吸 器系、消化器系、泌尿器系、神経系、皮膚系または他の器官系)、あるいは生物 全体（例えば、ヒト）でさえも−の一部であってもよい。好ましくは、ターゲッ ティングされる細胞は、心臓、血管、平滑筋、骨格筋、肺、肝臓、胆嚢、膀胱お よび眼の細胞からなる群より選択される。 細胞の感染方法は、アデノウイルスが本明細書に記載されるベクターのように 、 パッセンジャー遺伝子を含んで行われるのが理想的である。本発明のアデノウイ ルスがパッセンジャー遺伝子を含む場合、当該方法によりアデノウイルスは標的 細胞にその遺伝子を導入するためのベクターとして働くことが可能となる。いっ たんインターナリゼーションすると、パッセンジャー遺伝子は該細胞内で発現す る。したがって、本発明のベクターおよび方法は、至る所または正規の場所以外 で細胞に遺伝子を有意に供給することなく、選ばれたクラスの細胞にパッセンジ ャー遺伝子を導入するための有用な道具を提供する。 ウイルスの不活性化方法 記載されるように、本発明のウイルス上に存在する非天然のリガンドは血液ま たはリンパ液中に存在する基質（遊離の血液由来蛋白質、赤血球上に存在する蛋 白質等の上に存在するリガンドのような）を認識することができる。したがって 、本発明は血液またはリンパ液由来の基質を認識するリガンドを有するアデノウ イルスを、該基質に該アデノウイルスを曝露することによって不活性化する方法 を提供する。血液またはリンパ液中で、リガンドはその基質に選択的に結合し、 それによって該体液から遊離のウイルスを吸着する。好ましくは、基質は巨大分 子（例えば、アルブミン）中または（ウイルスを繁殖させるのに必要な転写機構 を欠く）赤血球表面上に存在する。もちろん、ウイルスを不活性化するためのリ ガンドは、ウィルスコート上のいかなる位置に存在してもよい(Fenderら，Virol ogy，214，110(1995))。しかしながら、アデノウイルスを認識および／または中 和する抗体は最初にヘキソン上のエピトープに結合するので(Gahery-Segardら， Eur．J．Immunol.，27，653(1997))、ウイルス不活性化のための非天然リガンド は、本明細書に記載されるように、ヘキソン中に組み込まれるのが好ましい。 アデノウイルスを効果的に不活性化する手段を提供することによって、該方法 は所望の位置（組織、細胞種等）にウイルス感染を制限するのを補助する。詳細 には、該方法は、ウイルスを基質に束縛してそれによってそれが細胞に接触する （したがって細胞に侵入する）能力を低下させることにより、個々のウイルスを 効果的に不活性化する。そのように吸着したウイルスが細胞に接触する場合でさ え、基質を有する粒子の存在のせいでインターナリゼーションの可能性は顕著に 低くなるだろう。これらの効果の総計により、本発明の方法は、ウイルスストッ クの有効な遊離力価を劇的に減少させることによって、（所望の感染位置の外側 で）ウイルスストックを効果的に不活性化する。 本発明のウイルス不活性化法は、本発明の他の態様と相補的である。例えば、 述べたように、本発明のウイルスは天然の哺乳動物ＡＲに対するアフィニティー が低下したファイバー三量体を一部として包含し、それによって所望の細胞種以 外の細胞種が該ウイルスに感染する可能性を実質的に低下させる。さらに、本発 明のウイルスはある細胞表面結合部位上に存在する基質に特異的なリガンドを含 むことができ、それによってウイルスを所定の細胞種にターゲッティングするこ とが可能となる。それら２つの性質により選択的なターゲッティングが達成され 、それによって正規の場所以外の感染が顕著に低減するが、血液またはリンパ液 由来の基質を認識するリガンドを有するウイルスはまた、ウイルス力価が効果的 に減少するために、正規の場所以外の組織と接触する可能性すら非常に低い。 当業者は前記記載を読めば十分本発明を実施し得るものと信じるが、以下の実 施例により本発明の特徴のいくつかをさらに説明する。これらの実施例は純粋に 例示目的で挙げられたものであり、いかなる点においても本発明の範囲を限定す るものと解されるべきではない。アフィニティークロマトグラフィー、サザンブ ロット、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ベクター構築(ＤＮＡの抽出、単離、制限消 化、ライゲーション等を含む)、細胞培養(抗生物質による選択を含む)、細胞の トランスフェクション、蛋白質アッセイ（ウェスタンブロッティング、免疫沈降 、免疫蛍光）等のような、これらの実施例において使用される手順は、当業者に よりルーチンに実施されている（例えば、一般に、Sambrookら，Molecular Clon ing，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har bor，NY (1989)を参照）。したがって、簡潔にするために、実験プロトコールは詳細には 述べない。 実施例１ 本実施例では、それぞれがアデノウイルスペントンベースと正しく相互作用す る、非天然の三量体化ドメインを有する２つの異なるファイバー三量体について 記載する。詳細には、該ファイバーキメラはレオウイルス シグマ１三量体化ド メインを一部として包含する。 ２つのキメラ、T5S7sigDelおよびT5sigDelを構築した。T5sigDelは、sigDelに 融合したＡｄ５ファイバーテール（T5）のみを含み、いかなるＡｄファイバーシ ャフトも持たなかった。T5S7sigDelは、sigDelに融合した、該テールおよびＡｄ シャフトの最初の７つのβシート反復（S7）を含んでいた。これら２つのクロー ンのＤＮＡ配列およびそれぞれのアミノ酸配列を配列番号１および配列番号２に 示す。 レオウイルスシグマ１遺伝子のsigDel領域をＰＣＲによって増幅し、ベクター pAcT5S7GCNTS.PS.LS.X（図３Ａ）にクローニングしてバキュロウイルス導入ベク ターpAcT5sigDel.TS.PS.LS（図３Ｂ）を創製した。このベクターは、レオウイル ス３型シグマ１蛋白質のＮ末端三量体化ドメインに融合したＡｄ５ファイバーテ ールをコードし、Ｃ末端付近にＦＬＡＧエピトープが続く。該遺伝子のＣ末端に おいて、該ベクターはまた、該遺伝子へのターゲッティング用および精製用配列 のクローニングを容易にする多数の制限部位を含む。 上記ＰＣＲ産物を制限酵素NheIおよびBamHIで切断し、同じくNheIおよびBamHI で切断したベクターpAcT5S7GCNTS.PS.LS.X（図３Ａ）にこの断片をクローニング して第二のベクターpAcT5S7sigDel.TS.PS.LS（図３Ｃ）を創製した。得られたベ クターはsigDelに融合したＡｄ５ファイバーのテールおよび最初の７つのβシー トシャフト反復を含み、ＦＬＡＧエピトープが続く蛋白質をコードする。 次いで、上記の各プラスミドを用いて、標準的な手段により各ファイバーキメ ラをコードする組換えバキュロウイルスクローンを作製した。得られたバキュロ ウイルスクローンを用いてＴｎ５昆虫細胞内で組換え蛋白質を産生させた。sigD el三量体化ドメインとGCNドメインと比較するために、最初のプラスミドpAcT5S7 GCNTS.PS.LS.X（図３Ａ）から、sigDel三量体化ドメインの代わりにGCN三量体化 ドメインを含む別のバキュロウイルスを構築した。 バキュロウイルス感染細胞を感染３日後にペレット化した。該細胞ペレットを プロテアーゼ阻害剤を加えたＰＢＳ中に再懸濁し、３回凍結融解して可溶性の細 胞内蛋白質を放出させた。次いで、細胞デブリスを高速遠心してペレット化し、 澄明化した細胞ライセートを除去した。次いで、ペレットを先と同量のＰＢＳに 再懸濁した。 次に、ペレット試料とライセート試料を０．１％ ＳＤＳ、１２．５％ポリア クリルアミドゲル上に流し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＭＡｂ（Kodak）を用いたウェス タン分析のためにニトロセルロースに転写した。