JP2001518283A - ブドウ球菌株の同定のための遺伝子配列、診断及び／又は定量法及び装置 - Google Patents
ブドウ球菌株の同定のための遺伝子配列、診断及び／又は定量法及び装置Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はブドウ球菌属の細菌の特異的同定のためのオリゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が図の「コンセンサス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）又はその相補的鎖から得られる１５〜３５０塩基対、好ましくは１５〜４５塩基対を有するオリゴヌクレオチドに関する。本発明は前記オリゴヌクレオチドを用いた様々な型のブドウ球菌属の細菌の株の同定方法及び診断装置にも関する。
Description
【０００１】発明の属する分野 本発明は様々なタイプのブドウ球菌株の同定のための新規遺伝子配列、前記配
列を用いた診断及び／又は定量法及び装置並びに前記遺伝子配列の治療上の側面
に関する。
列を用いた診断及び／又は定量法及び装置並びに前記遺伝子配列の治療上の側面
に関する。
【０００２】発明の背景 多耐性細菌（ヴァンコマイシンの如き抗生物質に対してさえも耐性のある細菌
）による疾病感染の確率の増加は世界中の関心の的である。メチシリン耐性であ
りかつコアグラーゼ(coagulase)陰性であるブドウ球菌属の細菌（ＭＲ−ＣＮＳ ）及びスタフィロコックス・アウレウス(Staphylococcus aureus)（ＭＲＳＡ） はβ−ラクタム系抗生物質すべてに対して高レベルの交差耐性を示す(Ryffel等
(1990)、Refsahl等 (1992)）。それらはmecA遺伝子によってコードされている付
加的な低親和性ペニシリン結合タンパク質ＰＢＰ２ａ（ＰＢＰ２′）を持つ。me
cA決定基はすべての多耐性ブドウ球菌属の細菌において見出されており（Chackb
art等 (1989)、Suzuki等 (1992)、Vannuffel等 (1995)）、様々な種において高 度に保存されている（Ryffel等 (1990)）。
）による疾病感染の確率の増加は世界中の関心の的である。メチシリン耐性であ
りかつコアグラーゼ(coagulase)陰性であるブドウ球菌属の細菌（ＭＲ−ＣＮＳ ）及びスタフィロコックス・アウレウス(Staphylococcus aureus)（ＭＲＳＡ） はβ−ラクタム系抗生物質すべてに対して高レベルの交差耐性を示す(Ryffel等
(1990)、Refsahl等 (1992)）。それらはmecA遺伝子によってコードされている付
加的な低親和性ペニシリン結合タンパク質ＰＢＰ２ａ（ＰＢＰ２′）を持つ。me
cA決定基はすべての多耐性ブドウ球菌属の細菌において見出されており（Chackb
art等 (1989)、Suzuki等 (1992)、Vannuffel等 (1995)）、様々な種において高 度に保存されている（Ryffel等 (1990)）。
【０００３】 トランスポゾン不活性化がβ−ラクタム耐性のレベルを減少させるいくつかの
他の染色体部位がエス・アウレウス(S. aureus)（ＳＡ）において同定されてい る（Hiramatsu (1992)、Berger-Baechi等 (1992)、de Lancastre等 (1994)）。 ＰＢＰ２ａの量以外のこれらの調節遺伝子の好適な機能発揮は最小阻害濃度値及
びブドウ球菌属の細菌の単離物の耐性の均一な発現を決定する（Ryffel等 (1994
)、de Lancastre等 (1994)）。
他の染色体部位がエス・アウレウス(S. aureus)（ＳＡ）において同定されてい る（Hiramatsu (1992)、Berger-Baechi等 (1992)、de Lancastre等 (1994)）。 ＰＢＰ２ａの量以外のこれらの調節遺伝子の好適な機能発揮は最小阻害濃度値及
びブドウ球菌属の細菌の単離物の耐性の均一な発現を決定する（Ryffel等 (1994
)、de Lancastre等 (1994)）。
【０００４】 エス・アウレウスにおいて最初に同定されたfemA-femBオペロンはメチシリン 耐性に必須の遺伝因子の一つである（Berger-Baechi等 (1989)）。それはＳＡペ
プチドグリカンの特異的ペンタグリシン側鎖の形成に関与している（Stranden等
(1997)）。他の調節遺伝子とは異なり、femAはＭＲＳＡの臨床上の単離物中で 強い保存時間を維持することが示されており、このことは細胞壁代謝及びメチシ
リン耐性におけるその重要な役割を確認させる（Hurlimann-Dalel等 (1992)）。
mecAとは対照的にfemA-femBは耐性ＳＡ株のゲノム中及び感受性ＳＡ株のゲノム 中の両方に存在する（Unal等 (1992)、Vannuffel等 (1995)）。
プチドグリカンの特異的ペンタグリシン側鎖の形成に関与している（Stranden等
(1997)）。他の調節遺伝子とは異なり、femAはＭＲＳＡの臨床上の単離物中で 強い保存時間を維持することが示されており、このことは細胞壁代謝及びメチシ
リン耐性におけるその重要な役割を確認させる（Hurlimann-Dalel等 (1992)）。
mecAとは対照的にfemA-femBは耐性ＳＡ株のゲノム中及び感受性ＳＡ株のゲノム 中の両方に存在する（Unal等 (1992)、Vannuffel等 (1995)）。
【０００５】 ブドウ球菌属の細菌の同定はエス・アウレウスについての迅速スクリーニング
試験にしばしば限定され、エス・アウレウスではない単離物はコアグラーゼ陰性
のブドウ球菌属の細菌として単純に報告される。実際にはこれらの細菌単離物は
様々の種及び多くの異なる株のものを含む（Kleeman等 (1993)）。これらの細菌
の獲得及び伝播に関する疫学的情報はほとんどない。この潜在的理由は種を同定
して臨床上の適時な情報を提供する容易かつ正確な方法がないためである。
試験にしばしば限定され、エス・アウレウスではない単離物はコアグラーゼ陰性
のブドウ球菌属の細菌として単純に報告される。実際にはこれらの細菌単離物は
様々の種及び多くの異なる株のものを含む（Kleeman等 (1993)）。これらの細菌
の獲得及び伝播に関する疫学的情報はほとんどない。この潜在的理由は種を同定
して臨床上の適時な情報を提供する容易かつ正確な方法がないためである。
【０００６】 ＳＡ中のfemAを検出するために設計されたいくつかの分子アッセイはコアグラ
ーゼ陰性のブドウ球菌属の細菌中の相同配列を増幅することに失敗している（Ki
zaki等 (1994)、Vannuffel等 (1995)）。それにもかかわらず、低厳密異種ハイ ブリダイゼーション分析(low-stringency heterologous hybridisation analysi
s)はかかる構造的に関連した遺伝子がエス・エピデルミディス（S. epidermidis
）（ＳＥ）中に存在することを示唆する（Unal等 (1992)）。
ーゼ陰性のブドウ球菌属の細菌中の相同配列を増幅することに失敗している（Ki
zaki等 (1994)、Vannuffel等 (1995)）。それにもかかわらず、低厳密異種ハイ ブリダイゼーション分析(low-stringency heterologous hybridisation analysi
s)はかかる構造的に関連した遺伝子がエス・エピデルミディス（S. epidermidis
