CZ422399A3

CZ422399A3 - Alternativně cílený adenovirus

Info

Publication number: CZ422399A3
Application number: CZ19994223A
Authority: CZ
Inventors: Thomas J. Wickham; Imre Kovesdi; Petrus W. Roelvink; David Einfeld; Douglas E. Brough; Alena Lizonova; Grant Yonehiro
Original assignee: Genvec, Inc.
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1998-05-28
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Popisuje se trimer obsahující tři monomeiy, kde každý máNkonec proteinu adenovirového vlákna a trimerizační oblast. Trimer vykazuje ve srovnání s přirozenýmtrimerem adenovirového vlákna sníženou afinitu pro přirozený substrát. Dále se popisuje adenovirus, který začleňuje tento trimer. Buněčná linie exprimující nepřirozený buněčný povrchový receptor, na který se váže adenovirus vykazující ligand pro uvedený receptor. Dále se popisuje způsob čištění adenoviru, který má ligand pro substrát z kompozice obsahující adenovirus. Způsob zahrnuje vystavení kompozice vlivu substrátu za podmínek, které podporují selektivní navázání ligandu na substrát. Pak se oddělí od substrátu kompozice, která na něm není vázána. Poté se ze substrátu eluuje navázaný odenovirus. Způsob deaktivace adenoviru, který má ligand rozeznávající substrát vznikající v krvi nebo lymfé. Dále se navíc popisuje chimerový blokační protein obsahující substrát pro adenovirové vlákno a způsob interferující navázání na adenovirový receptor tím, že se adenovirus inkubuje s takovým chimerovým blokačnímproteinem

Description

Oblast techniky

Vynález se týká alternativně cíleného adenoviru a zahrnuje způsoby produkce a čištění uvedených virů stejná jako proteinových modifikací, které zprostředkovávají altéfnativní cílení.

Dosavadní stav techniky ý

Adenovirová infekce začíná zachycením virionu na cílovou buňku. Adenovirus se zachytí na dva buněčné povrchové proteiny. Aby došlo k infekci cílové buňky musí být přítomny oba uvedené proteiny (Wickham et al., Cell, 73, 309-19 (1993)). Adenovirus divokého typu se nejdříve váže na buněčný povrch prostřednictvím adenovirového receptoru (AR). Jedním takovým AR je v poslední době identifikovaný receptor viru coxsackie a adenoviru (CAR) (popisují se v publikaci Bergelson

et al	. , Science,	275	, 1320-23	(1997); Tanako	et al. ,	Proč.
Nat.	Acad. Sci . ,	U.S	.A., 94,	3352-56 (1997))	Receptor MHC
třídy	I je také	AR	(Hong et	al., EMBO J.,	16(9),	2294-06
(1997)	). Po zachycení	na AR se	virus zachytí na	a_v integrinech,

což je rodina heterodimérových buněčných povrchových receptorů, které zprostředkovávají interakci s extracelulární matricí a mají důležitou úlohu při buněčné signalizaci (Hyneš, Cell, 69, 11-25 (1992)) .

Po zachycení na buněčném povrchu infekce pokračuje internalizací viru do endocytických vesikulí, kterou zprostředkovává receptor (popisuje se v publikaci Svensson et al., J. Virol., 51, 687-94 (1984); Chardonnet et al. , Virology, 40, 462-77 (1970)). V buňce jsou viriony rozloženy (popisuje se v publikaci Greber et al., Cell, 75, 477-86 (1993)), endozóm je porušen (Fitzerald et al., Cell, 32, 60717 (1983)) a virové částice se přenášejí do jádra • * * · prostřednictvím komplexu jaderných pórů (Dales et . al., Virology, 56, 465-83 (1973)).

Adenovirový virion je neobalený ikosae«k* o průměru 65 až 80 mm (popisuje se v publikaci Horene et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Adenovirový kapsid obsahuje 252 kapsomérů (240 hexonů a 12 pentonů) (popisuje se v publikaci Ginsberg et al., Virology, 28, 782-83 (1966)). Hexony a pentony se odvodily ze tří virových proteinů (popisuje se v publikaci Maizel et al., Virology, 36, 115-25 (1968); Weber et al., Virology, 76, 709-24 (1977)). Hexon obsahuje tři shodné proteiny, kdy každý má 967 aminokyselin. Jsou to polypeptid II (Roberts et al., Science, 232, 1148-51 (1986)).

Penton obsahuje bázi, která se váže na kapsid, a vlákno, které se nekovalentně váže na pentonovou bázi a vyčnívá z ní. Proteiny IX, VI a lila jsou také přítomny v adenovirověm plášti a stabilizují virový kapsid (popisuje se v publikaci Stewart et al., Cell, 67, 145-54 (1991); Stewart et al., EMBO

J., 12(7), 2589-99 (1993)) Pentonová báze je konzervativní a (mimo mezi sérotypy adenoviru vysoce pět ma

Ad4 0) enterický virus tripeptidových motivů RGD (Neumann et al., Gene, 69, 153-57 (1988)). V adenoviru tripeptidy RGD zjevně zprostředkovávají adenovirové navázání na a_v integriny a endocytózu viriónu (popisuje se v publikaci Wickham et al., Wickham et al., Cell, 73, 309-19 (1993)).

Adenovirové vlákno je homotrimer adenovirového polypeptidu IV (Devaux et al., J. Molec. Biol., 215, 567-88 (1990)). Vlákno má tři diskrétní domény. Oblast aminoterminálního ocasu se nekovalentně zachycuje na pentonovou bázi. Relativně dlouhé domény střední části obsahující variabilní počet opakujících se 15-ti aminokyselinových zbytků, které tvoří β-listy, vyčnívají z vrcholků virové částice (Yeh et al., Virus Res., 33, 179-98 (1991)). Přibližně 200 aminokyselinových zbytků na karboxylovém konci tvoří uzlinovou doménu. Uzlina ··· » zprostředkovává primární virové navázání na buněčný AR a XLzaci vlákna (popisuje se v publikaci Henry et al., J. Virol., 68(8), 5239-46 (1994)). Aby se konec vlákna správně spojil s pentonovou baží, oblast trimerizace se jeví být nezbytná (Novelli et al., Virology, 185, 365-76 (1991)). Vedle rozeznávání buněčného AR a navázání pentonové báze se vláknitý protein podílí na integritě sérotypu a zprostředkovává umístění v jádru.

Vláknité proteiny z různých adenovirových sérotypu se podstatně liší. Například počet 15 aminokyselinových βlistových repetic se u různých adenovirových sérotypů liší (popisuje se v publikaci Green et al. , EMBO J. , 2, 1357-65 (1983)). Avšak oblasti uzlin blízce příbuzných sérotupů Ad2 a Ad5 vykazují pouze 63 % podobnost na úrovni aminokyselin (Chrobozcek et al. , Virology, 186, 280-85 (1992)) a vláknité uzliny Ad2 a Ad3 vykazují pouze 20 % shodu (Signas et al. , J. Virol. 53, 672-78 (1985)). Naopak sekvence pentonové báze jsou z 99 % shodné. Navzdory těmto rozdílům v oblasti uzlin se porovnáním sekvencí genů vláken Ad2 a Ad3 demonstruji'' odlišné konzervativní oblasti, přičemž většina z nich je také konzervativní mezi jinými geny vláken lidských adenovirů.

Řada faktorů prezentuje adenoviry jako atraktivní vektory při použití v různých aplikacích přenosu genů (například produkce buněčného proteinu, terapie, akademické studie, atd.). Adenovirus je například dokonalý expresivní vektor.

Rekombinantní adenovirus se může produkovat s vysokými titry

Ί 3 V ř ' (například přibližně 10 virových /ml) a adenovirové vektory mohou přenést genetický materiál do buňky, ve které se buď replikuje nebo se nereplikuje (na rozdíl od retrovirových vektorů) . Adenovirový genom se může manipulovat tak, aby nesl velké množství exogenní

DNA ,az přibližně 7,5 kb) adenovirový kapsid může potenciovat přenos dokonce i delší sekvence (Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3, 147-54 (1992)).

Navíc některé rysy naznačují, že adenoviry reprezentují • · · ·· ♦ f * * * !· · « · bezpečnou volbu přenosu genu zvláště při terapeutickém použití. Například adenoviry se neintegrují do chromozomu hostitelské buňky, čímž se minimalizuje pravděpodobnost, že adenovirový vektor bude interferovat s normální funkcí buňky. Adenovirová infekce u člověka nekoreluje se zhoubným bujením a k rekombinaci adenovirového genomu dochází řídce. Díky těmto výhodám lékaři používají tyto vektory po mnoho let jako bezpečné lidské vakcíny a v případě genové terapie.

Na základě popularity adenovirových vektorů se vyvinulo úsilí zvýšit schopnost adenoviru vstupovat do určitých buněk, například do těch několika, které nejsou schopny adenoviry infikovat, pomocí tzv. „cílení (popisuje se například v mezinárodní patentové přihlášce woj^5/26412 (Curiel et al.,), v mezinárodní patentové přihlášcě WO 94/10323 (Spooner et al.,),· v US patentu 5 543 328 v mezinárodní patentové přihlášce al.)). Samozřejmě zatímco schopnost cílit adenoviry do jistých typů buněk je důležitým úkolem, daleko důležitější je připravit adenovirus, který infikuje pouze požadovaný buněčný typ, což se nazývá „exkluzivní cílení. Aby vznikl exkluzivně cílený virus, musí se nejdříve odstranit jeho přirozená afinita vůči AR hostitelské buňky, přičemž vzniká rekombinantní adenovirus, který infikovat celou sadu buněk, adenovirovýmí cíly. Úsilí vedoucí ke zrušení přirozené adenovirové buněčné afinity se logicky koncentruje na změnu uzliny vlákna. Toto úsilí bylo doprovázeno zklamáním, protože potlačení důležitých funkcí proteinu vlákna při stabilni\G7zaci a navázání na pentonovou bázi (Spooner et al., citace uvedena shora v textu) bylo neúspěšné. Avšak nahrazení uzliny vlákna buněčným povrchovým ligandem (McClelland et al., citace uvedena shora v textu) produkuje virus, který je vhodný pouze pro infekci buněčného typu, který má uvedený ligand. Na (McClelland WO 94/24299 et al.), (Cotten et není schopný produktivně které jsou přirozenými základě takové strategie vzniká virus, který vykazuje řadu « · · stejných problémů £ cílením spojených s adenoviry divokého typu (kde trimerizace vlákna a buněčný trofizmus je zprostředkován stejnou proteinovou doménou), tak se Snižuje flexibilita vektoru. Následkem nedostatku hostitelských buněk a integrace trimerizace vlákna a cílením funkcí je získání mutantního viru se substituovaným cílením obtížné. Například odstranění uzliny vlákna a jeho nahrazení s neizujícím ligandem (například McClelland et al., citace je uvedena shora v textu) vede ke vzniku viru, kterému chybí vhodný protein vlákna. Proto je nutné vytvořit adenovirové vlákno, které vykazuje omezenou afinitu k přirozenému AR, ale stále vykazuje (ízaci vlákna a funkci navázání se na pentonovou bázi.

Zatímco exkluzivní adenovirové cílení vyžaduje snížení přirozeného buněčného trofizmu, pak zrušení schopnosti přirozeného cílení také snižuje schopnost viru infikovat buněčné linie, které se v normálním případě používají při jeho pomnožení (například buňky 293) ( (Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3, 147-54 (1992)). Jeden publikovaný pokus překonává tuto překážku tím, že využívá buněčnou linii exprimující na povrchu relevantní buňky vazebné místo (McClelland et al., citace uvedena shora v textu). Avšak řada buněčných linií neexprimuje důležité buněčné receptory. Řada dostupných buněčných linií exprimujících potenciálně použitelná buněčná povrchová vazebná místa nejsou adekvátní pro produkci rekombinantních adenovirů, zvláště virů použitelných při klinických aplikacích (například buněčné linie nesoucí a exprimující podstatné adenovirové časné geny z oblastí El, E2 a/nebo E4 genomu). Je proto nutné vytvořit buněčnou linii a způsoby produkce buněčné linie, ve které je možné pomnožit a Sbalit rekombinantní adenovirus, jenž není v podstatě schopen produktivně infikovat buňky prostřednictvím přirozeného AR.

Typické protokoly čištění virových vektorů z buněčných lyzátů zahrnují jednu nebo opakovanou centrifugaci virů pomocí gradientu CsCl^. Zatímco takové způsoby adekvátně izolují viry, • * • · 9 · · 999 9 · 9 9 •99 99 9 9999

999 «9 9 9 99 · 9 9 • 9 999 9 9 9 9 θ 99999 99 999 99 9 9 potřebují však podstatný materiál, kterým je CSCI2, a jsou proto relativně neúčinné. Takové protokoly se nemohou často použít při mnoha aplikacích, což je podstatná překážka při ekonomickém vývoji virových vektorů v komerčním měřítku. Jiné metody zahrnující čištění na koloně neváží viry specificky (Shabram et al., Hum. Gene Ther., 8, 453 (1997); Huyghe et al., Hum. Gene Ther., 6, 1403 (1995)). Tyto metody často _o o způsobují výskyt nepřijatelného množství kontaminantM ve srovnání s formou získatelnou při afinitním čištění jiných materiálů. Je nutné vytvořit účinný způsob čištění a izolace rekombinantních virových vektorů.

Při mnoha aplikacích, které zahrnují in vívo zavádění virových vektorů, je nutné infikovat (a zavést gen) vybranou tkáň. Například léčba systémové infekce a zavedení biologicky aktivního genu reprezentuje podstatný problém při aplikacích genové terapie. Ektopická exprese transgenu však poškodí řadu experimentálních aplikací. Zatímco teoreticky hostitelské krevní buňky mohou exprimovat proteiny zprostředkovávající čištění cizorodých látek, jako jsou například adenoviry (News and Comment, Science, 275, 744-45 (1997)), manipulace takových buněk a jejich produkce v hostiteli je obtížná a intruzivní. Zatímco protilátky proti adenovirovému hexonu mohou deaktivovat virus (Toogood et al., J, Gen. Virol., 73, 1429-35 (1992)), neexistují účinné protokoly pro zavádění dostatečného množství anti-hexonového antiséra do genového transferového recipienta, aby došlo k omezení nebo prevenci ektopické virové infekce. Taková strategie může interferovat s protokoly pro. transfer genů tím, že blokuje infekci požadovaných tkání. Proto je nutné vytvořit způsob deaktivace rekombinantních virových vektorů, které zachovají v hostitelském zvířeti požadovaný lokus zavedení.

Podstata vynálezu • ·· ·· 9 9· · · · 9 9 9 9 9 · · · · 9 • 9 · 99 9 9 9 9 9 • 99999 9 9 99 9« 9 • 9 99« 9 9 9 9 •99 99 99 999 99 99

Vynález popisuje trimer obsahující tři monomery, kdy každý má N-konec proteinu adenovirového vlákna a každý vykazuje doménu trimerizace. Trimer ve srovnání s přirozeným trimerem adenovirového vlákna vykazuje omezenou afinitu vůči přirozenému substrátu. Předkládaný vynález dále poskytuje adenovirus začleňující trimer podle tohoto vynálezu. Vynález dále popisuje buněčnou linii exprimující nepřirozený buněčný povrchový receptor, přičemž adenovirus má ligand, kterým se na něj naváže. Dále se popisuje způsob pomnožení adenoviru za použití buněčné linie.

Vynález dále poskytuje způsob čištění adenoviru, který má ligand pro substrát z kompozice obsahující adenovirus. Způsob selektivně vázat substrát. Pak kompozice, která se neváže na substrát, je od substrátu oddělena a navázaný adenovirus se eluuje ze substrátu.

Vynález dále popisuje způsob deaktivace adenoviru, který má ligand rozeznávající substrát pocházející z krve a lymfy tím, že se substrát přijde do kontaktu s virem. V krvi nebo lymfě dojde k navázání ligandu na substrát, přičemž se adsorbuje volný virus.

Vynález popisuje chimérový blokační protein obsahující substrát pro adenovirové vlákno a způsob interference s adenovirovým receptorem, který se váže při inkubaci s adenovirem na chimérový blokační protein v roztoku tak, že chimérový blokační protein se váže na vlákno.

Vynález se dále používá v různých aplikacích in vivo a in vitro, jako je například terapie. Nachází uplatnění například jako vektor pro zavádění terapeutického genu do buňky s minimální etopickou infekcí. Vynález specificky umožňuje více účinnou produkci a konstrukci bezpečnějších vektorů pro využití v genové terapii. Vynález je možné také použít jako výzkumný nástroj tím, že se připraví metody a činidla pro studium adenovirového zachycení a infekce buněk a mohou se použít při testování interakce receptor-ligand. Podobně rekombinantní vláknité proteinové trimery se mohou použít v testech receptorligand a jako adhezivní proteiny in vitro a in vivo.

• 4 ··· 4 ·

Dále vynález poskytuje činidla a způsoby umožňující biologům zkoumat buněčnou biologii virového růstu a infekce. Takové vektory podle vynálezu jsou vysoce užitečné při biologickém výzkumu.

Definice

Termín „adenovirus,, je libovolný virus rodu Mastadenoviridae nebo Aviaadenoviridae a může patřit k libovolnému sérotypu tohoto rodu. Adenovirové zásobní roztoky, které se mohou použít jako zdroj adenoviru nebo adenovirového obalového proteinu, jako je pentonová báze a/nebo proteinu vlákna, se mohou amplifikovat z adenovirových sérotypů, které jsou dostupné v instituci American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) nebo z libovolného jiného zdroje.

„Ligandem,, může být libovolný druh selektivně se vázající na identifikovatelný substrát.

Termín „přirozený,, znamená protein nebo vlastnost neupraveného viru nebo buňky. Pak nepřirozený protein může být upraveným a mutovaným proteinem, který se liší od jeho přirozeného homologu ve viru nebo v buňce. V jiném případě nepřirozený protein může být proteinem, který nemá přirozenou homologii ve viru nebo v buňce.

Termín „AR„ znamená adenovirový receptor. „AR„ je zvláště pak ligand vázající se na mastadenovirovou uzlinu.

První druh se selektivně váže na substrát, jestliže se váže na substrát s větší afinitou než druhý druh. První druh se neváže selektivně, jestliže se váže na substrát se stejnou nebo menší afinitou než druhý druh, dokonce jestliže první druh se váže se stejnou afinitou.

Trimery

Vynález popisuje trimer, který obsahuje tři monomery (například alespoň část každého ze tří adenovirových monomerů vlákna), přičemž každý má N-konec odvozený od adenovirového proteinu vlákna a každý má doménu trimerizace. Trimer podle vynálezu ve srovnání s přirozeným adenovirovým trimerem

Φ · Φ

Φ · 9 · • * * • Φ *

Φ Φ * • · · • Φ ** proteinu vlákna a každý má doménu trimerizace. Trimer podle vynálezu ve srovnání s přirozeným adenovirovým trimerem vlákna vykazuje omezenou afinitu pro přirozený substrát , takový jako jsou protilátky, buněčné vazebné místo (to znamená přirozené pro sérotyp, ze kterého je získán N-konec) . Trimer může být homotrimerem nebo heterotrimerem různých vláknitých monomerů. Vynález dále popisuje libovolnou úpravu monomerních jednotek redukující afinitu výsledného trimeru vůči jeho přirozenému vazebnému místu na povrchu buňky (to znamená přirozené AR) . Snížení afinity je podstatná redukce afinity (jako alespoň o jeden řád, upřednostňuje se o více řádů) relativní k neupravenému odpovídajícímu vláknu.

V případě, že trimerizační doména je samotný ligand vhodný pro přirozené .vazebné místo na povrchu buňky, pak takové domény trimerizace jsou přítomny v trimerech. Proto doménou trimerizace monomeru začleněného do trimeru podle vynálezu přednostně není ligand pro CAR nebo MHC-1, domény na povrchu buňky nebo protilátky rozeznávající vlákno. Více se upřednostňuje, když nepřirozená trimerizační doména není ligand vhodný pro libovolné přirozené vazebné místo na povrchu savčí buňky, přičemž vazebné místo je AR nebo jiné vazebné místo na povrchu buňky. Adenoviry začleňující takové trimery vykazují omezenou schopnost infikovat jejich přirozené hostitelské buňky a mohou sloužit jako účinné zdroje vektorů pro manipulaci selektivně cílených vektorů. Proto zatímco trimerizační doména není přednostně ligand vhodný pro vazebné místo na povrchu buňky, pak celý trimer může být takový ligand ( nepřirozený ligand, jak se uvádí zde v textu). trimerizační doménou může být ligand vhodný pro substrát jiný než přirozené vazebné místo na povrchu buňky, jako jsou trimerizační ligandy. Tak například nepřirozenou trimerizační doménou může být ligand vhodný pro substrát na afinitní koloně, na molekule, která vzniká v krvi nebo dokonce na buněčném povrchu, kdy to není přirozené vazebné místo na povrchu buňky * · · « · • · Λ · fl • * · fl • · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 α«· «« «« (například na buňce manipulované tak, aby exprimovala substrátový buněčný povrchový protein, který není přirozený pro neupravený typ buňky).

Monomer pro inkluzi s trimerem může být celý nebo část přirozeného adenovirového monomerového proteinu vlákna. Upravenému monomeru může například chybět upravitelný počet zbytků nebo dokonce identifikovatelné domény, jak se zde popisuje. Monomer například nemusí obsahovat přirozenou doménu uzliny; může mu chybět jedna nebo více přirozených repetic βlistu nebo může být jiným způsobem zkrácen. Tak monomer může mít libovolnou jinou požadovanou úpravu, která může být tak velká pokud stále dochází k trimerizaci. Monomer se přednostně neupravuje na N-konci (například N-konec monomeru tvoří podstatu N-konce vlákna), aby se zajistilo, že výsledný trimer interaguje správně s pentonovou bází. Vynález dále popisuje kompozici obsahující trimer podle vynálezu a adenovirovou pentonovou bázi. Upřednostňuje se, aby se trimer a pentonová báze spojily stejným způsobem, jako vlákna divokého typu pentonové báze. Samozřejmě zatímco trimer obsahuje upravené monomery vlákna, pentonová báze se může také upravovat, aby například zahrnovala nepřirozený ligand, jak se popisuje v US patentu 5 559 099.

Mutantní uzliny

Vláknitý monomer vhodný pro začlenění do trimerů podle vynálezu má trimerizační doménu, která se váže na přirozený savčí AR (to znamená, že AR je přirozený pro sérotyp adenovirů) s menší afinitou než přirozené adenovirové vlákno. Upřednostňuje se, aby trimery, které inkorporují takové monomery nebyly ligandy vhodné pro jejich přirozená buněčná vazebná místa. Monomery se mohou upravovat libovolným způsobem vhodným pro redukci afinity vlákna vůči přirozenému AR, zatímco umožňuje monomerům trimerizaci. Například v jednom provedení vynálezu doménou trimerizace je doména uzliny • φ φ φ φ φ φφ upraveného adenovirového vlákna, která neobsahuje přirozenou aminokyselinu vázající se na receptor. Libovolný aminokyselinový zbytek zprostředkující nebo podílející se na interakci mezi uzlinou a přirozeným buněčným AR je aminokyselina vhodná pro mutaci nebo de 1 β'δΙν^ΠΤζΤι nové doméně může chybět libovolný počet takových přirozených aminokyselin vázajících se na receptor, pokud se v agregátu monomery spojují, aby vytvořily trímer podle vynálezu.

Libovolným způsobem se mohou vybrat přirozené aminokyselinové zbytky pro úpravu nebo deleci. Například, aby se dedukovaly konzervativní zbytky, které pravděpodobně zprostředkovávají navázáni na AR, mohou se porovnat sekvence pro různé adenovirové sérotypy. V jiném případě nebo při kombinování se sekvence může mapovat za vzniku třírozměrné reprezentace proteinu (jako je krystalová struktura), aby se dedukovaly ty zbytky, které jsou nejpravděpodobněji odpovědné za navázání na AR. Tyto analýzy se mohou uskutečnit použitím libovolného běžného algoritmu nebo programu pro dedukci proteinové strukturální funkční interakce. V jiném případě náhodné mutace se mohou začlenit do expresívní kazety klonovaného adenovirového vlákna. Způsob zavedení náhodných mutací do proteinu se provádí prostřednictvím Taq polymerázy. Například klon kódující uzlinu vlákna (SEQ ID NO: 9; Roelvink et al., J. Virol., 70, 7614-21 (1996)) může sloužit jako templát pro PCR amplifikaci adenovirové uzliny vlákna nebo jeho části. Četnost chyb transkriptů se může ve většině případů předem stanovit kolísáním koncentrace dvouvalentních kationtů v reakci PCR (Weiss et al., J. Virol., 71, 4385-94 (1997); Zhou et al., Nucl. Acid. Res., 19, 6052 (1991)).

Produkty PCR se pak mohou subklónovat zpátky do templátového vektoru, aby se zaměnila sekvence v sekvenci kódující vlákno, která slouží jako zdroj pro reakci PCR. Tak se vzniká knihovna vláken, přičemž některé z nich budou nést mutace, které znesnadňují přirozené navázání na AR, zatímco se zachovala schopnost trimerizace.

Monomer, kterému chybí jedna nebo více aminokyselin, jak se zde popisuje v textu, může vedle nebo místo chybějící pnrozene (například aminokyseliny obsahovat nepřirozený zbytek několik nepřirozených aminokyselin). V jiném případě se samozřejmě přirozené aminokyseliny mohu přirozeně detekovat z uzliny. Upřednostňuje se, aby se aminokyselina substituovala jinou nepřirozenou aminokyselinou tak, aby se zachovala topologie a zvláště trimerizace. Nahrazení aminokyseliny přednostně umožňuje novou kvalitu monomeru. Například, aby se maximálně odstranilo navázání na přirozený AR, přirozená aminokyselina se může nahradit zbytkem (nebo velkým množstvím zbytků) s odlišným nábojem. Taková substituce maximálně interferuje s elektrostatickou přirozenými doménami adenovirové uzliny

V podobném případě, je-li to možné, se přirozená aminokyselina může nahradit zbytkem s větší molekulovou hmotností (nebo velkým množstvím zbytků). Tyto zbytky mají delší boční řetězec, proto taková substituce maximálně interferuje se prostorovou interakcí mezi přirozenými adenovirovými doménami a buněčnými AR.

interakcí mezi a buněčnými AR.

Nepřirozené trimerizační domény

V jiném provedení vynálezu trimer zahrnuje upravené monomery, které jsou chimérovými polypeptidy adenovirového vlákna. Vhodný chimerový monomer neobsahuje celou nebo část trimerizační domény, která je přirozená pro zdroj adenovirového sérotypu. Trimerizační doména takového monomeru se může z viru deletovat nebo se může odstranit inzercí nebo substitucí nepřirozených aminokyselin. Samozřejmě monomer, který neobsahuje přirozenou trimerizační doménu, nemusí také obsahovat celou přirozenou uzlinu. Protože přirozená trimerizační doména je ligandedm vhodným pro AR, trimer • · · * • · « * · · « • ♦ » · • » · · • · ♦· monomerů chimérového adenovirového vlákna neobsahující přirozenou trimerizační doménu se váže na jeho přirozený AR s menší afinitou než přirozené adenovirové vlákno.

Aby chimérové monomery mohly tvořit trimer podle vynálezu, musí se do monomeru začlenit nahrazující (to znamená nepřirozené) trimerizační domény. Aby se maximálně podpořilo cílení viru, upřednostňuje se, aby nepřirozenou trimerizační doménou nebyl ligand vhodný pro receptor na povrchu savčí buňky nebo jiný povrchový buněčný receptor. Libovolná doména schopná tvořit homotrimery je vhodná jako trimerizační doména pro inkluzi do trimerů podle vynálezu. Chimérový monomer může například zahrnovat trimerizační doménu z proteinu faktoru tepelného šoku (HSF) organizmu K.lactis (popisuje se v publikaci Soreger and Nelson, Cell, 59, 807 (1989)), z axonálního dyneinu pstruha (Garber et al., EMBO J., 8, 1727 (1989)), z proteinu hemaglutininu viru parainfluenzy (Coelingh et al., Virology, 162, 137 (1988)), proteinu sigma-1 reoviru typu 1 (Strong et al., Virology, 184, 12 (1991)) nebo jiné vhodné trimery. V jiném případě chimérový monomer může zahrnovat upravený motiv leucinového zipu. Leucinové zipy obsahují skupinu sedmi repetic leucinů, které zprostředkovávají dimerizaci. Výsledkem nahrazení jednoho nebo více leucinů izoleucinem je stabilní trimerizace domén. Příklad takového upraveného motivu leucinového zipu je trimer GCN4p-II, který obsahuje 32 aminokyselin (Harbury et al., Science, 262, 1401 (1993)).

