JP2001517659A - 超分子ペアリングシステムその製造及び使用 - Google Patents
超分子ペアリングシステムその製造及び使用Info
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Abstract
Description
システムにおける使用に関する。 ペアリングシステムは、非共有結合相互作用の超分子システムであり、これら
は、選択性、安定性および可逆性によって識別され、それらの性質は、好ましく
は、熱力学的に、すなわち、温度、pHおよび濃度によって影響を受ける。DN
AおよびRNAが、遺伝形質のキャリヤーとして、ここでは、基本的な役割を演
ずる。このようなペアリングシステムは、例えば、それらの選択性の結果として
、また、異なる金属クラスターを結びつけて、潜在的に新規な性質を有するクラ
スター会合を生じさせる“分子接着剤”として使用することができる〔R.L.
Lestinger,et al.,Nature,1996,382,607
−9;P.G.Schultz,et al.,Nature,1996,38
2,609−11〕。
ノロジーの領域における使用のために、新規物質、診断薬、治療薬、ミクロ電子
工学、フォトニックおよび光電子工学コンポーネントの製造のために、および、
分子種をコントロールしつつ、結びつけて、超分子単位、例えば、蛋白質アセン
ブリの(組み合わせ)合成を生ずるためにますます重要な役割を演ずる〔例えば
、A.Lombardi,J.W.Bryson,W.F.DeGrado,B
iomolekuls(Rept.Sci.) 1997,40,495―50
4参照。〕 しかし、このタイプのペアリングシステムを製造するためには、DNAおよび
RNA単位は、以下の欠点を有する: (a) 互いに、2本のストランドを保持する力、特に、水素結合およびスタッ
キング効果(stacking effect)は、天然には非常に低い。した がって、このような二重構造は、安定性が低い。これは、いわゆる遷移曲線の記
録および遷移点の測定により容易に決定される。したがって、ペアリングシステ
ムを製造するためには、比較的長い個々のストランドを必要とし、超分子単位上
のペアリングシステムの部分が優勢である、すなわち、“ヌクレオチド負荷”が
高い結果を有する。 (b) フーグスチーン(Hoogsteen)ペアリング(これとは別に、ワ
トソン−クリックペアリングについても可能であるが、)の形成により、選択性
はは低下する。並列二重構造または不可逆的なペアリングプロセスは、かくして
、組合せられることが多い。 (c) 糖リン酸塩骨格が非常に柔軟であることにより、螺旋配座が形成され、
その結果として、超分子単位における空間的な配列は、容易に調節することがで
きない。 (d) 骨格におけるホスホジエステル結合の化学的不安定性は、超分子単位の
使用のための物理的条件、例えば、pHまたは温度において極わずかしか変動し
ない。 (e) 生成物のヌクレアーゼ感受性は、迅速な酵素分解を生じ、これは回避す
ることが困難であるのみで、かくして、超分子単位は破壊される。 (f) 超分子単位が生物系で使用される場合、すなわち、ペアリングプロセス
のオルソゴナリティ(orthogonality)が存在しない場合、生物系
の遺伝物質により起こり得る妨害は、除外するべきではない。 (g) 例えば、ペプチド合成と比較して、慣用的に使用される固相の負荷能力
が低いことにより、比較的多量のオリゴヌクレオチドの製造は困難である。 (h) 適当な配置の糖単位が接近しにくいことにより、非天然のLエナンチオ
マー形を製造することが難しい。
の超分子構造体(例えば、WO96/13522参照)におけるDNAまたはR
NA単位の使用は、特に、上記(e)項、(f)項および(g)項の点で実現が
非常に難しい。
)が存在する。pRNAは、リボフラノースの代わりに、糖単位としてリボピラ
ノースを含有し、したがって、専ら、ワトソン−クリック対をなす逆平行の可逆
的に“溶解する”準直鎖かつ安定な二重構造を形成するオリゴヌクレオチドであ
る。また、キラリティの反対の意味を有するホモキラルなp−RNAストランド
もまた存在し、これは、同様に、調節可能な対をなし、形成される二重構造にお
いて厳密には螺旋状ではない。超分子単位合成のためのこの貴重な特異性は、リ
ボピラノースホスフェート骨格の相対的に低い柔軟性および塩基平面のストラン
ド軸に対する強い傾斜と関連し、これによって生ずる傾向は、インターカテナリ
ー塩基(intercatenary base)が生成する二重構造において
列をなし、最終的に、骨格の合成における2’,4’−cis−ニ置換リボピラ
ノース環の関与であると考えることができる。かくして、p−RNAは、DNA
およびRNAの上記欠点の幾つかを解決するが、(d)項、(e)項、(g)項