）（ＳＥ）中に存在することを示唆する（Unal等 (1992)）。
【０００７】 これらのデータに続いてエス・エピデルミディス中のfemA及びfemBオープンリ
ーディングフレームの完全な同定及び配列分析が行われた（Alborn等 (1996)） 。それ故、これらの遺伝子が種内及び種間で関連していること及び遺伝子構造が
保存されていることは祖先生物におけるこれらの遺伝子の一つが遺伝子重複を起
こしたこと及びすべてのブドウ球菌属の細菌においてfemAが系統発生的に保存さ
れている可能性があることと矛盾しない（Alborn等 (1996)）。
ーディングフレームの完全な同定及び配列分析が行われた（Alborn等 (1996)） 。それ故、これらの遺伝子が種内及び種間で関連していること及び遺伝子構造が
保存されていることは祖先生物におけるこれらの遺伝子の一つが遺伝子重複を起
こしたこと及びすべてのブドウ球菌属の細菌においてfemAが系統発生的に保存さ
れている可能性があることと矛盾しない（Alborn等 (1996)）。
【０００８】 エス・エピデルミディスのfemA遺伝子の完全な遺伝子配列、femA遺伝子によっ
てコードされるタンパク質（FemA）及びFemAタンパク質をコードする遺伝子を含
むベクター及び微生物は米国特許５５８７３０７に記載されている。
てコードされるタンパク質（FemA）及びFemAタンパク質をコードする遺伝子を含
むベクター及び微生物は米国特許５５８７３０７に記載されている。
【０００９】発明の目的 本発明はブドウ球菌株のfemA様決定基を通した様々なタイプのブドウ球菌株の
同定及び／又は定量の改良のための新規遺伝子配列、方法及び装置を提供するこ
とを目的とする。これらは迅速なスクリーニングによってこれらの菌株の疫学的
研究を可能にする。
同定及び／又は定量の改良のための新規遺伝子配列、方法及び装置を提供するこ
とを目的とする。これらは迅速なスクリーニングによってこれらの菌株の疫学的
研究を可能にする。
【００１０】 本発明の別の目的は既知の又は未知のブドウ球菌属の細菌又は他のグラム陽性
細菌株中に存在するかもしれない同様の遺伝子配列を同定することである。
細菌株中に存在するかもしれない同様の遺伝子配列を同定することである。
【００１１】 本発明の最後の目的は所望の治療上の適用のため、ブドウ球菌属の細菌のfemA
タンパク質をコードする新規配列、それらのfemAタンパク質、前記ヌクレオチド
配列を含むベクター、および前記ベクターによって形質転換された細胞を提供す
ることである。
タンパク質をコードする新規配列、それらのfemAタンパク質、前記ヌクレオチド
配列を含むベクター、および前記ベクターによって形質転換された細胞を提供す
ることである。
【００１２】発明の概要 本発明者はスタフィロコックス・ホミニス(Staphylococcus hominis)、スタフ
ィロコックス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)及びスタフ
ィロコックス・ハエモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)の新規株から 新規ＤＮＡ及びアミノ酸配列を同定した。前記新規ヌクレオチド配列は以前記述
されているブドウ球菌属の細菌（エス・アウレウス、エス・エピデルミディス及
びエス・サプロフィティクス（S. saprophyticus））からのfemA遺伝子とこれら
の新規配列とのアラインメントを可能とする。２以上の、好ましくは４以上の配
列のアラインメントによって本発明者は様々なブドウ球菌属の細菌の分子的遺伝
子型分類に有用なコンセンサスfemA配列を初めて同定した（つまり、以前はブド
ウ球菌株のfemA配列はほんのわずかしか知られていなかったのでコンセンサスfe
mA配列の同定は不可能であった）。
ィロコックス・サプロフィティクス(Staphylococcus saprophyticus)及びスタフ
ィロコックス・ハエモリティクス(Staphylococcus haemolyticus)の新規株から 新規ＤＮＡ及びアミノ酸配列を同定した。前記新規ヌクレオチド配列は以前記述
されているブドウ球菌属の細菌（エス・アウレウス、エス・エピデルミディス及
びエス・サプロフィティクス（S. saprophyticus））からのfemA遺伝子とこれら
の新規配列とのアラインメントを可能とする。２以上の、好ましくは４以上の配
列のアラインメントによって本発明者は様々なブドウ球菌属の細菌の分子的遺伝
子型分類に有用なコンセンサスfemA配列を初めて同定した（つまり、以前はブド
ウ球菌株のfemA配列はほんのわずかしか知られていなかったのでコンセンサスfe
mA配列の同定は不可能であった）。
【００１３】 かくして本発明の第一の側面は添付の図３に示されるような「コンセンサス(c
onsensus)」ヌクレオチド配列に関する。前記「コンセンサス」ヌクレオチド配 列を用いて本発明者は既知の又は未知のブドウ球菌属の細菌に特異的な様々なfe
mA配列の遺伝子増幅、同定及び／又は定量に用いることができるオリゴヌクレオ
チド（プライマー又はプローブの如き）を提供することができた。
onsensus)」ヌクレオチド配列に関する。前記「コンセンサス」ヌクレオチド配 列を用いて本発明者は既知の又は未知のブドウ球菌属の細菌に特異的な様々なfe
mA配列の遺伝子増幅、同定及び／又は定量に用いることができるオリゴヌクレオ
チド（プライマー又はプローブの如き）を提供することができた。
【００１４】 femA配列はペプチドグリカンのグリシン含有架橋の生合成に関与していること
が知られており、ペプチドグリカン構造は様々なブドウ球菌属の細菌の間で、及
びたぶん他のグラム陽性細菌の間でも良く保存されていることが知られている。
が知られており、ペプチドグリカン構造は様々なブドウ球菌属の細菌の間で、及
びたぶん他のグラム陽性細菌の間でも良く保存されていることが知られている。
【００１５】 従って他のブドウ球菌属の細菌及びおそらく他のグラム陽性細菌を分子的に遺
伝子型分類するために、新規「コンセンサス」femA配列、及び図３に示されてい
る配列のアラインメントから推定される前記新規オリゴヌクレオチドを用いるこ
とも可能である。femA配列はfemB配列に類似していることも知られている。従っ
てこれらのオリゴヌクレオチドは様々なブドウ球菌属の細菌および他のグラム陽
性細菌のfemB遺伝子を分子的に遺伝子型分類するためにも用いることができるで
あろう。
伝子型分類するために、新規「コンセンサス」femA配列、及び図３に示されてい
る配列のアラインメントから推定される前記新規オリゴヌクレオチドを用いるこ
とも可能である。femA配列はfemB配列に類似していることも知られている。従っ
てこれらのオリゴヌクレオチドは様々なブドウ球菌属の細菌および他のグラム陽
性細菌のfemB遺伝子を分子的に遺伝子型分類するためにも用いることができるで
あろう。
【００１６】 本発明の他の側面は以下の株から単離された新規femAヌクレオチド配列の可能
な治療上の利用に関する：図６−１３に示された遺伝子配列、それらの相補的鎖
及びそれらの機能的変異体と８５％以上、好ましくは９０％以上又は１００％の
相同性を示すヌクレオチド又はアミノ酸配列を持つエス・ホミニス(S. hominis)
、エス・サプロフィティクス(S. saprophyticus)、エス・ハエモリティクス(S.