Z těchto trimerizačnich domén se preferuje trimerizační doména reoviru sigma 1. Tento protein obsahuje 17 alfahelikálních skupin sedmi repetic, připomínající dvoušrobicovou strukturu trimeru shora uvedených mutantních izoleucinových zipových domén (Harbury et al., Nátuře, 371, 80-83 (1994)). Vláknité chiméry obsahující doménu sigma 1 mohou tak vyčnívat z viru do větší vzdálenosti, než odpovídající chiméry obsahující kratší trimerizační domény. Výhodou trimerizační » ·

99 ···;— • 9 99 9 domény reoviru sigma 1 před mutantní doménou leucinového zipu (například GCN4) je, že doména sigma 1 je dlouhá 22 nm (Fraser et al

J. Virol., 64, 2990-3000 (1990)), zatímco doména GCN4 je dlouhá pouze 5 nm (Harbury et al., Nátuře, 371, 80-83 (1994)). Další výhodou při použití záchytného proteinu reoviru sigma 1 je, že na rozdíl od. střední části adenovirového proteinu viru, tento protein vykazuje sklon k intrinsické trimerizaci (Leone et al., Virology, 182, 336-45 (1991)). Zdá se, že délka vlákna zvyšuje účinnost a specifitu zachycení adenoviru na buňku (Roelvink et al., J. Virol., 70, 7614-21 (1996)). V případě jiných chimérových vláken se preferují delší vlákna s možnou doménou sigma 1.

Chimérový monomer může v jiném případě zahrnovat doménu uzliny z jiného sérotypu adenoviru. Trimerizační doména se může například nahradit mutovanou uzlinou z adenovirového sérotypu, který je schopný produktivně infikovat hostitele (například mutantní uzlina Ad3 obsahující mutaci ve smyčce HI). V jiném případě se může nahradit uzlinou ze sérotypu, který není schopný produktivně infikovat hostitele. Například uzlina vlákna sérotypu savčího adenoviru se může nahradit uzlinou z ptačího sérotypu. Zatímco ptačí uzlina zprostředkovává trimerizaci proteinů vlákna, je pravděpodobně nemožné, aby rozeznala savčí AR. Proto taková chimérická vlákna neobsahují schopnost vázat se na přirozený AR hostitele. Podobně uzlina vlákna jednoho sérotypu savčího adenoviru se může nahradit uzlinou z jiného savčího sérotypu. Upravená a neupravená uzlina z vlákna NADC-1 prasečího adenoviru je preferovanou doménou a je dobře charakterizovaná. Uzlina NADC-1 má stanovené ligandy, například galektin (který váže galaktózu) a LDZ a RGD peptidy (které vážou integriny) (popisuje se například v publikaci Hirabayashi et al., J. Biol. Chem., 266, 13648-53 (1991)). Tak chimérová vlákna lidských adenovirů vykazující uzliny NADC-1 s takovými mutacemi mohou tvořit trimery a mohou se spojovat s pentonovou bází, ale váží se na přirozené receptory na povrchu buňky s omezenou afinitou.

Nepřirozená trimerizační doména se může ligovat s přirozeným monomerem vlákna na libovolném vhodném místě, pokud se mohou monomery správně izovat (to znamená, že jsou schopny interagovat s adenovirovou pentonovou bází). Doména se může například začlenit do přirozené uzliny, přičemž se poruší její topologie. V jiném případě se trimerizační doména může začlenit za libovolné repetice 15-ti aminokyselin, upřednostňuje se za sedmou, patnáctou nebo dvacátou druhou repeticí, aby napodobovaly přirozenou velikost střední části adenovirů. Když se do střední části adenovirů začlení nepřirozená trimerizační doména, může tvořit karboxylový konec chimérového proteinu nebo se může začlenit do středu aminokyselinové sekvence. Do monomeru vlákna se může začlenit libovolný počet trimerizačních domén, pokud se výsledný trimer správně spojuje s pentonovou bází.

Blokační doména

Jiný vhodný chimérový monomer má novou doménu blokující ligand, který je vhodný pro AR hostitele. Blokační doménou je libovolný peptid, který se může těsně vázat na přirozený

Τ' lov* i ligand (Hong et al., EMBO J., 16, 2294-2306 (1997) )blokační doména je substrát, na který se selektivně váže (přirozený nebo upravený) vláknitý monomerní ligand. Je nutné, aby se interakce substrát-ligand objevila alespoň bezprostředně při produkci viru a účinně pokračovala až do okamžiku, kdy se poškodí vláknitý trimer. Protože se přirozený ligand váže na blokační doménu, ligand není schopný se vázat na je svůj přirozený substrát na povrchu buňky. Protože přirozená trimerizační doména je ligand vhodný pro přirozený AR, trimery chimérových adenovirových vláknitých monomerů, které mají takové blokační domény, se váží na přirozený AR s menší afinitou, než přirozené adenovirové vlákno. Blokační doména se ywwwa • · 4 · • ♦ 4 · • 4 · * » 4 · 4 » · 4 ·

4 44 může nacházet v libovolné poloze adenoviru, aby se navázala na přirozený ligand, aniž ovlivní trimerizaci nebo interakci s pentonovou bází. Blokační doména může být například připojena k shora v textu popsanému β-listu nebo ke smyčkám buď fúzí se čtecím rámcem, kovalentní post-translační modifikací. V jiném případě blokační doména se může připojit k jiné části monomeru. Blokační doména může také zahrnovat linkerový nebo mezerníkový polypeptid, který umožňuje blokačnímu činidlu interagovat s přirozeným ligandem. Jestliže blokační doména je připojena prostřednictvím takového mezerníku, pak mezerník může zahrnovat místa, která rozeznává proteáza.

Příprava

Monomery pro inkluzi do trimerů podle vynálezu se mohou produkovat libovolnou možnou metodou. Mutantní protein vlákna se může produkovat libovolným vhodným způsobem. Mutantní protein vlákna se může syntetizovat za použití standardní přímé syntézu peptidů (například jak se popisuje v publikaci Bodanszky , Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Heidelberg: 1984)), jako je syntéza na pevné fázi (popisuje se například v publikaci Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 219454 (1963); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30,

705-739 (1987) a US patent 5 424 398). V jiném případě místně specifické mutace (jako je nahrazení uzliny s nepřirozenou trimerizaění doménou, odstranění, nahrazení nebo mutování zbytků, které se vážou na AR, nebo přidání blokační domény, jak se popisuje shora v textu) se mohou zavést do monomeru ligací do expresívního vektoru, který obsahuje upravené místo. V jiném případě plazmid, oligonukleotid nebo jiný vektor kódující požadovanou mutaci se může rekombinovat s adenovirovým genomem nebo s expresívním vektorem, který kóduje monomer pro zavedení požadované mutace. Pro tyto úče je také vhodná oligonukleotidem řízená místně specifická mutageneze (popisuje se například v publikaci Walder et al., • · · ··· · ·

• ·

Gene, 42, 133,(1986); Bauer et al., Gene, 37, 73 (1985);

Craik, Biotechniques, 12 -19 (1995); US patent 4 518 584 a 4 737 462). Manipulovaný fragment DNA kódující upravený monomer se může subklónovat do vhodného vektoru za použití dobře známé metody molekulární genetiky. Fragment se pak přepisuje a peptid se následně překládá in vitro v hostitelské buňce. Libovolný vhodný expresívní vektor (popisuje se například v publikaci Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevior, NY:1985)) a odpovídající vhodné hostitelské buňky se mohou použít při produkci rekombinantních peptidů. Expresívní hostitelé zahrnují, ale nejsou omezeny na druhy bakterií, systémy savčích a hmyzích hostitelských buněk, které zahrnují bakuloviry (popisuje se například v publikaci Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47 (1988), a na vytvořené buněčné linie, jako jsou buněčné linie 293, COS-7, C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK atd.. Zvláště se preferuje expresívní systém vhodný pro přípravu upravených vláken podle vynálezu, kterým je bakulovirový expresívní systém (Wickham et al., J. Virol., 70, 6831-38 (1995)). Tento systém umožňuje produkci velkého množství rekombinantních proteinů. Volba expresívního hostitele se odráží na typu produkovaného peptidu , což primárně způsobují post-translační úpravy.

Když se připraví monomery, testuje se u nich aktivita proteinu vlákna. Zvláště pak se testuje schopnost monomerů tvořit trimery, interagovat s pentonovou bází a s přirozeným AR. Pro měření uvedených parametrů se může použít libovolný vhodný test. Protože nesprávně zabalené monomery . jsou v obecném případě nerozpustné (Scopes, „Protein Purification (3d Ed., 1994), Chapter 9, p. 270-82 (Springer-Verlag, New York)), jedním z testů trimerizace je rozpustnost rekombinantního vlákna. Rozpustnost vlákna se zjistí tak, když se do proteinu během syntézy začlení určité množství radioaktivní aminokyseliny. Lyzát z hostitelské buňky, která exprimuje rekombinantní vláknitý protein se může centrifugovat

• · a supernatant a pelet se může testovat prostřednictvím scintilačního počítače nebo Westernovou analýzou. Následně se separují proteiny v peletu a supernatantu (například na gelu SDS-PAGE), přičemž se izoluje protein vlákna pro další testování. Porovnání množství radioaktivity v proteinu vlákna izolovaném z peletu proti proteinu vlákna izolovanému ze supernatantu indikuje, zda mutantní protein je rozpustný. V jiném případě se může trimerizace testovat za použití monoklonálních protilátek, které rozeznávají pouze N-část trimerové formy vlákna (například prostřednictvím imunoprecipitace, Westernovým přenosem, atd.). Jedny takové protilátky se popisují v mezinárodní patentové přihlášce WO 95/26412. Další mírou trimerizace je schopnost rekombinantního vlákna tvořit komplex s pentonovou bází (Novelli and Boulanger, Virology, 185, 1189 (1995)), přičemž tímto způsobem mohou interagovat pouze vláknité trimery. Tento sklon se může testovat ko-imunoprecipitací, testem změny pohyblivosti na gelu, SDS-PAGE (vzorky uvedené do varu jsou monomery, jinak se test provádí s většími proteiny) atd.. Další mírou trimerizace je detekce rozdílu v molekulových hmotnostech trimeru, jako protějšku monomeru. Povalený a denaturovaný trimer například bude na gelu vykazovat menší molekulovou hmotnost ve srovnání s nedenaturovaným stabilním trimerem (Hong and Angler, J. Virol. , 70, 7071-78 (1996) ) .

U trimerového rekombinantního vlákna se musí také testovat jeho schopnost vázat se na přirozené AR. Libovolný vhodný test, který může tuto vlastnost detekovat, je vhodný pro použití v tomto vynálezu. Preferovaný test zahrnuje vystavení buněk exprimující AR (například buňky 293) rekombinantním vláknitým trimerům za standardních podmínek infekce. Následně jsou tyto buňky vystaveny působení přirozených adenovirů a sleduje se schopnost virů vázat se na buňky. Sledování se může zaznamenávat pomocí autoradiografie (například použitím radioaktivně značených virů), imunocytochemie nebo měřením

• 9 9 · • 9 · ♦ • · · 9 • 9 9 9

99 stupně infekce nebo zavedením genu (například za použití reportního genu). Na rozdíl od přirozených trimerů, které redukují nebo podstatně eliminují následné navázání viru na buňky 293, tyto trimery nepodstatně redukující schopnost přirozených adenovirů následně se vázat na buňky jsou trimery podle vynálezu. Omezení interference s podstatným navázáním virů ukazuje, že samotný trimer není ligandem vhodným pro jeho přirozený savčí AR nebo se alespoň váže s omezenou afinitou.

V jiném případě vektor zahrnující sekvenci kódující mutované vlákno (nebo knihovnu putativních mutovaných vláken, jak se popisuje zde v textu) se může zavést do vhodného kmene hostitelských buněk, aby se exprimoval vláknitý protein. Za účelem sledování s vysokou účinností se používají přednostně jako hostitelské buňky bakterie. V tomto případě se mohou mutanti identifikovat testováním schopnosti vázat rozpustný protein CAR. Například replika bakteriální plotny (například na nitrocelulózovém filtru) se může kultivovat ve vhodném kultivačním médiu, přičemž se vyvolá exprese z vektoru. Filtr se pak vystaví působení roztoku, který je vhodný pro lyži bakterií, které jsou na filtrech zachyceny. Pak dojde k testování za použití radioaktivně značeného proteinu CAR. Upřednostňuje se, aby se filtr nejdříve „blokoval” roztokem s velkým množstvím proteinu, přičemž se minimalizuje nespecifická adherence sondy CAR na filtr. Po hybridizaci se filtr exponuje na film, přičemž se identifikují kolonie exprimující vláknité proteiny, které váží CAR. Tyto kolonie nehybridizující s radioaktivně značenou sondou CAR (nebo se váží s omezenou afinitou, což indikuje slabší signál) potenciálně exprimují vláknité monomery podle vynálezu. Protože omezení navázání CAR může být způsobeno buď selektivním odstraněním ligandu nebo strukturální modifikací ovlivňující trimerizaci u mutantních vláken , která nevykazují navázání na CAR, schopnost trimerizace se pak musí zjišťovat

999 9 · • 9

9 « 9 4 testováním bakteriální knihovny, jak se popisuje shora v textu.

Blokační proteiny

Jako alternativní způsoby redukce přirozeného virového trofizmu vynález popisuje chimérový blokační protein obsahující substrát pro adenovirové vlákno. Chimérový blokační protein může zahrnovat libovolnou vhodnou doménu, která má substrát, jenž je rozeznáván ligandem na adenovirovém vláknu. Například v případě interference s navázáním adenoviru divokého typu na receptor, chimérový blokační protein může obsahovat extracelulární doménu proteinu buněčného povrchového proteinu CAR (Bergelson et al., Science, 275, 1320-23 (1997);

Tomko et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 3352-56 (1997)), extracelulární doménu vhodnou pro receptor MHC třídy I (Hong et al., EMBO J., 16(9),2294-06 (1997)) nebo jinou podobnou doménu extracelulárního substrátu vhodnou pro AR. Avšak v případě interference navázání rekombinantních adenovirů na adenovirů, kteří mají vláknité trimery, jak se substrát, popisuje zde v textu, blokační protein může obsahovat substrát, který rozeznává ligand přítomný na uvedeném trimeru.

Zatímco, jak se uvádí chimérový blokační protein může obsahovat domény z buněčných povrchových proteinů, v typickém případě nejde o samotný buněčný povrchový protein. Místo chimérového blokačního proteinu se upřednostňuje volný rozpustný protein, který je schopný interagovat s adenovirem v roztoku.

Chimérový blokační protein podle vynálezu umožňuje způsob interferující s navázáním na adenovirový receptor inkubací adenoviru s chimérovým blokačním proteinem v roztoku tak, že chimérový blokační protein se váže přítomný na adenovirovém vlákně na

Virus a ligand, který je chimérový blokační protein se může inkubovat po libovolně dlouhý čas za libovolných vhodných podmínek, aby se podpořilo navázání ·· 0 • · 0 0«· • 0 · » 0

000 000 0 0 0 0 0

00 «·« • 0

0 0 * • 0 0 9 ·0 0

0 0 0

00 ligandu na vlákno se substrátem na chimérovém blokačním proteinu. Parametry, jako je čas, teplota a roztok, které jsou chemicky vhodné pro podporu selektivního navázání ligandu vlákna na chimerový blokační proteinový substrát, mohou kolísat v závislosti na afinitě, se kterou se ligand selektivně váže na substrát. V obecném případě, když se použijí známé systémy ligand-substrát, jsou tyto parametry také známy. Když se použije nový systém ligand-substrát, pak vazebné podmínky se mohou ve velké míře předem stanovit, jak se uvádí zde v textu (například použitím takových podmínek, kdy se testuje u proteinové knihovny nové interakce ligandsusbtrát). Upřednostňuje se však, aby koncentrace chimerového blokačního činidla byla dostatečná pro saturaci povrchových buněčných ligandů, které jsou přítomny na vláknech adenovirů během inkubace.

Vedle zahrnuté domény, která vykazuje substrát rozeznávaný ligandem na adenovirovém vláknu, chimérový blokační protein má také jiné domény. Protein může například zahrnovat domény, které podporují sekreci (např. Suter et al., EMBO, J. , 10, 2395-2400 (1991); Beutler et al., J. Neurochem., 64, 475-81 (1995)), což napomáhá shromažďování volných chimérových blokačních proteinů z buněk, které produkují protein. Navíc chimérový blokační protein přednostně dále zahrnuje ligandovou doménu (to znamená ligand vedle substrátu vhodný pro virovou uzlinu), stejně jako ty ligandy popsané zde v textu. Přítomnost ligandu na chimérovém blokačním proteinu, za zmínku stojí peptid tag a jiné podobné sekvence, umožňuje čištění a identifikaci chimérového blokačního proteinu po jeho produkci. Více preferovaným ligandem je ten, který rozeznává vazebné místa na povrchu buňky nebo jiný substrát, jak se zde uvádí. Takové blokační proteiny fungují jako „bi-specifické molekuly vhodné pro změnu navázání na adenovirový receptor. Když například chimérový blokační protein zahrnuje ligand pro vazebné místo na povrchu proteinu, pak blokační protein je ·· ·· » · · · » · · · ··· · · · « · · •« ·· *· ·· « · · · • · · · • · · · · • · * · ·· ·· schopen ovlivnit selektivní cílení adenovirů tím, že interferuje s navázáním vlákna na receptor, zatímco řízení nového cílení pomocí ligandu, který je přítomný na chimérovém blokačním proteinu a který rozeznává substrát přítomný na vazebném místě na povrchu buňky v roztoku tak, že chimérový blokační protein váže adenovirové vlákno za vzniku komplexu a po té se komplex vystaví působení buňky, která obsahuje substrát pro ligand.

Vedle domény, která vykazuje substrát rozeznávaný ligandem na adenovirovém vláknu (pravděpodobně na ligandové doméně, která nepochází z adenovirů), může chimérový blokační protein také zahrnovat trimerizační doménu, jako jsou zde uvedené trimerizační domény. Přítomnost trimerizačních domén umožňuje chimérovým blokačním proteinovým monomerům trimerizovat. Zatímco, stejně jako monomery, chimérové blokační proteiny mohou saturovat ligandy přítomné jako vlákna, takové vazby jsou samozřejmě předmětem disociaot. a do jisté míry závisí na kinetice interakce ligand-substrát. Protože pravděpodobnost, že všechny tři vazby ligand/substrát mezi trimerovým vláknem a trimerovým blokačním proteinem budou posíleny, je podstatně menší, než pravděpodobnost, že libovolná taková vazba bude porušena. Trimerový blokační protein jednodušeji saturuje dostupné ligandy, které jsou přítomny na vlákně. Trimerová struktura účinně drží každý substrát proti ligandu uzliny vlákna, přičemž zvyšuje pravděpodobnost, že každý ligand je blokován.

Chimérové blokační proteiny se mohou produkovat libovolnou vhodnou metodou, jako je přímá proteinová syntéza, buněčná produkce, translace in vitro nebo jiné metody známé v oboru. Popisuje se zde řada vhodných metod, které produkují proteiny a jsou známy v oboru.

Viry

Vynález poskytuje adenovirus začleněný do rekombinantních vláknitých trimerů podle vynálezu. Adenovirus podle vynálezu neinfikuje své přirozené hostitelské buňky prostřednictvím přirozeného AR, stejně snadno jako sérotyp divokého typu, což je způsobeno shora uvedeným omezením afinity vláknitých trimerů přítomných ve virovém obalu (např. prostřednictvím nahrazení trimerizační domény trimerizační doménou, která nepochází z ligandu, selektivní mutací odpovědných zbytků nebo začleněním blokační domény). Tak adenovirus přednostně začleňuje ligand, který nepochází z adenoviru, což umožňuje propagaci, izolaci a/nebo cílení.

Virus může zahrnout libovolný vhodný ligand (např. peptid, který se specificky váže na substrát). Například při cílení adenoviru do typu buněk jiných než jsou přirozeně infikované buňky (nebo skupina buněčných typů jiných než je přirozené rozmezí nebo sada hostitelských buněk) se může ligand vázat na *

vazebné místo na povrchu buněk (například libovolné místo přítomné na povrchu buňky, se kterým může adenovirus interagovat, přičemž se naváže na buňku a tím podpoří vstup do buňky), které je jiné než AR nebo to dokonce může být libovolný přirozený AR. Vazebným místem na povrchu buňky může být libovolný vhodný typ molekuly, ale v typickém případě je to protein glykoprotein, mukoprotein (zahrnuj ící proteoglykan, nebo jiná protein), sacharid, molekulí! mucinu nebo molekula. Příklady upraveny lipid, podobná potencionálních vazebných míst na povrchu buňky zahrnují, ale nejsou omezeny na části heparinu a chondroitinsulfátu, které se nacházejí v glykosaminoglykanech; části kyseliny sialové, které se nacházejí v glykoproteinech a gangliozidy, běžné molekuly sacharidů, které se nacházejí v membránových glykoproteinech zahrnující manózu, N-acetyi-galaktozamin, Nacetyl-glukozamin, fukózu a galaktózu; glykoproteiny, jako jsou ICAM-1, VCAM, selektiny (např. E-selektin, P-selektin, Lselektin, atd.) a molekuly integrinu a nádorově specifické ϊ

A ·«· antigeny přítomné na karcinogenních buňkách, jako jsou například epitopy specifické pro nádor MUC-1. Protein se pak může exprimovat v úzké skupině buněčných typů (například buňky srdečního svalu, svalů skeletu, hladkého svalstva, atd.) nebo se exprimují v široké skupině zahrnující několik buněčných typů.

V jiných provedeních vynálezu (například aby se umožnilo čištění a pomnožení ve specificky vytvořených buněčných typech) nepřirozený ligand se může vázat na sloučeninu, která je jiná než přirozený buněčná povrchový protein. Ligand se tak může vázat na proteiny, které vznikají v krvi nebo/a v lymfě (například albumin), na syntetické peptidové sekvence, jako jsou polyaminokyseliny (například polylizin, polyhistidin, atd.), na umělé peptidové sekvence (např. FLAG uvedená v SEQ ID NO: 16) a peptidové fragmenty RGD (Pasqualini et al. , J. Cell. Biol. 130, 1189 (1995)). V jiném případě se ligand může vázat na substráty, které neobsahují peptidy, jako je plast (popisuje se například v publikaci Adey et al., Gene, 156, 27 (1995)), biotin (Saggio et al., Biochem. J. , 293, 613 (1993)), sekvence DNA (Cheng et al., Genen, 171, 1, (1996); Krook et al., Biochem. Biophys., Res. Commun., 204, 849 (1994)), streptavidin (Geibel et al., Biochemistry, 34, 15430 (1995),

Katz, Biochemistry, 34, 15421 (1995)), nitrostreptavidin (Balas et al., Anal. Biochem., 243, 264 (Wickham et al., Nátuře Biotechnol., 14, kationtové podklady, kovy, jako jsou nikl a zinek (popisuje se například v publikaci Rebar et al., Science, 263, 671 (1994); Qui et al. , Biochemistry, 33, 8319 (1994)) nebo jiné potencionální substráty. Příklady vhodných ligandů nebo jejich substrátů pro použití v metodě podle vynálezu zahrnuje, ale není omezeno na receptor CR2, jenž váže sekvence, na které jsou přichycené aminokyselinové zbytky; receptor CD4 rozeznávající smyčku V3 viru HIV gpl20; receptor transferinu a jeho ligand (transferin); receptor lipoproteinu s nízkou (1996)), heparin 1570-73 (1996)), hustotou jeho ligand; receptor

ICAM-1 na povrchu

Ligand může také (například krátké epiteliálních a endoteliálních buněk plic a jeho ligand; lineární a cyklické peptidové ligandy pro streptavidin nebo nitrostreptavidin (Katz, Biochemistry, 34, 15421 (1995)), sekvence galaktinu, které vážou laktózu, galaktózu a jiné sloučeniny obsahující galaktózu a asialoglykoproteiny, které rozeznávají deglykosylované proteinové ligandy. Další ligandy a jejich vazebná místa přednostně zahrnují (ale nejsou omezeny na) krátké lineární pruhy aminokyselin (například 6 aminokyselin nebo méně) rozeznávané integriny, stejně jako polyaminokyselinové sekvence, jako je polylyzin, polyarginin atd. . Začleněním velkého množství lyzinů a/nebo argininů se umožňuje rozeznávání heparinu a DNA.

obsahovat běžně používaný peptid tag aminokyselinové sekvence známé tím, že je rozeznávají dostupná antiséra), jako jsou sekvence z glutathion-S-transferázy (GST) z Shistosoma manosi, β-galaktozidáza thioredoxinu nebo protein vázající maltózu (MPB) pocházející z organizmu E. colí, lidská alkalická fosfatáza, oktapeptid FLAG (SEQ ID NO: 16), hemaglutamin (HA) (Wickham et al. , Nátuře Biotechnol., 14,

1570-73 (1996)), peptidy polyomaviru, peptid velkého T antigenu SV40, peptidy BPV, jádro viru hepatitidy C a obalové peptidy E2 a jednořetězové protilátky, které je rozeznávají (Chán, J. Gen. Virol., 77, 2531 (1996)), peptid c-myc, epitopy adenovirové pentonové báze (Stuart et al., EMBO J. , 16, 118998 (1997)), epitopy přítomné v obalu E2 viru hepatitidy C SEQ

ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 (popisuje se například v publikaci (Chán, J. Gen. Virol., 77, 2531 (1996)) a jiné běžně používané tag. Preferovaný substrát vhodný pro ligand tag je řízen protilátkami, deriváty takových protilátek (jako je například fragment FAB, jednořetězové protilátky (ScAb) nebo vhodný substrát).

Jak se uvádí vhodný ligand může být specifický pro libovolný požadovaný substrát, jako je ten, co se popisuje zde • » • · · ex» » · · » · · » « ·

9 ·· · v textu nebo je znám v oboru. Adenovirové vektory se mohou také manipulovat tak, aby zahrnovaly nové ligandy, přičemž se nejdříve testuje schopnost peptidu reagovat s da ným substrátem. V obecném případě lze připravit náhodnou nebo semi-náhodnou peptidovou knihovnu obsahující ligandy. Tato knihovna je v podstatě knihovna v expresívním vektorovém systému. Taková knihovna se může testovat tím, že se vystaví exprimované proteiny (to jsou putativní ligandy) vlivu požadovaného susbtrátu. Pozitivní selektivní navázání specie v knihovně na substrát indikuje ligand vhodný pro uvedený substrát, alespoň za podmínek testu. Při testování takové peptidové knihovny je možné použít libovolný test schopný detekovat interakce mezi proteiny a substráty. Řada těchto testů je v oboru známých. Jedním preferovaným testem vhodným pro testování proteinové knihovny je fágový systém, který se

13, využívá bakteriofágovou exprimující knihovnu (popisuje například v publikaci Koivunen et al., Bio/Technology, 265-70 (1995); Yanofsky et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 93, 7381-86 (1996); Barry et al., Nátuře Med., 2(3), 299-305 (1996)). Navázání fága na substrát se testuje vystavením fága vlivu substrátu, dále se provede opláchnutí substrátu a vybere se fág, který zůstane navázaný na substrátu. Pak limitující ředění fága může identifikovat jednotlivé klony exprimující putativní ligand. Samozřejmě inzert přítomný v takových klonech se může sekvenovat, aby se stanovila identita ligandu.

Pro identifikaci potencionálních ligandů se preferuje fág, protože nejlépe napodobuje virovou interakci s mikroprostředím. Je nutné poznamenat, že uvedené vyjádření ve fágu je extracelulární systém (jako je počáteční stádium virové infekce). Mimo to vyjádření ve fágu zahrnuje virus (fága), který prezentuje potencionální ligand. Vyjádření ve fágu také nabízí podstatně větší flexibilitu ve srovnání s jinými testy, kde dochází k navázání proteinu (zvláště vnitrobuněčné testy). Je nutné poznamenat, že vyjádření ve fágu nejenom pouze • · · ·· identifikuje navázání proteinů (ligand) na určitý substrát, ale také identifikuje ty ligandy, které se vážou za předem stanovených podmínek. Při vyjádření ve fágu se mohou identifikovat ligandy použitelné pro inkorporaci do adenoviru, aby se umožnilo čištění za předem stanovených podmínek. Fágová knihovna se může například testovat vystavením vlivu určitého plastu, pryskyřicfi nebo jiného požadovaného substrátu, který se používá v afinitní koloně. Jednoduše se mohou stanovit peptidy exprimované fágem, které se buď váží na substrát nebo se mohou eluovat ze substrátu za specifických podmínek nebo v rozmezí určitých podmínek (například při vysokém nebo nízkém obsahu solí, pH, teplotě atd.), ale nevážou se nebo nejsou eluovány za jiných podmínek. Adenovirus začleňující ligand se může čistit tím, že se vystaví působení substrátu za takových podmínek, jak se uvádí zde v textu.