これらの結果、各蛋白質T5S7GC N.TS.PS.LS、T5sigDel.TS.PS.LSおよびT5S7sigDel.TS.PS.LSの９０％を超える量 がライセート中に可溶であることがわかった。 蛋白質を三量体形成能についてさらにアッセイした。キメラの三量体化を試験 するために、０．１％ ＳＤＳ、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上に試料を 流す前に、各試料由来のライセートを煮沸した、あるいは煮沸しなかった。煮沸 試料のウェスタン分析より、煮沸試料は単量体蛋白質のサイズに相当する分子量 に移動することがわかったが、sigDel三量体化ドメインを含む非煮沸蛋白質は三 量体と同程度の分子量に移動した。非煮沸のT5S7GCN.TS.PS.LS蛋白質もまた三量 体として移動したが、非煮沸試料のかなりの部分（半分を超える）が単量体とし て移動した。野生型ファイバーとシグマ１蛋白質についての同様な分析から、こ れらの蛋白質は煮沸しない場合は完全に三量体として、煮沸した場合は単量体と して移動することがわかっている。 蛋白質のほとんどが（ペレットではなく）ライセートに可溶であったことは、 それらが正しくフォールディングされていたことを強く示唆する。さらに、非煮 沸試料の移動は、sigDel含有キメラが可溶性の三量体であり、sigDelドメインが より安定な三量体ファイバーキメラを形成することによってGCNよりも良好に機 能することを示している。 三量体がアデノウイルスペントンベース蛋白質と正しく複合体を形成すること ができることを試験するために、組換えペントンベースを溶液中でT5S7GCN.TS.P S.LS、T5sigDel.TS.PS.LSおよびT5S7sigDel.TS.PS.LS三量体ファイバー蛋白質と 混合する。次いで、得られたペントンベース／ファイバーキメラ複合体をプロテ インＡ−アガロースにカップリングした抗ペントンベース抗体と免疫沈降させる 。次に、沈降した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、上記のようにＦＬＡＧ 抗体を用いてウェスタン分析によって評価する。ＦＬＡＧ抗体の結合は、ＦＬＡ Ｇエピトープを含むファイバーキメラが、溶液中でペントンベースと複合体形成 することを示す。 実施例２ 本実施例では、ファイバー−sigDelキメラがペプチドタグよりも大きな外因性 蛋白質ドメインを組み込み得ることを実証する。 改変型グリーン・フルオレセント・プロテインをコードする配列を、実施例１ における上記ファイバー−sigDelキメラプラスミド中への効率よいクローニング を可能にする制限部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＧＦ Ｐ配列をpAcT5sigDel.TS.PS.LS（図３Ｂ）のSpeI部位に正しい方向でクローニン グして、ファイバー−sigDel−ＧＦＰキメラをコードするプラスミドpAcT5sigDe l.GFP.TS.PS.LS（図４）を得た。このクローンのＤＮＡおよびアミノ酸配列を配 列番号３として示す。 次いで、このプラスミドを用い、上記のようにバキュロウイルス発現系を使用 して組換え蛋白質を産生させた。該キメラファイバー蛋白質の可溶性（正しいフ ォールディングを示す）および得られた蛋白質のペントンベース結合能（三量体 化を示す）を上で論じたようにして確認した。ＧＦＰドメインを含む可溶性の三 量体蛋白質の生産は、大きな機能的蛋白質ドメインを、より小さなペプチドタグ と同じぐらい容易にファイバー−sigDelキメラ中に組み込み得ることを示す。そ の結果から、このようなキメラはまた、ＳｃＡｂのようなリガンドも蛋白質機能 を有意に妨げることなく一部として取り込むであろうと予測される。 実施例３ 本実施例では、非天然の三量体化ドメインを有するファイバー三量体を含む組 換えアデノウイルスベクターの構築について記載する。 pAcT5S7sigDel.TS.PS.LS（図３Ｃ）からNdeIからBamHIまでの断片を切り出し 、pAS pGS HAAV（図５Ａ）およびpAS pGS pK7（図５Ｂ）中の対応する断片と置 換して、それぞれ最終の導入ベクターpAS T5S7sigDelpGS.HAAV（図５Ｃ）および pAST5S7sigDelpGS.pK7（図５Ｄ）を製造する。該ベクターは、そのＣ末端に、２ ９３細胞により発現されるａ_Vインテグリンおよびヘパリン硫酸含有受容体との 結合のためのＲＧＤまたはｐＫ７結合ドメインを含むファイバー−sigDelキメラ をコードする。 次いで、これらのベクターを線状化し、それからトランスフェクトする２９３ 細胞を、該プラスミドでトランスフェクトする前に、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４欠失アデ ノウイルスAdCMVZ.11A（GenVec，Inc.，Rockville，MD）と予備インキュベート する。Ｅ４＋のｐＮＳプラスミドとＥ４欠失ベクターとの組換えにより、２９３ 細胞内で複製し得るＥ１−、Ｅ３−、Ｅ４＋ベクターがレスキューされる。５日 後に感染／トランスフェクトした細胞を集め、溶解してビリオンを放出させる。 次いで、ライセートを用いて新鮮な培地にプレーティングした細胞を感染させ、 さらに組換えウイルスをプラーク精製する。元のAdCMVZ.11A株が交叉夾雑するプ ラ ークは、Ｘ−ｇｌｕ基質含有培地中でプラーキングさせると青色を呈する。次い で、（生育し得るベクターを示す）白色プラークを増幅して組換えアデノウイル スの純粋なウイルスストックを製造する。 実施例４ 本実施例では、キメラファイバーをコードするゲノムを有する、ターゲッティ ングされるアデノウイルス粒子の製造について記載する。該キメラファイバーは 、レオウイルス由来のsigDel三量体化ドメインに融合したＡｄ５ファイバーテー ルおよび７つのシャフト反復を呈示し、ａ_Vインテグリンとの結合に高いアフィ ニティーを有するＲＧＤ配列が続く。 プラスミドpAST5S7sigDel.HAAV（図５Ｃ）を制限酵素DrdIで切断し、全アデノ ウイルス配列を含む大きな断片を単離・精製する。次いで、pAS T5S7sigDel.HAAV プラスミドと同一の配列の小さな重複を有する、ファイバー遺伝子に先立つＡｄ ゲノムの大部分を含む線状化したプラスミドとともに、この断片をＢＪ５１８３ 細菌細胞中にエレクトロポーレーションする。二片のＤＮＡの組換え後に、新た なプラスミドが該細菌細胞内に相同組換えを通じて産生する。このプラスミドは 、適当な相補的哺乳動物細胞株（Ｅ１およびファイバー相補的）内で複製し得る 改変されたアデノウイルスゲノムをコードする。選択されたコロニー由来のプラ スミドＤＮＡを単離し、制限分析によって正しいプラスミドであることを確認す る。次に、ファイバー相補的細胞株へのトランスフェクション用に適量のＤＮＡ を取得するために、このプラスミドＤＮＡを用いてＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換 する。 プラスミド１μｇを適当な制限酵素で切断し、上記の細胞株のようなファイバ ー相補的細胞株中にトランスフェクトする。トランスフェクション後０〜４日目 に細胞を亜鉛で誘導し、１〜５日後に細胞を溶解する。ライセートを新鮮なファ イバー相補的細胞株上で継代する。細胞に細胞変性効果が現れるまでこの継代と 溶解のサイクルを繰り返す。組換えベクターが増幅するにつれてそれも増加する はずなので、該サイクルの間、細胞ライセートのＬａｃＺ活性もフォローする。 いったん十分な力価の「混合」ストックが得られれば、非ファイバー相補的細胞 上で最後の継代を行って、天然のファイバー蛋白質を欠く、ターゲッティングさ れるウイルスを産生させる。