haemolyticus)、エス・ルグドゥネンシス(S. lugdunensis)、エス・キシロスス(
S. xylosus)、エス・キャピティス(S. capitis)、エス・シレイフェリ(S. schle
iferi)及びエス・スキウリ(S. sciuri)。前記アミノ酸配列の機能的変異体は主 要アミノ酸配列に一以上の改変を含み、完全及び野生型femA分子の活性を保持し
ているペプチドである。ペプチドの変異体は上記配列とは異なるヌクレオチド配
列によって、それらの遺伝子コードの縮重によって、又は前記配列又はそれらの
相補的鎖に好ましくはSambrook等、§§９．４７−９．５１ in Molecular Clon
ing：A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York (1989)に記述されているような厳密条件下でハイブリダイ
ズする配列によって得られる。
な治療上の利用に関する：図６−１３に示された遺伝子配列、それらの相補的鎖
及びそれらの機能的変異体と８５％以上、好ましくは９０％以上又は１００％の
相同性を示すヌクレオチド又はアミノ酸配列を持つエス・ホミニス(S. hominis)
、エス・サプロフィティクス(S. saprophyticus)、エス・ハエモリティクス(S.
haemolyticus)、エス・ルグドゥネンシス(S. lugdunensis)、エス・キシロスス(
S. xylosus)、エス・キャピティス(S. capitis)、エス・シレイフェリ(S. schle
iferi)及びエス・スキウリ(S. sciuri)。前記アミノ酸配列の機能的変異体は主 要アミノ酸配列に一以上の改変を含み、完全及び野生型femA分子の活性を保持し
ているペプチドである。ペプチドの変異体は上記配列とは異なるヌクレオチド配
列によって、それらの遺伝子コードの縮重によって、又は前記配列又はそれらの
相補的鎖に好ましくはSambrook等、§§９．４７−９．５１ in Molecular Clon
ing：A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York (1989)に記述されているような厳密条件下でハイブリダイ
ズする配列によって得られる。
【００１７】 本発明の更なる側面は、所望により細胞中で活性の一以上の調節配列又はマー
カー（抗生物質に対する耐性、酵素コード配列．．．）に結合された前記ヌクレ
オチド配列及びそられの相補的鎖又は対応するＲＮＡ配列を含む組み換えベクタ
ー（即ち、異なる遺伝的環境中に移送するため及びファージミド、ウイルス、プ
ラスミド、陽イオン性小胞、リポソーム等の如き宿主細胞中で発現させるために
本発明の配列が挿入されていてもよい構築物）に関する。
カー（抗生物質に対する耐性、酵素コード配列．．．）に結合された前記ヌクレ
オチド配列及びそられの相補的鎖又は対応するＲＮＡ配列を含む組み換えベクタ
ー（即ち、異なる遺伝的環境中に移送するため及びファージミド、ウイルス、プ
ラスミド、陽イオン性小胞、リポソーム等の如き宿主細胞中で発現させるために
本発明の配列が挿入されていてもよい構築物）に関する。
【００１８】 同様に本発明による核酸配列はBrown等によって記述されているような当業者 には周知の合成方法によって（“Method of Enzymology”，Acad. Press, New-Y
ork, No. 68 pp. 109-151 (1979)）、又は応用バイオシステムモデル３８０Ａ又
は３８０Ｂ ＤＮＡ合成機の如き従来のＤＮＡ合成装置によって得ることができ
る。
ork, No. 68 pp. 109-151 (1979)）、又は応用バイオシステムモデル３８０Ａ又
は３８０Ｂ ＤＮＡ合成機の如き従来のＤＮＡ合成装置によって得ることができ
る。
【００１９】 本発明の他の側面は前記ベクターによって形質転換された組み換え宿主（原核
）細胞及び所望によりＢＳＡの如き担体分子に結合され、前記細胞によって得ら
れる前記核酸配列によってコードされる精製（所望により組み換えられた）タン
パク質又はペプチドに関する。前記組み換えタンパク質又はペプチドは遺伝子工
学によって得られるか又は合成によって得られ（米国特許５５８７３０７参照。
この文献は参考文献としてここに組み入れる）、Nachman等（Regul. Pept. Vol.
57, pp. 359-370 (1995)）によって記述されているようなそれらの安定性（プ ロテアーゼによる加水分解に対する耐性など）を増大させる残基を含んでいても
よい。
）細胞及び所望によりＢＳＡの如き担体分子に結合され、前記細胞によって得ら
れる前記核酸配列によってコードされる精製（所望により組み換えられた）タン
パク質又はペプチドに関する。前記組み換えタンパク質又はペプチドは遺伝子工
学によって得られるか又は合成によって得られ（米国特許５５８７３０７参照。
この文献は参考文献としてここに組み入れる）、Nachman等（Regul. Pept. Vol.