Když se ligand identifikuje, může se začlenit do libovolné, polohy viru, který je schopný interagovat se substrátem (to je virový povrch). Ligand se může například začlenit do vlákna, pentonové báze, hexonu nebo jiné vhodné polohy. Když se ligand zachytí na vláknitý protein, upřednostňuje se, aby nepoškodil interakci mezi virovými proteiny nebo monomery. Upřednostňuje se, aby samotný ligand nebyl oligomerizační doménou. Jako takový může nepříznivě interagovat s trimerizační doménou, jak se diskutuje shora v textu. Ligand přednostně nenahrazuje část vláknitého proteinu, což může nepříznivě ovlivnit trimerizaci a interakcí s pentonem. S výhodou se ligand přidává k vláknitému proteinu a začlení se takovým způsobem, aby se snadno mohl vystavit substrátu (např. na karboxylový konec proteinu se přichytí na zbytek, který je vystaven susbtrátu; nachází se na peptidovém mezerníku, aby přišel do kontaktu se substrátem atd.), přičemž se maximalizuje prezentace ligandu vůči substrátu. Když se ligand zachytí na část pentonu nebo ligand nahradí jeho část, upřednostňuje se, aby k tomu došlo v hypervariabilních oblastech, aby se zajistily kontakty se • » fl ·

2í substrátem. Dále, když se ligand zachytí na penton, dojde ke zkrácení rekombinantního vlákna (například o 0 až 10 repetic), aby se maximalizovala prezentace ligandu vůči susbtrátu (popisuje se například v dokumentu US patent 5,559,099 (Wickham et al.)). V případě, že ligand je zachycen na hexonu, je výhodné, aby k tomu došlo v hypervariábilní oblasti (Miksza et al., J. Virol., 70(3), 1836-44 (1996)).

V případě, že se ligand začlení do adenovirového proteinu (nebo blokačního proteinu), může ligand obsahovat část přirozené sekvence a část nepřirozené sekvence. Podobně sekvence (buď přirozené nebo nepřirozené), které obsahují v proteinu ligand nemusí nezbytně přiléhat k řetězci aminokyselin, které obsahují protein. Jinými slovy ligand se může vytvořit určitou konformací proteinu, například prostřednictvím balení proteinu takovým způsobem, že přiléhající a/nebo nepřiléhající sekvence se mohou dostat do vzájemné blízkosti. Adenovirus podle vynálezu (nebo blokační protein) může samozřejmě obsahovat velké množství ligandů, kdy každý se váže na různý substrát. Například virus může obsahovat první ligand umožňující afinitní čištění, jak se popisuje zde v textu a/nebo třetí ligand vhodný pro deaktivaci viru, jak se také popisuje zde v textu.

Protein zahrnující ligand může zahrnovat také jiné nepřirozené elementy. Například do aminokyselinové sekvence se může začlenit nepřirozené, jediné místo, které rozeznává proteáza. Proteázové místo přednostně neovlivňuje trimerizaci vlákna nebo susbtrátovou specifitu vláknitého ligandu. V oboru je známa řada takových proteázových míst. Například trombin rozeznává a štěpí známou aminokyselinovou sekvenci (Stenflo et al., J. Biol. Chem. 257, 12280-90 (1982)). Přítomnost takových sekvencí, které rozeznávají proteázy umožňuje čištění viru podle některých protokolů, jak se popisuje shora v textu. Protein se může manipulovat tak, aby zahrnoval ligand,

Α·Α **

Α · A Α • * A «

A A Α ♦

A A A Α

A A A Α libovolnou vhodnou metodou. Tyto metody vhodné pro zavedení mutací do proteinů se popisují shora v textu.

Vedle trimeru a ligandu může virus podle vynálezu zahrnovat jeden nebo více nepřirozených cizorodých genů. „Cizorodý gen může být libovolným vhodným genem a požaduje se, aby byl buď terapeutickým genem (to znamená sekvence nukleové kyseliny kódující produkt, který působí biologickou, s výhodou terapeutickou odezvu, buď na úrovni buňky nebo sytémově) nebo reportním genem (to je sekvence nukleové kyseliny, která kóduje produkt, který lze detekovat v buňce). Upřednostňuje se, aby cizorodý gen se exprimoval v buňce, do které se zavedl vektor. Cizorodý gen s výhodou projevuje svůj účinek na úrovni RNA nebo proteinu. Například protein kódovaný přeneseným terapeutickým genem se může použít při léčbě dědičného onemocnění. Příkladem je například cDNA regulátoru vodivosti transmembrány cystické fibrózy při léčbě cystické fibrózy. V jiném případě protein kódovaný terapeutickým genem může projevit svůj terapeutický účinek tím, že způsobí odumření buněk. Například exprese samotného genu může vést k odumření buněk. Takovým příkladem je toxin diftérie. V jiném případě gen nebo exprese genu může tvořit buňky selektivně citlivé k nežádoucímu působení určitých buněk, což může vést k usmrcení buněk. Příkladem je například exprese genu thymidinové kinázy HSV, která způsobuje citlivost buňky k antivirovým sloučeninám, které zahrnují aciklovir, ganciklovir a FIAU (1-(2-deoxy-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)5-jodouracil). Terapeutický gen může však vykazovat svůj účinek na úrovni RNA. Například tím, že kóduje antisense message nebo ribozym, protein, který ovlivňuje sestřih nebo zpracování 3'-konce (například adenylaci), nebo může jít o protein ovlivňující expresi jiného genu v buňce (to je v případě, že exprese genu zahrnuje všechny kroky počínaje počátkem přepisu až po produkci upraveného proteinu), dále může zprostředkovávat změnu rychlosti akumulace mRNA, může «3>33S3BSSÍSS3 • * · » · A měnit post-translační použití pro zavedení • 9 ·· ► · · 4 » · · 4 měnit transport mRNA regulace. Samozřejmě, a/nebo může je-li nutné cizorodého genu metodu transferu genu, pak se použije gen, jehož sekvence je v oboru známa.

Změněný protein (například trimer nebo obalový protein mající ligand) a cizorodý gen (v případě, že je přítomen) se může začlenit do adenovirů libovolnou vhodnou metodou, přičemž řada z nich je známo v oboru. Jak se uvádí zde v textu, protein se přednostně identifikuje testováním produktů, které se produkují ve velkém objemu z genů v expresívních vektorech (například v bakulovirových vektorech). Geny pocházející z vektorů, které nesou požadovanou mutaci, se mohou snadno sub-klónovat do plazmidů. Tyto plazmidy se pak transfekují do vhodných buněk, kde dochází k jejich balení (to jsou například buňky 293). Transfekované buňky se pak inkubují s adenoviry za podmínek vhodných pro infekci. Při určité frekvenci výskytu v buňkách homologní rekombinace mezi vektorem a virem bude produkovat adenovirový genom nesoucí požadovanou mutaci.

mohou být buď replikačně Upřednostňuje se, aby genom s alespoň jednou

Adenoviry podle vynálezu kompetentní nebo nedostateční adenovirový vektor obsahoval modifikací, která tvoří virus replikačně deficitní (popisuje se například v dokumentu mezinárodní patentové přihlášky WO 95/34671). Modifikace adenovirového genomu zahrnuje, ale není omezena na přidání segmentu DNA, přeskupení segmentu DNA, deleci segmentu DNA, nahrazení segmentu DNA nebo zavedení léze DNA. Segment DNA může být tak malý, jako je jeden nukleotid a velký jako adenovirový genom (například 36 kb) nebo v jiném případě může být roven maximálnímu množství, které se může zabalit do adenovirového viriónu (to je přibližně 38 kb) . Preferované modifikace adenovirového genomu zahrnují úpravy v oblastech El, E2, E3 a/nebo E4. Adenovirus se může přednostně také ko-integrovat, což znamená ligaci »!SI,W«· • » · * · « · « · · « » • f · W * · · * » * • ··· · · » · · · · · · · ········ '-s · · » * · « τ «« · · «· adenovirových genomových sekvencí s jinými sekvencemi, jako jsou sekvence jiných virů, fágů nebo plazmidů.

Adenovirus podle vynálezu má řadu kvalit, které umožňují, aby se staly atraktivní volbou pro použití při genovém přenosu, stejně i při jiných aplikacích. Adenovirus například neinfikuje svou přirozenou hostitelskou buňku ochotněji než adenovirus divokého typu, což způsobují mutantní trimery vlákna (například selektivní mutace zbytků odpovědných z navázání na AR, nahrazení trimerizační domény nebo přidání blokační domény, jak se popisuje zde v textu). Dále adenovirus má alespoň jeden nepřirozený ligand specifický pro substrát, který umožňuje propagaci viru, cílení, čištění a/nebo deaktivaci, jak se uvádí shora v textu. V případě jednoduchého klonování jsou s výhodou ligandy a trimerizační domény oddělenými doménami, což umožňuje, aby virus byl jednoduše manipulován tak, aby se mohly začlenit různé ligandy, aniž se poruší trimerizace vlákna. Jestliže se do trimeru. vlákna začlenila mutovaná uzlina vlákna, pak se ligand může začlenit do uzliny, jak se popisuje zde v textu.

Za účelem začlenění do hostitele (jako je zvíře) je možné vnést virus podle vynálezu do vhodného nosiče. Jako takový podle vynálezu poskytuje kompozici obsahující adenovirus podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Libovolná vhodná příprava je v rozsahu vynálezu, přičemž přesný vzorec samozřejmě záleží na podstatě požadované aplikace (např. typ buňky, mód aplikace atd.). Řada vhodných přípravků se popisuje v dokumentu US patent 5. 559 099 (Wickham et al.).

Buněčná linie

Jak se zde popisuje, adenovirus podle vynálezu není schopen snadno infikovat svou přirozenou hostitelskou buňku prostřednictvím AR, protože jeho schopnost vázat se na AR je podstatně utlumena (což je způsobeno inkorporací chimérových trimerů podle vynálezu). Vynález proto poskytuje buněčnou • 9

9 9 9 9

9 9 9

99999 9

9 9

9 9 9

9 9 9 · • 9 9 9

9 9 9 9 linii, která je schopna pomnožit uvedený adenovirus. Buněčná linie s výhodou podporuje virový růst v případě alespoň přibližně 10 pasáží (například přibližně 15 pasáží), více se upřednostňuje alespoň přibližně 20 pasáží (například přibližně 25 pasáží) nebo dokonce 30 a více pasáží.

Adenovirus se může nejdříve kultivovat v pakovací buněčné linii, která exprimuje gen přirozeného proteinu vlákna. Výsledné virové částice proto pravděpodobně obsahují obě přirozená vlákna kódovaná komplementační buněčnou linií a nepřirozená vlákna kódovaná adenovirovým genomem (jako zde popsaná vlákna). Proto populace takových výsledných virů bude obsahovat oba typy vláken. Takové částice budou schopny se vázat na pakovací buněčné linie nebo do nich vstupovat prostřednictvím přirozeného vlákna účinněji než částice, které neobsahují přirozené vláknité molekuly. Tak použití takové buněčné linie kódující vlákno umožňuje kultivovat a amplifikovat genomy adenovirů, které kódují chimérová, cílená adenovirové vlákna, s vhodným vysokým titrem. Výsledné smíchané zásobní roztoky adenovirů produkovaných z buněčných linií kódujících přirozenou vláknitou molekulu budou obsahovat přirozené a chimérové adenovirové vláknité molekuly. Částice však obsahují genomy kódující pouze chimérové adenovirové vlákno. Za účelem produkce čistého zásobního roztoku adenovirů, které vykazují pouze chimérové adenovirové vláknité sloučeniny, se pro infekci pakovací buněčné linie, která neprodukuje přirozené vlákno (jako jsou buňky 293 v případě El deletovaných virů), používá smíchaný zásobní roztok. Výsledné adenoviry obsahují pouze molekuly vlákna kódované genomy (to jsou chimérové molekuly vlákna).

Produkují se podobné buněčné linie, které doplňují vlákno. Tyto buněčné linie se používají pro kultivaci mutantního adenovirů, kterému chybí gen vlákna. Rychlost produkce těchto buněčných linií není v obecném případě dostatečně vysoká, aby se vzniklý titr adenovirů nesoucí deleci vlákna srovnatelný

I * · » · ·

I » · ·# • ♦ · <« s titrem adenovirových částic exprimujících vlákno. Nižší titry produkované takovými mutanty se mohou vylepšit dočasnou regulací exprese přirozeného vlákna, aby se více doplnil mutandní adenovirový genom. Jedna taková strategie produkce zdokonalené buněčné linie používá indukovatelný promotor (například promotor metalothioninu), což umožňuje produkci vlákna řízenou a aktivovanou infekcí buněk adenoviry. V jiném případě účinné místo sestřihu mRNA zavedené do genu vlákna v komplementační buněčné linii zdokonaluje sílu produkce vláknitého proteinu v buněčné linii.

Když se adenovirus manipuluje, aby obsahoval ligand specifický pro vazebné místo na povrchu buňky, pak jako hostitelská buněčná linie se může použít libovolná buněčná linie, která exprimuje receptor a která je schopna podpořit růst adenovirů. Protože řada ligand^se neváže na vazebná místa na povrchu buňky (zvláště zde popsané nové ligandy), pak buněčná linie se může manipulovat tak, aby exprimovala substrát pro ligand.

Vynález popisuje buněčnou linii exprimující nepřirozené vazebné místo na povrchu buňky, pro které adenovirus (nebo bispecifický blokační protein) vykazuje ligand vhodný pro navázání na receptor. Libovolná buněčná linie schopná podpořit růst adenovirů je vhodná jako buněčná linie, kterou je možné použit podle vynálezu. V případě, že adenovirus neobsahuje geny podstatné pro virovou replikaci, upřednostňuje se, když buněčná linie exprimuje komplementační množství genových produktů. Vzhledem k tomu, že buňky 293 podporují růst adenovirů upřednostňuje se, aby se buněčná linie podle vynálezu odvodila od buněk 293.

Nepřirozené vazebné místo na povrchu buňky je susbtrátová molekula| ^Naní se selektivně váže adenovirus (nebo bispecífiký blokační protein) vykazující ligand. Substrát se může vázat na buňku a tím podpořit vstup do buňky. Když ligand je na adenovirů, vazebné místo může rozeznat nepřirozený • · ·*· · · * ligand začleněný do adenovirového obalu nebo ligand, který je pro virus přirozený. Například, jestliže nepřirozený virový ligand je peptid tag, pak vazebným místem může být receptor jednořetězcových protilátek (ScAb), který rozeznává tag. V jiném případě ScAb může rozeznat epitop přítomný v oblasti mutované vláknité uzliny (v případě, že je přítomna) nebo dokonce epitop přítomný na přirozeném adenovirovém obalovém proteinu (například na vláknu, pentonu, hexonu atd.). V jiném případě, kdy nepřirozený ligand rozeznává substrát na povrchu buňky (například protein vázaný na membránu) , pak vazebné místo může obsahovat substrát. V případě, že vazebným místem je přirozený receptor na povrchu buňky, pak buněčná linie může exprimovat mutantní schopností (například receptor se sníženou interagovat s celulární signální buněčnou dráhou zkrácený receptor, jako je NMDA (popisuje se v publikaci Li, et al., Nat. Biotech., 14, 989 (1996)), s utlumenou schopností působit jako kanál iontů nebo s jinými úpravami. Infekce prostřednictvím takových upravených proteinů minimalizuje druhotné působení virové infekce na metabolizmus hostitelské buňky tím, že se omezuje aktivace dráhy vnitrobuněčného zpracování zpráv a jejich různých elementárních odpovědí. V krátkosti, volba vazebného místa závisí ve velkém rozsahu na podstatě adenoviru. Avšak, aby se podpořila specifita typu buňky vzhledem k adenoviru, pak vazebné místo s výhodou není přirozený savčí AR. Vazebné místo se však musí exprimovat na povrchu buňky, aby bylo pro virus dostupné. V případě, že vazebné místo je protein, upřednostňují se vedoucí sekvence a sekvence zaručující zachycení na membránu (popisuje se například v publikaci Davitz et al., J. Exp. Med. 163, 1150 (1986)), které podporují správnou integraci do membrány.

Buněčná linie může vznikat libovolným standardním způsobem. Například vektor (například oligonukleotidový, plazmidový, virový nebo jiný vektor) obsahující gen kódující nepřirozený receptor se může zavést do zdrojové buněčné linie standardním způsobem. Upřednostňuje se, aby vektor také kódoval činidlo, které umožňuje, aby buňky, jenž ho nesou, byly snadno identifikovatelné (vektor může například kódovat rezistenci na antibiotika, která usmrcují buňky, jenž nenesou plazmid). Vektor se bude se stejnou četností rekombinovat s buněčným genomem za vzniku transformované buněčné linie exprimující vazebné místo.

Způsob pomnožení

Spolu s buněčnou linií nepřirozeného adenovirového vazebného místa na povrchu buňky vynález popisuje způsob pomnožení adenoviru podle vynálezu. Způsob podle vynálezu zahrnuje infekci buňky adenovirem, který vykazuje nepřirozený ligand selektivně se vázající na receptor, inkubaci buněk a získání adenovirů, jenž se produkují v buňkách. Adenoviry získané z buněk se mohou opět pomnožit (například amplifikovat) za vzniku virového zásobního roztoku s velmi vysokým titrem. Ligand na adenoviru může být libovolným ligandem, který se popisuje zde v textu. Buňky podle vynálezu se infikují virem v libovolném m.i.o., aby se podpořila účinná infekce buněčné linie (například přibližně 1. m.o.i. až 10 m.o.i.). Podmínky buněčné kultivace závisí na podstatě hostitelské buňky. Odborník je však schopen vybrat podmínky kultivace daného buněčného typu. Viry se z buněk získávají standardními způsoby, jako je lyže buněk. Po té se buňky mohou čistit standardními postupy nebo jinými metodami podle vynálezu.

Způsob čištění

Jak se zde uvádí, není nutné, aby substrát vhodný pro ligand, který se zavede do adenoviru, byl přítomen na povrchu buňky. Substrát se například může nacházet na podkladu, jako je například anorganická hmota, například plast, sklo, kov, pryskyřice nebo jiné materiály, které se běžně používají při • 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 · 4 4 4

444 4 4 4

4 4 4

444 44 ·4

4 4 4 4 •4 4 44 4

4 4 4 4 · 4 4 4 4

4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 4 chromatografické nebo afinitní separaci. Příklady takových podpor zahrnují kovy, přirozené polymérní sacharidy a jejich synteticky modifikované, zesíťované nebo substituované deriváty, jako je agar, agaróza, zesíťované kyselina alginová, substituované a zesíťované guarové polysacharidy, estery celulózy, zvláště pak s kyselinou dusičnou a s karboxylovými kyselinami, smíšené estery celulózy a etery celulózy; přirozené polyméry obsahující dusík, jako jsou proteiny a deriváty, zahrnující zesíťované nebo upravené přirozené polyméry uhlovodíků, jako jsou latexy syntetické polyméry, které porézní strukturou, jako polyetylén, polypropylén, želatiny; a guma;

se mohou připravit s vhodnou je vinylpolymér, zahrnující polystyren, polyvinylchlorid, polyvinylacetát a jiné částečně hydrolyzované deriváty, polyakrylamidy, polymetakryláty, kopolyméry a terpolyméry shora uvedených polykondenzátů, jako jsou polyestery, jako sou polyuretany polyamidy a jiné polyméry, polyepoxidy; porézní anorganické materiály, jako jsou sírany nebo uhličitany kovů alkalických zemin a hořčíku, zahrnující síran barnatý, síran vápenatý, uhličitan vápenatý, silikáty alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, hliníku a hořčíku; hliník nebo oxidy nebo hydráty křemíku, jako jsou jíly, alumina, talek, kaolin, zeolit, silikagel nebo sklo (tyto materiály lze použít jako filtry se shora uvedenými polymérními materiály) a směsi nebo kopolyméry shora uvedených tříd, jako jsou kopolyméry transplantátů, jiné materiály, které se běžně používají při chromatografické a afinitní separaci. Takové podpory se mohou připravit ve formě kuliček, filmů, listů, ploten atd. nebo se mohou jimi potáhnout, laminovat inertní nosiče nebo se na ně mohou vázat nebo se s nimi jinak spojit. Nosičem může být papír, sklo, polymérní film, látka atd..

Přítomnost substrátu vhodného pro ligand na povrchu adenoviru podle vynálezu umožňuje, aby se adenoviry jednoduše kompozic (např. Běžnou kompozicí čistily s vysokou afinitou a taxonomickou věrností. Vynález dále popisuje způsob čištění adenoviru, který nese ligand vhodný pro substrát, z kompozice obsahující adenovirus. Způsob zahrnuje vystavení kompozice substrátu za takových podmínek, aby se podpořilo selektivní navázání ligandu, který je přítomen na adenoviru, na substrát. Pak se ze substrátu odstraní kompozice (například podstatná část kompozice), která se na něj nenavázala. Pak následuje eluce adenoviru navázaného na susbtrát. Za použití uvedené metody se může izolovat adenovirus vykazující ligand z různých z roztoků, disperzí, suspenzí gelů apod.) obsahující adenovirus je buněčný lyzát, který se například produkuje z pakovacích buněk během propagace adenoviru.

V obecném případě se substrát váže na podklad, jak se popisuje dříve v textu. Fúzování požadovaného komplexu ligandsusbtrát s vhodným podkladovým materiálem je dobře známo v oboru. Vynález popisuje libovolnou vhodnou metodu produkce podkladu, který vykazuje susbtrát. Samotným susbtrátem může být plast, sklo, kov, pryskyřice atd.. Libovolný způsob vystavení kompozice obsahující adenovirus substrátu je vhodný pro použití podle vynálezu. Kompozice může například projít kolonou, která obsahuje podklad, na který se váže susbtrát. Kompozice se může samozřejmě smíchat s kaší takového podkladového materiálu (například kuličky nebo jiné materiály obsahující navázaný substrát), umístí se do kontejneru (což je například zkumavka, prohlubeň destičky atd.), který je potažen substrátem, nebo se jinak vystaví působení substrátu.

Parametry, jako je čas, teplota a roztoky, které jsou nezbytné, aby došlo k selektivnímu navázání, mohou kolísat v závislosti na afinitě, kterou vykazuje ligand vůči substrátu. Když se použijí známé systémy ligand-substrát, parametry jsou známy. Jestliže se použijí nové systémy ligand-substrát, vazebné podmínky lze ve velké míře předem stanovit, jak se uvádí zde v textu (například použitím takových

99

9 9 9

9 9 ·

9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 ·9· podmínek, kdy se u proteinové knihovny testují interakce ligand-susbtrát). Je výhodné, když podmínky pro selektivní navázání neumožňují selektivní navázání jiných konstituentů kompozice k susbtrátu. Tam kde se jiní konstituenti selektivně váží na susbtrát, podstatné množství adenoviru se může odstranit z kompozice spojením se substrátem.

Po selektivním navázání se kompozice zbavená viru odstraní ze substrátu (je například selektivně eluována). Může se použít libovolný vhodný způsob odstranění kompozice zbavené adenoviru, přičemž adenovirus zůstává selektivně navázán na susbtrátu. Podmínky, které se používají při odstranění kompozice zbavené adenoviru ze substrátu, nejsou v obecném případě dostatečné k eluci adenoviru ze susbtrátu. Způsob odstranění kompozice zbavené adenoviru je ve velké míře funkcí typu substrátu a podkladu. Například kompozice zbavená adenoviru se může odstranit z kolony obsahující substrát vypláchnutím kolony několika objemy vhodného roztoku. Kompozice zbavená adenoviru se může odstranit z kaše podkladu obsahující substrát opakovanou centrifugací, opětným vytvořením suspenze ve vhodném roztoku a opětnou centrifugací. V jiném případě, kdy podklad je magnetický materiál, může být fyzikálně odstraněn z roztoku tím, že se roztok obsahující částice vystaví působení magnetu a magnetický podklad se promyje. Když se substrát naváže na plotnu nebo na prohlubeň na destičce, kontejner se může jednoduše promýt několika objemy vhodného roztoku.

Když se kompozice zbavená adenoviru odstraní ze substrátu, ze substrátu se také uvolní adenovirus. Pro odstranění adenoviru ze substrátu se může použít libovolný způsob. Při mnoha aplikacích je možné adenovirus uvolnit expozicí komplexu adenovirus-podklad elučnímu činidlu, které není kompatibilní s vazbou ligand-substrát. Parametry času, teploty a roztoku, které jsou nezbytné pro vyvolání selektivní eluce viru z podkladu, se mohou lišit podle afinity, se kterou se ligand

9 9

9 9 9

99 *· ·· • · 4 · · · 9

9 # 9 ' ·

999 99 ♦

9 9 9 • · · 9 9 99 9 selektivně váže na substrát. V obecném případě, kdy se používají známé systémy ligand-susbtrát, jsou tyto parametry známy. V případě, že se používají nové systémy ligandsubstrát, podmínky eluce se mohou ve velké míře předem stanovit například nastavením podmínek, při kterých se testuje proteinová knihovna, jak se uvádí zde v textu. Když se ligand začlení do adenoviru do mezerníku nebo jiného peptidů, jak se popisuje zde v textu, pak mezerník může zahrnovat sekvenci, kterou rozeznává peptidáza nebo jiný specifický motiv pro štěpení. Adenoviry obsahující takovou štěpící sekvenci se mohou uvolnit z podkladu tak, že se podklad vystaví působení činidla, které ovlivňuje štěpení,, jako je endoproteáza nebo jiné činidlo. Zatímco způsob štěpení poškozuje ligand adenoviru, při mnoha aplikacích je výhodný. Například ligand pro čištění viru může interferovat s druhým ligandem vhodným pro cílení viru na určitý typ buňky. Odstranění čistícího ligandu tak umožňuje, aby izolovaný adenovirus jednodušeji infikoval buněčný typ.

Zatímco se mohou použít libovolné vhodné podmínky navázání nebo eluce, praktické omezení je dáno schopností adenoviru přežít uvedené podmínky. Jestliže však adenovirus je schopen přežít různé podmínky okolí , jako je vysoká koncentrace solí, vysoká osmolalita a bazické prostředí, pak se uvedený způsob může použít v různém rozmezí podmínek. Takové podmínky jsou dokonce dobře známy v oboru.

Při uvedeném způsobu čištění adenovirů není třeba odstranit z roztoku všechny viry nebo dokonce velkou část virů. Při mnoha aplikacích množství viru přítomné v počáteční kompozici může saturovat množství substrátu přítomné na podkladu. Zatímco ligand na podkladu se selektivně váže na substrát, k takovému selektivnímu navázání nemusí dojít na základě afinity. Takové podstatné množství substrátu nemusí při kroku separace vázat dostupné ligandy. Proto, aby se získalo z počáteční kompozice tolik adenoviru, jak jen je * ·· ·· 0 00 •00 · 0 · 00 0 00 možné, kompozice zbavená adenovirů uvolněná ze substrátu, jak se zde popisuje, se může vystavit několika cyklům čištění. Takto získaný virus se může sloučit do jednoho zásobního roztoku. V podobném případě, zatímco se jiné konstituenty počáteční kompozice s výhodou selektivně nevážou na pryskyřici, pak nedochází k chybnému navázání, alespoň v prvních krocích čištění. Přítomnost základní hodnoty chybného navázání nezbytně vede ke kontaminaci počátečního virového roztoku. Aby se redukovala nebo podstatně omezila taková základní kontaminace, virový zásobní roztok se může vystavit úspěšnému čištění až základní množství kontaminantů dosáhne nuly. Způsob podle vynálezu je ekonomickým, účinným a dostupným způsobem čištění adenovirů, které vykazují ligandy. Použití kaší a kolon je při průmyslových aplikacích běžné, což umožňuje, aby se uvedený způsob podle vynálezu použil v komerčním měřítku.

Způsob infekce buňky

Nepřirozený ligand přítomný na viru podle vynálezu (nebo na komplexu virus/blokační protein) může rozeznávat susbtrát přítomný ve vazebném místě na povrchu buňky. Vynález proto poskytuje způsob infekce buňky, která vykazuje vazebné místo na povrchu buňky zahrnující substrát pro nepřirozený ligand. Způsob zahrnuje kontaktování buňky s adenovirem tak, že nepřirozený ligand adenovirů (nebo komplex víru/blokační protein) se váže na určité vazebné místo na povrchu buňky a tím způsobuje vstup adenovirů. Protože viry podle vynálezu začleňují vláknité trimery vykazující omezenou schopnost vázat přirozený savčí AR, adenovirus se začleňuje do buňky primárně na základě nepřirozeného ligandu. Uvedený způsob umožňuje selektivní cílení viru, který obsahuje ligand vůči buněčnému typu, jenž exprimuje vazebné místo obsahující susbtrát vhodný pro uvedený ligand, aniž dojde k podstatné infekci buněk prostřednictvím přirozeného savčího AR. V tomto případě, kdy • ·99 9 · V » ♦ · ·· · • 9 9 9 9 9 9 9 9 999 99 99 999 99 Φ· virus je na pentonové bázi (takové, jako je upravená nebo neupravená pentonová báze), virus se začleňuje prostřednictvím ligandu, který je vhodný pro penton.