次いで、得られたウイルスが、その高アフィニティ ーＲＧＤ配列とａ_Vインテグリンとの相互作用を介して細胞に結合し、その中に 侵入し得ることを調べる。 実施例５ 本実施例では、非天然の三量体化ドメインを有する４つの異なるファイバー三 量体について記載する。詳細には、例示されるファイバー三量体は、ブタアデノ イド株であるNADC-1ファイバーのノブ部分を組み込んだキメラである。したがっ て、例示される三量体は、公知の受容体結合モチーフ（すなわち、ガレクチンモ チーフおよびＲＧＤモチーフ）を含む。さらに、例示の三量体は、該受容体結合 モチーフのそれぞれのアフィニティーを低下させることが知られている変異を組 み込んでいる。最後に、本実施例では、非天然の三量体の露出したループ中への 非天然リガンド（ＦＬＡＧ）の組込みについて記載する。 ＰＣＲを用いて、全長遺伝子を含むプラスミドからNADC-1ファイバー遺伝子の ノブを増幅した。次いで、バキュロウイルス発現プラスミドに該ＰＣＲ産物をク ローニングして、NADC-1ノブと、精製および抗ポリヒスチジン抗体を用いたウェ スタン分析による検出のためのＮ末端ポリヒスチジンタグ(Ｐｉｇ４ＫＮ蛋白質) をコードするプラスミドを製造した。このクローンのＤＮＡおよびアミノ酸配列 を配列番号４に示す。 次に、２つのオリゴヌクレオチドプライマー対、PigD363Es（配列番号１０） およびPigD363Ea(配列番号１１)並びにPigN437Ds(配列番号１２)およびPigN437D a（配列番号１３）を用いて、部位特異的変異誘発により得られたプラスミドpAc Pig4KN（図６Ａ）を変異させた。前者のプライマー対を用いて、ＲＧＤインテ グリン結合モチーフ（天然ファイバー蛋白質のアミノ酸３６１〜３６３）をコー ドするＤＮＡ配列が非機能的な配列ＲＧＥに変異したプラスミドpAcPigKND363E （図６Ｂ）を製造した。第二のプライマー対を用いて、天然のアミノ酸Ｎ（アミ ノ酸４３７）をコードするＤＮＡ配列がＤに変異したプラスミドpAcPigKN N437D （図６Ｃ）を製造した。この変異は別のガレクチン蛋白質がそのリガンドである ガラクトースに結合しないようにすることが以前にわかっている（Hirabayashi ら，J．Biol．Chem.，266，23648-53(1991)）。 NADC-1ノブ上の露出したループ中に新規な結合モチーフを組み込むことができ るのを実証するために、最後のバキュロウイルスプラスミドを構築した。NADC-1 ノブ蛋白質の疎水性分析から、ＲＧＤモチーフの直前の蛋白質配列がおそらく、 ターゲッティングや精製のための付加的アミノ酸配列（例えば、ポリペプチドド メイン）を組み込むことができるだろう露出したループであるらしいことが明ら かになった。したがって、ＦＬＡＧ結合ドメインをコードする相補的な重複する オリゴヌクレオチドを用いて、プラスミドpAcPig4KN(FLAG)（図６Ｄ）を製造し た。該オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＲＧＤドメインをコードする配 列の直前にユニークな天然の制限部位AvrIIを含むプラスミドpAcPig4KN（図１１ Ａ）にクローニングした。 NADC-1ノブ遺伝子を担持する上記の４つのバキュロウイルス導入ベクターを用 い、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞内で組換え蛋白質を発現させた 。Ｔｎ５昆虫細胞をプラスミド由来の組換えバキュロウイルスクローンに感染さ せた。３日後、細胞をペレット化し、プロテアーゼ阻害剤を加えたＰＢＳ中で３ 回凍結融解して可溶性の細胞内蛋白質を放出させた。デブリスをペレット化して 澄明化したライセートを傾斜法で除いた。残ったペレットをＰＢＳに再懸濁した 。 次いで、ライセートおよびペレット試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン 分析で評価し、組換えノブ蛋白質が可溶性であるかどうかを測定した。ウェスタ ン分析の結果、４つのノブ蛋白質すべてについて、その大部分が細胞ライセート 中に存在することが明らかとなり、それらが可溶性で正しくフォールディングさ れていることがわかった。これらの結果は、露出したループ中に挿入された受容 体結合ドメインおよびＦＬＡＧ結合配列中に導入された点変異は、どちらもノブ のフォールディングおよび可溶性に悪影響を及ぼさなかったことを示している。 NADC-1ノブ−ＦＬＡＧドメインを有するキメラ三量体がＦＬＡＧ抗体と相互作 用し得るかどうかを調べるために、ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いて細胞ライセート を免疫沈降させ、次いでブロッティングする。ウェスタン分析により、ＦＬＡＧ エピトープを含むNADC-1ノブが抗ＦＬＡＧ抗体によって沈降することがわかるだ ろう。したがって、NADC-1−ファイバー三量体は可溶性であり、それぞれが抗Ｆ ＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体と相互作用することができる。 実施例６ 本実施例では、NADC-1（ブタアデノウイルス）ファイバーノブを含む、Ａｄ５ をベースにした組換えベクターの合成について記載する。 ＰＣＲを用いて、全長遺伝子を含むプラスミドからNADC-1ファイバー遺伝子の ノブを増幅した。次いで、該ＰＣＲ産物をプラスミドPNS F5F2K（図７Ａ）にク ローニングして、NADC-1ノブに融合したＡｄ５シャフトの最初の７つのβ反復を コードするプラスミドpNS Pig4.SS（図７Ｂ）を製造した。このクローンのＤＮ Ａおよびアミノ酸配列を配列番号５に示す。 次に、pNS Pig4.SSプラスミドを用いて組込みアデノウイルスベクターを創製 した。Ｅ４領域を欠くアデノウイルスベクターに感染した２９３細胞に該プラス ミドをトランスフェクトした。プラスミドとベクターとの間の相同組換えにより 、キメラNADC-1ファイバーを有する、Ｅ４含有の、複製能力のあるベクターが産 生された。次いで、該組換えウイルスを２９３細胞上でプラーク精製した。（ａ_V インテグリンを発現せず、アデノウイルスのファイバー蛋白質に対する受容体 を 発現する）ラモス細胞を組換えNADC-1ノブと予備インキュベートすると、AdZ.Pi gSSベクターによるこれらの細胞の形質導入がブロックされ、該ベクターが機能 的なNADCノブを含むことがわかった。この結果は、キメラNADC-1ファイバーが正 しく合成され、生育し得るウイルス粒子中に組み込まれることを示している。 実施例７ 本実施例では、受容体結合能が低減し、且つ機能的な非天然リガンドを含む変 異NADC-1ノブを含有するキメラファイバー三量体を有する、Ａｄ５をベースとし たアデノウイルスベクターについて記載する。 pAcPig4KN N437D（図６Ｃ）中のＮ−Ｄ変異を含むApaIからBamHIまでの断片を 、ＲＧＤ−ＲＧＥ変異を含むプラスミドpAcPig4KN D363E（図６Ｂ）にクローニ ングして、NADC-1ノブ遺伝子中に両方の変異を含むプラスミドpAcPig4KN D363E N437D（図８Ａ）を創製する。その後、高アフィニティーのａ_Vインテグリン結合 ドメインをコードする、重複する相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを天然 のAvrII部位にクローニングしてプラスミドpAcPig4KN D363E N437D HAAV（図８ Ｂ）を製造する。次に、変異したNADC-1遺伝子のEcoRIからBamHIまでの断片を、 プラスミドpNSPig4.SS(図７Ｂ)にクローニングして、プラスミドpNSPig4 D363E N437D HAAV SS（図８Ｃ）を創製する。