57, pp. 359-370 (1995)）によって記述されているようなそれらの安定性（プ ロテアーゼによる加水分解に対する耐性など）を増大させる残基を含んでいても
よい。
【００２０】 イー・コリ（E. coli）宿主細胞中での発現のために好ましいベクターはイー ・コリプラスミドpET-11A由来であり、これはNovagen Inc.から入手することが できる（カタログＮｏ．６９４３６−Ａ）。上述のベクターで用いた形質転換法
は米国特許５５８７３０７に記述されている。
は米国特許５５８７３０７に記述されている。
【００２１】 本発明の更なる側面は前記タンパク質、ペプチド又は核酸分子に対して指向さ
れた阻害剤（（抗生物質の添加によって）抗生物質耐性細菌を所望により処理す
るために用いられる）に関する。有利には前記阻害剤は抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体又はリボザイムの如きアンチセンスヌクレオチド分子であり、これ
らは前記femAヌクレオチド配列の発現を阻害するためにベクター内に存在するこ
とができる。
れた阻害剤（（抗生物質の添加によって）抗生物質耐性細菌を所望により処理す
るために用いられる）に関する。有利には前記阻害剤は抗体、好ましくはモノク
ローナル抗体又はリボザイムの如きアンチセンスヌクレオチド分子であり、これ
らは前記femAヌクレオチド配列の発現を阻害するためにベクター内に存在するこ
とができる。
【００２２】 本発明の最後の側面はヒトを含む動物におけるブドウ球菌属の細菌の感染に対
する医薬組成物、好ましくはワクチンに関し、前記組成物は医薬的に許容可能な
担体および前記核酸分子、ベクター、前記ベクターによって形質転換された組み
換え宿主細胞、阻害剤（前記タンパク質、ペプチド又は核酸分子に対して指向さ
れた）及びそれらの混合物からなる群から選択される十分な量の活性化合物を含
む。
する医薬組成物、好ましくはワクチンに関し、前記組成物は医薬的に許容可能な
担体および前記核酸分子、ベクター、前記ベクターによって形質転換された組み
換え宿主細胞、阻害剤（前記タンパク質、ペプチド又は核酸分子に対して指向さ
れた）及びそれらの混合物からなる群から選択される十分な量の活性化合物を含
む。
【００２３】 本発明の他の側面は図３のコンセンサス配列又はその相補的鎖から得られた１
５〜３５０塩基対、好ましくは１７〜２５０塩基対を有する（ＤＮＡ）配列であ
るオリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブの如き）に関する。好ましくは
前記オリゴヌクレオチドは１５〜４５塩基対、より好ましくは１７〜２５塩基対
を有するプライマーである。
５〜３５０塩基対、好ましくは１７〜２５０塩基対を有する（ＤＮＡ）配列であ
るオリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブの如き）に関する。好ましくは
前記オリゴヌクレオチドは１５〜４５塩基対、より好ましくは１７〜２５塩基対
を有するプライマーである。
【００２４】 本発明の第一実施態様によれば、前記オリゴヌクレオチドは１５〜４５塩基対
を有しかつ図３において同定される「コンセンサス」femAヌクレオチド配列（Ｃ
ＮＳ）（のフラグメント）と６０％以上、有利には７０％以上、好ましくは８０
％以上、より特別には９０％以上の相同性を示すプライマーである。
を有しかつ図３において同定される「コンセンサス」femAヌクレオチド配列（Ｃ
ＮＳ）（のフラグメント）と６０％以上、有利には７０％以上、好ましくは８０
％以上、より特別には９０％以上の相同性を示すプライマーである。
【００２５】 従って本発明によるオリゴヌクレオチドは新規配列又はエス・アウレウス、エ
ス・エピデルミディス又はエス・シムランス(S. simulans)の既知の配列の好ま しいフラグメントであるが、完全な野生型の既知のfemAヌクレオチド配列ではな
い。
ス・エピデルミディス又はエス・シムランス(S. simulans)の既知の配列の好ま しいフラグメントであるが、完全な野生型の既知のfemAヌクレオチド配列ではな
い。
【００２６】 好ましくは本発明によるオリゴヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列からな
る群から選択される：
る群から選択される：
【外３】
【外４】
【００２７】 前記プライマーは以下「普遍的プライマー(universal primer(s))」と称され る。
【００２８】 本発明の更なる側面は１５〜３５０塩基対、好ましくは１７〜２５０塩基対を
有する上述のようなプライマー又はプローブ、又は１５〜４５塩基対、より好ま
しくは１７〜２５塩基対を有するプライマー（これは以下「特異的プライマー(s
pecific primer(s))」と称される）であって図３において同定される「コンセン
サス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）（のフラグメント）および他のブドウ球
菌株に対して特異的な他のfemAヌクレオチド配列（のフラグメント）と５０％以
下、有利には４０％以下、好ましくは３０％以下、より特別には２０％以下の相
同性を示すヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドに関する。
有する上述のようなプライマー又はプローブ、又は１５〜４５塩基対、より好ま
しくは１７〜２５塩基対を有するプライマー（これは以下「特異的プライマー(s
pecific primer(s))」と称される）であって図３において同定される「コンセン
サス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）（のフラグメント）および他のブドウ球
菌株に対して特異的な他のfemAヌクレオチド配列（のフラグメント）と５０％以
下、有利には４０％以下、好ましくは３０％以下、より特別には２０％以下の相
同性を示すヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドに関する。
【００２９】 有利には前記「特異的プライマー」は以下のヌクレオチド配列からなる群から
選択される：
選択される：
【外５】
【００３０】 本発明によるオリゴヌクレオチドはそれら自身の間のクロスハイブリダイゼー
ションを回避するためにそれらの物理化学的特性に応じて選択される。前記プラ
イマーは相互に対して相補的ではなく、同様のＧＣ塩基含有率を持つ。
ションを回避するためにそれらの物理化学的特性に応じて選択される。前記プラ
イマーは相互に対して相補的ではなく、同様のＧＣ塩基含有率を持つ。
【００３１】 前記オリゴヌクレオチドは一以上のブドウ球菌属の細菌及びたぶん他のグラム
陽性細菌の同定及び／又は定量において用いられる。
陽性細菌の同定及び／又は定量において用いられる。
【００３２】 従って本発明の他の側面は一以上の抗生物質に対して耐性を持っていることが
できるブドウ球菌属の細菌の同定及び／又は定量法に関し、前記方法は抗生物質
、特にβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性の同定法と所望により組み合わせる
ことができる（例えばVannuffel等 (1998)によって記載されているようなmecA遺
伝子の変異体の同定法を通して）。
できるブドウ球菌属の細菌の同定及び／又は定量法に関し、前記方法は抗生物質
、特にβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性の同定法と所望により組み合わせる
ことができる（例えばVannuffel等 (1998)によって記載されているようなmecA遺
伝子の変異体の同定法を通して）。
【００３３】 細菌、好ましくはブドウ球菌属の細菌の検出、同定及び／又は定量法は以下の
工程を含む： − サンプル（好ましくは、血液、血清、透析液又は脳脊髄液の如き患者から
又は他の細菌増殖培地から得られた生体サンプル）中に存在する前記細菌からヌ
クレオチド配列を得、 − 所望により前記ヌクレオチド配列をあり得る汚染から精製し、 − 所望により本発明による一以上の普遍的オリゴヌクレオチド（普遍的プラ
イマー）を用いて前記ヌクレオチド配列を既知の遺伝子増幅法によって増幅し、
そして − （所望により増幅された）ヌクレオチド配列の長さの比較測定によって、
又は 前記細菌に対して特異的である本発明による一以上の特異的オリゴヌクレオチ
ド（特異的プローブ又はプライマー）（前記オリゴヌクレオチドは好ましくは固
体支持体上に固定されている）を用いた（所望により増幅された）ヌクレオチド
配列の逆ハイブリダイゼーション(reverse hybridisation)によって、 特異的グラム陽性細菌、好ましくは特異的ブドウ球菌属の細菌を同定する。
工程を含む： − サンプル（好ましくは、血液、血清、透析液又は脳脊髄液の如き患者から
又は他の細菌増殖培地から得られた生体サンプル）中に存在する前記細菌からヌ