Libovolná buňka exprimující na svém povrchu vazebné místo zahrnující substrát vhodný pro ligand se může selektivně cílit v souladu s vynálezem. Buňka může být přítomna jako jediný objekt nebo může být součástí větší sbírky buněk, jako je buněčná kultura (buď smíšená nebo izolovaná), nádor, tkáň (například epiteliální, svalová nebo jiná tkáň), orgán, systém orgánů (například cirkulační systém, respirační systém, gastrointestinální systém, močový systém, nervový systém nebo systém jiných orgánů) nebo dokonce celý organizmus (například člověk). Upřednostňuje se, aby se cílené buňky vybraly ze skupiny zahrnující srdce, krevní cévy, hladké svalstvo, svalstvo skeletu, plíce, játra, žlučník, močový měchýř a oční buňky.

Způsob infekce buňky v ideálním případě probíhá, když adenovirus zahrnuje cizorodý gen, jako ty vektory, které se zde popisují. Když adenovirus podle vynálezu zahrnuje cizorodý gen, pak způsob umožňuje, aby adenovirus sloužil jako vektor zavádějící gen do cílové buňky. Vektory a metody podle vynálezu poskytují použitelné nástroje pro zavedení cizorodého genu do vybrané třídy buněk aniž by významně zaváděly gen do buněk ubikvitně nebo ektopicky.

Způsob deaktivace viru

Jak se uvádí nepřirozený ligand přítomný na viru podle vynálezu může rozeznat substrát přítomný v krvi a lymfatické kapalině (takovým ligand je přítomen na volném proteinu, který vzniká v krvi, protein přítomný na erytrocytech atd..). Proto vynález popisuje způsob deaktivace adenovirů vykazující ligand rozeznávající substrát pocházející z krve nebo z lymfy tím, že se virus vystaví působení substrátu. V krvi nebo lymfě se ligand selektivně váže na substrát, přičemž se z kapaliny adsorbuje volný virus. Upřednostňuje se, aby se substrát • · ♦ • 4

4 »♦ 4 4

4 4 · • 4 4 4

4 4 4

4 44 vyskytoval ve velkých molekulách (jako je například albumin) nebo na povrchu erytrocytů (kterým chybí nástroje pro transkripci, které jsou nutné pro propagaci virů). Ligand vhodný pro deaktivaci viru může být samozřejmě přítomný v libovolné poloze na virovém obalu (Fender et al., Virology, 214, 110 (1995)). Když se protilátky rozeznávající a/nebo neutralizující adenoviry primárně váží na epitopy na hexonu (Gahery-Segard et al., Eur. J. Immunol.m 27, 653 (1997)), pak nepřirozené ligandy vhodné pro deaktivaci viru se přednostně začleňují do hexonu, jak se popisuje zde v textu.

Způsob, který účinně deaktivuje adenoviry, se účastní omezení virové infekce požadovaného lokusu (tkáně, buněčného typu atd.). Způsob zvláště účinně deaktivuje jednotlivý virus tím, že se připevní na substrát, přičemž se omezuje jeho aktivita kontaktovat buňku (a proto vstoupit do buňky). Dokonce když takto adsorbovaný virus přijde do kontaktu z buňkou je podstatně méně pravděpodobné, že jeho začleněni je způsobeno přítomností substrátu, který má částice. Spojením těchto účinků uvedený způsob účinně deaktivuje virový zásobní roztok (vně požadovaného lokusu infekce) tím, že dramaticky snižuje jeho účinný volný titr.

Způsob deaktivace viru doplňuje další provedení vynálezu. Například viry podle vynálezu začleňují vláknité trimery, které vykazují sníženou afinitu vůči přirozenému savčímu AR, přičemž podstatně redukují pravděpodobnost, že virus bude infikovat typy buněk jiné, než je požadovaný buněčný typ. Viry podle vynálezu mohou zahrnovat ligandy specifické pro substrát přítomný na vazebném místě na povrchu buňky, což umožňuje, aby virus se cílil na předem definovaný typ buňky. Zatímco tyto dvě výhody ovlivňují selektivní cílení a tím podstatně utlumují ektopickou infekci. Viry vykazující ligand rozeznávající substrát pocházející z krve nebo lymf s daleko menší pravděpodobností kontaktují ektopickou tkáň z důvodu účinného snížení virového titru.

9« ··· 9 9 »9 9 99 «

9 9 9 «

9 9 9 9 «

9 9 9 « »99 99 99 (zahrnující selekci testování proteinů

Zatímco odborník je zcela schopen uvést do praxe vynález po té, co si přečte popis, následující příklady dále ilustrují některé jeho rysy. V příkladech se popisují metody, jako je afinitní chromatografie, Southernův přenos, PCR, sekvenování DNA, konstrukce vektoru (zahrnující extrakci DNA, izolaci, štěpení restrikčními enzymy, ligace atd.), kultivace buněk na antibiotikách), transfekci buněk, (Westernův přenos, imunoprecipitace, . % imunofluorescence) atd.. Jsou to metody, které se rutině používají v oboru (popisují se například v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk)).

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. IA a IB znázorňuje trojrozměrnou strukturu uzliny adenovirového proteinu (sérotyp 5) . Obrázek č. IA je diagram reprezentující β-list a smyčky vnitřně spojující listy. Obrázek č. IB je diagram, který bere v úvahu relativní velikosti aminokyselinových zbytků.

Obrázek č. 2 znázorňuje porovnání sekvencí mezi adenovirovýmí sérotypy.

Obrázky 3A až 3C znázorňují vektory tvořící rekombinantní trimery adenovirových vláken, které nemají přirozené domény trimerizace. Obrázek č. 3A zobrazuje pAcT5S7GCNTS.PS.LS.X. Obrázek č. 3B znázorňuje pAcT5sigDel.TS.PS.LS. Obrázek č. 3C znázorňuje pAcT5S7sigDel.TS.PS.LS.

Obrázek č. 4 znázorňuje pAcT5sigDel.GFP.TS.PS.LS, což je vektor obsahující gen kódující chiméru fiber-sigDel-GFP.

Obrázky č. 5A až 5D znázorňují vektory použitelné při konstrukci rekombinantních adenovirových vektorů obsahujících trimery vlákna, které nemají přirozené domény trimerizace. Obrázek č. 5A znázorňuje pAS pGS HAAV. Obrázek č. 5B znázorňuje pAS pGS pK7. Obrázek č. 5C znázorňuje pAS * ·· ·· · · · · · • * · » · • ··· t · · • · · » ··« ·· ·· · ·· ·· * · · · • · · · • φ * · 4 • · · · ·· ··»

T5S7sigDelpGS.HAAV. Obrázek č. 5D znázorňuje pAST5S7sigDel.GFP.pGS.pK7.

Obrázky č. 6A až 6D znázorňují vektory užívané při konstrukci trimerů vlákna, které nemají přirozené domény trimerizace. Obrázek č. 6A reprezentuje pAcPig4KN. Obrázek č. 6B reprezentuje pAcPigKN D363E. Obrázek č. 6C reprezentuje pAcPigKN N437D. Obrázek č. 6D znázorňuje pAcPig4KN(FLAG).

Obrázky č. 7A až 7B reprezentují vektory, které se používají při přípravě trimerů vlákna, které nemá přirozenou doménu trimerizace.. Obrázek č. 7A znázorňuje PNS F5F2K. Obrázek č. 7B znázorňuje pNS Pig4.SS.

Obrázky č. 8A až 80 reprezentují vektory použitelné při tvoření adenovirového vektoru, který má chimérický trimer vlákna obsahující mutantní uzlinu NADC-1, který nemá přirozenou schopnost vázat se na receptor a obsahuje funkční nepřirozený ligand. Obrázek č. 8A znázorňuje pAcPig4KN D363E N437D. Obrázek č. 8B znázorňuje pAcPig4KN D363E N437D HAAV. Obrázek č.' 8C znázorňuje pNS Pig D363E N437D HAAV SS.

Obrázky č. 9A až 9B reprezentují vektory použitelné pro vytvoření chimérických blokačních proteinů podle vynálezu, které jsou schopné interferovat s navázáním na přirozený adenovirový receptor. Obrázek č. 9A znázorňuje pACSG2-sCAR. Obrázek č. 9B znázorňuje pACSG2-sCAR-HAAV.

Obrázky č. 10A až 10B reprezentují vektory, které je možné použít při tvorbě chimerových blokačních proteinů schopných tvořit trimery interferující a navázáním na přirozený adenovirový receptor. Obrázek č. 10A zobrazuje pAcSG2sCAR.sigDel. Obrázek č. 10B znázorňuje pAcSG2sCARsigDel(HAAV).

Obrázky č. 11A až 11E zobrazují vektory použitelné pro vytvoření konstrukce adenovirových vektorů, které namají specifické nepřirozené ligandy. Obrázek č. 11A ukazuje pBSSpGS. Obrázek č. 11B znázorňuje pBSS pGS(RKKK)2. Obrázek č.

11C znázorňuje pNSF5F2K(RKKK)2. Obrázek č. 11D znázorňuje pBSSpGS(FLAG). Obrázek č. 11E znázorňuje pNS F5F2K(FLAG).

Obrázek č. 12A až 12E reprezentuje vektory použitelné pro vytvoření buněčné linie exprimující nepřirozená buněčná povrchová místa pro substrát. Obrázek č. 12A znázorňuje pHOOK3. Obrázek č. 12B znázorňuje pRC/CMVp-Puro. Obrázek č. 12C znázorňuje pScHAHK. Obrázek č. 12D znázorňuje pNSE4GLP.

Obrázek č. 13A až 13D reprezentuje vektory použitelné pro tvoření buněčné linie exprimující vlákno při produkci cílových adenovirových částic. Obrázek č. 13A označuje pCR2.1TOPO+fiber. Obrázek č. 13B znázorňuje pKSII Fiber. Obrázek č. 13C znázorňuje pSMTZeo-DBP. Obrázek 13D znázorňuje pSMTZeoFiber.

Obrázek č. 14 znázorňuje pAdEl(Z)E3/E4(B), což je plazmid použitelný při konstrukci cílových adenovirových partikulí, které mají genom kódující chimérové vlákna.

Obrázky č. v adenovirových

15A až 15E ilustrují umístění mutací uzlinách, které interferují s navázáním ligandu. Obrázek 15A je pohled ze shora, obrázek č. 15B je boční pohled a obrázek č. 15C je pohled zespoda na uzlinu znázorňující polohu mutace 3D9. Obrázek č. 15D je pohled ze shora na , obrázek 15E je boční pohled a obrázek č. 15F je spodní pohled na uzlinu ilustrující polohy mutace CD smyčky, mutace FG smyčky a IJ mutace.

Obrázek č. 16 znázorňuje vektor použitelný při konstrukci rekombinantního adenovirů obsahujícího krátké vlákno a mutantní uzlinou na vláknu vykazující omezenou afinitu vůči přirozenému receptorů.

Obrázky č. 17A až 17B znázorňují vektory použitelné pro konstrukci buněčné linie, kde je možné replikovat adenoviry, kterým chybí přirozená funkce navázání se na buňku (ale cíleno na pseudoreceptor). Obrázek č. 17A znázorňuje pCANTAB5E(HA). Obrázek č. 17B znázorňuje pScFGHA.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

V tomto příkladu se popisují dva trimery vláken, které mají dvě nepřirozené trimerizační domény, kdy každá z nich interaguje s adenovirovou pentonovou bází. Chiméry vlákna začleňují trimerizační domény reoviru sigma 1.

Zkonstruovaly se dvě chiméry T5S7sigDel a T5sigDel. T5sigDel obsahovala pouze konec vlákna Ad5 (T5) fúzovaný se sigDe bez žádné sekvence střední části vlákna Ad. T5S7sigDel obsahuje konec plus prvních 7 repetic β-listu střední části Ad (S7) fúzovaného se sigDel. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence těchto dvou klonů jsou uvedeny v SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO: 2.

Oblast sigDel genu reoviru sigma 1 se amplifikovala pomocí PCR a klonovala se do vektoru pAcT5S7GCNTS.PS Ad.LS.X (obrázek č. 3A) , aby vznikl bakulovirový transferový vektor pAcT5sigDel.TS.PS.LS (obr. č. 3B). Tento vektor kóduje konec vlákna Ad5 fúzovaného s trimerizační doménou proteinu reoviru typu 3 sigma 1 následovaného epitopem FLAG blízko C-konce. Na C-konci genu vektor také obsahuje velké množství restrikčních míst, což umožňuje klonování cílené a čištěné sekvence do genu.

Druhý vektor pAcT5S7sigDel.TS.PS.LS (obrázek č. 3C) se připravil štěpením shora uvedeného produktu PCR restrikčními enzymy Nhel a BamHI a klonováním uvedeného fragmentu do vektoru pAcT5S7GCNTS.PS.LS.X (obr. č. 3A), který se také štěpil restrikčními enzymy Nhel a BamHI. Výsledný vektor kóduje protein obsahující konec a prvních sedm repetic střední části β-listu vlákna Ad5 fúzovaného s sigDel následovaného epitopem FLAG.

Rekombinantní bakulovirové klony kódující každou z vláknitých chimér se pak připravily standardními způsoby za použití každého shora uvedených plazmidů. Výsledné ···

··· ·· bakulovirové klony se používaly při produkci rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách Tn5. Aby se porovnala trimerizační doména sigDel s doménou GCN, zkonstruoval se z počátečního plazmidů pAcT5S7GCNTS.PS.LS.X (obr. č. 3A) jiný bakulovirus, který obsahoval trimerizační doménu GCN v místě trimerizační domény sigDel.

Buňky infikované bakulovirem se centrifugovaly tři dny po infekci. Buněčný pelet se resuspendoval v PBS s inhibitory proteáz a třikrát prošel mrazením a rozmražením, aby se uvolnily rozpustné vnitrobuněčné proteiny. Buněčný odpad se pak centrifugoval při vysoké rychlosti za vzniku peletu a odebral se čistý buněčný lyzát. Pelet se pak resuspendoval ve stejném objemu PBS, jak se popisuje dříve v textu.·

Vzorky peletu a lyzátu se ' pak nanesly na 12,5 % polyakrylamidový gel s 0,1 % SDS a přenesly se na nitrocelulózu Westernovou analýzou za použití anti-FLAG M2 Mab (Kodak). Tyto výsledky demonstrují, že v lyzátu je rozpuštěno přes 90 % každého z proteinů T5S7GCN.TS.PS.LS, T5sigDel.TS.PS.LS a T5S7sigDel.TS.PS.LS.

U proteinů se dále testovala jejich schopnost tvořit trimery. Za účelem testování trimerizace chimér se lyzáty z každého vzorku před elektroforézou na 12,5 % polyakrylovém gelu s 0,1% SDS buď povařily nebo nepovařily. Westernová analýza povalených vzorků ukazuje, že povalené vzorky migrují do vzdálenosti, která odpovídá molekulárním hmotnostem monomerního proteinu, přičemž nevařené proteiny obsahující trimerizační domény sigDel migrovaly do vzdálenosti odpovídající molekulárním hmotnostem trimerů. Nevařený protein T5S7GCN.TS.PS.Ls také migroval jako trimer. Podstatná část (více jak polovina) nevařeného vzorku migrovala jako monomer. Podobné analýzy vlákna divokého typu a proteinu sigma 1 ukazuje, že tyto proteiny, když neprojdou varem, migrují zcela jako trimery a když se povaří, migrují jako monomery.

Velké množství proteinů bylo rozpuštěných v lyzátu (na rozdíl od peletu), což ukazuje, že proteiny byly správně zbaleny. Migrace nevařených vzorků však ukazuje, že chiméry obsahující sigDel jsou rozpustné trimery a že doména sigDel funguje lépe než GCN, protože tvoří stabilnější trimerové chiméry vlákna.

Za účelem testování schopnosti trimerů tvořit komplex s proteinem adenovirové pentonové báze, se rekombinantní pentonová báze smísí v roztoku s trimerovými proteiny vlákna T5S7GCN.TS.PS.LS, T5sigDel.TS.PS.LS a T5S7sigDel.TS.PS.LS. Výsledný komplex pentonová báze/chiméry vlákna pak imunoprecipituje s protilátkami vytvořenými proti pentonové bázi spojenými s proteinovou A-agarózou. Vysrážený vzorek se pak nanese na gel SDS-PAGE a hodnotí se Westernovou analýzou, jak se popisuje shora v textu, za použití protilátek FLAG. Navázání protilátek FLAG ukazuje, že vláknitá chiméra obsahující epitop FLAG tvoří komplex s pentonovou bází v roztoku.

Příklad 2: V tomto příkladu se popisuje schopnost chimér vlákno-sigDel začlenit exogenní proteinovou doménu, která je větší než peptid tag.

Sekvence kódující upravenou verzi zeleně fluoreskujícího proteinu se amplifikovala pomocí PCR za použití primerů obsahujících restrikční místa, což umožňuje účinné klonování do chimérových plazmidů Fiber-sigDel, které se popisují shora v textu v příkladu 1. Klonování sekvence GFP ve správné orientaci do restrikčního místa Spěl plazmidu pAcT5sigDel.TS.PS.LS (obr. č. 3B) vede ke vzniku plazmidu pAcT5sigDel.GFP.TS . PS . LS (obr. č. 4), který kóduje chiméru Fiber-sigDel-GFP. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence tohoto klonu je uvedena jako SEQ ID NO: 3.

Tento plazmid se pak používal při produkci rekombinantního proteinu za použití bakulovirového expresívního systému, jak se popisuje shora v textu. Potvrdila se rozpustnost chimérových proteinů vlákna (což ukazuje na správné balení) a schopnost výsledných proteinů vázat se na pentonovou bázi (což prokazuje trimerizaci). Produkce rozpustného trimerového proteinu obsahujícího domény GFP ukazuje, že velké funkční proteinové domény se mohou začlenit do chimér Fiber-sigDel stejně snadno jako menší peptid tag. Výsledky naznačují, že takové chiméry mohou také začlenit ligandy, jako jsou ScAbs, aniž dojde k podstatné interferenci s funkcí proteinu.

Příklad 3:

Tento příklad popisuje konstrukci rekombinantních adenovirových vektorů obsahujících trimery vlákna, které vykazují nepřirozené trimerizační domény.

Z pAcT5S7sigDel.TS.PS.LS (obr. č. 3C) se vystřihl fragment Ndel až BamHI, aby nahradil odpovídající fragmenty v pAS pGS HAAV (obr. č. 5A) a pAS pGS pK7 (Obr. č. 5B) , přičemž vzniká konečný transferový vektor pAS T5S7sigDelGS.HAAV (Obr. č. 5C) a pAST5S7sigDelpGS.pK7 (obr. č. 5D) . Vektory kódují chiméru Fiber-sigDel obsahující na C-konci vazebnou doménu RGD nebo pK7 za účelem navázání na a_v integrin a receptory obsahující heparinsulfát se exprimují v buňkách 293.

Tyto vektory se pak linearizují. Tranfekované buňky 293 se před transfekcí plazmidy inkubovaly s adenovirem AdCMVZ.llA s deletovanými El, E3 a E4 (GenVec, lne., Rockville, . MD) . Rekombinace plazmidu E4+pNS s vektorem s deletovanou E4 vede k záchraně E1-, E3-, E4+ vektoru, který je schopný se replikovat v buňkách 293. Infikované/transfekované buňky se sklidily po pěti dnech a lyžovaly se, aby se uvolnily viriony. Lyzát se pak používá k infekci buněk čerstvě nanesených na plotnu a dále probíhá čištění rekombinantntích virů pomocí plaků. Plaky zkříženě kontaminované původním AdCMVZ.llA se obarví na modro, jestliže se kultivují na kultivačním médiu, které obsahuje substrát X-glu. Bílé plaky (označující vektor) • · «· • · · · I · > 9 9 <

• · · · ' «« · «« «» se pak amplifikují za vzniku zásobních roztoků čistého rekombinantního adenovirů.

Příklad 4:

Tento příklad popisuje produkci cílených adenovirových částic, které mají genomy kódující chimérová vlákna. Chimérová vlákna reprezentují konec vlákna Ad5 a sedm repetic střední části fúzovaných s trimerizační doménou sigDel z reoviru následovanou vysoce afinitní RGD sekvencí, která slouží k navázání na a_v integriny.

Plazmid pAS T5S7sigDel.HAAV (obr. č. 5C) se štěpí restrikčním enzymem Drdl, izoluje se a čistí se velký fragment obsahující všechny adenovirové sekvence. Tento fragment se pak zavede spolu s linearizovaným plazmidem elektroporézou do bakteriálních buněk BJ5183. Uvedený plazmid obsahuje většinu genomu Ad umístěnou před genem vlákna s malým přesahem identické sekvence s plazmidem pAS T5S7sigDel.HAAV. Na základě rekombinace dvou kusů DNA vzniká homologní rekombinací v bakteriálních buňkách nový plazmid. Tento plazmid kóduje upravený adenovirový genom, který je schopný se replikovat ve vhodné komplementační savčí buněčné líni (komplementuje El a vlákno). Z vybraných kolonií se izolovala plazmidová DNA a restrikční analýzou se zjistilo, že jde o správný plazmid. Tato plazmidová DNA se pak používá k transformaci bakteriálních buněk DH5a za účelem získání adekvátního množství DNA pro transfekci do vlákno-komplementující buněčné linie.

Jeden mikrogram plazmidu se štěpí správným restrikčním enzymem a transfekuje se s ním vlákno-komplementující buněčná linie, jako je shora popsaná buněčná linie. 0. až 4. den po transfekci se buňky indukují zinkem a o jeden až pět dní později se buňky lyžují. Lyzát se přenese na čerstvé vláknokomplementu j ící buňky. Tento cyklus pasážování a lyže se opakuje až do okamžiku, kdy dojde v buňkách cytopatickému ·· «’ ·· • 9 · 0

9 9

0 0 · • 0 00 * 9 9 0 «0 0

0 · 0 • 0· 0 « « 0 účinku. Během cyklu se také sleduje aktivita LacZ buněčného lyzátu. Tato aktivita by měla růst spolu s amplifikovaným vektorem. Když se získá adekvátní titr smíšeného* zásobního roztoku, provede se konečná pasáž na buňky, které nejsou komplementační v případě vlákna, a dojde k produkci cíleného viru, kterému chybí přirozený protein vlákna. U výsledného viru se pak testuje jeho schopnost vázat se a vstupovat do buněk prostřednictvím interakce s vysokou afinitou sekvence RGD s a_v integriny.

Příklad 5:

Tento příklad popisuje čtyři různé trimery vlákna s nepřirozenými trimerizačnímí doménami. Zvláště v příkladech uvedené trimery vlákna jsou chiméry začleňující část uzliny vlákna NADC-1, což je prasečí adenoidní kmen. Trimery popsané v příkladech tak obsahují známé motivy vhodné pro navázání na receptor (to je motiv galaktin a RGD motiv). Dále v příkladech popsané trimery začleňují mutace známé tím, že snižují afinitu každého motivu vhodného pro navázání receptoru. Nakonec tento příklad popisuje začlenění nepřirozeného ligandu (FLAG) do exponované smyčky nepřirozeného trimeru.

Za použití PCR se z plazmidu, který nese gen v plné délce, amplifikovala uzlina genu vlákna NADC-1. Produkt PCR se pak klonoval do bakulovirového expresívního plazmidu za účelem produkce plazmidu, který kóduje uzlinu NADC-1 plus Ntermínální polyhistidinový tag (protein Pig4KN), za účelem produkce a detekce westernovým přenosem pomocí protilátek proti polyhistidinu. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence tohoto klonu se uvádí v SEQ ID NO: 4.

Výsledný plazmid pAcPig4KN (obr. č. 6A) se mutoval místně řízenou mutagenezí za použití dvou párů oligonukleotidových primerů PigD363Es (SEQ ID NO: 10) a PigD363Ea (SEQ ID NO: 11) a PigN437Ds (SEQ ID NO: 12) a PigN437Da (SEQ ID NO: 13) . Uvedené priméry se používají při produkci plazmidu pAcPigKN

O e · * • 9 9 · · 9 9 9

9 9 «99« #· <99 <« «φ

D363E (obr. č. 6B) , ve kterém sekvence DNA kódující motiv vázající RGD integrin (a.k. 361 až 363 v přirozeném proteinu vlákna) se mutoval na nefunkční sekvenci RGE. Druhý pár primerů se použil k produkci plazmidu pAcPigKN N437D (obr. č. 6C) , ve kterém sekvence DNA kódující přirozenou aminokyselinu N (a.k. 437) se mutovala na D. Tato mutace se dříve projevila zrušením navázáním jiného galaktinového proteinu na svůj ligand, kterým je galaktóza (Hirabayashi et al., J. Biol. Chem., 266, 23648-53 (1991)).

Aby se demonstrovala možnost začlenění nového vazebného motivu do exponované smyčky na uzlině NADC-1, zkonstruoval se konečný bakulovirový plazmid. Analýza hydrofóbicity proteinu smyčky NADC-1 ukázala, že proteinová sekvence bezprostředně před motivem RGD je pravděpodobně exponovaná smyčka, která bude schopna začlenit aminokyselinové sekvence (např. polypeptidové domény) za účelem cílení nebo čištění. Proto plazmid pAcPig4KN(FLAG) (Obr. č. 6D) se produkoval za použití komplementárních překrývajících se oligonukleotidů, které kódují vazebnou doménu FLAG. Oligonukleotidy se spojily a klonovaly se do plazmidu pAcPig4KN (obr. č. 11A), který obsahuje jediné přirozené restrikční místo AvrlI, umístěné právě před sekvencí kódující doménu RGD.

Při expresi rekombinantního proteinu ve hmyzích buňkách za použití bakulovirového expresivního systému se použily čtyři bakulovirové transferové plazmidy popisované shora v textu nesoucí geny uzliny NADC-1. Hmyzí buňky Tn5 se infikovaly rekombinantními bakulovirovými klony získanými z plazmidů. Po třech dnech se buňky centrifugovaly za vzniku peletu a třikrát se zmrazily a opětně rozmrazily v PBS obsahujícím proteázové inhibitory, přičemž se uvolnil rozpustný vnitrobuněčný protein. Buněčný odpad se centrifugoval za vzniku peletu a slil se čirý lyzát. Zbylý pelet se resuspendoval v PBS.

Vzorky lyzátu a peletu se pak hodnotily testem SDS-PAGE a Westernovou analýzou za účelem stanovit, zda rekombinantní *

proteiny uzliny jsou rozpustné. Westernová analýza ukázala, že většina proteinů všech čtyř uzlin se nachází v buněčném lyzátu, což naznačuje, že uvedené proteiny jsou rozpustné a správně svinuté. Tyto výsledky demonstrují, že ani bodové mutace zavedené do domén vhodných pro navázání receptorů ani vazebné sekvence FLAG začleněné do exponované smyčky neovlivnily negativně balení uzliny a její rozpustnost.

Za účelem zjistit, zda chimérové trimery vykazující domény FLAG uzliny NADC-1 mohou interagovat s protilátkami FLAG, se buněčné lyzáty imunoprecipitovaly za použití protilátek proti FLAG M2 a pak se blotovaly. Westernová analýza ukázala, že uzlina NADC-1 obsahující epitop FLAG se sráží protilátkami připravenými proti FLAG. Vláknitý trimer NADC-1 je tedy rozpustný a každý je schopný interagovat s monoklonálními protilátkami proti FLAG M2.

Příklad 6:

Tento příklad popisuje syntézu rekombinantního vektoru založeného na Ad5, který obsahuje vláknitou uzlinu NADC-1 (prasečí adenovirus).

Za použití PCR se uzlina genu vlákna NADC-1 amplifikovala z plazmidu, který obsahuje gen v plné délce. Produkt PCR se pak klonoval do plazmidu PNS F5F2K (obr. č. 7A) , za účelem produkce plazmidu pNS Pig4.SS (obr. č. 7B), který kóduje prvních sedm β-repetic střední části Ad5 fúzovaných s uzlinou NADC-1. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence tohoto klonu jsou uvedeny v SEQ ID NO: 5.