次いで、このプラスミドを用いて、上記 のような変異した、ａ_VインテグリンにターゲッティングされるNADC-1ノブを含 む組換えアデノウイルスベクターを創製する。 NADC-1ノブ中の二重変異が、天然の細胞表面結合部位（ガレクチンおよびイン テグリン）への結合をブロックし得ることを、競合アッセイにより確認する。さ らに、得られたウイルスが細胞表面のａ_Vインテグリンをターゲッティングし得 ることを、上で論じたように２９３細胞を用いて確認する。 実施例８ 本実施例では、天然のアデノウイルス受容体との結合を妨害し得る２つのキメ ラブロッキング蛋白質について記載する。特に、該ブロッキング蛋白質は、それ ぞれ天然のアデノウイルスファイバーに対する基質を有するドメイン、すなわち ＣＡＲの細胞外ドメインを含む。 ＣＡＲの細胞外ドメインを、ＰＣＲによりＣＡＲ遺伝子（Bergelsonら，上述; Tomkoら，上述）から増幅した。次いで、該ＰＣＲ産物をバキュロウイルス発現 ベクターにクローニングして、プラスミドpACSG2-sCAR（図９Ａ）を創製した。 可溶性のＣＡＲ蛋白質（ｓＣＡＲ）はまた、精製およびウェスタン分析による検 出のためのＦＬＡＧエピトープを含んでいた。このｓＣＡＲクローンのＤＮＡお よびアミノ酸配列を配列番号６に示す。 ｓＣＡＲを含むバキュロウイルスクローンを用いて昆虫細胞内で生産されるｓ ＣＡＲのウェスタン分析より、該蛋白質は細胞から分泌され、また該蛋白質のい くらかは細胞内にとどまることが明らかとなった。 ｓＣＡＲ蛋白質が天然のＣＡＲの機能を保持しているかどうかを調べるために 、放射標識したアデノウイルス２型を、種々の濃度のｓＣＡＲを含む溶液中で予 備インキュベートしてから、２９３細胞に曝露した。データから、ｓＣＡＲの濃 度が増すとウイルスの２９３細胞への結合がブロックされることが実証された。 この結果から、可溶性のｓＣＡＲ蛋白質がＣＡＲの天然の細胞外ドメインの構造 および機能を保持していることがわかった。さらに、これらの結果から、ｓＣＡ Ｒと予備インキュベートすることにより、アデノウイルスファイバー上のＣＡＲ 結合リガンドを介した天然のアデノウイルス受容体との結合を除去できることが わかった。 ＲＧＤターゲッティングモチーフをコードするＤＮＡ配列がｓＣＡＲのＣ末端 の後のSpeI部位にクローニングされた第二のｓＣＡＲ含有キメラを、相補的な、 重複するプライマーを用いて製造した。該キメラ遺伝子はＣ末端上にＦＬＡＧエ ピトープを保持していた。得られたプラスミドSG2-sCAR-HAAV（図９Ｂ）を用い 、上記のｓＣＡＲ蛋白質について行ったのと同様にして、組換えｓＣＡＲ．ＲＧ Ｄ蛋白質を産生させた。このクローンのＤＮＡ配列を配列番号７に示す。 ｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質を合成し、ｓＣＡＲ蛋白質と同様に昆虫細胞から分泌 させた。ｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質が天然のＣＡＲの機能を保持しているかどうか を調べるために、放射標識したアデノウイルス２型を種々の濃度のｓＣＡＲ．Ｒ ＧＤを含む溶液中で予備インキュベートした後、ａ_Vインテグリンではなくアデ ノウイルスのファイバー蛋白質に対する受容体を発現するラモス細胞に曝露した 。放射標識したアデノウイルス２型をｓＣＡＲまたはｓＣＡＲ．ＲＧＤと予備イ ンキュベートすると、ウイルスのラモス細胞への結合がブロックされた。この結 果は、ｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質中に存在するｓＣＡＲドメインが機能的であるこ とを示している。 ｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質が天然のＲＧＤドメインの機能を保持しているかどう かを調べるために、細胞接着研究を行った。ｓＣＡＲ．ＲＧＤとｓＣＡＲをどち らも組織培養用のプラスチックプレート上に固定し、続いてそれに（ａ_Vインテ グリンを発現する）２９３細胞を接触させた。コーティングしたプレート上で細 胞をインキュベートした後、プレートをリンスし、プレートに接触して残ってい る細胞数を調べた。その結果、細胞はｓＣＡＲ．ＲＧＤでコーティングしたプレ ートには付着するが、ｓＣＡＲでコーティングしたプレートおよびコントロール プレートには付着しないことがわかり、ｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質中に存在するＲ ＧＤモチーフが機能的であることが実証された。 実施例９ 本実施例では、細胞表面結合部位に対するリガンドを有するキメラブロッキン グ蛋白質を用いて、アデノウイルスのターゲッティングを指示する本発明の方法 について説明する。 実施例８に上記されるように、ｌａｃＺリポーター遺伝子を担持するアデノウ イルスベクターをｓＣＡＲ．ＲＧＤ蛋白質またはｓＣＡＲ蛋白質と予備インキュ ベートする。次いで、ウイルス感染に適した条件下で、得られた複合体をラモス 細胞（ファイバー受容体（ＣＡＲ）を発現するが、ａ_Vインテグリンを欠く）ま たはＨｕＶＥＣ細胞（ＣＡＲとａ_Vインテグリンの両方を発現する）に曝露する 。その後ｌａｃＺの発現について細胞をアッセイする−そのレベルは細胞がウイ ルスに感染する度合いと相関するだろう。その結果から、ラモス細胞のアデノウ イルス形質導入についてはｓＣＡＲとｓＣＡＲ．ＲＧＤはどちらも効果的にブロ ックするが、ＨｕＶＥＣ細胞のアデノウイルス形質導入については、ｓＣＡＲは ブロックするがｓＣＡＲ．ＲＧＤはブロックしないことが示され、Ａｄ／ｓＣＡ Ｒ．ＲＧＤ複合体は、ＣＡＲを介したアデノウイルス介在性の細胞への遺伝子送 達を回避しつつ、ａ_Vインテグリンにターゲッティングされる。 実施例１０ 本実施例では、天然のアデノウイルス受容体との結合を妨害する三量体を形成 し得る２つのキメラブロッキング蛋白質について記載する。特に、該ブロッキン グ蛋白質は、それぞれ天然のアデノウイルスファイバーに対する基質を有するド メイン、すなわちＣＡＲの細胞外ドメインと、三量体化ドメイン、すなわちシグ マ１ レオウイルス蛋白質のsigDel三量体化ドメインとを含む。 シグマ１ レオウイルス蛋白質のsigDel三量体化ドメインをＰＣＲによって増 幅し、得られたＰＣＲ産物をpAcSG2-sCARプラスミド（図９Ａ）にクローニング する。得られたプラスミドpAcSG2sCAR.sigDel（図１０Ａ）は、ＣＡＲの細胞外 ドメイン、スペーサー領域、レオウイルスのシグマ１蛋白質由来の三量体化ドメ インおよびＦＬＡＧ結合ドメインをコードする遺伝子キメラを含む。三量体化ド メインの後のSpeI制限部位により、ａ_Vインテグリンに結合する高アフィニティ ーのＲＧＤモチーフのようなターゲッティングドメインの簡便なクローニングが 可能となる。このクローンのＤＮＡおよびアミノ酸配列を配列番号８に示す。 PAcsCAR.sigDelを用いてバキュロウイルスを作製した。バキュロウイルス感染 細胞由来の煮沸した、および煮沸していないライセートのウェスタン分析より、 非煮沸のキメラsCAR.sigDelは三量体として移動することがわかった。 sCAR.sigDelのＣ末端の後のSpeI部位にＲＧＤターゲッティングモチーフをコ ードするＤＮＡ配列がクローニングされた第二のｓＣＡＲ含有キメラを、相補的 な、重複するプライマーを用いて製造する。得られたプラスミドpAcSG2-sCARsig Del（HAAV）(図１０Ｂ)は、ＣＡＲの細胞外ドメイン、スペーサー領域、レオウ イルスのシグマ１蛋白質由来の三量体化ドメインおよびａ_Vインテグリンに結合 する高アフィニティーのＲＧＤモチーフを有するキメラをコードする。 