クレオチド配列を得、 − 所望により前記ヌクレオチド配列をあり得る汚染から精製し、 − 所望により本発明による一以上の普遍的オリゴヌクレオチド（普遍的プラ
イマー）を用いて前記ヌクレオチド配列を既知の遺伝子増幅法によって増幅し、
そして − （所望により増幅された）ヌクレオチド配列の長さの比較測定によって、
又は 前記細菌に対して特異的である本発明による一以上の特異的オリゴヌクレオチ
ド（特異的プローブ又はプライマー）（前記オリゴヌクレオチドは好ましくは固
体支持体上に固定されている）を用いた（所望により増幅された）ヌクレオチド
配列の逆ハイブリダイゼーション(reverse hybridisation)によって、 特異的グラム陽性細菌、好ましくは特異的ブドウ球菌属の細菌を同定する。
【００３４】 所望により増幅されたヌクレオチド配列の長さの比較測定は電気泳動ゲル上で
のそれらの移動度の分析（既知の分子量マーカーと比較することによる）によっ
て行うことができる。
のそれらの移動度の分析（既知の分子量マーカーと比較することによる）によっ
て行うことができる。
【００３５】 好ましくは遺伝子増幅法はＰＣＲ（米国特許４９６５１８８）、ＬＣＲ（Land
gren等、Sciences, 241, pp. 1077-1080 (1988)），ＮＡＳＢＡ（Kievits 等、J
. Virol. Methods, 35, pp. 273-286 (1991)）、ＣＰＲ（特許ＷＯ ９５／１４
１０６）又はＩＣＲからなる群から選択される。
gren等、Sciences, 241, pp. 1077-1080 (1988)），ＮＡＳＢＡ（Kievits 等、J
. Virol. Methods, 35, pp. 273-286 (1991)）、ＣＰＲ（特許ＷＯ ９５／１４
１０６）又はＩＣＲからなる群から選択される。
【００３６】 所望により増幅されたヌクレオチド配列の特異的検出は当業者によって既知の
特異的ゲル電気泳動法、インシトゥハイブリダイゼーション、固体支持体上での
、溶液中での、ドットブロット上でのハイブリダイゼーション、ノーザンブロッ
ト又はサザンブロットハイブリダイセーション等によって行うことができる。
特異的ゲル電気泳動法、インシトゥハイブリダイゼーション、固体支持体上での
、溶液中での、ドットブロット上でのハイブリダイゼーション、ノーザンブロッ
ト又はサザンブロットハイブリダイセーション等によって行うことができる。
【００３７】 有利には細菌に対して特異的なプローブは国際特許出願ＷＯ ９８／１１２５
３（これは参考文献としてここに組み入れる）に記述されている方法に従って固
体支持体上に固定される。
３（これは参考文献としてここに組み入れる）に記述されている方法に従って固
体支持体上に固定される。
【００３８】 前記特異的オリゴヌクレオチド（プローブ又は「延長された」プライマー）は
５０〜３５０塩基対、好ましくは１２０〜２５０塩基対の長さを持ち、カルボジ
イミド反応によって固体支持体のアミン官能基への末端５′リン酸の結合によっ
て固体支持体に固定される（ここに参考文献として組み入れるＷＯ ９８／１１
２５３において記載されるように）。
５０〜３５０塩基対、好ましくは１２０〜２５０塩基対の長さを持ち、カルボジ
イミド反応によって固体支持体のアミン官能基への末端５′リン酸の結合によっ
て固体支持体に固定される（ここに参考文献として組み入れるＷＯ ９８／１１
２５３において記載されるように）。
【００３９】 固体支持体はセルロース又はナイロンフィルター、９６ウェルマイクロタイタ
ープレートの如きプラスチック支持体、マイクロビーズ、好ましくは磁気マイク
ロビーズ又はヌクレオチド配列の固定に好適ないかなる他の支持体からなる群か
ら選択されることができる。
ープレートの如きプラスチック支持体、マイクロビーズ、好ましくは磁気マイク
ロビーズ又はヌクレオチド配列の固定に好適ないかなる他の支持体からなる群か
ら選択されることができる。
【００４０】 本発明による方法は抗生物質、特にβ−ラクタム系抗生物質に対するあり得る
耐性の別の特異的検出工程と有利には組み合わせることができる（例えばVannuf
fel等 (1998)によって記載されているようなmecA遺伝子の変異体の上述の方法に
よる同定を通して）。
耐性の別の特異的検出工程と有利には組み合わせることができる（例えばVannuf
fel等 (1998)によって記載されているようなmecA遺伝子の変異体の上述の方法に
よる同定を通して）。
【００４１】 本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチド及び所望により上述の方法のいず
れか一つを通した前記細菌の（所望により増幅された）ヌクレオチド配列の同定
に必要なすべての媒体を含む、ブドウ球菌属の細菌又は他のグラム陽性細菌の同
定及び／又は定量のための診断及び／又は定量装置又はキットにも関する。
れか一つを通した前記細菌の（所望により増幅された）ヌクレオチド配列の同定
に必要なすべての媒体を含む、ブドウ球菌属の細菌又は他のグラム陽性細菌の同
定及び／又は定量のための診断及び／又は定量装置又はキットにも関する。
【００４２】 有利には本発明による方法及び装置は「内部又は外部標準配列(internal or e
xternal standard sequence)」（好ましくは参考文献としてここに組み入れる特
許出願ＷＯ ９８／１１２５３において記述されているもの）の使用によって前
記ブドウ球菌株の同定に適合される。
xternal standard sequence)」（好ましくは参考文献としてここに組み入れる特
許出願ＷＯ ９８／１１２５３において記述されているもの）の使用によって前
記ブドウ球菌株の同定に適合される。
【００４３】 従って本発明の第一実施態様によれば、ブドウ球菌属の細菌例えばスタフィロ
コックス・アウレウスからの核酸配列はエス・アウレウスに対して特異的な「普
遍的プライマー」によって及び「特異的プライマー」によって増幅される。エス
・アウレウスの同定はアガロース電気泳動ゲル上で得られ（そこでは増幅された
ヌクレオチド配列はエス・エピデルミディスの如き他のブドウ球菌属の細菌の増
幅されたヌクレオチド配列よりも小さい）、比較分子量マーカーの使用によって
同定される。
コックス・アウレウスからの核酸配列はエス・アウレウスに対して特異的な「普
遍的プライマー」によって及び「特異的プライマー」によって増幅される。エス
・アウレウスの同定はアガロース電気泳動ゲル上で得られ（そこでは増幅された
ヌクレオチド配列はエス・エピデルミディスの如き他のブドウ球菌属の細菌の増
幅されたヌクレオチド配列よりも小さい）、比較分子量マーカーの使用によって
同定される。
【００４４】 本発明の他の実施態様によれば、ブドウ球菌属の細菌（例えばエス・アウレウス
）は前記細菌に対して特異的であり、フィルターの如き固体支持体上に固定され
ているプローブを用いて増幅されたヌクレオチド配列の逆ハイブリダイゼーショ
ンによって同定される。
）は前記細菌に対して特異的であり、フィルターの如き固体支持体上に固定され
ているプローブを用いて増幅されたヌクレオチド配列の逆ハイブリダイゼーショ
ンによって同定される。
【００４５】 本発明は以下の非限定的実施例において以下の図を参照して詳細に説明される
であろう。
であろう。
【００４６】図面の簡単な説明 図１はＰＣＲ増幅によって得られるエス・ホミニス、エス・サプロフィティク
ス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子の五つの部分的に重複するフラ
グメントを示す。
ス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子の五つの部分的に重複するフラ
グメントを示す。
【００４７】 図２はエス・ホミニス、エス・サプロフィティクス、エス・アウレウス、エス
・エピデルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチ
ド配列のアラインメントを示す。
・エピデルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチ
ド配列のアラインメントを示す。
【００４８】 図３は本発明によるコンセンサス配列を示す。
【００４９】 図４は逆ハイブリダイゼーションによるブドウ球菌の様々な株間の特異的診断
の結果を示す。
の結果を示す。
【００５０】 図５は普遍的条件下でのＣＮＳ種の増幅を示す。
【００５１】 図６〜１３は株エス・ホミニス、エス・サプロフィティクス、エス・ハエモリ
ティクス、エス・ルグドゥネンシス、エス・キシロスス、エス・キャプティス、
エス・シレイフェリ及びエス・スキウリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
ティクス、エス・ルグドゥネンシス、エス・キシロスス、エス・キャプティス、
エス・シレイフェリ及びエス・スキウリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【００５２】
【実施例】実施例 １：配列決定方法 エス・ホミニス、エス・サプロフィティクスからのfemA遺伝子のフラグメント