Plazmid pNS Pig4.SS se pak použil při přípravě rekombinantního adenovirového vektoru. Plazmid se transfekoval do buněk 293, které se infikovaly adenovirovým vektorem, kterému chybí oblast E4. Homologní rekombinaci mezi plazmidem a vektorem vzniká replikačně kompetentní vektor obsahující E4 a vykazující chimérové vlákno NADC-1. Rekombinantní virus se pak čistil pomocí plaků na buňkách 293. Pre-inkubace • * · · · • ·4 4 * · 4

4 4 4 4

4 4 4 4 · 4

4 4

4 4 • 4 « 4 * * 4 4

Ramosových buněk (které neexprimují a_v integriny, ale exprimují receptory proteinu vlákna adenoviru) s rekombinantní uzlinou NADC-1 blokovala transdukci těchto buněk vektorem AdZ.PigSS, což demonstruje, že vektor obsahuje funkční uzlinu NADC. Výsledky ukazují, že chimérové vlákno NADC-1 se může správně syntetizovat a začlenit do živých virových částic.

Příklad 7:

V tomto příkladu se popisuje adenovirový vektor založený na Ad5, který má chimérový vláknitý trimer obsahující mutantní uzlinu NADC-1 s utlumenou schopností vázat receptor a obsahující funkční nepřirozený ligand.

Fragment Apal až BamHI obsahující mutaci N-D v pAcPigíKN N437D (obr. č. 6C) se klonoval do plazmidu pAcPig4KN Ď363E (Obr. č. 6B) , který obsahuje mutace RGD-RGE, za účelem vzniku plazmidu pAcPig4KN D363E N437D (obr. č. 8A) . Tento plazmid obsahuje mutace genu uzliny NADC-1. Překrývající se komplementární oligonukleotidové primery kódující vazebnou doménu integrinu a_v s vysokou afinitou se proto klonují do přirozeného místa AvrlI, za vzniku plazmidu pAcPig4KN D363E N437D HAAV (obr. č. 8B). Mutovaný fragment EcoRI až BamHI genu NADC-1 se pak klonoval do plazmidu pNSPig4.SS (Obr. č. 7B) za vzniku plazmidu pNS Pig4 D363E N437D HAAV SS (obr. č. 8C) . Tento plazmid se pak použil pro přípravu rekombinantního adenovirového vektoru obsahujícího mutovanou uzlinu NADC-1, která je cílena na a_v integrin, jak se popisuje shora v textu.

Schopnost dvojité mutace v uzlině NADC-1 blokovat navázání na vazebné místo na povrchu buňky (galaktin a integrin) se potvrdila pomocí kompetičního testu. Schopnost výsledného viru cílit na a_v integrin na povrchu buňky je potvrzena za použití buněk 293, jak se uvádí shora v textu.

Příklad 8:

• · · ♦ ‘ * 9 4

V tomto příkladu se popisují dva chimérové blokační proteiny, které jsou schopné interferovat s navázáním na přirozený adenovirový receptor. Každý blokační protein zahrnuje doménu vykazující substrát vhodný pro přirozené adenovirové vlákno, jmenovitě extracelulární doménu CAR.

Extracelulární doména CAR se amplifikovala z genu CAR (Bergelson et alScience, 275, 1320-23 (1997);. Tomko et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 94, 3352-56 (1997)) pomocí PCR. Produkt PCR se pak klonoval do bakulovirového expresívního vektoru za vzniku plazmidu pACSG2-sCAR (obr. č. 9A). Rozpustný protein CAR (sCAR) také obsahuje epitop FLAG vhodný pro čištění a detekci V/esternovou analýzou. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence klonu sCAR se uvádí v SEQ ID NO: 6.

Westernová analýza sCAR produkovaného ve hmyzích buňkách za použití bakulovirového klonu obsahujícího sCAR ukázala, že protein se vylučoval z buňky a že určitá část vylučovaného proteinu zůstala v buňce.

Aby se posoudilo, zda protein sCAR si zachoval funkci přirozeného CAR, radioaktivně značený adenovirus typu 2 se předem inkuboval v roztoku, který obsahuje různé koncentrace sCAR a pak se uvedl do kontaktu s buňkami 293. Data ukazují, že zvyšující se koncentrace sCAR blokovala navázání viru na buňky 293. Tento výsledek demonstruje, že rozpustný protein sCAR si uchoval strukturu a funkci přirozené extrabuněčné domény CAR. Tyto výsledky demonstrují, že pre-inkubace s proteinem sCAR může zabránit navázání na přirozený adenovirový receptor prostřednictvím ligandu, který váže CAR a jenž se nachází na adenovirovém vláknu.

Připravila se druhá chiméra obsahující sCAR, ve které sekvence DNA kódující motiv cílení RGD se klonoval do restrikčního místa Spěl, které následuje po C-konci sCAR za použití komplementárních přesahujících primerů. Chimerový gen si na C-konci zachoval epitop FLAG. Výsledný plazmid SG2-sCARHAAV (obr. č. 9B) , se použil při produkci rekombinantního proteinu sCAR.RGD, jak se také provedlo v případě shora v textu popsaného proteinu sCAR. Sekvence DNA tohoto klonu je uvedena v SEQ ID NO: 7.

Protein sCAR.RGD se syntetizoval a vylučoval z hmyzích buněk podobně jako protein sCAR. Aby se zjistilo, zda protein sCAR.RGD si zachoval funkci přirozeného proteinu CAR, radioaktivně značený adenovirus typu 2 se předem inkuboval v roztoku, který obsahuje různé koncentrace sCAR.RGD a uvedl se do kontaktu s buňkami Ramos, které neexprimují integriny a_v, ale exprimuje receptory pro vláknitý protein adenoviru. Preinkubace radioaktivně značeného adenoviru typu s proteinem sCAR nebo sCAR.RGD blokovala navázání viru na buňky Ramos. Tento výsledek ukazuje, že oblast sCAR přítomná na proteinu sCAR.RGD je funkční.

Aby se zjistilo, zda protein sCAR.RGD si zachoval funkci přirozené domény RGD, provedla se studie buněčné adheze. Oba proteiny sCAR.RGD a sCAR se imobilizovaly na plastové plotny vhodné pro tkáňové kultury, které následně přišly do kontaktu s buňkami 293 (které exprimují integrin a_v) · Po^té, co se buňky inkubovaly na potažených plotnách, plotny se promyly a stanovil se počet buněk, které zůstaly v kontaktu s plotnami. Výsledky ukazují, že buňky adherují na plotnách potažených zatímco nedochází k jejich adhezi na sCAR nebo na kontrolních že motiv RGD přítomný buď proteinem sCAR.RGD, plotnách potažených ukazuj í, funkční.

na plotnách, proteinu sCAR.RGD je

Příklad 9:

Tento příklad popisuje způsob řízení adenovirového cílení za použití chimérového blokačního proteinu, který obsahuje ligand vhodný pro vazebné místo na povrchu buňky.

Adenovirový vektor nesoucí reportní gen lacZ se preinkuboval buď s proteinem sCAR.RGD nebo s sCAR, což se popisuje v příkladu 8. Výsledné komplexy mohou pak přijít do •AAA · · A A A « A «

AAA AAA A A · * • AAAA· A A *a AA A • * ·ΑΑ AAAA «·A AA A* AAA AA «» kontaktu buď s buňkami Ramos (které exprimují vláknitý receptor (CAR), ale chybí jim integriny a_v) za podmínek vhodných pro virovou infekci. Pak se u buněk testuje exprese lacZ, přičemž síla exprese bude kolerovat se stupněm infekce buněk virem. Výsledky ukazují, že jak sCAR a sCAR.RGD účinně blokují adenovirovou transdukcí buněk Ramos, zatímco sCAR, ale nikoli sCAR.RGD, blokují adenovirovou transdukcí buněk HuVEC, což indikuje, že komplex Ad/sCAR.RGD je cílen na integriny a_v a brání zavedení genu zprostředkovaném adenovirem do buněk pomocí sCAR.

Příklad 10:

V tomto příkladu se popisují dva chimérové blokační proteiny, které jsou schopny tvořit trimery, jenž interferují s navázáním na přirozený adenovirový receptor. Zvláště to jsou blokační proteiny, kdy každý obsahuje oblast vykazující substrát pro přirozené adenovirové vlákno, jmenovitě extracelulární oblast CAR, a trimerizační oblast, jmenovitě trimerizační oblast sigDel proteinu reoviru Sigma-1.

Trimerizační oblast sigDel proteinu reoviru Sigma-1 se amplifikovala PCR a výsledný produkt PCR se klonoval do plazmidu pAcSG2-sCAR (obrázek č. 9A). Výsledný plazmid pAcSG2sCAR.sigDel (obr. č. 10A) obsahuje chiméru genu kódující extracelulární oblast^ oblast mezerníku, trimerizační doménu proteinu pocházejícího z reoviru sigma 1 a vazebnou oblast FLAG. Restrikční místo Spěl, které následuje po trimerizační doméně, umožňuje snadné klonování oblastí vhodných pro cílení. Příkladem je motiv RGD, který se s vysokou afinitou váže na integriny a_v. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence uvedeného klonu se uvádí v SEQ ID NO: 8.

PAcsCAR.sigDel se používá pro přípravu bakuloviru. Westernová analýza buněčných lyzátů, které prošly nebo neprošly varem a připravily se z buněk infikovaných bakuloviry, ukazují, že nevařený chimérový sCAR.sigDel migruje jako trimer.

Druhá chiméra obsahující sCAR se připravila tak, že sekvence DNA kódující motiv cílení RGD se klonovala do restrikčního místa Spěl, které následuje po C-konci sCAR.sigDel za použití komplementárních překrývajících se primerů. Výsledný plazmid pAcSG2-sCARsigDel(HAAV) (obr. č. 10B) kóduje chiméru, která obsahuje extracelulární oblast CAR, oblast mezerníku, trimerizační oblast proteinu sigma 1 pocházející z reoviru a motiv RGD, který se s vysokou afinitou váže na integriny a_v.

Plazmidy pAcSG2sCAR.sigDel a pAcSG2-sCARsigDel.RGD(HAAV) se používaly při produkci rekombinantních bakulovirů, které jsou vhodné pro produkci rekombinantního chimerového proteinu »

v hmyzích buňkách za použití standardního způsobu. Westernová analýza buněčných lyzátů buněk infikovaných bakulovirem, které prošly nebo neprošly varem, ukázala, že nevařený protein sCAR.sigDel migroval jako trimer.

Aby se zjistila schopnost trimerových proteinů sCAR.sigDel a sCARsigDel blokovat adenovirovou infekci, pre-inkuboval se adenovirový vektor nesoucí značící gen lacZ buď s sCAR.sigDel nebo s sCARsigDel.RGD trimerem nebo s monomerním proteinem sCAR. Aby se získala data závislá na dávce používá se několik koncentrací. Výsledné komplexy se pak přivedou do kontaktu s buňkami 293 za podmínek vhodných pro virovou infekci. V buňkách se pak testuje exprese lacZ, jejíž stupeň bude korelovat se stupněm infekce buněk virem. Výsledky budou ukazovat, že trimerové proteiny sCAR.sigDel a sCARsigDel.RGD jsou účinnější při blokování navázání adenovirů na buňky prostřednictvím proteinu sCAR, než monomery sCAR.

Příklad 11:

4 4 4	44 4	• 4 4	4 4 4	4	44 4	4
4 4· ·	4
							•
* 4 4 4 4	4	•	4	4 4	•	4	4
• ·	4	•	•	4	«	•	♦
• · 4 4 4		• 4	4 4 4	4 4		4 4

V tomto příkladu se popisuje způsob řízení cílení adenovirů za použití trimerového blokačního proteinu, jenž nese ligand vhodný pro vazebné místo na povrchu buňky.

Adenovirový vektor nesoucí značící gen lacZ se preinkuboval buď s sCAR.sigDel, sCARsigDel.RGD nebo s sCAR, které se popisují shora v textu. Podobně adenovirus se může preinkubovat s blokačním proteinem izolovaným například objevením se fága. Výsledné komplexy se pak přivedou do kontaktu buď s buňkami Ramos nebo HuVEC za podmínek vhodných pro virovou infekci. U buněk se pak testuje exprese lacZ, jejíž stupeň pak koreluje se stupněm infekce buněk virem. Výsledky ukazují, že zatímco proteiny budou účinně blokovat adenovirovou transdukci buněk Ramos, trimery jsou účinnější při blokování navázání adenoviru než monomery sCAR. Adenovirovou transdukci buněk HuVEC budou blokovat proteiny sCAR a sCAR.sigDel. Avšak sCARsigDel.RGD nebude účinně blokovat adenovirovou transdukci buněk HuVEC. Takové výsledky naznačují, že komplex AdsCARsigDel.RGD je cílen na integriny a_v, zatímco brání zavedení genu do buněk zprostředkovaným adenovirem pomocí CAR.

Příklad 12:

FV příkladu se popisuje konstrukce a hodnocení mutovaných uzlin vlákna, přičemž každá má sníženou afinitu pro přirozené substráty, zvláště v případě monoklonálních protilátek vytvořených proti přirozené uzlině vlákna.

Za použití místně řízené mutageneze se do genu vlákna Ad5 v plné délce v bakulovirovém vektoru zavedly jednotlivé mutace. Výsledné plazmidy se pak použily při přípravě rekombinantních bakulovirových klonů.

Každý z mutantů plus přirozená kontrola vlákna Ad5 se použily při produkci proteinu v infikovaných hmyzích buňkách. Tři dny po infekci se buňky sklidily a lyžovaly. Westernová analýza za použití polyklonálního antiséra, které rozeznává vlákno Ad5, prokázala přítomnost velkého množství vláknitého ·· ·« ·· • · ·

9 9

9 9 proteinu v lyzátu vytvořeného z buněk infikovaných s každým z vektorů. V buňkách infikovaných pěti mutantními klony (uvádí se v tabulce č. 1) (stejně jako přirozený gen vlákna) se signál převážně nacházel v rozpustné části lyzátů, což ukazuje, že protein kódovaný takovým mutantem se správně zabalil. Sekvence vlákna divokého typu Ad5 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9. Aminokyselinové kyseliny SEQ ID NO: 9 změněné každou z těchto mutací jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1:

Mutace	Monoklonální protilátky
	2C9	4B8	3D9	2E5
Smyčka CD(449 SGTVQ-GSGSG)	-	-	+	+
Smyčka IJ(559 GSHN-GSGS)	-	-	+	+
Smyčka FG(507 SHGKTA-GSGSGS)	-	-	+	+
T533S/T353S (535 TIT-SIS)	+	-	+	+
K506R(506 K-R)	4-	+	-	+
Adice na C-konci	+	+	+	+
Přirozené vlákno Ad5	4-	+	+	+
vlákno Ad5 prošlé varem	-	-	-	-

Za použití analýzy westernovým přenosem se každý z pěti rozpustných mutantních proteinů vlákna, přirozené vlákno Ad5 a denaturované vlákno Ad5 testoval čtyřmi monoklonálními protilátkami, které vznikly proti uzlině vlákna. Signály se detekovaly chemoluminiscencí a porovnávala se síla signálů každého pruhu. Výsledky uvedeného testu jsou uvedeny v tabulce č. 1.

V případě, že žádné protilátky nerozeznávají denaturované vlákno, znamená to, že každá protilátka se váže pouze na správně zabalená trimerová vlákna. V případě, že žádný z mutantů nevykazuje omezenou afinitu pro protilátky 2E£, znamená to, že každé mutantní vlákno bylo opravdu trimer.

'«WMrt»nYl TV

Mutace K506R podstatně omezuje afinitu výsledného vlákna

444 • 9 v případě protilátek 3D9, aniž ovlivňuje afinitu » · 4 4

I 4 4 1

44 pro libovolnou jinou protilátku. Pozice této mutace v uzlině vlákna je uvedena na obrázku č. 15A až 15C.

Mutace ve smyčkách CD, IJ nebo FG, kde 4 až 6 aminokyselin se nahradilo šeřiny nebo glyciny, podstatně omezují afinitu výsledných mutantních trimerů pro protilátky 2C9. Dvojitý mutant T533S/T535S také snižoval afinitu mutantní smyčky v případě protilátek 4B8. Umístění každé z těchto mutací v uzlině vlákna se uvádí na obrázcích 15D až 15F.

Tyto výsledky trimerovém vláknu, ukazují, že mohou vznikat uzliny na které vykazují sníženou afinitu pro přirozené substráty. Podobný testovací protokol se může použít pří identifikaci mutantů, které mají omezenou afinitu pro buněčné receptory. Rozpustná forma sCAR, která vykazuje epitop FLAG (nebo jiný tag) , jak se popisuje shora v textu, se může například použít jako sonda místo shora v textu popsaných monoklonálních protilátek. Bloty se pak za účelem detekce mutací interferujících s navázáním vlákna-CAR testují monoklonálními protilátkami proti FLAG.

Příklad 13:

V tomto příkladu se popisuje konstrukce rekombinantního adenoviru obsahujícího vlákno zkrácené ve střední části (například 8 repetic střední části) a uzlinu mutantního vlákna (5) vykazující sníženou afinitu pro její přirozený receptor (to znamená CAR) . Takové vlákno umožňuje cílení prostřednictvím ligandu exprimovaným v pentonové bázi.

Za použití standardních rekombinantních postupů se do sekvence kódující střední část vlákna zavedla delece. Ze sekvence uvedené v SEQ ID NO: 8 se pomocí PCR amplifikovala část uzliny mutantního vlákna od 22-té repetice střední části až do konce kódující sekvence. Tato část obsahuje mutaci K506R (popisuje se v příkladu 12) . Výsledný produkt se používá při

000 0 · • ·

0 přípravě plazmidu pAS T5S7F5K(R506K) (obr. č. 16). Plazmid tak obsahuje gen kódující vlákno se zkrácenou střední částí s redukovanou afinitou pro přirozený substrát (protilátky' 3D9) . Adenovirus, který má takové vlákno se zkrácenou střední částí, vykazuje omezenou afinitu pro přirozený substrát (protilátky 3D9) . Adenovirus, který obsahuje takové vlákno se zkrácenou střední částí bude schopen se vázat na buňky prostřednictvím ligandu RGD na pentonové bázi. Podobné strategie se může například použít při přípravě adenovirových vektorů, které mají vlákna se zkrácenou střední částí se sníženou afinitou pro CAR.

použití afinitní (obrázek č. 8A)

Příklad 14:

V tomto příkladu se popisuje konstrukce adenovirových vektorů, které mají specifické nepřirozené ligandy, které se mohou používat při čištění vektoru za chromatografie. Základní vektor pNSF5F2K obsahuje gen, který kóduje chimerové vlákno, které obsahuje střední část vlákna Ad5 a uzlinu proteinu vlákna Ad2. Gen vlákna Ad2 obsahuje restrikční místo Spěl v oblasti uzliny, která kóduje flexibilní obnaženou smyčku HI uzliny vlákna. Toto restrikční místo Spěl se použilo pro začlenění sekvencí, které kódují peptid FLAG SEQ ID NO: 16 nebo ligand vázající DNA/heparin (SEQ ID NO: 15) .

Základní vektor pBSSpGS (obr. č.

aminokyselin C-konce (SEQ ID NO:

jsou také jediným restrikčním místem Spěl, které se používaly při začlenění sekvencí, které kódují peptid FLAG (SEQ ID NO: 16) nebo polypeptid vázající DNA/heparin (SEQ ID NO: 15), jak se popisuje dále v textu.

Transferové plazmidy (pBSSpGS(RKKK)2 (obr. č. 11B) a pNSF5F2K(RKKK)2 (obr. č. 11C)) vhodné pro zavedení ligandu, který váže DNA/heparin do adenovirového genomu, vznikl za použití překrývajících se oligonukleotidů. Sense a anti-sense

11A) kóduje prodloužení o 14) . Kodony kódující TS

00« • · «* 00

0 0 0

0 ·· 0

0 0 0

0 00 oligonukleotidy se smísily v ekvimolárních poměrech a klonovaly se do restrikčního místa Spěl pBSSpGS (obr. č. 11A) nebo pNS F5F2K (obr. č. 8A) za vzniku transferových plazmidů. Sekvenováním v obou směrech přes oblast inzertů se ověřilo, že klony obsahují správnou sekvenci.

V podobném případě se připravily transferové plazmidy pBSSpGS (FLAG) (obr. č. 11D) a pNSF5F2K(FLAG) (obr. č. 11E) vhodné pro zavedení ligandu FLAG (SEQ ID NO: 16) do adenovirového genomu. Sekvenování v obou směrech přes oblast inzertů ověřilo, že klony obsahují správnou sekvenci.

Plazmidová DNA ze čtyř transferových vektorů se linearilizovala pomocí restrikčního enzymu Sáli, čistila se a transfekovala se za použití fosforečnanu vápenatého do buněk 293, které se předem inkubovaly po dobu jedné hodiny s adenovirem AdCMVZ.llA (GenVec, lne., Rockville, MD) s deleci El, E3 a E4 s multiplicitou lffu na jednu, buňku. Rekombinace plazmidu E4+pNS s vektorem s deleci E4 vedla k záchraně vektoru E1-,E3-,E4+ schopného se replikovat v buňkách 293. Výsledné vektory AdZ.F2K(RKKK)2, AdZ.F2K(FLAG), Ad.F(RKKK)2 a AdZ.F(FLAG) se izolovaly ve dvou kolech tvorby plaků na buňkách 293.

U každého vektoru se ověřilo sekvenováním produktů PCR získaných z virové templátové DNA za použití primerů, které překlenou oblast inzertu DNA, zda obsahuje správný inzert. Restrikční analýza DNA Ad z každého viru ukázala, že viry jsou čisté a že správně konstruovaný virus obsahuje jediné restrikční místo BamHI.

Příklad 15:

Tento příklad popisuje, že adenovirový vektor, který má nepřirozený ligand se může vázat na podporu spojenou se substrátem pro uvedený ligand.

Vektor AdZ.PK se konstruoval podobně jako vektory popsané shora v textu. Virus má protein vlákna, který obsahuje

9·· 9 9

9 «

99 • 9 9 1 » 9 9 4 » 9 9 1

I 9 9 <

99 obsahuj e Pak se měřila polylyxíny. AdZ. PK se testoval, aby se zjistilo, zda by se virus mohl vázat na podklad, který obsahuje substrát pro polylyzin, což je heparin. 50 ml kuliček tvořených heparinem a agarózou (SIGMA) se přidalo do 1,0 ml fosforečnanových pufrů, které obsahují 150, 300, 500 a 1 000 mM NaCl. 6 600 cpm buď AdZ nebo AdZ.PK se pak přidalo do fyziologických roztoků, které obsahují kuličky tvořené heparinem a agarozou a vše se míchalo houpáním po dobu 60 minut. Kuličky se pak tři krát promyly v pufru se stejným obsahem solí, jako inkubační pufr (150, 300, 500 a 1 000 mM NaCl) hodnota cpm spojená s kuličkami a ukázalo se, že preferenčně probíhá navázání AdZ.PK před AdZ při koncentraci NaCl 150, 300 a 500 mM. Při koncentraci NaCl 1 000 mM však navázání AdZ. PK na kuličky bylo daleko nižší a rovná se přibližně pozadí pozorovaném v případě AdZ.

Tyto výsledky ukazují, že vektor AdZ.PK se váže na heparin navázaný na podkladovém materiálu a tak k navázání nedojde z důvodu vysoké koncentrace soli. Takový podklad je možné použít při čištění upraveného vektoru tak, že se nejdříve virus naváže na podklad při nízké koncentraci solí a pak se vektor eluuje při vysoké koncentraci solí.

Příklad 16:

Tento příklad ukazuje, že adenovirový vektor vykazující nepřirozený ligand se může čistit na koloně obsahující substrát pro ligand.

Kultivační baňka pro tkáňové kultury s plochou 20 175 cm2 obsahující pakovací buněčnou linii 293 se infikovala při m.o.i. 5 jedním ze tří vektorů: AdZ.PK, AdZ.F2K(RKKK)2 nebo AdZ.F(RKKK)2, které se popisují shora v textu. Buňky se pak inkubují po dobu dvou dní a pak zbývající adherentní buňky jsou odděleny od plastu. Odstraněné buňky se pak centrifugují při 3 000 g a tvoří pelet. Odstraní se kultivační médium a • 9 99 · 9 9 • 9 9 9

9· · 9 · · · e ·· 99

99

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 «9 pelet se dvakrát promyje PBS. Buňky se pak resuspendovaly v celkovém objemu 5 ml PBS, které obsahuje 10 mM MgCl₂.

Resuspendované buňky se pak třikrát zmrazí a rozmrazí, aby se uvolnil virus, a buněčný odpad se pak centrifuguje při 15 000 g po dobu 15 minut. Supernatant prošel kolonou o objemu větším jak 3 ml, která obsahuje heparin navázaný na agarozových kuličkách. Kolona se pak promyje 30 ml PBS, pak následuje eluce viru z kolony pomocí postupného gradientu solí. Za účelem eluce viru kolonou projde 3 ml pufru obsahujícího podstatně vyšší koncentrace NaCl (v krocích 100 mM). Zachycuje se eluát o objemu 1 ml (3 ml 200 mM, 3ml 300 mM NaCl, 3 ml 400 mM NaCl až 2 000 mM NaCl).

U frakcí zahrnujících procházející a promývající frakce se pak hodnotí adenovirové obalové proteiny Westernovým přenosem, dále se pak hodnotí aktivní virové partikule pomocí stupně transdukce lacZ buněk A549 nebo testem tvoření plaků a dále se hodnotí celková čistota analytickou vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC), jak se popisuje v publikaci Shabram et al., 1997, Hum. Genen Ther. 8, 453-46; Huyghe et al., 1995, Hum. Gene Ther., 6: 1403-1416; Shabram et al., WO 96/27677). Celková čistota frakcí ukázala, že pík koncentrací adenoviru se hodnotil tak, že frakce prošly HPLC a porovnáním profilu s frakcí na vstupu do kolony a s vysoce čištěným přípravkem adenoviru (připraveným ve třech kolech čištění na gradientu CsCl).

Příklad 17:

Tento příklad popisuje produkci pseudo-receptoru pro konstrukci buněčné linie schopné replikovat adenoviry, kterým chybí přirozená funkce vázat se na buňku (ale jsou cíleny na pseudo-receptor). Ve specifickém případě příklad pseudoreceptoru zahrnuje vazebnou doménu z jednořetězcových protilátek (ScFv).

·· · ·· ·· • · · ♦ · · · • · · · · ( • · * · <

··· ·· ··

Nejdříve vektor exprimující ScFv z pH00K3 (obr. č. 12A) (Invitrogen), který kóduje ScFv, se syntetizuje s myším signálním peptidem Ig. ScFv má N-terminální epitop tag HA a jeho C-konec je spojen s párem epitopů myc, po kterých následuje receptorová transmembránová kotva PDGF. Expresívní kazeta zahrnující tuto konstrukci se klonovala do plazmidu pRC/CMVp-Puro (obr. č. 12B) za vzniku plazmidu pScHAHK (obr. č. 12C) . Tento plazmid má klónovací místa pro začlenění genů po promotoru CMV a na C-konci genu vykazuje jediná restrikční místa Agel a Xbal pro přidání cytoplazmatických sekvencí.

Za účelem ukázat, že dochází k expresi pseudo-receptoru ScFv na povrchu buňky, se buňky 293 transfekovaly buď samotným

12D) , který nese gen zeleně detekci transfektantů, nebo plazmidem pNSE4GLP (obr. č. fluoreskujícího proteinu pro v kombinaci s pScHAHK. Jeden den po transfekci povrchová imunofluorescence vykazovaná pScHAHK za použití protilátek určených proti epitopu HA demonstruje správnou povrchovou expresi pseudo-receptoru.

Aby se ukázalo, že exprimovaný pseudo-receptor je funkční, transfekované buňky se uvedly do kontaktu s magnetickými částicemi CAPTURE-TEC spojenými s antigeny, které jsou rozeznávány pomocí ScFv. Po inkubaci se částice shromáždily na dně zkumavky za použití magnetu, promyly se a přenesly se na kultivační destičku. Kultivační destičky se prohlížely za účelem identifikace buněk exprimujících GFP pod fluorescenčním mikroskopem. U buněk transfekovaných pouze pNSE4GLP se nepozorovalo žádné zabervení, což dokazuje, že tyto buňky se nevážou na částice. Buňky transfekované pNSE4GLP a pScHAHK však byly v prohlubních viditelné. Tento výsledek ukazuje, že dvojitě transfekované buňky se vážou na částice.

Příklad 18:

·· ·· • ·

Tento příklad popisuje produkci pseudo-receptoru pro konstrukci buněčné linie schopné replikovat adenoviry, kterým chybí přirozená funkce navázání se na buňku (ale jsou cíleny na pseudo-receptor) . Příklad pseudo-receptoru zahrnuje vazebnou oblast pocházející z jednořetězcových protilátek rozeznávajících HA.