pAcSG2sCAR.sigDelおよびpAcSG2-sCARsigDel.RGD(HAAV)プラスミドを用いて、 標準的な手段により、昆虫細胞内で組換えキメラ蛋白質を生産するのに使用する 組換えバキュロウイルスを製造した。バキュロウイルス感染細胞由来の煮沸した 、および煮沸していないライセートのウェスタン分析より、非煮沸のsCAR.sigDe l蛋白質は三量体として移動することがわかった。 三量体のsCAR.sigDelおよびsCARsigDel.RGD蛋白質がアデノウイルス感染をブ ロックし得ることを調べるために、ｌａｃＺリポーター遺伝子を担持するアデノ ウイルスベクターをsCAR.sigDelもしくはsCARsigDel.RGD三量体またはｓＣＡＲ 単量体蛋白質と予備インキュベートする。いくつかの濃度を使用して用量応答デ ータを作る。次いで、ウイルス感染に適した条件下で、得られた複合体を２９３ 細胞に曝露する。その後、ｌａｃＺの発現について細胞をアッセイする−そのレ ベルは細胞がウイルスに感染する度合いと相関するだろう。その結果は、三量体 のsCAR.sigDelおよびsCARsigDel.RGD蛋白質が、ｓＣＡＲ単量体よりも、ｓＣＡ Ｒ蛋白質を介したアデノウイルスの細胞への結合をより強力にブロックすること を実証するだろう。 実施例１１ 本実施例では、細胞表面結合部位に対するリガンドを有する三量体ブロッキン グ蛋白質を用いて、アデノウイルスのターゲッティングを指示する本発明の方法 について説明する。 ｌａｃＺリポーター遺伝子を担持するアデノウイルスベクターを、上記のsCAR .sigDel、sCARsigDel.RGDまたはsCARと予備インキュベートする。同様に、該ア デノウイルスを、例えばファージディスプレイにより単離されたブロッキング蛋 白質と予備インキュベートすることもできる。次いで、ウイルス感染に適した条 件下で、得られた複合体をラモス細胞またはＨｕＶＥＣ細胞に曝露する。その後 、ｌａｃＺの発現について細胞をアッセイする−そのレベルは細胞がウイルスに 感染する度合いと相関するだろう。その結果は、そのような蛋白質はラモス細胞 のアデノウイルス形質導入を効果的にブロックするが、三量体の方がｓＣＡＲ単 量体よりも強力にアデノウイルスの結合をブロッキングすることを示すだろう。 さらに、ｓＣＡＲとsCAR.sigDelはどちらもＨｕＶＥＣ細胞のアデノウイルス形 質導入をブロックするだろうが、sCARsigDel.RGDはＨｕＶＥＣ細胞のアデノウイ ルス形質導入を効果的にはブロックしないだろう。そのような結果は、AdsCARsi gDel.RGD複合体が、ＣＡＲを介したアデノウイルス介在性の細胞への遺伝子送達 を回避しつつ、ａ_Vインテグリンにターゲッティングされることを強く示唆して いる。 実施例１２ 本実施例では、それぞれが、天然の基質、特に天然のファイバーノブに対して 生じたモノクローナル抗体に対してアフィニティーが低下している変異ファイバ ーノブの構築および評価について記載する。 部位特異的変異誘発を用いて、バキュロウイルスベクター中の全長Ａｄ５ファ イバー遺伝子に別個の変異を導入した。次いで、得られたプラスミドを用いて組 換えバキュロウイルスクローンを作製した。 各々の変異体と天然のＡｄ５ファイバーコントロールを用いて感染昆虫細胞内 で蛋白質を生産させた。感染３日後に細胞を集めて溶解した。Ａｄ５ファイバー を認識するポリクローナル抗血清を用いたウェスタン分析より、各々のベクター に感染した細胞由来のライセート中に大量のファイバー蛋白質が存在することが 明らかとなった。５つの変異クローンに感染した細胞（表１を参照）（および天 然のファイバー遺伝子）において、シグナルはライセートの可溶性部分に支配的 に存在し、各変異体にコードされる蛋白質が正しくフォールディングしているこ とがわかった。野生型のＡｄ５ファイバーの配列を配列番号９に示す。これらの 変異のそれぞれによって変化した配列番号９のアミノ酸を表１に示す。 ウェスタンスロットブロット分析を用いて、５つの可溶性変異ファイバー蛋白 質のそれぞれ、天然のＡｄ５ファイバーおよび変性したＡｄ５ファイバーを、フ ァイバーノブに対して生じた４つのモノクローナル抗体のパネルに対してスクリ ーニングした。化学発光によりシグナルを検出し、各バンドのシグナル強度を比 較した。このアッセイの結果を表１に示す。 変性したファイバーを認識する抗体がないということは、各々が正しくフォー ルディングされた三量体ファイバーにのみ結合することを示している。さらに、 ２Ｅ５抗体に対するアフィニティーが低下した変異体がなかったことから、各変 異ファイバーが実際に三量体であることが確認された。 Ｋ５０６Ｒ変異は、他のいずれの抗体に対するアフィニティーにも影響するこ となく、得られるファイバーの３Ｄ９抗体に対するアフィニティーを顕著に低下 させた。ファイバーノブ中のこの変異の位置を図１５Ａ〜１５Ｃに示した。 セリンおよびグリシンに代えることによって４〜６アミノ酸を置換したＣＤ、 ＩＪまたはＦＧループ内の変異は、得られる変異三量体の２Ｃ９抗体に対するア フィニティーを顕著に低下させた。さらに、二重変異Ｔ５３３Ｓ／Ｔ５３５Ｓは 、４Ｂ８抗体に対する変異ノブのアフィニティーも低下させた。ファイバーノブ 中のこれらの変異の各位置を、図１５Ｄ〜１５Ｆに示す。 これらの結果は、天然の基質に対するアフィニティーが低下した三量体ファイ バーノブを生じさせ得ることを示している。同様のスクリーニングプロトコール を用いて、細胞の受容体に対するアフィニティーが低下した変異体を同定するこ とができる。例えば、上述のような、ＦＬＡＧエピトープ（または他のタグ）を 有する可溶型のｓＣＡＲを、上記モノクローナル抗体の代わりにプローブとして 用いることができる。次いで、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いてブロット をスクリーニングし、ファイバーとＣＡＲの結合を妨害する変異を検出する。 実施例１３ 本実施例では、短シャフト化ファイバー（例えば、８シャフト反復）、および その天然の受容体（すなわち、ＣＡＲ）に対するアフィニティーが低下した変異 ファイバー（５）ノブを含む組換えアデノウイルスの構築について記載する。そ のようなファイバーは、ペントンベース中に発現したリガンドを介したターゲッ ティングを可能にする。 標準的な組換え技術を用いて、ファイバーシャフトをコードする配列中に欠失 を導入する。例えば、第２２番目のシャフト反復からコード配列の最後までの、 Ｋ５０６Ｒ変異（実施例１２を参照）を含む、変異ファイバーノブの一部を、Ｐ ＣＲにより配列番号８から増幅する。得られた産物を用いてpAS T5S7F5K(R506K) プラスミド（図１６）を創製する。したがって、該プラスミドは、天然の基質（ ３Ｄ９抗体）に対するアフィニティーが低下した短シャフト化ファイバーをコー ドする遺伝子を含む。そのような短シャフト化ファイバーを有するアデノウイル スは、ペントンベース上のＲＧＤリガンドを介して細胞に結合することができる だろう。もちろん、同様の戦略を用いてＣＡＲに対するアフィニティーが低下し た短シャフト化ファイバーを有するアデノウイルスベクターを創製することがで きる。 実施例１４ 本実施例では、アフィニティークロマトグラフィーによりベクターを精製する のに使用することができる、特異的な非天然リガンドを有するアデノウイルスベ クターの構築について説明する。 ベースとなるベクターpNSF5F2K（図８Ａ）はＡｄ５ファイバーのシャフトとＡ ｄ２ファイバー蛋白質のノブを有するキメラファイバーをコードする遺伝子を含 む。Ａｄ２ファイバー遺伝子は、フレキシブルな、ファイバーノブの露出したＨ Ｉループをコードするノブ領域内にSpeI制限部位を含む。このSpeI制限部位を用 いてＦＬＡＧペプチド（配列番号１６）またはＤＮＡ／ヘパリン結合リガンド（ 配列番号１５）をコードする配列を挿入した。 ベースとなるベクターpBSSpGS（図１１Ａ）はＣ末端の１２アミノ酸の延長（ 配列番号１４）をコードする。