は低厳密アニーリング条件でＰＣＲ増幅によって得られた。増幅に用いられたプ
ライマーは潜在的に保存された領域とぴったりと適合しており、エス・アウレウ
ス、エス・サプロフィティクス及びエス・エピデルミディスのfemAヌクレオチド
配列間の配列相同性に従って設計されていた。エス・ホミニス、エス・サプロフ
ィティクスの両種について、五つの部分的に重複するフラグメントが合成され、
これはfemA遺伝子全体の配列決定を可能とした（図１）。
は低厳密アニーリング条件でＰＣＲ増幅によって得られた。増幅に用いられたプ
ライマーは潜在的に保存された領域とぴったりと適合しており、エス・アウレウ
ス、エス・サプロフィティクス及びエス・エピデルミディスのfemAヌクレオチド
配列間の配列相同性に従って設計されていた。エス・ホミニス、エス・サプロフ
ィティクスの両種について、五つの部分的に重複するフラグメントが合成され、
これはfemA遺伝子全体の配列決定を可能とした（図１）。
【００５３】実施例 ２：コンセンサス配列の同定 エス・ホミニス及びエス・サプロフィティクスからのfemA遺伝子並びにエス・
アウレウスから現在までに配列決定されているfemA遺伝子（GenBank アセッショ
ン番号Ｍ２３９１８）、エス・エピデルミディスから現在までに配列決定されて
いるfemA遺伝子（GenBank アセッション番号Ｕ２３７１３）及びエス・ハエモリ
ティクスから現在までに配列決定されているfemA遺伝子のヌクレオチド配列のア
ラインメントは図３に示されている。このアラインメントは遺伝子構造が可変領
域によって分断されている高度保存領域を示す「コンセンサス」femAヌクレオチ
ド配列（ＣＮＳ）を提案することを可能とした。これに基づいて種間の系統発生
上の変異をブドウ球菌属の細菌の種特異的同定のための遺伝子型分類法を案出す
るのに利用することができた。それ故、前記「コンセンサス」配列はブドウ球菌
属の細菌の感染の特異的診断のための強力な分子ツールである。
アウレウスから現在までに配列決定されているfemA遺伝子（GenBank アセッショ
ン番号Ｍ２３９１８）、エス・エピデルミディスから現在までに配列決定されて
いるfemA遺伝子（GenBank アセッション番号Ｕ２３７１３）及びエス・ハエモリ
ティクスから現在までに配列決定されているfemA遺伝子のヌクレオチド配列のア
ラインメントは図３に示されている。このアラインメントは遺伝子構造が可変領
域によって分断されている高度保存領域を示す「コンセンサス」femAヌクレオチ
ド配列（ＣＮＳ）を提案することを可能とした。これに基づいて種間の系統発生
上の変異をブドウ球菌属の細菌の種特異的同定のための遺伝子型分類法を案出す
るのに利用することができた。それ故、前記「コンセンサス」配列はブドウ球菌
属の細菌の感染の特異的診断のための強力な分子ツールである。
【００５４】実施例 ３：他のブドウ球菌属の細菌のfemA遺伝子の配列決定 前記コンセンサス配列は重複しているＰＣＲ生成物の製造を自由アニーリング
条件下で可能とする普遍的プライマーを設計するのに利用することができ、前記
重複ＰＣＲ生成物の配列決定によりfemA配列全体が同定されるであろう。
条件下で可能とする普遍的プライマーを設計するのに利用することができ、前記
重複ＰＣＲ生成物の配列決定によりfemA配列全体が同定されるであろう。
【００５５】実施例 ４：逆ハイブリダイゼーションによるエス・アウレウス、エス・エピデ ルミディス、エス・ホミニス及びエス・サプロフィティクスの間の特異的診断 本発明者は臨床上最も関連のあるブドウ球菌属の細菌及びそれらのmecAの状態
の迅速かつ結合した同定のための逆ハイブリダイゼーションアッセイを計画した
。コンセンサス配列の保存ドメインにおいて選択された二つのセットのプライマ
ー（bioU1-bioU3及びfem1-fem3bio）が合成された（これらは２８６及びbio-220
bpのフラグメントをそれぞれ増幅する）。femAアンプリコンの種特異性は保存領
域間の遺伝的変異性によって保証されていた。femAプローブはナイロンストリッ
プ上に固定された。ハイブリダイゼーションは関心のある株からのビオチン化さ
れたfemA ＰＣＲフラグメントを用いて行われた。この方法はＡＴＣＣ株（エス
・アウレウス、エス・エピデルミディス、エス・ホミニス及びエス・サプロフィ
ティクス）を用いてまず評価された（図４）。特異性は標準的方法によって同定
された。精度は種の同定について１００％であった。
の迅速かつ結合した同定のための逆ハイブリダイゼーションアッセイを計画した
。コンセンサス配列の保存ドメインにおいて選択された二つのセットのプライマ
ー（bioU1-bioU3及びfem1-fem3bio）が合成された（これらは２８６及びbio-220
bpのフラグメントをそれぞれ増幅する）。femAアンプリコンの種特異性は保存領
域間の遺伝的変異性によって保証されていた。femAプローブはナイロンストリッ
プ上に固定された。ハイブリダイゼーションは関心のある株からのビオチン化さ
れたfemA ＰＣＲフラグメントを用いて行われた。この方法はＡＴＣＣ株（エス
・アウレウス、エス・エピデルミディス、エス・ホミニス及びエス・サプロフィ
ティクス）を用いてまず評価された（図４）。特異性は標準的方法によって同定
された。精度は種の同定について１００％であった。
【００５６】実施例 ５：ブドウ球菌属の細菌の間の特異的診断 このアッセイは以下の必要条件が満たされるならばブドウ球菌属のいかなる細
菌の同定をも可能にする： − プライマーfem1、fem2及びfem3bioがブドウ球菌属に普遍的であること； − いかなるＣＮＳ種間にも特異的ハイブリダイゼーションを助成するのに十
分な幅広い系統発生上の変異があること。
菌の同定をも可能にする： − プライマーfem1、fem2及びfem3bioがブドウ球菌属に普遍的であること； − いかなるＣＮＳ種間にも特異的ハイブリダイゼーションを助成するのに十
分な幅広い系統発生上の変異があること。
【００５７】 第一の必要条件はエス・ハエモリティクス、エス・キャピティス、エス・コー
ニイ(S. cohnii)、エス・キシロスス、エス・シムランス、エス・ルグドゥネン シス、エス・シレイフェリ及びエス・ワルネリ(S. warneri)株については満たさ
れる（図５）。
ニイ(S. cohnii)、エス・キシロスス、エス・シムランス、エス・ルグドゥネン シス、エス・シレイフェリ及びエス・ワルネリ(S. warneri)株については満たさ
れる（図５）。
【００５８】実施例 ６：特異的ブドウ球菌属細菌による感染の分子的診断のためのfemA及び mecA遺伝子決定基の多重増幅 四つの隣接集中治療室で治療されている合計４８人の患者が研究対象とされた
。気管内吸引液（ＥＴＡ）が患者から集められ、Vannuffel等 (1995)によって記
述されている方法に従って多重ＰＣＲ分析に供された。臨床上の標本は２％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳを含有する５ｍｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に均質混合された。
。気管内吸引液（ＥＴＡ）が患者から集められ、Vannuffel等 (1995)によって記
述されている方法に従って多重ＰＣＲ分析に供された。臨床上の標本は２％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳを含有する５ｍｌのＴＥ緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に均質混合された。
【００５９】 前記均質混合物（１．５ｍｌ）は次に７５００ｇで５分間遠心分離された。細
胞ペレットはＴＥ緩衝液で一回洗浄され、１％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００及
び５０μｇのリソスタフィン(Sigma)の存在下で溶解され、３７℃で１５分間イ ンキュベートされた。溶解は１００μｇのプロテイナーゼＫ（Boehringer)を添 加することによって完了された。溶解物は５５℃でもう５分間、そして９５℃で
５分間インキュベートされ、４０００ｇで５分間遠心分離された。
胞ペレットはＴＥ緩衝液で一回洗浄され、１％（ｖ／ｖ）Triton Ｘ−１００及
び５０μｇのリソスタフィン(Sigma)の存在下で溶解され、３７℃で１５分間イ ンキュベートされた。溶解は１００μｇのプロテイナーゼＫ（Boehringer)を添 加することによって完了された。溶解物は５５℃でもう５分間、そして９５℃で
５分間インキュベートされ、４０００ｇで５分間遠心分離された。
【００６０】 細菌ＤＮＡを精製するため、２００μｌの上澄みは次にMacherey-Nagel Nucle
ospin Ｃ＋Ｔ（登録商標）カラム上で濾過され、２００μｌの滅菌Ｈ２Ｏで溶 出された。二つの異なる量のＤＮＡ懸濁液（２μｌ及び２００μｌ）はmecAのた
めにはプライマー 5′-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3′及び 5′-CTGGAACTTGTTGAGCAG