Anti-HA ScFv se zkonstruovaly jako fúzní protein N-TermVL-VH. RT-PCR se provedla na RNA, přičemž se získaly hybridomy produkující protilátky HA za použití primerů specifických pro K- nebo γ2β- a C-konec genů Vli a VH (popisuje se v publikaci Gillilan et al., Tissue Antigens, 47, 1-20 (1996)). Po sekvenování výsledných produktů PCR se označily specifické oligonukleotidy, aby se v druhém kole PCR amplifikovala fúze VL-VH. Konečný produkt PCR se klonoval za vzniku plazmidu pCANTAB5E(HA) (obr. č. 17A), který je vhodný pro produkci anti HA ScFv v bakteriích E. coli. Exprimovaný protein má Cterminální E peptid vhodný pro detekci navázání HA pentonové báze prostřednictvím westernový ananlýzy testu ELISA. Po transformaci bakteriálních buněk plazmidem pCANTAB5E(HA) se provedla westernová analýza za použití protilátek, které rozeznávají E peptid. Tímto způsobem se prokázal peptid očekávané velikosti.

Za účelem stanovení, zda anti-HA ScFv je funkční, se tyto protilátky použily v imunoprecipitačním testu s proteinem A za použití adenovirových obalových proteinů (rekombinantní pentonová báze), která obsahuje epitop HA. Anti-HA ScFv jsou schopny srážet proteiny pentonové báze obsahující HA. Tyto výsledku ukazují že proběhla úspěšná konstrukce extracelulární části pseudo-receptoru vhodného pro navázání adenovirů, který má nepřirozený ligand (to znamená HA).

Aby se vytvořil celý anti-HA pseudo-receptor anti-HA ScFv se klonoval do plazmidu pSCHAHK, ve kterém se HA odstranil za vzniku plazmidu pScFGHA (obr. č. 17B). Tento plazmid bude produkovat anti-HA pseudo-receptor, který je schopný vázat

• · • · rekombinantní adenoviry, jenž vykazují epitop HA podobný adenovirům popisovaným shora v textu, které mají epitopy FLAG.

Příklad 19:

V tomto příkladu se popisuje vytvoření buněčné linie exprimující vlákno, která je vhodná pro produkci cílených adenovirových partikul!. Doplňovací buněčná linie produkuje protein vlákna, která buď obsahuje nebo neobsahuje další komplementární geny z adenovirového genomu.

Celý gen vlákna adenovirů typu 2 se amplifikoval z DNA adenovirů typu 2 pomocí PCR. Výsledný produkt se klonoval do plazmidu pCR2.1-TOPO (Invitrogen) za vzniku plazmidu pCR2.1TOPO+fiber (obr. č. 13A) . Gen fiber2 se vystřihl z plazmidu pCR2.1-TOPO+Fiber restrikčními enzymy BamHI a Eagl a pak se subklónoval do plazmidu pKSII (Stratagene), přičemž se zkonstruoval plazmid pKSII Fiber (obr. č. pak vystřihl z plazmidu pKSII Fiber za použití restrikčních enzymů KpnI a Eagl a pak se klonoval do plazmidu pSMTZeo-DBP (obr. č. 13C) . Výsledný plazmid pSMTZeo-Fiber (obr. č. 13D)

13B)

Gen fiber2 se je řízen metalothioninovým se umístilo účinné místo kóduje celý gen fiber2, jenž promotorem. V této konstrukci sestřihu mRNA před gen vlákna, přičemž se zesílila syntéza proteinu vlákna následující po indukci. Plazmid pSMTZeo-Fiber také obsahuje markér Zeo rezistence, což umožňuje selekci buněčných linií na antibiotikum zeocin.

Za účelem produkce buněčné linie se plazmid pSMTZeo-Fiber se transfekoval do buněk 293 (nebo některé jiné buněčné linie) ať . už se přidaly nebo nepřidaly funkce doplňující adenovirus. Jednotlivé kolonie buněk rezistentní na zeocin se pak amplifikují standardním způsobem a testuje se u nich produkce fiber2 (například Westernovou analýzou za použití anti-fiber2 protilátek) před a po indukci zinkem, který aktivuje metalothioninový promotor. U vybraných klonů exprimující schopnost tvořit plaky a/nebo vlákno se pak testovala • · doplňovat růst adenovirů obsahujících mutovaná vlákna. Klony, které adekvátně doplňují mutovaná vlákna, jsou vhodné pro amplifikaci a kultivaci adenovirových partikulí, které obsahují genomy kódující mutantní geny vlákna.

· * ·

Sekvenční protokol

Informace o	SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 960 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: neznámá

(D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..957 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

ATG AAG

CGC GCA

AGA Arg 5

CCG TCT

GAA GAT ACC TTC AAC CCC GTG

TAT Tyr 15

CCA Pro

48

Met 1

Lys

Arg

Ala

Pro

Ser

Glu

Asp Thr 10

Phé

Asn

Pro Val

TAT

GAC

ACG

GAA

ACC.

GGT

CCT

CCA

ACT

GTG

CCT

TTT

CTT

ACT

CCT

CCC

96

Tyr

Asp

Thr

Glu

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Phe

Leu

Thr

Pro

20

25

30

TTT

GTA

TCC

CCC

AAT

GGG

TTT

CAA

GAG

AGT

CCC

GGG

GTA

CTC

TCT

144

Phe

Val

Ser

Pro

Asn

Gly

Phe

Gin

Glu

Ser

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

35

40

45

TTG

CGC

CTA

TCC

GAA

CCT

CTA

GTT

ACC

TCC

AAT

GGC

ATG

CTT

GCG

CTC

192

Leu

Arg

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Val

Thr

Ser

Asn

Gly

Met

Leu

Ala

Leu

50

55

60

AAA

ATG

GGC

AAC

GGC

CTC

TCT

CTG

GAC

GAG

GCC

GGC

AAC

CTT

ACC

TCC

240

Lys

Met

Gly

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Asn

Leu

Thr

Ser

65

70

75

80

CAA

AAT

GTA

ACC

ACT

GTG

AGC

CCA

CCT

CTC

AAA

ACC

AAG

TCA

AAC

288

Gin

Asn

Val

Thr

Val

Ser

Pro

. Pro

Leu

Lys

Thr

Lys

Ser

Asn

85

90

95

ATA

AAC

CTG

GAA

ATA

TCT

GCA

CCC

CTC

ACA

GTT

ACC

TCA

GAA

GCC

CTA

336

Ile

Asn

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

Thr

Ser

Glu

Ala

Leu

100

105

110

ACT

GTG

GCT

GCC

GCA

CCT

CTA

ATG

GTC

GCG

GGC

AAC

ACA

CTC

ACC

384

Thr

Val

Ala

Pro

Leu

Met

Val

Ala

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

115

120

125

ATG

CAA

TCA

CAG

GCC

CCG

CTA

ACC

GTG

CAC

GAC

TCC

AAA

CTT

AGC

ATT

432

Met

Gin

Ser

Gin

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

His

Asp

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

130

135

140

* · · · • · 4

44444 4 • · ·

4 4 4 ·

GCC Ala 145

ACC CAA GGA CCC CTC ACA GTG TCA GAA GGA’ AAG CTA GCA TCA

AGG Arg 160

480

Thr

Gin Gly

Pro Leu 150

Thr

Val

Ser

Glu

Gly 155

Lys

Leu

Ala

Ser

GTC

TCG

GCG

CTC

GAG

AAG

ACG

TCT

CAA

ATA

CAC

TCT

GAT

ACT

ATC

CTC

528

Val

Ser

Ala

Leu

Glu

Lys

Thr

Ser

Gin

Ile

His

Ser

Asp

Thr

Ile

Leu

165

170

175

CGG

ATC

ACC

CAG

GGA

CTC

GAT

GCA

AAC

AAA

CGA

ATC

GCT

CTT

576

Arg

Ile

Thr

Gin

Gly

Leu

Asp

Ala

Asn

Lys

Arg

Ile

Ala

Leu

180

185

190

GAG

CAA

AGT

CGG

GAT

GAC

TTG

GTT

GCA

TCA

GTC

AGT

GAT

GCT

CAA

CTT

624

Glu

Gin

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Ala

Ser

Val

Ser

Asp

Ala

Gin

Leu

195

200

205

GCA

ATC

TCC

AGA

TTG

GAA

AGC

TCT

ATC

GGA

GCC

CTC

CAA

ACA

GTT

GTC

672

Ala

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Ser

Ile

Gly

Ala

Leu

Gin

Thr

Val

210

215

220

AAT

GGA

CTT

GAT

TCG

AGT

GTT

ACC

CAG

TTG

GGT

GCT

CGA

GTG

GGA

CAA

720

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser

Val

Thr

Gin

Leu

Gly

Ala

Arg

Val

Gly

Gin

225

230

235

240

CTT

GAG

ACA

GGA

CTT

GCA

GAC

GTA

CGC

GTT

GAT

CAC

GAC

AAT

CTC

GTT

768

Leu

Glu

Thr

Gly

Leu

Ala

Asp

Val

Arg

Val

Asp

His

Asp

Asn

Leu

Val

245

250

255

GCG

AGA

GTG

GAT

ACT

GCA

GAA

CGT

AAC

ATT

GGA

TCA

TTG

ACC

ACT

GAG

816

Ala

Arg

Val

Asp

Thr

Ala

Glu

Arg

Asn

Ile

Gly

Ser

Leu

Thr

Glu

260

265

270

CTA

TCA

ACT

CTG

ACG

TTA

CGA

GTA

ACA

TCC

ATA

CAA

GCG

GAT

TTC

GAA

864

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Arg

Val

Thr

Ser

Ile

Gin

Ala

Asp

Phe

Glu

275

280

285

TCT

AGG

GGA

TCC

GGC

ACT

AGT

GGC

GAC

TAC

AAG

GAC

912

Ser

Arg

Gly

Sér

Gly

Thr

Ser

Gly

Asp

Tyr

Lys

Asp

290

295

300

GAC

AAG

GGC

CCT

AGG

GGC

GCC

CGC

GCC

TCC

CTT

GGC

TCT

AGA

TAA

960

Asp

Lys

dy

Pro

Arg

Gly

Ala

Arg

Ala

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

305 310 315 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 633 párů baží
	(3)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: neznámý
	(D)	TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč: CDS
	(3)	Pozice: 1 ..630
(xí)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

TAT GAC ACG GAA ACC GGT CCT CCA ACT GTG CCT TTT CTT ACT CCT CCC

Tyr

Asp

Thr

Glu 340

Thr

Gly

Pro

Thr 345

Val

Pro

Phe

Leu

Thr 350

Pro

TTT

GTA

TCC

ccc

AAT

GGG

TTT

CAA

GAG

AGT

CCC

GGG

GGA

GGG

CTA

144

Phe

Val

Ser 355

Pro

Asn

Gly

Phe

Gin 360

Glu

Ser

Pro

Gly 365

Gly

Leu

GCA

TCA

AGG

GTC

TCG

GCG

CTC

GAG

AAG

ACG

TCT

CAA

ATA

CAC

TCT

GAT

192

Ala

Ser 370

Arg

Val

Ser

Ala

Leu 375

Glu

Lys

Thr

Ser

Gin 380

Ile

His

Ser

Asp

ACT

ATC

CTC

CGG

ATC

ACC

CAG

GGA

CTC

GAT

GCA

AAC

AAA

CGA

ATC

•240

Thr 385

Ile

Leu

Arg

Ile

Thr 390

Gin

Gly

Leu

Asp

Asp 395

Ala

Asn

Lys

Arg

Ile 400

ATC

GCT

CTT

GAG

CAA

AGT

CGG

GAT

GAC

TTG

GTT

GCA

TCA

GTC

AGT

GAT

288

Ile

Ala

Leu

Glu

Gin 405

Ser

Arg

Asp Asp

Leu 410

Val

Ala

Ser

Val

Ser 415

Asp

GCT

CAA

CTT

GCA

ATC

TCC

AGA

TTG

GAA

AGC

TCT

ATC

GGA

GCC

CTC

CAA

336

Ala

Gin

Leu

Ala 420

Ile

Ser

Arg

Leu'

Glu 425

Ser

Ile

Gly

Ala 430

Leu

Gin

ACA

GTT

GTC

AAT

GGA

CTT

GAT

TCG

AGT

GTT

ACC

CAG

TTG

GGT

GCT

CGA

384

Thr

Val

Val 435

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser 440

Ser

Val

Thr

Gin

Leu 445

Gly

Ala

Arg

GTG

GGA

CAA

CTT

GAG

ACA

GGA

CTT

GCA

GAC

GTA

CGC

GTT

GAT

CAC

GAC

432

Val

Gly 450

Gin

Leu

Glu

Thr

Gly 455

Leu

Ala

Asp

Val

Arg 460

Val

Asp

His

Asp

AAT

CTC

GTT

GCG

AGA

GTG

GAT

ACT

GCA

GAA

CGT

AAC

ATT

GGA

TCA

TTG

480

Asn 465

Leu

Val

Ala

Arg

Val 470

Asp

Thr

Ala

Glu

Arg 475

Asn

Ile

Gly

Ser

Leu 480

ACC

ACT

GAG

CTA

TCA

ACT

CTG

ACG

TTA

CGA

GTA

ACA

TCC

ATA

CAA

GCG

528

Thr

Glu

Leu

Ser 485

Thr

Leu

Thr

Leu

Arg 490

Val

Thr

Ser

Ile

Gin 4 95

Ala

GAT

TTC

GAA

TCT

AGG

GGA

TCC

GGC

ACT

AGT

GGC

GAC

TAC

AAG

576

Asp

Phe

Glu

Ser 500

Arg

Gly

Ser

Gly

Gly 505

Thr

Ser

Gly

Asp 510

Tyr

Lys

GAC

AAG

GGC

CCT

AGG

GGC

GCC

CGC

GCC

TCC

CTT

GGC

624

Asp

Lys

Gly

Pro

Arg

Gly

Ala

Arg

Ala

Ser

Leu

Gly

515 520 525

TCT AGA TAA 633

Ser Arg

530

2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1704 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: ODS (B) Pozice: 1 ..1701 (xí «Ρ

9 9

Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

ATG AAG CGC

GCA AGA

CCG Pro

TCT Ser

GAA GAT ACC TTC AAC CCC GTG TAT CCA

48

Met

Lys Arg

Ala 215

Arg

Glu Asp Thr 220

Phe

Asn

Pro

Val 225

Tyr

Pro

TAT

GAC

ACG

GAA

ACC

GGT

CCT

CCA

ACT

GTG

CCT

TTT

CTT

ACT

CCT

CCC

96

Tyr

Asp

Thr

Glu

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Phe

Leu

Thr

Pro

230

235

240

TTT

GTA

TCC

CCC

AAT

GGG

TTT

CAA

GAG

AGT

CCC

GGG

GTA

CTC

TCT

144

Phe

val

Ser

Pro

Asn

Gly

Phe

Gin

Glu

Ser

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

245

250

255

TTG

CGC

CTA

TCC

GAA

CCT

CTA

GTT

ACC

TCC

AAT

GGC

ATG

CTT

GCG

CTC

192

Leu

Arg

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Val

Thr

Ser

Asn

Gly

Met

Leu

Ala

Leu

260

265

270

275

AAA

ATG

GGC

AAC

GGC

CTC

TCT

CTG

GAC

GAG

GCC

GGC

AAC

CTT

ACC

TCC

240

Lys

Met

Gly

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Asn

Leu

Thr

Ser

280

285

290

CAA

AAT

GTA

ACC

ACT

GTG

AGC

CCA

CCT

CTC

AAA

ACC

AAG

TCA

AAC

288

Gin

Asn

Val

Thr

Val

Ser

Pro

Leu

Lys

Thr

Lys

Ser

Asn

295

300

305

ATA

AAC

CTG

GAA

ATA

TCT

GCA

CCC

CTC

ACA

GTT

ACC

TCA

GAA

GCC

CTA

336

Ile

Asn

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

Thr

Ser

Glu

Ala

Leu

310

315

320

ACT

GTG

GCT

GCC

GCA

CCT

CTA

ATG

GTC

GCG

GGC

AAC

ACA

CTC

ACC

384

Thr

Val

Ala

Pro

Leu

Met

Val

Ala

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

325

330

335

ATG

CAA

TCA

CAG

GCC

CCG

CTA

ACC

GTG

CAC

GAC

TCC

AAA

CTT

AGC

ATT

432

Met

Gin

Ser

Gin

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

His

Asp

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

340

345

350

355

GCC

ACC

CAA

GGA

CCC

CTC

ACA

GTG

TCA

GAA

GGA

AAG

CTA

GCA

TCA

AGG

480

Ala

Thr

Gin

Gly

Pro

Leu

Thr

Val

Ser

Glu

Gly

Lys

Leu

Ala

Ser

Arg

360

365

370

GTC

TCG

GCG

CTC

GAG

AAG

ACG

TCT

CAA

ATA

CAC

TCT

GAT

ACT

ATC

CTC

528

Val

Ser

Ala

Leu

Glu

Lys

Thr

Ser

Gin

Ile

His

Ser

Asp

Thr

Ile

Leu

375

380

385

CGG

ATC

ACC

CAG

GGA

CTC

GAT

GCA

AAC

AAA

CGA

ATC

GCT

CTT

576

Arg

Ile

Thr

Gin

Gly

Leu

Asp

Ala

Asn

Lys

Arg

Ile

Ala

Leu

390

395

400

GAG

CAA

AGT

CGG

GAT

GAC

TTG

GTT

GCA

TCA

GTC

AGT

GAT

GCT

CAA

CTT

624

Glu

Gin

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Ala

Ser

Val

Ser

Asp

Ala

Gin

Leu

405

410

415

GCA

ÁTC

TCC

AGA

TTG

GAA

AGC

TCT

ATC

GGA

GCC

CTC

CAA

ACA

GTT

GTC

672

Ala

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Ser

Ile

Gly

Ala

Leu

Gin

Thr

Val

420

425

430

435

AAT

GGA

CTT

GAT

TCG

AGT

GTT

ACC

CAG

TTG

GGT

GCT

CGA

GTG

GGA

CAA

720

Asn

Gly

Leu

Asp

Ser

Val

Thr

Gin

Leu

Gly

Ala

Arg

Val

Gly

Gin

440

445

450

CTT

GAG

ACA

GGA

CTT

GCA

GAC

GTA

CGC

GTT

GAT

CAC

GAC

AAT

CTC

GTT

768

Leu

Glu

Thr

Gly

Leu

Ala

Asp

Val

Arg

Val

Asp

His

Asp

Asn

Leu

Val

455

460

465

GCG

AGA

GTG

GAT

ACT

GCA

GAA

CGT

AAC

ATT

GGA

TCA

TTG

ACC

ACT

GAG

816

· • Φ

Ala

Arg

Val 470

Asp

Thr

Ala Glu

Arg 475

Asn

Ile

Gly

Ser

Leu Thr Thr Glu 480

CTA

TCA

ACT

CTG

ACG

TTA

CGA

GTA

ACA

TCC

ATA

CAA

GCG

GAT

TTC

GAA

864

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Arg

Val

Thr

Ser

Ile

Gin

Ala

Asp

Phe

Glu

485

490

495

TCT

AGG

GGA

TCC

GGC

ACT

AGA

GGA

GGT

GGA

ATG

AGC

AAG

GGC

GAG

912

Ser

Arg

Gly

Ser

Gly Gly

Thr

Arg

Gly

Met

Ser

Lys

Gly

Glu

500

505

510

515

GAA

CTG

TTC

ACT

GGC

GTG

GTC

CCA

ATT

CTC

GTG

GAA

CTG

GAT

GGC

GAT

960

Glu

Leu

Phe

Thr

Gly

Val

Pro

Ile

Leu

Val

Glu

Leu

Asp

Gly

Asp

520

525

530

GTG

AAT

GGG

CAC

AAA

TTT

TCT

GTC

AGC

GGA

GAG

GGT

GAA

GGT

GAT

GCC

1008

Val

Asn

Gly

His

Lys

Phe

Ser

Val

Ser

Gly

Glu

Gly

Glu

Gly

Asp

Ala

535

540

545

ACA

TAC

GGA

AAG

CTC

ACC

CTG

AAA

TTC

ATC

TGC

ACC

ACT

GGA

AAG

CTC

1056

Thr

Tyr

Gly

Lys

Leu

Thr

Leu

Lys

Phe

Ile

Cys

Thr

Gly

Lys

Leu

550

555

560

CCT

GTG

CCA

TGG

CCA

ACA

CTG

GTC

ACT

ACC

TTC

ACC

TAT

GGC

GTG

CAG

1104

Pro

Val

Pro

Trp

Pro

Thr

Leu

Val

Thr

Phe

Thr

Tyr

Gly

Val

Gin

565

570

575

TGC

TTT

TCC

AGA

TAC

CCA

GAC

CAT

ATG

AAG

CAG

CAT

GAC

TTT

TTC

AAG

1152

Cys

Phe

Ser

Arg

Tyr

Pro

Asp

His

Met

Lys

Gin

His

Asp

Phe

Lys

580

585

590

595

AGC

GCC

ATG

CCC

GAG

GGC

TAT

GTG

CAG

GAG

AGA

ACC

ATC

TTT

TTC

AAA

1200

Ser

Ala

Met

Pro

Glu

Gly

Tyr

Val

Gin

Glu

Arg

Thr

Ile

Phe

Lys

600

605

610

GAT

GAC

GGG

AAC

TAC

AAG

ACC

CGC

GCT

GAA

GTC

AAG

TTC

GAA

GGT

GAC

1248

Asp

Gly

Asn

Tyr

Lys

Thr

Arg

Ala

Glu

Val

Lys

Phe

Glu

Gly

Asp

615

620

625

ACC

CTG

GTG

AAT

AGA

ATC

GAG

TTG

AAG

GGC

ATT

GAC

TTT

AAG

GAA

GAT

1296

Thr

Leu

Val

Asn

Arg

Ile

Glu

Leu

Lys

Gly

Ile

Asp

Phe

Lys

Glu

Asp

630

635

640

GGA

AAC

ATT

CTC

GGC

CAC

AAG

CTG

GAA

TAC

AAC

TAT

AAC

TCC

CAC

AAT

1344

Gly

Asn

Ile

Leu

Gly

His

Lys

Leu

Glu

Tyr

Asn

Tyr

Asn

Ser

His

Asn

645

650

655

GTG

TAC

ATC

ATG

GCC

GAC

AAG

CAA

AAG

AAT

GGC

ATC

AAG

GTC

AAC

TTC

1392

Val

Tyr

Ile

Met

Ala

Asp

Lys

Gin

Lys

Asn

Gly

Ile

Lys

Val

Asn

Phe

660

665

670

675

AAG

ATC

AGA

CAC

AAC

ATT

GAG

GAT

GGA

TCC

GTG

CAG

CTG

GCC

GAC

CAT

1440

Lys

Ile

Arg

His

Asn

Ile

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Gin

Leu

Ala

Asp

His

680

685

690

TAT

CAA

CAG

AAC

ACT

CCA

ATC

GGC

GAC

GGC

CCT

GTG

CTC

CCA

GAC

1488

Tyr

Gin

Asn

Thr

Pro

Ile

Gly

Asp

Gly

Pro

Val

Leu

Pro

Asp

695

700

705

AAC

CAT

TAC

CTG

TCC

ACC

CAG

TCT

GCC

CTG

TCT

AAA

GAT

CCC

AAC

GAA

1536

Asn

His

Tyr

Leu

Ser

Thr

Gin

Ser

Ala

Leu

Ser

Lys

Asp

Pro

Asn

Glu

710

715

720

AAG

AGA

GAC

CAC

ATG

GTC

CTG

GAG

TTT

GTG

ACC

GCT

GGG

ATC

1584

Lys

Arg

Asp

His

Met

Val

Leu

Glu

Phe

Val

Thr

Ala

Gly

Ile

725

730

735

• 4 »· • · · * • » · « • · · · • · · · • » 44

ACA	CAT	GGC	ATG	GAC	GAG	CTG	TAC	AAG
Thr 740	His	Gly	Met	Asp	Glu 745	Leu	Tyr	Lys
GGC	GGC	GAC	TAC	AAG	GAC	GAC	GAC	GAC
Gly	Gly	Asp	Tyr	Lys 760	Asp	Asp	Asp	Asp
CGC Arg	GCC Ala	TCC Ser	CTT Leu 775	GGC Gly	TCT Ser	AGA Arg	TAA

GGT Gly	GGA’ GGT AGA TCT ACT AGT Gly Gly Arg Ser Thr Ser	1632
750	755
AAG	GGC	CCT	AGG	GGC	GCC	CGC	1680
Lys	Gly	Pro	Arg	Gly	Ala	Arg
765					770

1704 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1830 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámá (D) TOPOLOGIE: neznámá

(ii;	i DRUH	MOLEKULY:	DNA	(genomová
ix)	ZNAKY:
	(A)	.Název/klíč	: CDS
	(B)	Pozice: 1	..1827
xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID NO: 4:

ATG AGA GGA TCT CAC

CAT His

CAC His 575

CAT CAC CAT

GGC GAA GAT GGA GCT TTG

48

Met Arg Gly Ser

His

Gly

Glu 580

Asp

Gly

Ala

Leu

570

TCC

CTG

ACA

AAA

ACC

TTA

GTC

TAT

CCC

ACC

CTG

TGG

ACG

GGG

CCT

GCT

96

Ser

Leu

Thr

Lys

Thr

Leu

Val

Tyr

Pro

Thr

Leu

Trp

Thr

Gly

Pro

Ala

585

590

595

600

CCC

GAG

GCC

AAC

GTC

ACC

TTC

TCG

GGG

GAG

AAT

TCC

CCA

TCT

GGC

ATT

144

Pro

Glu

Ala

Asn

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Gly

Ile

605

610

615

CTC

AGA

CTG

TGT

CTC

AGC

AGA

ACC

GGG

GGC

ACG

GTC

ATT

GGC

ACC

CTG

192

Leu

Arg

Leu

Cys

Leu

Ser

Arg

Thr

Gly

Thr

Val

Ile

Gly

Thr

Leu

620

625

630

TCT

GTA

CAA

GGT

AGC

CTC

ACG

AAC

CCC

AGT

ACC

GGT

CAG

ACC

CTG

GGC

240

Ser

Val

Gin

Gly

Ser

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Gin

Thr

Leu

Gly

635

640

645

ATG

AAC

CTT

TAC

TTT

GAC

GCA

GAC

GGC

AAT

GTG

CTG

TCT

GAG

AGC

AAC

288

Met

Asn

Leu

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asp

Gly

Asn

Val

Leu

Ser

Glu

Ser

Asn

650

655

660

CTC

GTC

CGA

GGG

TCC

TGG

GGA

ATG

AAA

GAC

CAA

GAT

ACC

CTG

GTG

ACT

336

Leu

Val

Arg

Gly

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Val

Thr

665

670

675

680

CCC

ATT

GCC

AAT

GGG

CAG

TAC

CTG

ATG

CCC

AAC

CTC

ACT

GCA

TAC

CCT

384

Pro

Ile

Ala

Asn

Gly

Gin

Tyr

Leu

Met

Pro

Asn

Leu

Thr

Ala

Tyr

Pro

685

690

695

CGC

CTC

ATA

CAG

ACC

CTA

ACT

TCC

AGC

TAC

ATT

TAC

ACA

CAA

GCG

CAC

432

Arg

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Thr

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Gin

Ala

His

700

705

710

CTT

GAC

CAC

AAT

AAC

AGT

GTG

GAC

ATC

AAG

ATA

GGG

CTC

AAC

ACA

480

· * 9 9

9 9 « · φ

Leu Asp

His Asn Asn 715

Ser

Val

Val Asp 720

Ile

Lys

Ile Gly Leu 725

Asn

Thr

GAC

CTG

AGG

CCC

ACT

GCG

GCC

TAC

GGC

CTA

AGC

TTT

ACC

ATG

ACC

TTC

528

Asp

Leu

Arg

Pro

Thr

Ala

Tyr

Gly

Leu

Ser

Phe

Thr

Met

Thr

Phe

730

735

740

ÁCT

AAC

TCT

CCC

ACC

TCA

TTT

GGT

ACC

GAC

CTG

GTG

CAA

TTT

GGC

576

Thr

Asn

Ser

Pro

Thr

Ser

Phe

Gly

Thr

Asp

Leu

Val

Gin

Phe

Gly

745

750

755

760

TAC

CTG

GGT

CAG

GAT

AGC

TCC

CCC

TCC

TTC

CTG

AGA

GAA

CTT

CCC

CTT

624

Tyr

Leu

Gly

Gin

Asp

Ser

Pro

Ser

Phe

Leu

Arg

Glu

Leu

Pro

Leu

765

770

775

GCA

TCC

GAG

GCG

GGC

TAC

TTT

GGC

AAA

CTG

GCA

GCT

GCC

TCT

GAG

GAA

672

Ala

Ser

Glu

Ala

Gly

Tyr

Phe

Gly

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

780

785

790

ATG

CCA

GCC

CCT

GAG

GCC

CAG

ACG

CAG

GAC

CAA

GCA

GCT

GAG

720

Met

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

Gin

Thr

Gin

Asp

Gin

Ala

Glu

795

800

805

CCC

CCG

GCT

CCT

GCT

GAG

GCT

GAG

GCC

CCC

GCT

CCT

GCT

GAG

GCT

GAG

768

Pro

Ala

Pro

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Glu

Ala

Glu

810

815

820

GCT

GAG

GCT

GAA

CCG

CCC

CGA

AAA

CCC

CCT

AGG

GGT

GAC

CTG

GCC

816

Ala

Glu

Ala

Glu

Pro

Arg

Lys

Pro

Arg

Gly

Asp

Leu

Ala

825

830

835

840

CTA

TAC

AAT

AGG

GTC

CAC

AGC

GAC

ACC

CGC

GCA

GAG

GAC

ACA

CCA

ACC

864

Leu

Tyr

Asn

Arg

Val

His

Ser

Asp

Thr

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Pro

Thr

845

850

855

AGC

CCC

GAG

TTG

GTC

ACA

ACC

TTG

CCA

GAC

CCC

TTT

GTC

CTC

CCC

CTA

912

Ser

Pro

Glu

Leu

Val

Thr

Leu

Pro

Asp

Pro

Phe

Val

Leu

Pro

Leu

860

865

870

CCC

GAC

GGA

GTC

CCA

ACC

GGT

GCG

AGC

ATT

GTG

TTG

GAA

GGT

ACC

CTC

960

Pro

Asp

Gly

Val

Pro

Thr

Gly

Ala

Ser

Ile

Val

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

875

880

885

ACA

CCC

TCC

GCT

GTG

TTT

ACC

CTG

GAT

CTG

GTG

ACC

GGG

CCC

GCC

1008

Thr

Pro

Ser

Ala

Val

Phe

Thr

Leu

Asp

Leu

Val

Thr

Gly

Pro

Ala

890

895

900

AGT

CTG

GCG

CTG

CAC

TTT

AAC

GTG

CGC

CTC

CCA

CTG

GAA

GGC

GAA

AAG

1056

Ser

Leu

Ala

Leu

His

Phe

Asn

Val

Arg

Leu

Pro

Leu

Glu

Gly

Glu

Lys

905

910

915

920

CAC

ATT

GTG

TGC

AAC

TCC

AGA

GAG

GGT

AGC

AAC

TGG

GGC

GAA

1104

Jf

His

Ile

Val

Cys

Asn

Ser

Arg

Glu

Gly

Ser

Asn

Trp

Gly

Glu

925 930 935

GTA AGA

CCG CAG GAG

TTC CCC TTT

GAA AGG GAA AAG CCA TTC GTC CTG

1152

Val

Arg

Pro

Gin Glu 940

Phe

Pro

Phe

Glu 945

Arg

Glu

Lys

Pro

Phe 950

Val

Leu

GTC

ATT

GTC

ATC

CAA

AGT

GAC

ACA

TAC

CAG

ATC

ACT

GTG

AAC

GGG

AAG

1200

Val

Ile

Val

Ile

Gin

Ser

Asp

Thr

Tyr

Gin

Ile

Thr

Val

Asn

Gly

Lys

955

960

965

CCT

CTG

GTG

GAT

TTT

CCA

CAG

AGA

CTA

CAG

GGC

ATT

ACC

CGT

GCC

TCC

1248

Pro

Leu

Val

Asp

Phe

Pro

Gin

Arg

Leu

Gin

Gly

Ile

Thr

Arg

Ala

Ser

970

975

980

4

4 4

4 · • <4 ·· • 44 4 4 4 • 4 4 4 4

44444 4 ·»4

444 44 44

CTA TCC GGA GAC CTT GTG TTT ACC CGG TTG ACA' ATG TAC CCA

CCC Pro

GGA Gly 1000

1296

Leu 985

Ser Gly

Asp

Leu Val 990

Phe

Thr

Arg Leu

Thr 995

Met

Tyr

Pro

GAC

CCC CGT

CCC

ACA ACC

TTG

TTA

CCA· CCC

CCC

GCA

GCT

CCC

CTG

GAC

1344

Asp

Pro Arg

Pro

Thr Thr 1005

Leu

Pro Pro Pro 1010

Ala

Pro

Leu Asp 1015

GTA

ATC CCA

GAT

GCC TAT

GTG

CTC

AAT CTG

CCC

ACC

GGA

CTG

ACG

CCT

1392

Val

Ile Pro

Asp Ala Tyr 1020

Val

Leu

Asn Leu 1025

Pro

Thr

Gly

Leu Thr 1030

Pro

AGA

ACA CTC

CTC

ACC GTC

ACG

GGA

ACC CCC

ACG

CCC

CTC

GCC

GAA

TTT

1440

Arg

Thr Leu Leu 1035

Thr Val

Thr

Gly Thr Pro 1040

Thr

Pro

Leu Ala 1045

Glu

Phe

TTT

ATT GTG

AAT

CTG GTC

TAC

GAT

TTA CAC

TAT

GAT

TCC

AAA

AAT

GTG

1488

Phe

Ile Val 1050

Asn

Leu Val

Tyr Asp 1055

Leu His

Tyr

Asp Ser 1060

Lys

Asn

Val

GCC

CTC CAC

TTT

AAT GTC

GGC

TTC

ACC TCT

GAC

AGC

AAA

GGC

CAC

ATC

1536

Ala 106E

Leu His

Phe

Asn Val Gly 1070

Phe

Thr Ser

Asp Ser 1075

Lys

Gly

His

Ile 1080

GCC

TGC AAT

GCC

AGA ATG

AAT

GGC

ACA TGG

GGA

AGT

GAA

ATC

ACA

GTG

1584

Ala

Cys Asn

Ala

Arg Met 1085

Asn

Gly

Thr Trp Gly 1090

Ser

Glu

Ile

Thr Val 1095

TCT

GAT TTC

CCC

TTT CAA

AGG

GGA

AAA CCC

TTC

ACT

CTG

CAG

ATT

CTC

1632

Ser

Asp Phe

Pro Phe Gin 1100

Arg

Gly

Lys Pro 1105

Phe

Thr

Leu

Gin Ile 1110

Leu

ACC

AGA GAG

GCA

GAC TTC

CAA

GTC

CTC GTA

GAT

AAA

CAA

CCT

TTA

ACC

1680

Thr

Arg Glu Ala 1115

Asp Phe

Gin

Val Leu Val 1120

Asp

Lys

Gin Pro 1125

Leu

Thr

CAG

TTT CAA

TAC

AGG CTG

AAG

GAA

CTG GAC

CAA

ATC

AAA

TAT

GTA

CAC

1728

Gin

Phe Gin 1130

Tyr

Arg Leu

Lys Glu 1135 ·

Leu Asp

Gin

Ile Lys 1140

Tyr

Val

His

ATG

TTT GGC

CAT

GTT GTG

CAA

ACC

CAC CTG

GAA

CAC

CAA

GTG

CCA

GAT

1776

Met 1145

Phe Gly

His

Val Val Gin 1150

Thr

His Leu

Glu His 1155

Gin

Val

Pro

Asp 1160

ACT

CCA GTT

TTT

TCT ACT

GCG

GGA

GTT TCG

AAA

GTT

TAC

CCT

CAG

ATA

1824

Thr

Pro Val

Phe

Ser Thr

Ala

Gly

Val Ser

Lys

Val

Tyr

Pro

Gin

Ile

1165 1170 1175

CTG TAG 1830

Leu (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2253 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámá (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

• · • ·

999 «

• 4 (A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 . . 2250 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

ATG AAG

CGC Arg

GCA AGA

CCG TCT

GAA GAT ACC TTC AAC CCC GTG

TAT Tyr 625

CCA Pro

48

Met

Lys

Ala

Arg 615

Pro

Ser

Glu Asp

Thr 620

Phe Asn

Pro

Val

TAT

GAC

ACG

GAA

ACC

GGT

CCT

CCA

ACT

GTG

CCT

TTT

CTT

ACT

CCT

CCC

96

Tyr

Asp

Thr

Glu

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Phe

Leu

Thr

Pro

630

635

640

TTT

GTA

TCC

CCC

AAT

GGG

TTT

CAA

GAG

AGT

CCC

CCT

GGG

GTA

CTC

TCT

144

Phe

Val

Ser

Pro

Asn

Gly

Phe

Gin

Glu

Ser

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

645

650

655

TTG

CGC

CTA

TCC

GAA

CCT

CTA

GTT

ACC

TCC

AAT

GGC

ATG

CTT

GCG

CTC

192

Leu

Arg

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Val

Thr

Ser

Asn

Gly

Met

Leu

Ala

Leu

660

665

670

AAA

ATG

GGC

AAC

GGC

CTC

TCT

CTG

GAC

GAG

GCC

GGC

AAC

CTT

ACC

TCC

240

Lys

Met

Gly

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Asn

Leu

Thr

Ser

675

680

685

690

CAA

AAT

GTA

ACC

ACT

GTG

AGC

CCA

CCT

CTC

AAA

ACC

AAG

TCA

AAC

288

Gin

Asn

Val

Thr

Val

Ser

Pro

Leu

Lys

Thr

Lys

Ser

Asn

695

700

705

ATA

AAC

CTG

GAA

ATA

TCT

GCA

CCC

CTC

ACA

GTT

ACC

TCA

GAA

GCC

CTA

336

Ile

Asn

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

Thr

Ser

Glu

Ala

Leu

710

715

720

ACT

GTG

GCT

GCC

GCA

CCT

CTA

ATG

GTC

GCG

GGC

AAC

ACA

CTC

ACC

384

Thr

Val

Ala

Pro

Leu

Met

Val

Ala

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

725

730

735

ATG

CAA

TCA

CAG

GCC

CCG

CTA

ACC

GTG

CAC

GAC

TCC

AAA

CTT

AGC

ATT

432

Met

Gin

Ser

Gin

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

His

Asp

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

740

745

750

GCC

ACC

CAA

GGA

CCC

CTC

ACA

GTG

TCA

GAA'

GGA

AAG

CTA

GCC

CTG

ACA

480

Ala

Thr

Gin

Gly

Pro

Leu

Thr

Val

Ser

Glu

Gly

Lys

Leu

Ala

Leu

Thr

755

7 60

765

770

AAA

ACC

TTA

GTC

TAT

CCC

ACC

CTG

TGG

ACG

GGG

CCT

GCT

CCC

GAG

GCC

528

Lys

Thr

Leu

Val

Tyr

Pro

Thr

Leu

Trp

Thr

Gly

Pro

Ala

Pro

Glu

Ala

775

780

785

AAC

GTC

ACC

TTC

TCG

GGG

GAG

AAT

TCC

CCA

TCT

GGC

ATT

CTC

AGA

CTG

576

Asn

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Glu

Asn

Ser

Pro

Ser

Gly

Ile

Leu

Arg

Leu

790

795

800

TGT

CTC

AGC

AGA

ACC

GGG

GGC

ACG

GTC

ATT

GGC

ACC

CTG

TCT

GTA

CAA

624

Cys

Leu

Ser

Arg

Thr

Gly

Thr

Val

Ile

Gly

Thr

Leu

Ser

Val

Gin

805

810

815

GGT

AGC

CTC

ACG

AAC

CCC

AGT

ACC

GGT

CAG

ACC

CTG

GGC

ATG

AAC

CTT

672

Gly

Ser

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Gin

Thr

Leu

Gly

Met

Asn

Leu

820

825

830

TAC

TTT

GAC

GCA

GAC

GGC

AAT

GTG

CTG

TCT

GAG

AGC

AAC

CTC

GTC

CGA

720

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asp

Gly

Asn

Val

Leu

Ser

Glu

Ser

Asn

Leu

Val

Arg

835

840

845

850

GGG

TCC

TGG

GGA

ATG

AAA

GAC

CAA

GAT

ACC

CTG

GTG

ACT

CCC

ATT

GCC

768

Gly

Ser

Trp

Gly

Met

Lys

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Val

Thr

Pro

Ile

Ala

855

860

865

• · • A

AAA AA • ·· » ·

AAT GGG	CAG Gin	TAC Tyr 870	CTG ATG CCC AAC CTC ACT GCA TAC CCT CGC CTC ATA
Asn	Gly	Leu Met	Pro	Asn Leu Thr 875	Ala'Tyr	Pro	Arg 880	Leu	Ile
CAG	ACC	CTA	ACT	TCC AGC	TAC	ATT TAC ACA	CAA GCG	CAC	CTT	GAC	CAC
Gin	Thr	Leu 885	Thr	Ser Ser	Tyr	Ile Tyr Thr 890	Gin Ala	His 895	Leu	Asp	His
AAT	AAC	AGT	GTG	GTG GAC	ATC	AAG ATA GGG	CTC AAC	ACA	GAC	CTG	AGG
Asn	Asn 900	Ser	Val	Val Asp	Ile 905	Lys Ile Gly	Leu Asn 910	Thr	Asp	Leu	Arg
CCC	ACT	GCG	GCC	TAC GGC	CTA	AGC TTT ACC	ATG ACC	TTC	ACT	AAC	TCT
Pro 915	Thr	Ala	Ala	Tyr Gly 920	Leu	Ser Phe Thr	Met Thr 925	Phe	Thr	Asn	Ser 930
CCC	CCC	ACC	TCA	TTT GGT	ACC	GAC CTG GTG	CAA TTT	GGC	TAC	CTG	GGT
Pro	Pro	Thr	Ser	Phe Gly 935	Thr	Asp Leu Val 940	Gin Phe	Gly	Tyr	Leu 945	Gly
CAG	GAT	AGC	TCC	CCC TCC	TTC	CTG AGA GAA	CTT CCC	CTT	GCA	TCC	GAG
Gin	Asp	Ser	Ser 950	Pro Ser	Phe	Leu Arg Glu 955	Leu Pro	Leu	Ala 960	Ser	Glu
GCG	GGC	TAC	TTT	GGC AAA	CTG	GCA GCT GCC	TCT GAG	GAA	ATG	CCA	GCC
Ala	Gly	Tyr 965	Phe	Gly Lys	Leu	Ala Ala Ala 970	Ser Glu	Glu 975	Met	Pro	Ala
CCT	CCT	GAG	GCC	CAG ACG	CAG	GAC CAA GCA	GCT GAG	GAG	CCC	CCG	GCT
Pro	Pro 980	Glu	Ala	Gin Thr	Gin 985	Asp Gin Ala	Ala Glu 990	Glu	Pro	Pro	Ala
CCT	GCT	GAG	GCT	GAG GCC	CCC	GCT CCT GCT	GAG GCT	GAG	GCT	GAG	GCT
Pro 995	Ala	Glu	Ala	Glu Ala Pro 1000	Ala Pro Ala	Glu Ala 1005	Glu	Ala	Glu	Ala 1010
GAA	CCG	CCC	CGA	AAA CCC	CCT	AGG GGT GAC	CTG GCC	GCC	CTA	TAC	AAT
Glu	Pro	Pro	Arg	Lys Pro 1015	Pro	Arg Gly Asp 102C	Leu Ala 1	Ala	Leu	Tyr Asn 1025
AGG	GTC	CAC	AGC	GAC ACC	CGC	GCA GAG GAC	ACA CCA	ACC	AGC	CCC	GAG
Arg	Val	His	Ser 103C	Asp Thr 1	Arg	Ala Glu Asp 1035	Thr Pro	Thr	Ser Pro 1040	Glu
TTG	GTC	ACA	ACC	TTG CCA	GAC	CCC TTT GTC	CTC CCC	CTA	CCC	GAC	GGA
Leu	Val	Thr 1045	Thr	Leu Pro	Asp	Pro Phe Val 1050	Leu Pro	Leu Pro 1055	Asp	Gly
GTC	CCA	ACC	GGT	GCG AGC	ATT	GTG TTG GAA	GGT ACC	CTC	ACA	CCC	TCC
Val	Pro 106C	Thr 1	Gly	Ala Ser	Ile 1065	Val Leu Glu	Gly Thr Leu 1070	Thr	Pro	Ser
GCT	GTG	TTT	TTT	ACC CTG	GAT	CTG GTG ACC	GGG CCC	GCC	AGT	CTG	GCG
Ala 1075	Val 1	Phe	Phe	Thr Leu Asp 1080	Leu Val Thr	Gly Pro 1085	Ala	Ser	Leu	Ala 1090
CTG	CAC	TTT	AAC	GTG CGC	CTC	CCA CTG GAA	GGC GAA	AAG	CAC	ATT	GTG
Leu	His	Phe	Asn	Val Arg 1095	Leu	Pro Leu Glu Gly Glu 1100	Lys	His	Ile Val 1105
TGC	AAC	TCC	AGA	GAG GGT	AGC	AGC AAC TGG	GGC GAA	GAA	GTA	AGA	CCG
Cys	Asn	Ser	Arg Glu Gly 1110	Ser	Ser Asn Trp 1115	Gly Glu	Glu	Val Arg 1120	Pro
CAG	GAG	TTC	CCC	TTT GAA	AGG	GAA AAG CCA	TTC GTC	CTG	GTC	ATT	GTC
Gin	Glu	Phe	Pro	Phe Glu	Arg	Glu Lys Pro	Phe Val	Leu	Val	Ile	Val

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584 • 9 • · · · · • · · · 9

999 99 9

9 9 9

9 9 9 9 9 9

9

9 • ·

9

1125 1130 1135

ATC CAA AGT Ile Gin Ser

GAC ACA TAC CAG ATC

ACT GTG AAC GGG AAG CCT CTG GTG

1632

Asp

Thr

Tyr Gin Ile 1145

Thr

Val

Asn

Gly Lys 1150

Pro

Leu

Val

1140

GAT

TTT CCA

CAG

AGA

CTA CAG GGC

ATT

ACC

CGT

GCC TCC

CTA

TCC

GGA

1680

Asp

Phe Pro

Gin

Arg

Leu Gin Gly

Ile

Thr

Arg

Ala Ser

Leu

Ser

Gly

1155

1160

1165

1170

GAC

CTT GTG

TTT

ACC

CGG TTG ACA

ATG

TAC

CCA

CCC GGA

GAC

CCC

CGT

1728

Asp

Leu Val

Phe

Thr

Arg Leu Thr-

Met

Tyr

Pro

Pro Gly

Asp

Pro

Arg

1175 1180 1185

CCC Pro

ACA Thr

ACC Thr

TTG TTA Leu Leu 1190

CCA Pro

CCC Pro

GCA GCT Ala Ala 1195

CCC Pro

CTG Leu

GAC Asp

GTA ATC Val Ile 1200

CCA Pro

1776

GAT

GCC

TAT

GTG CTC

AAT

CTG

CCC

ACC GGA

CTG

ACG

CCT

AGA ACA

CTC

1824

Asp

Ala

Tyr

Val Leu

Asn

Leu

Pro

Thr Gly

Leu

Thr

Pro

Arg Thr

Leu

1205

1210

1215

CTC

ACC

GTC

ACG GGA

ACC

CCC

ACG

CCC CTC

GCC

GAA

TTT

TTT ATT

GTG

1872

Leu

Thr

Val

Thr Gly

Thr

Pro

Thr

Pro Leu

Ala

Glu

Phe

Phe Ile

Val

1220

1225

1230

AAT

CTG

GTC

TAC GAT

TTA

CAC

TAT

GAT TCC

AAA

AAT

GTG

GCC CTC

CAC

1920

Asn

Leu

Val

Tyr Asp

Leu

His

Tyr

Asp Ser

Lys

Asn

Val

Ala Leu

His

1235

1240

1245

1250

TTT

AAT

GTC

GGC TTC

ACC

TCT

GAC

AGC AAA

GGC

CAC

ATC

GCC TGC

AAT

1968

Phe

Asn

Val

Gly Phe

Thr

Ser

Asp Ser Lys

Gly

His

Ile

Ala Cys

Asn

1255

1260

1265

GCC

AGA

ATG

AAT GGC

ACA

TGG

GGA

AGT GAA

ATC

ACA

GTG

TCT GAT

TTC

2016

Ala

Arg

Met

Asn Gly

Thr

Trp

Gly

Ser Glu

Ile

Thr

Val

Ser Asp

Phe

1270

1275

1280

CCC

TTT

CAA

AGG GGA

AAA

CCC

TTC

ACT CTG

CAG

ATT

CTC

ACC AGA

GAG

2064

Pro

Phe

Gin

Arg Gly

Lys

Pro

Phe

Thr Leu

Gin

Ile

Leu

Thr Arg

Glu

1285

1290

1295

GCA

GAC

TTC

CAA GTC

CTC

GTA

GAT

AAA CAA

CCT

TTA

ACC

CAG TTT

CAA

2112

Ala

Asp

Phe

Gin Val

Leu

Val

Asp

Lys Gin

Pro

Leu

Thr

Gin Phe

Gin

1300

1305

1310

TAC

AGG

CTG

AAG GAA

CTG

GAC

CAA

ATC AAA

TAT

GTA

CAC

ATG TTT

GGC

2160

Tyr

Arg

Leu

Lys Glu

Leu

Asp

Gin

Ile Lys

Tyr

Val

His

Met Phe

Gly

1315

1320

1325

1330

y

CAT

GTT

GTG

CAA ACC

CAC

CTG

GAA

CAC CAA

GTG

CCA

GAT

ACT CCA

GTT

2208

i

His

Val

Gin Thr

His

Leu

Glu

His Gin

Val

Pro

Asp

Thr Pro

Val

1335

1340

1345

Z

, _ττψ·

TCT

ACT

GCG GGA

GTT

TCG

AAA

GTT TAC

CCT

CAG

ATA

CTG TAG

2253

Phe

Ser

Thr

Ala Gly

Val

Ser

Lys

Val Tyr

Pro

Gin

Ile

Leu

1350

1355

1360

(2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 795 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá • ·

(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA (	genomová)
ix)	ZNAKY:
	(A) Název/klíč: CDS
	(B) Pozice: 1 ..792
xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 6

ATG GCG CTC CTG CTG

TGC Cys

TTC GTG CTC CTG TGC GGA GTA GTG

GAT Asp

TTC Phe

48

Met Ala Leu Leu 755

Leu

Phe

Val

Leu 760

Leu

Cys

Gly

Val

Val 765

GCC

AGA

AGT

TTG

AGT

ATC

ACT

CCT

GAA

GAG

ATG

ATT

GAA

AAA

GCC

96

Ala

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Pro

Glu

Met

Ile

Glu

Lys

Ala

770

775

780

AAA

GGG

GAA

ACT

GCC

TAT

CTG

CCG

TGC

AAA

TTT

ACG

CTT

AGT

CCC

GAA

144

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

Tyr

Leu

Pro

Cys

Lys

Phe

Thr

Leu

Ser

Pro

Glu

785

790

795

GAC

CAG

GGA

CCG

CTG

GAC

ATC

GAG

TGG

CTG

ATA

TCA

CCA

GCT

GAT

AAT

192

Asp

Gin

Gly

Pro

Leu

Asp

Ile

Glu

Trp

Leu

Ile

Ser

Pro

Ala

Asp

Asn

800

805

810

815

CAG

AAG

GTG

GAT

CAA

GTG

ATT

TTA

TAT

TCT

GGA

GAC

AAA

ATT

TAT

240

Gin

Lys

Val

Asp

Gin

Val

Ile

Leu

Tyr

Ser

Gly

Asp

Lys

Ile

Tyr

820

825

830

GAT

GAC

TAC

TAT

CCA

GAT

CTG

AAA

GGC

CGA

GTA

CAT

TTT

ACG

AGT

AAT

288

Asp

Tyr

Pro

Asp

Leu

Lys

Gly

Arg

Val

His

Phe

Thr

Ser

Asn

835

840

845

GAT

CTC

AAA

TCT

GGT

GAT

GCA

TCA

ATA

AAT

GTA

ACG

AAT

TTA

CAA

CTG

336

Asp

Leu

Lys

Ser

Gly

Asp

Ala

Ser

Ile

Asn-

Val

Thr

Asn

Leu

Gin

Leu

850

855

860

TCA

GAT

ATT

GGC

ACA

TAT

CAG

TGC

AAA

GTG

AAA

GCT

CCT

GGT

GTT

384

Ser

Asp

Ile

Gly

Thr

Tyr

Gin

Cys

Lys

Val

Lys

Ala

Pro

Gly

Val

865

870

875

GCA

AAT

AAG

ATT

CAT

CTG

GTA

GTT

CTT

GTT

AAG

CCT

TCA

GGT

GCG

432

Ala

Asn

Lys

Ile

His

Leu

Val

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gly

Ala

880

885

890

895

AGA

TGT

TAC

GTT

GAT

GGA

TCT

GAA

ATT

GGA

AGT

GAC

TTT

AAG

ATA

480

Arg

Cys

Tyr

Val

Asp

Gly

Ser

Glu

Ile

Gly

Ser

Asp

Phe

Lys

Ile

900

905

910

AAA

TGT

GAA

CCA

AAA

GAA

GGT

TCA

CTT

CCA

TTA

CAG

TAT

GAG

TGG

CAA

528

Lys

Cys

Glu

Pro

Lys

Glu

Gly

Ser

Leu

Pro

Leu

Gin

Tyr

Glu

Trp

Gin

915

920

925

AAA

TTG

TCT

GAC

TCA

CAG

AAA

ATG

CCC

ACT

TCA

TGG

TTA

GCA

GAA

ATG

576

Lys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gin

Lys

Met

Pro

Thr

Ser

Trp

Leu

Ala

Glu

Met

930

935

940

ACT

TCA

TCT

GTT

ATA

TCT

GTA

AAA

AAT

GCC

TCT

GAG

TAC

TCT

GGG

624

Thr

Ser

Val

Ile

Ser

Val

Lys

Asn

Ala

Ser

Glu

Tyr

Ser

Gly

945

950

955

ACA

TAC

AGC

TGT

ACA

GTC

AGA

AAC

AGA

GTG

GGC

TCT

GAT

CAG

TGC

CTG

672

Thr

Tyr

Ser

Cys

Thr

Val

Arg

Asn

Arg

Val

Gly

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

960

965

970

975

TTG

CGT

CTA

AAC

GTT

GTC

CCT

TCA

AAT

AAA

GCT

GGA

TCT

GGA

TCC

720

Leu

Arg

Leu

Asn

Val

Pro

Ser

Asn

Lys

Ala

Gly

Ser

Gly

Ser

• · • » · 9 ·· ··

980 985 990

GGC Gly

TCA Ser

GGG Gly

TCT Ser 995

ACT AGT GGG

GCC CAG CCG GCC CTG CAG

GCG GCC GCA Ala Ala Ala 1005

Thr

Ser

Gly

Ala Gin Pro 1000

Ala

Leu

Gin

GAC

TAT

AAA

GAT

GAC

GAT

AAG

TGA

Asp

Tyr

Lys

Asp

Lys

1010

1015

768

795

	(2) Informace o SEQ ID NO: 7:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
v		(A) DÉLKA: 834 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina
		(C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá
	(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA (genomová)
	(ix)	ZNAKY: (A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..831
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 7