および(h)項に従う欠点を解決することはできない。
ゴマーペプチド、いわゆる、ペプチド核酸(PNAs)の合成も存在する。 それらの開鎖構造により、PNAsは、高度の柔軟性を有し、かくして、それ
らの配座前組織化の点で、超分子システムの合成の調節には適していない。
造することである。 したがって、本発明の1つの主題は、式(I):
に独立に、同一または異なり、H;または、CnH2n+1であり、nは、1−12 の整数、好ましくは、1−8の整数であり、特に、1−4の整数である。]に等 しく、好ましくは、R1は、NR3R4またはOR3であり、特に、NR3R4であり
、とりわけ、NH2であり; R2は、CmH2m−C(X)−Y[ここで、Xは、=O、=Sまたは=Nに等し く;Yは、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、R3およびR4は、上記した意
味を有する。)に等しく;nは、1−4の整数、特に、1−3の整数、とりわけ
、1−2の整数であり、好ましくは、Xは、NR3R4またはOR3、特に、NR3 R4、とりわけ、NH2に等しく、Yは、好ましくは、OR3またはNR3R4に等 しい。]であるか;または、 R2は、CmH2m−Z−Y’[ここで、Zは、スルホニル、ホスホニル、エーテ ルまたはアミン基に等しく、Zがスルホニルまたはホスホニル基に等しい場合、
Y’は、H;CnH2n+1、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、n、R3および
R4は、上記した意味を有する。)に等しく、Zがエーテルまたはアミン基に等 しい場合、Y’は、CnH2n+1に等しい。]に等しく; A、BおよびDは、相互に独立に、同一または異なり、CR5R6、O、NR7 またはS[ここで、R5、R6、R7は、相互に独立であり、H;または、CnH2n+ 1 (ここで、nは、上記した意味を有する。)である。]であり; Cは、CR8またはN[ここで、R8は、独立に、R5の意味を表す。]に等しく ; A−B、B−CまたはC−Dは、2つの同一のヘテロ原子ではなく; 本発明の意味の範囲内でヌクレオ塩基という用語は、チミン、ウラシル、アデ
ニン、シトシン、グアニン、イソシトシン、イソグアニン、キサンチンまたはヒ
ポキサンチンを表し、好ましくは、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンまた
はグアニンを表す。〕 で表される化合物である。
とりわけ、〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕ヌクレオ
塩基、例えば、1−〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕
チミン、1−〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕ウラシ
ル、1−〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕シトシン、
9−〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕アデニンまたは
9−〔2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕グアニンが好ま
しい。
る。 合成のためには、R1が保護基を有する場合、例えば、R1がNH2に等しい場 合に、t−ブトキシカルボニル基(BOC)または9−フルオレニルメトキシカ
ルボニル基(FMOC)を有する場合、R1がOHに等しい場合に、エーテルま たはアセタール保護基を有する場合がさらに有益である。保護基は、概して、所
望されない反応から化合物の反応性基を保護し、容易に除去可能な基を意味する
と理解される。このタイプの基は、例えば、ベンジルオキシメチル(BOM)、
BOC、FMOC、エーテルまたはアセタール基である。
物を与える。 好ましくは、本発明に従う化合物は、1’−位に、ヌクレオ塩基を、2’−位
に、求核剤、例えば、4’−位の反応性基と、または、その活性化後、カルボニ
ル官能基と反応することができ、かくして、このプロセスを繰り返すことによっ
て、オリゴマー構造を形成することのできる窒素原子を有するシクロヘキサノン
誘導体である。立体化学的な観点から、6員環に全ての置換基がエカトリアル位
を有する誘導体が好ましく、特に、1’−および2’−位の置換基がエカトリア
ル位を有する誘導体が好ましく、とりわけ、ヌクレオ塩基がエカトリアル位を有
する誘導体が好ましい。
ル)1,3−オキサゾリジン−2−オン2とを、キラルな非ラセミの促進剤、例
えば、ゼーバッハのTADDOL3(D.Seebach et al.,J.