AG-3′を用いて、及びfemAのためには上述のプライマーを用いて多重ＰＣＲ増幅
に供され、異なるフラグメントを生じた。
ospin Ｃ＋Ｔ（登録商標）カラム上で濾過され、２００μｌの滅菌Ｈ２Ｏで溶 出された。二つの異なる量のＤＮＡ懸濁液（２μｌ及び２００μｌ）はmecAのた
めにはプライマー 5′-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3′及び 5′-CTGGAACTTGTTGAGCAG
AG-3′を用いて、及びfemAのためには上述のプライマーを用いて多重ＰＣＲ増幅
に供され、異なるフラグメントを生じた。
【００６１】 femA及びmecAのシグナルは感受性のエス・アウレウスに接触した標本（ｎ＝１
０）、及びメチシリン耐性でコアグラーゼ陰性のブドウ球菌属の細菌に接触した
標本（ｎ＝６）それぞれで見出された。他方、ＥＴＡグラム陰性細菌（ｎ＝５）
並びにＭＳ−ＣＮＳ（ｎ＝６）から、及び正常な咽頭細菌相を含む五つのＥＴＡ
からはシグナルは得られなかった。
０）、及びメチシリン耐性でコアグラーゼ陰性のブドウ球菌属の細菌に接触した
標本（ｎ＝６）それぞれで見出された。他方、ＥＴＡグラム陰性細菌（ｎ＝５）
並びにＭＳ−ＣＮＳ（ｎ＝６）から、及び正常な咽頭細菌相を含む五つのＥＴＡ
からはシグナルは得られなかった。
【００６２】 ＥＴＡ中のブドウ球菌属細菌を検出するためのこの多重ＰＣＲ法はサンプルの
採取日中に６時間以下の時間で完了された。これは従来の同定及び感受性試験に
必要な時間（４８から７２時間）と比較すると有利である。
採取日中に６時間以下の時間で完了された。これは従来の同定及び感受性試験に
必要な時間（４８から７２時間）と比較すると有利である。
【００６３】実施例 ７：他のfemA遺伝子の増幅、クローニング及び配列決定 femA遺伝子の増幅のため、コンセンサス配列の保存されている部分から二つの
プライマーが選択された。
プライマーが選択された。
【００６４】 これらのプライマーはfemS1、femS2及びfemAS1（アンチセンスプライマー）で
ある。エス・ホミンス、エス・サプロフィティクス、エス・ハエモリティクス、
エス・ルグドゥネンシス、エス・シレイフェリ、エス・スキウリ、エス・キシロ
スス、エス・シムランス、エス・キャピティス、エス・ガリナルム(S. gallinar
um)、エス・コーニイ及びエス・ワルネリの株からのＤＮＡは前記プライマーか ら増幅され、増幅フラグメントはベクターｐＣＲ−ＸＬＴＯＰＯ（登録商標）中
でクローニングされ、エレクトロポレーションによってイー・コリ細胞ＴＯＰ１
０（TOPO XL PCR Cloning Kit（登録商標）、Invitrogen, Carlsbad, CA)中に導
入された。
ある。エス・ホミンス、エス・サプロフィティクス、エス・ハエモリティクス、
エス・ルグドゥネンシス、エス・シレイフェリ、エス・スキウリ、エス・キシロ
スス、エス・シムランス、エス・キャピティス、エス・ガリナルム(S. gallinar
um)、エス・コーニイ及びエス・ワルネリの株からのＤＮＡは前記プライマーか ら増幅され、増幅フラグメントはベクターｐＣＲ−ＸＬＴＯＰＯ（登録商標）中
でクローニングされ、エレクトロポレーションによってイー・コリ細胞ＴＯＰ１
０（TOPO XL PCR Cloning Kit（登録商標）、Invitrogen, Carlsbad, CA)中に導
入された。
【００６５】 株エス・ルグドゥネンシス、エス・シレイフェリ、エス・スキウリ、エス・キ
シロスス及びエス・キャピティスの増幅されたフラグメントは以下のプライマー
を用いてＡＢＩ ２７７ ＤＮＡ配列決定機（登録商標）（ＰＥ Applied Bios
ystems, Foster City, CA）上でTaq Dye Deoxy Terminator Cycle（登録商標） 配列決定によって配列決定された：
シロスス及びエス・キャピティスの増幅されたフラグメントは以下のプライマー
を用いてＡＢＩ ２７７ ＤＮＡ配列決定機（登録商標）（ＰＥ Applied Bios
ystems, Foster City, CA）上でTaq Dye Deoxy Terminator Cycle（登録商標） 配列決定によって配列決定された：
【外６】
【００６６】
【参考文献】
【図１】 ＰＣＲ増幅によって得られるエス・ホミニス、エス・サプロフィティクス及び
エス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子の五つの部分的に重複するフラグメン
トを示す。
エス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子の五つの部分的に重複するフラグメン
トを示す。
【図２ａ】 エス・ホミニス、エス・サプロフィティクス、エス・アウレウス、エス・エピ
デルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチド配列
のアラインメントを示す。
デルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチド配列
のアラインメントを示す。
【図２ｂ】 エス・ホミニス、エス・サプロフィティクス、エス・アウレウス、エス・エピ
デルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチド配列
のアラインメントを示す。
デルミディス及びエス・ハエモリティクスからのfemA遺伝子のヌクレオチド配列
のアラインメントを示す。
【図３】 本発明によるコンセンサス配列を示す。
【図４】 逆ハイブリダイゼーションによるブドウ球菌の様々な株間の特異的診断の結果
を示す。
を示す。
【図５】 普遍的条件下でのＣＮＳ種の増幅を示す。
【図６ａ】 株エス・ハエモリティクスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図６ｂ】 株エス・ハエモリティクスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図７ａ】 株エス・ルグドゥネンシスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図７ｂ】 株エス・ルグドゥネンシスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図８ａ】 株エス・キシロススの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図８ｂ】 株エス・キシロススの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図９ａ】 株エス・キャプティスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図９ｂ】 株エス・キャプティスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１０ａ】 株エス・シレイフェリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１０ｂ】 株エス・シレイフェリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１１ａ】 株エス・スキウリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１１ｂ】 株エス・スキウリの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１２】 株エス・ホミニスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【図１３】 株エス・サプロフィティクスの完全femA野生型遺伝子配列を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２３日（２０００．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【外１】
【外２】
【外３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 バニュフェル， パスカル ベルギー， ベ−7133 ブヴリヌ， リュ ド ラ バス エジプト， 138 (72)発明者 ガラ， ジャン−リュク ベルギー， ベ−5380 フェルネルモン, リュ グラン シュマン コミュナル ６ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 CA01 CA09 CA11 CA20 DA05 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA18 QA19 QQ03 QQ06 QQ15 QQ42 QR31 QR33 QR55 QR59 QR62 QR80 QR83 QR84 QS02 QS16 QS24 QS25 QS34 QS38 QS39
Claims (30)