ATG GCG CTC CTG CTG

TGC TTC GTG

CTC CTG TGC GGA GTA GTG GAT TTC

48

Met Ala

Leu

Leu Leu 270

Cys

Phe

Val

Leu Leu 275

Cys

Gly

Val

Asp 280

Phe

GCC

AGA

AGT

TTG

AGT

ATC

ACT

CCT

GAA

GAG

ATG

ATT

GAA

AAA

GCC

96

Ala

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Pro

Glu

Met

Ile

Glu

Lys

Ala

285

290

295

AAA

GGG

GAA

ACT

GCC

TAT

CTG

CCG

TGC

AAA

TTT

ACG

CTT

AGT

CCC

GAA

144

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

Tyr

Leu

Pro

Cys

Lys

Phe

Thr

Leu

Ser

Pro

Glu

300

305

310

GAC

CAG

GGA

CCG

CTG

GAC

ATC

GAG

TGG

CTG

ATA

TCA

CCA

GCT

GAT

AAT

192

Asp

Gin

Gly

Pro

Leu

Asp

Ile

Glu

Trp

Leu

Ile

Ser

Pro

Ala

Asp

Asn

315

320

325

CAG

AAG

GTG

GAT

CAA

GTG

ATT

TTA

TAT

TCT

GGA

GAC

AAA

ATT

TAT

240

Gin

Lys

Val

Asp

Gin

Val

Ile

Leu

Tyr

Ser

Gly

Asp

Lys

Ile

Tyr

330

335

340

345

GAT

GAC

TAC

TAT

CCA

GAT

CTG

AAA

GGC

CGA

GTA

CAT

TTT

ACG

AGT

AAT

288

Asp

Tyr

Pro

Asp

Leu

Lys

Gly

Arg

Val

His

Phe

Thr

Ser

Asn

350

355

360

GAT

CTC

AAA

TCT

GGT

GAT

GCA

TCA

ATA

AAT

GTA

ACG

AAT

TTA

CAA

CTG

336

Asp

Leu

Lys

Ser

Gly

Asp

Ala

Ser

Ile

Asn

Val

Thr

Asn

Leu

Gin

Leu

365

370

375

TCA

GAT

ATT

GGC

ACA

TAT

CAG

TGC

AAA

GTG

AAA

GCT

CCT

GGT

GTT

384

Ser

Asp

Ile

Gly

Thr

Tyr

Gin

Cys

Lys

Val

Lys

Ala

Pro

Gly

Val

380

385

390

GCA

AAT

AAG

ATT

CAT

CTG

GTA

GTT

CTT

GTT

AAG

CCT

TCA

GGT

GCG

432

Ala

Asn

Lys

Ile

His

Leu

Val

Leu

Val

Lys

Pro

Ser

Gly

Ala

395

400

405

AGA

TGT

TAC

GTT

GAT

GGA

TCT

GAA

ATT

GGA

AGT

GAC

TTT

AAG

ATA

480

Arg

Cys

Tyr

Val

Asp

Gly

Ser

Glu

Ile

Gly

Ser

Asp

Phe

Lys

Ile

410

415

420

425

··«

AAA Lys

TGT Cys

GAA CCA

AAA GAA Lys Glu 430

GGT TCA

CTT CCA TTA CAG TAT GAG TGG CAA

528

Glu

Pro

Gly

Ser

Leu

Pro 435

Leu

Gin

Tyr

Glu

Trp 440

Gin

AAA

TTG

TCT

GAC

TCA CAG

AAA

ATG

CCC

ACT

TCA

TGG

TTA

GCA

GAA

ATG

576

Lys

Leu

Ser

Asp

Ser Gin

Lys

Met

Pro

Thr

Ser

Trp

Leu

Ala

Glu

Met

445

450

455

ACT

TCA

TCT

GTT

ATA TCT

GTA

AAA

AAT

GCC

TCT

GAG

TAC

TCT

GGG

624

Thr

Ser

Val

Ile Ser

Val

Lys

Asn

Ala

Ser

Glu

Tyr

Ser

Gly

460

465

470

ACA

TAC

AGC

TGT

ACA GTC

AGA

AAC

AGA

GTG

GGC

TCT

GAT

CAG

TGC

CTG

672

Thr

Tyr

Ser

Cys

Thr Val

Arg

Asn

Arg

Val

Gly

Ser

Asp

Gin

Cys

Leu

475

480

485

TTG

CGT

CTA

AAC

GTT GTC

CCT

TCA

AAT

ÁAA

GCT

GGA

TCT

GGA

TCC

720

Leu

Arg

Leu

Asn

Val Val

Pro

Ser

Asn

Lys

Ala

Gly

Ser

Gly

Ser

4 90

495

500

505

GGC

TCA

GGG

TCT

ACT AGA

GCC

TGC

GAC

TGT

CGC

GGC

GAT

TGT

TTT

TGC

768

Gly

Ser

Gly

Ser

Thr Arg

Ala

Cys

Asp

Cys

Arg

Gly

Asp

Cys

Phe

Cys

510

515

520

GGT

ACT

AGT

GGG

GCC CAG

CCG

GCC

CTG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAC

TAT

AAA

816

Gly

Thr

Ser

Gly

Ala Gin

Pro

Ala

Leu

Gin

Ala

Asp

Tyr

Lys

525

530

535

GAT

GAC

GAT

AAG TGA

834

Asp

Lys

540

')

Informace

O SEQ

ID

NO

: 8

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1194 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1191

i)

Popis sekvence:

SEQ

ID

NO

: 8

ATG

GCG

CTC

CTG

TGC

TTC

GTG

CTC

CTG

TGC

GGA

GTA

GTG

GAT

TTC

48

Met

Ala

Leu

Cys

Phe

Val

Leu

Cys

Gly

Val

Asp

Phe

280

285

290

GCC

AGA

AGT

TTG

AGT

ATC

ACT

CCT

GAA

GAG

ATG

ATT

GAA

AAA

GCC

96

Ala

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

Thr

Pro

Glu

Met

Ile

Glu

Lys

Ala

295

300

305

310

AAA

GGG

GAA

ACT

GCC

TAT

CTG

CCG

TGC

AAA

TTT

ACG

CTT

AGT

CCC

GAA

144

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

Tyr

Leu

Pro

Cys

Lys

Phe

Thr

Leu

Ser

Pro

Glu

315

320

325

GAC

CAG

GGA

CCG

CTG

GAC

ATC

GAG

TGG

CTG

ATA

TCA

CCA

GCT

GAT

AAT

192

Asp

Gin

Gly

Pro

Leu

Asp

Ile

Glu

Trp

Leu

Ile

Ser

Pro

Ala

Asp

Asn

330

335

340

CAG

AAG

GTG

GAT

CAA

GTG

ATT

TTA

TAT

TCT

GGA

GAC

AAA

ATT

TAT

240

Gin

Lys

Val

Asp

Gin

Val

Ile

Leu

Tyr

Ser

Gly

Asp

Lys

Ile

Tyr

• ·· » »

345 350 355

GAT

GAC

TAC

TAT

CCA

GAT

CTG

AAA

GGC

CGA

GTA

CAT

TTT

ACG

AGT

AAT

288

Asp

Asp 360

Tyr

Pro

Asp

Leu 365

Lys

Gly

Arg

Val

His 370

Phe

Thr

Ser

Asn

GAT

CTC

AAA

TCT

GGT

GAT

GCA

TCA

ATA

AAT

GTA

ACG

AAT

TTA

CAA

CTG

336

Asp 375

Leu

Lys

Ser

Gly

Asp 380

Ala

Ser

Ile

Asn

Val 385

Thr

Asn

Leu

Gin

Leu 390

TCA

GAT

ATT

GGC

ACA

TAT

CAG

TGC

AAA

GTG

AAA

GCT

CCT

GGT

GTT

384

Ser

Asp

Ile

Gly

Thr 395

Tyr

Gin

Cys

Lys

Val 400

Lys

Ala

Pro

Gly 405

Val

GCA

AAT

AAG

ATT

CAT

CTG

GTA

GTT

CTT

GTT

AAG

CCT

TCA

GGT

GCG

432

Ala

Asn

Lys

Lys 410

Ile

His

Leu

Val

Val 415

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 420

Gly

Ala

AGA

TGT

TAC

GTT

GAT

GGA

TCT

GAA

ATT

GGA

AGT

GAC

TTT

AAG

ATA

480

Arg

Cys

Tyr 425

Val

Asp

Gly

Ser

Glu 430

Glu

Ile

Gly

Ser

Asp 435

Phe

Lys

Ile

AAA

TGT

GAA

CCA

AAA

GAA

GGT

TCA

CTT

CCA

TTA

CAG

TAT

GAG

TGG

CAA

528

Lys

Cys 440

Glu

Pro

Lys

Glu

Gly 445

Ser

Leu

Pro

Leu

Gin 450

Tyr

Glu

Trp

Gin

AAA

TTG

TCT

GAC

TCA

CAG

AAA

ATG

CCC

ACT

TCA

TGG

TTA

GCA

GAA

ATG

576

Lys 455

Leu

Ser

Asp

Ser

Gin 460

Lys

Met

Pro

Thr

Ser 465

Trp

Leu

Ala

Glu

Met 470

ACT

TCA

TCT

GTT

ATA

TCT

GTA

AAA

AAT

GCC

TCT

GAG

TAC

TCT

GGG

624

Thr

Ser

Val

Ile 475

Ser

Val

Lys

Asn

Ala 480

Ser

Glu

Tyr

Ser 485

Gly

ACA

TAC

AGC

TGT

ACA

GTC

AGA

AAC

AGA

GTG

GGC

TCT

GAT

CAG

TGC

CTG

672

Thr

Tyr

Ser

Cys 4 90

Thr

Val

Arg

Asn

Arg 4 95

Val

Gly

Ser

Asp

Gin 500

Cys

Leu

TTG

CGT

CTA

AAC

GTT

GTC

CCT

TCA

AAT

AAA

GCT

GGA

TCT

GGA

TCC

720

Leu

Arg

Leu 505

Asn

Val

Pro

Pro 510

Ser

Asn

Lys

Ala

Gly 515

Ser

Gly

Ser

GGC

TCA

GGG

TCT

ACT

AGA

GGA

GGT

GCA

TCA

AGG

GTC

TCG

GCG

CTC

768

Gly

Ser 520

Gly

Ser

Thr

Arg

Gly 525

Gly

Ala

Ser

Arg 530

Val

Ser

Ala

Leu

GAG

AAG

ACG

TCT

CAA

ATA

CAC

TCT

GAT

ACT

ATC

CTC

CGG

ATC

ACC

CAG

816

Glu 535

Lys

Thr

Ser

Gin

Ile 540

His

Ser

Asp

Thr

Ile 545

Leu

Arg

Ile

Thr

Gin 550

GGA

CTC

GAT

GCA

AAC

AAA

CGA

ATC

GCT

CTT

GAG

CAA

AGT

CGG

864

Gly

Leu

Asp

Ala 555

Asn

Lys

Arg

Ile

Ile 560

Ala

Leu

Glu

Gin

Ser 565

Arg

GAT

GAC

TTG

GTT

GCA

TCA

GTC

AGT

GAT

GCT

CAA

CTT

GCA

ATC

TCC

AGA

912

Asp

Leu

Val 570

Ala

Ser

Val

Ser

Asp 575

Ala

Gin

Leu

Ala

Ile 580

Ser

Arg

TTG

GAA

AGC

TCT

ATC

GGA

GCC

CTC

CAA

ACA

GTT

GTC

AAT

GGA

CTT

GAT

960

Leu

Glu

Ser 585

Ser

Ile

Gly

Ala

Leu 590

Gin

Thr

Val

Asn 595

Gly

Leu

Asp

TCG

AGT

GTT

ACC

CAG

TTG

GGT

GCT

CGA

GTG

GGA

CAA

CTT

GAG

ACA

GGA

1008

Ser

Val

Thr

Gin

Leu

Gly

Ala

Arg

Val

Gly

Gin

Leu

Glu

Thr

Gly

600 605 610 ·· «0 • · · · • · · ·

0 · · · • * 0 · »0 00

CTT GCA Leu Ala 615

GAC Asp

GTA CGC GTT Val Arg Val 620

GAT CAC GAC

AAT CTC GTT GCG AGA GTG

GAT Asp 630

1056

Asp

His

Asp

Asn

Letr 625

Val

Ala

Arg

Val

ACT

GCA

GAA

CGT

AAC

ATT

GGA

TCA

TTG

ACC

ACT

GAG

CTA

TCA

ACT

CTG

1104

Thr

Ala

Glu

Arg

Asn

Ile

Gly

Ser

Leu

Thr

Glu

Leu

Ser

Thr

Leu

635

640

645

ACG

TTA

CGA

GTA

ACA

TCC

ATA

CAA

GCG

GAT

TTC

GAA

TCT

AGG

ACT

AGT

1152

Thr

Leu

Arg

Val

Thr

Ser

Ile

Gin

Ala

Asp

Phe

Glu

Ser

Arg

Thr

Ser

650

655

660

ATG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAC

TAT

AAA

GAT

GAC

GAT

AAG

TGA

1194

Met

Gin

Ala

Asp

Tyr

Lys

Asp

Lys

665 670 Informace o SEQ ID NO: 9:	675
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 1743 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá
(íí: (ix)	) DRUH MOLEKULY: DNA ( ZNAKY: (A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..1743	genomová)
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 9:

ATG AAG

CGC GCA AGA CCG TCT GAA GAT ACC

TTC AAC CCC GTG TAT CCA

48

Met 1

Lys

Arg Ala

Arg 5

Pro

Ser

Glu

Asp

Thr 10

Phe

Asn

Pro

Val

Tyr 15

Pro

TAT

GAC

ACG

GAA

ACC

GGT

CCT

CCA

ACT

GTG

CCT

TTT

CTT

ACT

CCT

CCC

96

Tyr

Asp

Thr

Glu

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Phe

Leu

Thr

Pro

20

25

30

TTT

GTA

TCC

CCC

AAT

GGG

TTT

CAA

GAG

AGT

CCC

CCT

GGG

GTA

CTC

TCT

144

Phe

Val

Ser

Pro

Asn

Gly

Phe

Gin

Glu

Ser

Pro

Gly

Val

Leu

Ser

35

40

45

TTG

CGC

CTA

TCC

GAA

CCT

CTA

GTT

ACC

TCC

AAT

GGC

ATG

CTT

GCG

CTC

192

Leu

Arg

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Val

Thr

Ser

Asn

Gly

Met

Leu

Ala

Leu

50

55

60

AAA

ATG

GGC

AAC

GGC

CTC

TCT

CTG

GAC

GAG

GCC

GGC

AAC

CTT

ACC

TCC

240

Lys

Met

Gly

Asn

Gly

Leu

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Asn

Leu

Thr

Ser

65

70

75

80

CAA

^AT

GTA

ACC

ACT

GTG

AGC

CCA

CCT

CTC

AAA

ACC

AAG

TCA

AAC

288

Gin

Asn

Val

Thr

Val

Ser

Pro

Leu

Lys

Thr

Lys

Ser

Asn

85

90

95

ATA

AAC

CTG

GAA

ATA

TCT

GCA

CCC

CTC

ACA

GTT

ACC

TCA

GAA

GCC

CTA

336

Ile

Asn

Leu

Glu

Ile

Ser

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

Thr

Ser

Glu

Ala

Leu

100

105

110

ACT

GTG

GCT

GCC

GCA

CCT

CTA

ATG

GTC

GCG

GGC

AAC

ACA

CTC

ACC

384

Thr

Val

Ala

Pro

Leu

Met

Val

Ala

Gly

Asn

Thr

Leu

Thr

115

120

125

ATG

CAA

TCA

CAG

GCC

CCG

CTA

ACC

GTG

CAC

GAC

TCC

AAA

CTT

AGC

ATT

432

Met

Gin

Ser

Gin

Ala

Pro

Leu

Thr

Val

His

Asp

Ser

Lys

Leu

Ser

Ile

·· ·· e · • · • · • · ·· ·· ·· · Λ · · • · · · · • ··· · · · • · · · ··· ·· ·· • · • · >·· ·· • * *·

130

135

140

GCC

ACC

CAA

GGA

CCC

CTC

ACA

GTG

TCA

GAA

GGA

AAG

CTA

GCC

CTG

CAA

Ala 145

Thr

Gin

Gly

Pro

Leu 150

Thr

Val

Ser

Glu

Gly 155

Lys

Leu

Ala

Leu

Gin 160

ACA

TCA

GGC

CCC

CTC

ACC

GAT

AGC

AGT

ACC

CTT

ACT

ATC

ACT

Thr

Ser

Gly

Pro

Leu 165

Thr

Asp

Ser 170

Ser

Thr

Leu

Thr

Ile 175

Thr

GCC

TCA

CCC

CCT

CTA

ACT

GCC

ACT

GGT

AGC

TTG

GGC

ATT

GAC

TTG

Ala

Ser

Pro

Pro 180

Leu

Thr

Ala

Thr 185

Gly

Ser

Leu

Gly

Ile 190

Asp

Leu

AAA

GAG

CCC

ATT

TAT

ACA

CAA

AAT

GGA

AAA

CTA

GGA

CTA

AAG

TAC

GGG

Lys

Glu

Pro 195

Ile

Tyr

Thr

Gin

Asn 200

Gly

Lys

Leu

Gly

Leu 205

Lys

Tyr

Gly

GCT

CCT

TTG

CAT

GTA

ACA

GAC

CTA

AAC

ACT

TTG

ACC

GTA

GCA

ACT

Ala

Pro 210

Leu

His

Val

Thr

Asp 215

Asp

Leu

Asn

Thr

Leu 220

Thr

Val

Ala

Thr

GGT

CCA

GGT

GTG

ACT

ATT

AAT

ACT

TCC

TTG

CAA

ACT

AAA

GTT

ACT

Gly 225

Pro

Gly

Val

Thr

Ile 230

Asn

Thr

Ser

Leu 235

Gin

Thr

Lys

Val

Thr 240

GGA

GCC

TTG

GGT

TTT

GAT

TCA

CAA

GGC

AAT

ATG

CAA

CTT

AAT

GTA

GCA

Gly

Ala

Leu

Gly

Phe 245

Asp

Ser

Gin

Gly

Asn 250

Met

Gin

Leu

Asn

Val 255

Ala

GGA

CTA

AGG

ATT

GAT

TCT

CAA

AAC

AGA

CGC

CTT

ATA

CTT

GAT

GTT

Gly

Leu

Arg 260

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn 265

Arg

Leu

Ile

Leu 270

Asp

Val

AGT

TAT

CCG

TTT

GAT

GCT

CAA

AAC

CAA

CTA

AAT

CTA

AGA

CTA

GGA

CAG

Ser

Tyr

Pro 275

Phe

Asp

Ala

Gin

Asn 280

Gin

Leu

Asn

Leu

Arg 285

Leu

Gly

Gin

GGC

CCT

CTT

TTT

ATA

AAC

TCA

GCC

CAC

AAC

TTG

GAT

ATT

AAC

TAC

AAC

Gly

Pro 290

Leu

Phe

Ile

Asn

Ser 295

Ala

His

Asn

Leu

Asp 300

Ile

Asn

Tyr

Asn

AAA

GGC

CTT

TAC

TTG

TTT

ACA

GCT

TCA

AAC

AAT

TCC

AAA

AAG

CTT

GAG

Lys 305

Gly

Leu

Tyr

Leu

Phe 310

Thr

Ala

Ser

Asn

Asn 315

Ser

Lys

Leu

Glu 320

GTT

AAC

CTA

AGC

ACT

GCC

AAG

GGG

TTG

ATG

TTT

GAC

GCT

ACA

GCC

ATA

Val

Asn

Leu

Ser

Thr 325

Ala

Lys

Gly

Leu

Met 330

Phe

Asp

Ala

Thr

Ala 335

Ile

GCC

ATT

AAT

GCA

GGA

GAT

GGG

CTT

GAA

TTT

GGT

TCA

CCT

AAT

GCA

CCA

Ala

Ile

Asn

Ala 340

Gly

Asp

Gly

Leu

Glu 345

Phe

Gly

Ser

Pro

Asn 350

Ala

Pro

AAC

ACA

AAT

CCC

CTC

AAA

ACA

AAA

ATT

GGC

CAT

GGC

CTA

GAA

TTT

GAT

Asn

Thr

Asn 355

Pro

Leu

Lys

Thr

Lys 360

Ile

Gly

His

Gly

Leu 365

Glu

Phe

Asp

TCA

AAC

AAG

GCT

ATG

GTT

CCT

AAA

CTA

GGA

ACT

GGC

CTT

AGT

TTT

GAC

Ser

Asn 370

Lys

Ala

Met

Val

Pro 375

Lys

Leu

Gly

Thr

Gly 380

Leu

Ser

Phe

Asp

AGC

ACA

GGT

GCC

ATT

ACA

GTA

GGA

AAC

AAA

AAT

GAT

AAG

CTA

ACT

Ser

Thr

Gly

Ala

Ile

Thr

Val

Gly

Asn

Lys

Asn

Asp

Lys

Leu

Thr

385

390

395

400

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200 ·

0·

W 0

TTG TGG ACC ACA CCA GCT CCA TCT

CCT AAC TGT AGA CTA AAT

GCA Ala 415

GAG Glu

1248

Leu

Trp

Thr

Pro Ala 405

Pro

Ser

Pro Asn 410

Cys

Arg

Leu

Asn

AAA

GAT

GCT

AAA

CTC

ACT

TTG

GTC

TTA

ACA

AAA

TGT

GGC

AGT

CAA

ATA

1296

Lys

Asp

Ala

Lys

Leu

Thr

Leu

Val

Leu

Thr

Lys

Cys

Gly

Ser

Gin

Ile

420

425

430

CTT

GCT

ACA

GTT

TCA

GTT

TTG

GCT

GTT

AAA

GGC

AGT

TTG

GCT

CCA

ATA

1344

Leu

Ala

Thr

Val

Ser

Val

Leu

Ala

Val

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Pro

Ile

435

440

445

TCT

GGA

ACA

GTT

CAA

AGT

GCT

CAT

CTT

ATT

ATA

AGA

TTT

GAC

GAA

AAT

1392

Ser

Gly

Thr

Val

Gin

Ser

Ala

His

Leu

Ile

Arg

Phe

Asp

Glu

Asn

450

455

460

GGA

GTG

CTA

AAC

AAT

TCC

TTC

CTG

GAC

CCA

GAA

TAT

TGG

AAC

TTT

1440

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Phe

Leu

Asp

Pro

Glu

Tyr

Trp

Asn

Phe

465

470

475

480

AGA

AAT

GGA

GAT

CTT

ACT

GAA

GGC'

ACA

GCC

TAT

ACA

AAC

GCT

GTT

GGA

1488

Arg

Asn

Gly

Asp

Leu

Thr

Glu

Gly

Thr

Ala

Tyr

Thr

Asn

Ala

Val

Gly

485

4 90

495

TTT

ATG

CCT

AAC

CTA

TCA

GCT

TAT

CCA

AAA

TCT

CAC

GGT

AAA

ACT

GCC

1536

Phe

Met

Pro

Asn

Leu

Ser

Ala

Tyr

Pro

Lys

Ser

His

Gly

Lys

Thr

Ala

500

505

510

AAA

AGT

AAC

ATT

GTC

AGT

CAA

GTT

TAC

TTA

AAC

GGA

GAC

AAA

ACT

AAA

1584

Lys

Ser

Asn

Ile

Val

Ser

Gin

Val

Tyr

Leu

Asn

Gly

Asp

Lys

Thr

Lys

51 f

b

520

525

CCT

GTA

ACA

CTA

ACC

ATT

ACA

CTA

AAC

GGT

ACA

CAG

GAA

ACA

GGA

GAC

1632

Pro

Val

Thr

Leu

Thr’

Ile

Thr

Leu

Asn

Gly

Thr

Gin

Glu

Thr

Gly Asp

530

535

540

ACA

ACT

CCA

AGT

GCA

TAC

TCT

ATG

TCA

TTT

TCA

TGG

GAC

TGG

TCT

GGC

1680

Thr

Pro

Ser

Ala

Tyr

Ser

Met

Ser

Phe

Ser

Trp

Asp

Trp

Ser

Gly

545

550

555

560

CAC

AAC

TAC

ATT

AAT

GAA

ATA

TTT

GCC

ACA

TCC

TCT

TAC

ACT

TTT

TCA

1728

His

Asn

Tyr

Ile

Asn

Glu

Ile

Phe

Ala

Thr

Ser

Tyr

Thr

Phe

Ser

565

570

575

TAC

ATT

GCC

CAA

GAA

1743

	Tyr Ile	Ala Gin 580	Glu
	(2) Informace o	SEQ ID NO: 10:
t	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 36 párů baží
J		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové
		(D)	TOPOLOGIE: neznámá
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
	(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 10:

TGCATGCATA CTAGTCCTAG ATTCGAAATC CGCTTG ·· w

• · · • · • * ·· « (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 38 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořet
	(D)	TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

GCTCTAGAGG AGGTGGTGCA TCAAGGGTCT CGGCGCTC (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 29 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetěz
	(D)	TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA (genomová)
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 12

CCGGATCCCT ACAGTATCTG AGGGTAAAC (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 31 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: neznámá
(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA (genomová)
Xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 13:

GGGCACCATG GCGAAGATGG AGCTTTGTCC C (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser 15 10

(2)	Informace o SEQ ID NO: 15:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní
	(ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
	(ii)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
Arg	Lys Lys	Lys Arg Lys Lys Lys
1		5
(2)	Informace o SEQ ID NO: 16:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní
	(ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
Asp	Tyr Lys	Asp Asp Asp Asp Lys

5 • ·· (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 14 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: není relevantní
ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Pro Lys Ala Arg Arg Pro Ala Gly Arg Thr Trp Ala Gin Pro 15 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 15 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: není relevantní
	(D)	TOPOLOGIE: není relevantní
(ii)	DRUH	MOLEKULY: peptid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Arg Pro Ile Asp Asp Phe Asp Gin Gly Trp Gly Pro Ile Thr

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY (změněné)

99« 9 · · · • 9 · ·

9 9 9 ·· ··* fW^-yuj

1. Trimer obsahující tři monomery, kdy každý z uvedených monomerů má N-konec proteinu adenovirového vlákna a . každý z uvedených monomerů má trimerizační oblast obsahující uzlinu adenovirového vlákna, které chybí přirozená aminokyselina vázající substrát, a dále má nepřirozenou aminokyselinu, která se liší od přirozené aminokyseliny nábojem nebo molekulovou hmotností.
2. Trimer podle nároku 1, kde uvedená přirozená aminokyselina je nahrazena nepřirozenou aminokyselinou.
3. Trimer podle nároku 1 nebo 2, kde uvedená přirozená aminokyselina vázající substrát je v β-listu.
4. Trimer podle nároku 1 nebo 2, kde uvedená přirozená aminokyselina vázající substrát je ve smyčce, která spojuje dva β-listy.
5. Trimer obsahující tři monomery, kdy každý z uvedených monomerů má N-konec proteinu adenovirového vlákna a každý z uvedených monomerů má trimerizační oblast z pstruhového axonálního dyneinu, hemaglutaninu viru parainfluenzy nebo proteinu sigma-1 reoviru.
6. Trimer obsahující tři monomery, kde každý z uvedených monomerů má N-konec proteinu adenovirového vlákna a každý , z uvedených monomerů má trimerizační oblast obsahující upravený motiv leucinového zipu.

j·
7. Trimer podle nároku 6, kde uvedený motiv leucinového zipu je upraven nahrazením jednoho nebo více leucinových zbytků izoleucinem.
8. Trimer podle nároku 6 nebo 7, kde uvedená trimerizační oblast je získána z kvasinkového trimeru GCN4p-II.
9. Trimer podle libovolného z nároků 1 až 8, který není ligandem pro přirozená vazebná místa na povrchu savčí buňky.

I · ·4
10. Trimer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde alespoň jeden ze tří uvedených monomerů obsahuje nepřirozený polypeptid, který interferuje s navázáním uvedeného trimerů na jeho přirozené vazebné místo na povrchu buňky.
11. Kompozice látky, vyznačující se tím, že obsahuje trimer podle libovolného z nároků 1 až 10 a adenovirovou pentonovou bázi.
12. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená pentonová báze obsahuje nepřirozený ligand.
13. Adenovirus, obsahující trimer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
14. Adenovirus podle nároku 13, který neinfikuje produktivně buňky 293.
15. Adenovirus podle nároku 13 nebo 14, obsahující ligand, který nepochází z adenoviru.
16. Adenovirus podle nároku 15, kde uvedený ligand se váže na jiný substrát, než je přirozený savčí adenovirový receptor.
17. Adenovirus podle nároku 15 nebo 16, kde uvedený ligand se váže na jiný substrát než je přirozený buněčný povrchový protein.
18. Adenovirus podle nároku 16 nebo 17, kde uvedený substrát je přítomen na povrchu buňky.
19. Adenovirus podle nároku 16 nebo 17, kde uvedený substrát je přítomen v afinitní koloně.
20. Adenovirus podle nároku 16 nebo 17, kde uvedený substrát je přítomen na molekule vznikající v krvi.
21. Buněčná linie exprimující nepřirozený buněčný povrchový receptor, na který se váže adenovirus, který má ligand pro uvedený receptor, kde uvedeným receptorem je molekula protilátek.
22. Buněčná linie podle nároku 21, kde uvedená molekula protilátek obsahuje jednořetězcové protilátky.

• ·
23. Buněčná linie podle nároku 21 nebo 22, kde uvedená molekula protilátek rozeznává hemaglutinin.
24. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23, která může podporovat růst viru při alespoň 10 pasážích.
25. Způsob množení adenoviru, vyznačuj ící se tím, že obsahuje infekci buněčné linie podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24 adenovirem, udržení uvedené buněčné linie a získání adenovirů produkovaných uvedenou buněčnou linií.