ＴＳをコードするコドンはまた、下記のようなＦ Ｌ ＡＧペプチド（配列番号１６）またはＤＮＡ／ヘパリン結合ポリペプチド(配列 番号１５)をコードする配列を挿入するのに使用されたユニークなSpeI部位でも ある。 アデノウイルスゲノムにＤＮＡ／ヘパリン結合リガンドを導入するための導入 プラスミド（pBSSpGS(RKKK)2（図１１Ｂ）およびpNSF5F2K(RKKK)2(図１１Ｃ)） を、重複するオリゴヌクレオチドを用いて創製した。センスおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドを等モル比で混合し、pBSS pGS（図１１Ａ）またはpNS F5F2 K（図８Ａ）のSpeI部位にクローニングして、該導入プラスミドを創製した。イ ンサートの領域を横切って両方向にシーケンシングを行い、適当な配列を含むク ローンであることを確かめた。 同様に、ＦＬＡＧリガンド（配列番号１６）をアデノウイルスゲノムに導入す るための導入プラスミドpBSSpGS(FLAG)（図１１Ｄ）およびpNSF5F2K(FLAG)（図 １１Ｅ）を創製した。インサートの領域を横切って両方向にシーケンシングを行 い、適当な配列を含むクローンであることを確かめた。 ４つの導入ベクター由来のプラスミドＤＮＡをSalIで線状化し、精製して、Ｅ １、Ｅ３、Ｅ４欠失アデノウイルスAdCMVZ.11A（GenVec，Inc.，Rockville，MD ）と細胞あたり１ｆｆｕの多重度で１時間予備インキュベートした２９３細胞に 、リン酸カルシウムを用いてトランスフェクトした。Ｅ４＋のpNSプラスミドと Ｅ４欠失ベクターとの組換えの結果、２９３細胞内で複製し得るＥ１−、Ｅ３− 、Ｅ４＋ベクターがレスキューされた。得られたベクターAdZ.F2K(RKKK)2、AdZ. F2K(FLAG)、AdZ.F(RKKK)2およびAdZ.F(FLAG)を、２９３細胞上で連続２ラウンド のプラーキングを行って単離した。 インサートＤＮＡ領域にまたがるプライマーを用いて、ウイルスＤＮＡ鋳型由 来のＰＣＲ産物をシーケンシングすることにより、各ベクターが正しいインサー トを含むことを確かめた。各ウイルス由来のＡｄ ＤＮＡの制限分析から、ウイ ルスが純粋であり、且つ正しく構築されたウイルスにユニークなBamHI制限部位 を 含むことがわかった。 実施例１５ 本実施例では、非天然のリガンドを有するアデノウイルスベクターが、そのリ ガンドに対する基質にコンジュゲートした支持体に結合し得ることを実証する。 上記ベクターと同様に、ベクターAdZ.PKを構築した。該ウイルスはポリリジン を含むファイバー蛋白質を有する。AdZ.PKをアッセイして、該ウイルスが、ポリ リジンに対する基質であるヘパリンを有する支持体に結合するかどうかを測定し た。１５０、３００、５００および１０００ｍＭ ＮａＣｌをそれぞれ含有する リン酸緩衝液１．０ｍｌにヘパリン−アガロースビーズ（SIGMA）５０ｍｌを加 えた。次いで、該ヘパリン−アガロースビーズ含有食塩緩衝液に６６００ｃｐｍ のAdZまたはAdZ.PKを加えて６０分間振盪した。それからインキュベーション緩 衝液（それぞれ１５０、３００、５００および１０００ｍＭ）と等塩濃度の緩衝 液で３回ビーズを洗浄した。次いで、ビーズに付随したｃｐｍを測定したところ 、AdZ.PKは１５０、３００および５００ｍＭ ＮａＣｌではAdZよりも優先的に結 合することがわかった。しかしながら、１０００ｍＭ ＮａＣｌではAdZ.PKのビ ーズへの結合はもっと低く、AdZについて観察されるバックグラウンドの結合に ほぼ等しかった。 これらの結果は、AdZ.PKベクターがヘパリンを連結した支持体材料に結合し、 その結合は高塩濃度により除去されることを示している。したがって、そのよう な支持体を用いて、まず低塩条件でウイルスを支持体に結合させ、次に高塩条件 でベクターを溶出させることにより、改変されたベクターを精製することができ る。 実施例１６ 本実施例では、非天然のリガンドを有するアデノウイルスベクターを、そのリ ガンドに対する基質を含むカラム上で精製できることを実証する。 ２９３パッケージング細胞株を含む２０個の１７５ｃｍ2組織培養フラスコを 上記３つベクターのうちの１つ、AdZ.PK、AdZ.F2K(RKKK)2またはAdZ.F(RKKK)2に 、m.o.i．５で感染させる。次いで、細胞を２日間インキュベートした後、残っ ている付着細胞をすべてプラスチックから取り除く。除去された細胞を３，００ ０ｇで遠心分離してペレットを形成させ、培養培地を除いて、ペレットをＰＢＳ で２回、穏やかに洗浄する。次いで、細胞を全量５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂含 有ＰＢＳに再懸濁する。 次に、再懸濁した細胞を３回凍結融解してウイルスを放出させた後、細胞デブ リスを１５，０００ｇで１５分間遠心分離する。ヘパリンを連結したアガロース ビーズを含むカラム３ｍｌに上清を通す。次いで、カラムをＰＢＳ３０ｍｌで洗 浄した後、塩ステップ勾配によりカラムからウイルスを溶出させる。ウイルスを 溶出させるために、ＮａＣｌ濃度が（１００ｍＭ刻みで）連続的に増す緩衝液を ３ｍｌ容量で連続的にカラムに通し、溶出量１ｍｌを集める（２００ｍＭ Ｎａ Ｃ１３ｍｌ；３００ｍＭ ＮａＣｌ３ｍｌ；４００ｍＭ ＮａＣｌ３ｍｌ；２００ ０ｍＭ ＮａＣｌまで）。 次に、素通りおよび洗浄画分を、アデノウイルスコート蛋白質についてウェス タンブロットにより、活性なウイルス粒子についてＡ５４９細胞のｌａｃＺ形質 導入レベルあるいはプラークアッセイにより、全体の純度について、以前に記載 されるような分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により（Shabram ら，1997，Hum．Gene Ther．8，453-46;Huygheら，1995，Hum．Gene Ther.，6:1 403-1416;Shabramら，WO 96/27677）評価する。ピークのアデノウイルス濃度を 含むと確定された画分の全体の純度を、該画分をＨＰＬＣにかけて、予備カラム 画分に対するプロファイルと、高度精製されたアデノウイルス調製物（連続３ラ ウンドのＣｓＣｌ勾配上での精製により調製された）に対するプロファイルとを 比較することによって評価する。 実施例１７ 本実施例では、天然の細胞に結合する機能を欠く(が、偽受容体にターゲッテ ィングされる)アデノウイルスを複製することができる細胞株を構築するための 、該偽受容体の製造について記載する。詳細には、例示の偽受容体は一本鎖抗体 由来の結合ドメイン（ＳｃＦｖ）を含む。 まず、マウスＩｇシグナルペプチドとともに合成されるＳｃＦｖをコードする pHOOK3（図１２Ａ）（Invitrogen）由来のＳｃＦｖを発現するベクターである。 該ＳｃＦｖはＮ末端のＨＡエピトープタグを有し、また、そのＣ末端は一対のｍ ｙｃエピトープに連結し、その後にＰＤＧＦ受容体膜貫通アンカーがある。この コンストラクトを含む発現カセットをプラスミドpRC/CMVp-Puro（図１２Ｂ）に クローニングしてpScHAHKプラスミド（図１２Ｃ）を創製した。このプラスミド は、ＣＭＶプロモーターの後に遺伝しを挿入するためのクローニング部位と、遺 伝子のＣ末端に細胞質配列を付加するためのユニークなAgeIおよびXbaI部位を有 する。 ＳｃＦｖ偽受容体の細胞表面での発現を実証するために、トランスフェクタン ト検出用のグリーン・フルオレセント・プロテイン遺伝子を担持するpNSE4GLPプ ラスミドを単独で（図１２Ｄ）、あるいはpScHAHKと組み合わせて２９３細胞に トランスフェクトした。トランスフェクション１日後、ＨＡエピトープに指向す る抗体を用いた、pScHAHKが示す表面の免疫蛍光から、偽受容体が正しく表面で 発現していることがわかった。 