- 【請求項１】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のためのオリゴヌクレオチ
ドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜４５塩基対、好ましくは１５〜２５
塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）と
６０％以上の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項１記載のオ
リゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜４５塩基対、好まし
くは１７〜２５塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌクレオチド配
列（ＣＮＳ）と７０％以上の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項１又は２記
載のオリゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜４５塩基対、
好ましくは１７〜２５塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌクレオ
チド配列（ＣＮＳ）と８０％以上の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項１〜３のい
ずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５
〜４５塩基対、好ましくは１７〜２５塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス
」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）と９０％以上の相同性を示すオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項５】 以下のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項
１〜４のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド： 【外１】 - 【請求項６】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のためのオリゴヌクレオチ
ドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜３５０塩基対、好ましくは１７〜２
５０塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ
）と５０％以下の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項６記載のオ
リゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜３５０塩基対、好ま
しくは１７〜２５０塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌクレオチ
ド配列（ＣＮＳ）と４０％以下の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項８】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項６又は７記
載のオリゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５〜３５０塩基対
、好ましくは１７〜２５０塩基対を有し、かつ図３の「コンセンサス」femAヌク
レオチド配列（ＣＮＳ）と３０％以下の相同性を示すオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 ブドウ球菌属の細菌の特異的同定のための請求項６〜８のい
ずれか一つに記載のオリゴヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が１５
〜３５０塩基対、好ましくは１７〜２５０塩基対を有し、かつ図３の「コンセン
サス」femAヌクレオチド配列（ＣＮＳ）と２０％以下の相同性を示すオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項１０】 ヌクレオチド配列が１５〜４５塩基対、好ましくは１７〜
２５塩基対を有するプライマーである請求項６記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】 以下のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求
項１０記載のオリゴヌクレオチド： 【外２】 - 【請求項１２】 以下の工程を含む、抗生物質に対して耐性を示すことがで
きるブドウ球菌属の細菌であってサンプル中に存在するブドウ球菌属の細菌の同
定及び／又は定量方法： − サンプル中に存在するブドウ球菌属の細菌からヌクレオチド配列を得、 − 請求項１〜８記載の一以上のオリゴヌクレオチドを用いて前記ヌクレオチ
ド配列を増幅させ、そして − 前記ブドウ球菌属の細菌に対して特異的でありかつ固体支持体上に固定さ
れている請求項９〜１１記載の一以上のオリゴヌクレオチドを用いた前記増幅さ
れたヌクレオチド配列の逆ハイブリダイゼーションによって、又は 増幅されたヌクレオチド配列の長さの比較測定によって、 前記特異的ブドウ球菌属の細菌を同定し、及び所望により定量する。 - 【請求項１３】 以下のものを含む、ブドウ球菌属の細菌を同定するための
診断装置： 請求項１〜１１のいずれか一つに記載のオリゴヌクレオチド、及び所望により 以下のものから成る群から選択されるいずれか一つの方法を通した前記ブドウ
球菌属の細菌の増幅配列の同定に必要な全ての媒体： インシトゥハイブリダイゼーション、固体支持体上のハイブリダイゼーション
溶液中のハイブリダイゼーション、ドットブロット上のハイブリダイゼーション
、ノーザンブロット、サザンブロット、同位体又は非同位体標識を用いたプロー
ブハイブリダイゼーション、遺伝子増幅又はそれらの組合せ。 - 【請求項１４】 添付した図６〜１３中に示されているヌクレオチド又はア
ミノ酸配列からなる群から選択されるヌクレオチド又はアミノ酸配列と９０％以
上の相同性を示すfemA遺伝子配列。 - 【請求項１５】 図６のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子配
列。 - 【請求項１６】 図６のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列。
- 【請求項１７】 図７のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子配
列。 - 【請求項１８】 図７のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列。
- 【請求項１９】 図８のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子配
列。 - 【請求項２０】 図８のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列。
- 【請求項２１】 図９のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子配
列。 - 【請求項２２】 図９のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列。
- 【請求項２３】 図１０のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子
配列。 - 【請求項２４】 図１０のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列
。 - 【請求項２５】 図１１のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子
配列。 - 【請求項２６】 図１１のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列
。 - 【請求項２７】 図１２のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子
配列。 - 【請求項２８】 図１２のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列
。 - 【請求項２９】 図１３のヌクレオチド配列である請求項１４記載の遺伝子
配列。 - 【請求項３０】 図１３のアミノ酸配列である請求項１４記載の遺伝子配列
。
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