発現した偽受容体が機能的であることを実証するために、トランスフェクトし た細胞を、ＳｃＦｖにより認識される抗体をコンジュゲートした、磁性のあるCA PTURE-TECビーズに晒した。インキュベートした後、磁石を用いてビーズをチュ ーブの底に集めて洗浄し、培養ディッシュに移した。次いで、該培養ディッシュ を蛍光顕微鏡下に検鏡し、ＧＦＰ発現細胞を同定した。pNSE4GLPのみでトラン スフェクトした細胞からは染色が観察されず、これらの細胞はビーズに結合しな いことがわかった。しかしながら、pNSE4GLPおよびpScHAHKでトランスフェクト した細胞は、ウェル中に観察された。この結果は、二重にトランスフェクトされ た細胞がビーズに結合したことを示している。 実施例１８ 本実施例では、天然の細胞に結合する機能を欠く(が、偽受容体にターゲッテ ィングされる)アデノウイルスを複製することができる細胞株を構築するための 、該偽受容体の製造について記載する。詳細には、例示の偽受容体は、ＨＡを認 識する一本鎖抗体由来の結合ドメインを含む。 抗ＨＡ ＳｃＦｖをＮ末端−ＶＬ−ＶＨ融合蛋白質として構築した。ＶＬおよ びＶＨ遺伝子（例えば、Gillilandら，Tissue Antigens，47，1-20(1996)を参照 ）のκまたはγ２βおよびＣ末端に特異的なプライマーを用いて、ＨＡ抗体を生 産するハイブリドーマから得られるＲＮＡ上でＲＴ−ＰＣＲを実施した。得られ たＰＣＲ産物をシーケンシングした後、特異的なオリゴヌクレオチドをデザイン して、第二ラウンドのＰＣＲでＶＬ−ＶＨ融合物を増幅した。最終ＰＣＲ産物を クローニングして、大腸菌で抗ＨＡ ＳｃＦｖを製造するためのpCANTAB5E(HA)プ ラスミド（図１７Ａ）を創製した。発現した蛋白質は、ＥＬＩＳＡアッセイのウ ェスタン分析により、ＨＡタグを有するペントンベースへの結合を検出するため のＣ末端Ｅペプチドを有する。pCANTAB5E(HA)プラスミドで細菌細胞を形質転換 した後、Ｅペプチドを認識する抗体を用いたウェスタン分析から、期待されたサ イズの蛋白質であることが明らかとなった。 抗ＨＡ ＳｃＦｖが機能的であるかどうかを確かめるために、ＨＡエピトープ を含むアデノウイルスコート蛋白質（組換えペントンベース）を用いたプロテイ ンＡ免疫沈降アッセイにおいて、それを使用した。抗ＨＡ ＳｃＦｖはＨＡを含 むペントンベース蛋白質を沈降させることができた。これらの結果は、非天然リ ガン ド（すなわち、ＨＡ）を有するアデノウイルスに結合するための偽受容体の細胞 外部分を首尾よく構築することができたことを示している。 抗ＨＡ偽受容体全体を創製するために、ＨＡが除去されたpSCHAHKプラスミド に抗ＨＡ ＳｃＦｖクローニングして、pScFGHAプラスミド（図１７Ｂ）を創製し た。このプラスミドはＦＬＡＧエピトープを有する上記アデノウイルスと同様、 ＨＡエピトープを有する組換えアデノウイルスに結合し得る抗ＨＡ偽受容体を生 産するだろう。 実施例１９ 本実施例では、ターゲッティングされるアデノウイルス粒子を生産するための ファイバー発現細胞株の創製について記載する。該相補的細胞株は、アデノウイ ルスゲノム由来の付加的な相補遺伝子を伴って、あるいは伴うことなく、ファイ バー蛋白質を生産する。 アデノウイルス２型遺伝子全体を、アデノウイルス２型ＤＮＡからＰＣＲによ って増幅した。得られた産物をpCR2.1-TOPOプラスミド（Invitrogen）にクロー ニングして、プラスミドpCR2.1-TOPO+fiber（図１３Ａ）を作製した。次いで、 制限酵素BamHIおよびEagIを用いて、ファイバー２遺伝子をpCR2.1-TOPO+fiberプ ラスミドから切り出した後、プラスミドpKSII（Stratagene）にサブクローニン グして、プラスミドpKSII Fiber（図１３Ｂ）を構築した。次に、制限酵素KpnI およびEagIを用いて、ファイバー２遺伝子をpKSII Fiberプラスミドから切り出 した後、プラスミドpSMTZeo-DBP（図１３Ｃ）にクローニングした。得られたプ ラスミドpSMTZeo-Fiber（図１３Ｄ）は、メタロチオネインプロモーターの制御 下にファイバー２遺伝子全体をコードしていた。このコンストラクトにはまた、 誘導後のファイバー蛋白質の合成を増進させるために、ファイバー遺伝子の前に 効率よいｍＲＮＡスプライス部位がおかれていた。pSMTZeo-Fiberプラスミドは また、抗生物質ゼオシン上での細胞株の選択が可能となるＺｅｏ耐性マーカーを 含む。 細胞株を生産するために、pSMTZeo-Fiberプラスミドを、機能を相補する付加 的なアデノウイルスとともに、あるいはそれを伴わず、２９３細胞（または他の ある細胞株）にトランスフェクトする。次いで、個々のゼオシン耐性コロニーを 標準的な手段により増幅させ、メタロチオネインプロモーターを活性化する亜鉛 での誘導前後で、ファイバー２の生産について試験する（例えば、抗ファイバー ２抗体を用いたウェスタン分析によって）。次に、選択されたファイバー発現ク ローンを、プラーク形成能および／または変異ファイバーを含むアデノウイルス の増殖を相補する能力について試験する。変異ファイバーを十分に相補するクロ ーンは、変異ファイバー遺伝子をコードするゲノムを有するアデノウイルス粒子 を増幅および生育させるのに適している。 ここで述べられたすべての引用文献は、ここに言及したことで、引用により組 み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここにそのすべてが明示されたと同程 度に、明細書中に組み込まれるものである。 本発明は好適な態様を強調して記載したものであるが、様々な好適な態様が使 用され得ること、および本発明がここで詳細に記載された以外の方法で実施され 得ることを意図していることは、当業者には自明であろう。したがって、本発明 は以下の請求の範囲によって定義される発明の精神および範囲内に包含されるす べての改変を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年７月２４日（１９９９．７．２４） 【補正内容】 請求の範囲 １．３つの単量体を含む三量体であって、該単量体のそれぞれがアデノウイルス ファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、該単量体のそれぞれが、基質と結合する 天然のアミノ酸を欠き、且つ該天然のアミノ酸とは電荷または分子量において異 なる非天然のアミノ酸を有するアデノウイルスファイバーノブを含む三量体化ド メインを有する三量体。 ２．該天然のアミノ酸が該非天然のアミノ酸で置換されている請求の範囲１の三 量体。 ３．基質と結合する該天然のアミノ酸がβシート内にある請求の範囲１または２ の三量体。 ４．基質と結合する該天然のアミノ酸が２つのβシートを繋ぐループ内にある、 請求の範囲１または２の三量体。 ５．３つの単量体を含む三量体であって、該単量体のそれぞれがアデノウイルス ファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且つ該単量体のそれぞれがマス軸索ダイ ニン、パラインフルエンザウイルス赤血球凝集素またはレオウイルスのシグマ１ 蛋白質由来の三量体化ドメインを有する三量体。 ６．３つの単量体を含む三量体であって、該単量体のそれぞれがアデノウイルス ファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且つ該単量体のそれぞれが改変されたロ イシンジッパーモチーフを含む三量体化ドメインを有する三量体。 ７．該ロイシンジッパーモチーフが１または２以上のロイシン残基をイソロイシ ンで置換することにより改変されている、請求の範囲６の三量体。 ８．該三量体化ドメインが酵母GCN4p-II三量体由来である、請求の範囲６または ７の三量体。 ９．天然の哺乳動物細胞表面結合部位に対するリガンドではない、請求の範囲１ 〜８のいずれかの三量体。 １０．該３つの単量体の少なくとも１つが、該三量体がその天然の細胞表面結合 部位に結合するのを妨害する非天然のポリペプチドを含む、請求の範囲１〜９の いずれかの三量体。 １１．請求の範囲１〜１０のいずれかの三量体およびアデノウイルスペントンベ ースを含むものの組成物。 １２．該ペントンベースが非天然のリガンドを含む、請求の範囲１１の組成物。 １３．請求の範囲１〜１２のいずれかの三量体を含むアデノウイルス。 １４．生産的には２９３細胞に感染しない請求の範囲１３のアデノウイルス。 １５．非アデノウイルスリガンドを含む請求の範囲１３または１４のアデノウイ ルス。 １６．該リガンドが天然の哺乳動物アデノウイルス受容体以外の基質に結合する 、請求の範囲１５のアデノウイルス。 １７．該リガンドが天然の細胞表面蛋白質以外の基質に結合する、請求の範囲１ ５または１６のアデノウイルス。 １８．該基質が細胞の表面上に存在する請求の範囲１６または１７のアデノウイ ルス。 １９．該基質がアフィニティーカラムの中に存在する、請求の範囲１６または１ ７のアデノウイルス。 ２０．該基質が血液由来の分子上に存在する請求の範囲１６または１７のアデノ ウイルス。 ２１．非天然の細胞表面受容体に対するリガンドを有するアデノウイルスが結合 する該非天然の細胞表面受容体を発現する細胞株であって、該細胞表面受容体が 抗体分子である細胞株。 ２２．該抗体分子が一本鎖抗体を含む請求の範囲２１の細胞株。 ２３．該抗体分子が赤血球凝集素を認識する請求の範囲２１または２２の細胞株 。 ２４．少なくとも１０継代の間ウイルス増殖を支援することができる、請求の範 囲２１〜２３のいずれかの細胞株。 ２５．請求の範囲２１〜２４のいずれかの細胞株をアデノウイルスに感染させ、 該細胞株を維持し、該細胞株内で産生されたアデノウイルスを回収することを含 む、アデノウイルスの繁殖方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロウエルヴィンク、ペトラス ダヴリュ ー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20832、 オルニー、ギャラガー ウェイ 17502 (72)発明者 アインフェルド、デイヴィッド アメリカ合衆国、メリーランド州 20874、 ジャーマンタウン、ウォリアー ブルック テラス 13617 (72)発明者 ブロー、ダグラス イー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20832、 オルニー、シャロウブルック レイン 3900 (72)発明者 リゾノワ、アリーナ アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、 ロックヴィル、ランドルフ ロウド 5329 (72)発明者 ヨネヒロ、グラント アメリカ合衆国、メリーランド州 20814、 ベセスダ、ケントベリー ドライヴ 4395

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．３つの単量体を含む三量体であって、該単量体のそれぞれがアデノウイルス ファイバー蛋白質のアミノ末端を有し、且つ該単量体のそれぞれが三量体化ドメ インを有し、該三量体が天然のアデノウイルスファイバー三量体に比べて、天然 の基質に対して低下したアフィニティーを示すものである三量体。 ２．天然の哺乳動物細胞表面結合部位に対するリガンドではない、請求の範囲１ の三量体。 ３．該単量体の少なくとも１つの該三量体化ドメインが、天然の基質に結合する アミノ酸を欠くアデノウイルスファイバーノブドメインである、請求の範囲１ま たは２の三量体。 ４．該天然の基質に結合するアミノ酸がβシート内にある、請求の範囲３の三量 体。 ５．該天然の基質に結合するアミノ酸が２つのβシートを繋ぐループ内にある、 請求の範囲３の三量体。 ６．該天然の基質に結合するアミノ酸が非天然の残基で置換されている、請求の 範囲３〜５のいずれかの三量体。 ７．該非天然の残基が、該天然の基質に結合するアミノ酸とは異なる電荷を有す るものである、請求の範囲６の三量体。 ８．該非天然の残基が、該天然の基質に結合するアミノ酸よりも大きな分子量を 有するものである、請求の範囲６または７の三量体。 ９．該３つの単量体のキメラアデノウイルスファイバーポリペプチドを含む、請 求の範囲１〜８のいずれかの三量体。 １０．該三量体化ドメインの少なくとも１つは、哺乳動物のアデノウイルス三量 体化ドメインではない、請求の範囲１〜９のいずれかの三量体。 １１．該三量体化ドメインのそれぞれがレオウイルスのシグマ１蛋白質由来であ る、請求の範囲１〜１０のいずれかの三量体。 １２．該三量体化ドメインのそれぞれが改変されたロイシンジッパーモチーフを 含む、請求の範囲１〜１０のいずれかの三量体。 １３．該３つの単量体の少なくとも１つが、該三量体がその天然の細胞表面結合 部位に結合するのを妨害する非天然のポリペプチドを含む、請求の範囲１〜１２ のいずれかの三量体。 １４．請求の範囲１〜１３のいずれかの三量体およびアデノウイルスペントンベ ースを含むものの組成物。 １５．該ペントンベースが非天然のリガンドを含む、請求の範囲１４の組成物。 １６．請求の範囲１〜１３のいずれかの三量体を含むアデノウイルス。 １７．生産的に２９３細胞に感染しない請求の範囲１６のアデノウイルス。 １８．非アデノウイルスリガンドを含む請求の範囲１６または１７のアデノウイ ルス。 １９．該リガンドが天然の哺乳動物アデノウイルス受容体以外の基質に結合する 、請求の範囲１８のアデノウイルス。 ２０．該リガンドが天然の細胞表面蛋白質以外の基質に結合する、請求の範囲１ ８または１９のアデノウイルス。 ２１．該基質が細胞の表面上に存在する請求の範囲１９または２０のアデノウイ ルス。 ２２．該基質がアフィニティーカラムの中に存在する、請求の範囲１９または２ ０のアデノウイルス。 ２３．該基質が血液由来の分子上に存在する請求の範囲１９または２０のアデノ ウイルス。 ２４．非天然の細胞表面受容体に対するリガンドを有するアデノウイルスが結合 する該非天然の細胞表面受容体を発現する細胞株。 ２５．請求の範囲２４の細胞株をアデノウイルスに感染させ、該細胞株を維持し 、該細胞株内で産生されたアデノウイルスを回収することを含む、アデノウイル スの繁殖方法。 ２６．ある基質に対するリガンドを有するアデノウイルスを、該アデノウイルス を含有する組成物から精製する方法であって、該組成物を該基質に曝露して該ア デノウイルスを該基質に選択的に結合させ、該基質から該アデノウイルスを除去 することなく該基質を該組成物から分離し、該基質から該アデノウイルスを溶出 させることを含む方法。 ２７．体液由来の基質を認識するリガンドを有するアデノウイルスを体液中で不 活性化する方法であって、該ウイルスを該基質に曝露して該リガンドを該基質に 結合させ、それによって該ウイルスを該体液から吸着することによる方法。 ２８．該体液が血液またはリンパ液である請求の範囲２７の方法。 ２９．アデノウイルスファイバーに対する基質を含むキメラブロッキング蛋白質 。 ３０．該基質がＣＡＲ細胞表面蛋白質の細胞外ドメインである、請求の範囲２９ のキメラブロッキング蛋白質。 ３１．さらにリガンドを含む請求の範囲２９または３０のキメラブロッキング蛋 白質。 ３２．該リガンドが細胞表面結合部位上に存在する基質を認識する、請求の範囲 ３１のキメラブロッキング蛋白質。 ３３．溶液中で、アデノウイルスを請求の範囲２９〜３２のいずれかのキメラブ ロッキング蛋白質とインキュベートして、該キメラブロッキング蛋白質をアデノ ウイルスのファイバーに結合させることを含む、アデノウイルスのターゲッティ ングを妨害する方法。