Org.Chem.1995,60,1788)の存在で、キロジェニックな(
chirogenic)ディールス−アルダー反応を行う。3−(2−プロペノ
イル)−1,3−オキサゾリジン−2−オンは、例えば、オキサゾリジン−2−
オンの、銅および塩化第1銅(I)の存在における、アクリロイルクロライドと
の反応によって製造することができる。化合物5は、例えば、化合物4から、マ
グネシウム削り屑および無水メタノールの存在で、製造することができる。つい
で、例えば、リチウムアルミニウムハイドライドで反応生成物を還元すると、化
合物6を与える。アセトニトリル7は、6から、例えば、メタノイルクロライド
と反応させて、メチルメタノエートを生成させ、ついで、シアニドと反応させる
ことによって製造することができる。反応生成物をアルカリ加水分解すると、酢
酸誘導体を形成し、これは、SOCl2と反応させることができ、アセチルクロ ライドを与え、アンモニア水溶液の存在で、アセトアミド8を生ずる。これのヨ
ードラクタム化を、ついで、実施すると(S.Knapp et al.,Or
g.Synth.1991,70,101)、ヨードラクタム9を与える。
なく、ヌクレオ塩基とカップリングさせることができる。 このためには、ヌクレオ塩基の反応性基を多分適当な保護基、例えば、BOC
、FMOC、アセタール等によって保護する場合が有益であろう。ヌクレオ塩基
としてジアミノプリンの場合においてのみ、保護基は、不要である。しかし、ヌ
クレオ塩基としてのジアミノプリンの場合には、ラクタム環を開くことがもはや
可能ではない。これとは関係なく、ジアミノプリンは、生物系において何の役割
も演じない。
であり、1つの立体化学的系列にのみ属する必要があるので、ヨードラクタムは
、ラセミ形で存在するのではなく、エナンチオマー的に純粋な形で存在する場合
がなおさらに好ましい。ラセミ単位からのペアリングシステムの合成は、概して
、不可能である。
、ヨードラクタム9から出発して、5段階の合成順序で、全工程にわたる収率2
7%で製造される(図2): 第1の工程において、ヌクレオ塩基の立体選択的導入は、置換反応(13a)
、続いて、チミン(13b)の酸性イミドプロトンのマスキングによって行われ
る。ついで、ラクタムは、保護基、例えば、Boc基(13c)を導入すること
によって活性化され、環は、例えば、LiOOH(14a)によって求核的に開
環される。例えば、存在するBOM保護基を除去した後、接触水素化によって、
所望される単位(14b)を生ずる。
ent−9から類似の処方によって得ることが可能である。同様に、カップリン
グ可能なウラシル、シトシンおよびイソシトシン単位は、類似して得ることが可
能である。
から出発して、7段階の合成順序で、全工程にわたる収率19%で達成可能であ
る(図3): 例えば、N(6)−ベンゾイル化したアデニンの保持(15a)しての(S)
−ヨードラクタム9への導入後、例えば、N(6)−ホルムアミジンアデニンラ
クタム(15c)を与える再保護化を行う。例えば、t−ブトキシカルボニル化
(15d)によるラクタムの活性化、例えば、N(6)−アニソイル保護ラクタ
ム(15f)を与える新しい再保護化、および、所望される単位16を生成する
例えば、LiOHによる続くラクタムの開裂をついで行う。
ent−9から類似の処方によって得ることが可能である。同様に、カップリン
グ可能なグアニン、イソグアニン、キサンチンおよびヒポキサンチン単位を類似
的に得ることが可能である。
ヘテロ−ディールス−アルダー反応によって、または、適当な出発化合物でのデ
ィールス−アルダー反応によって、類似的に、可能である。
の方法であって、以下の工程: (a) 適当なヨードシクロアルカン、例えば、ヨードラクタム、好ましくは 、エナンチオマー的に純粋なヨードラクタムの保護されたヌクレオ塩基との、好
ましくは、ハイドライド、例えば、NaHの存在におけるカップリング;および
、ヨードラクタムの場合においては、 (b) 例えば、保護基、例えば、BOC基の導入によるラクタムの活性化;
および、 (c) 例えば、ヒドロパーオキシド、例えば、LiOOHによる求核的な開
環; を有する方法である。
、Merrifieldのペプチド合成に従い、固相で合成され、オリゴマー構
造体を与える。この方法において、必要とされる試薬は、好ましくは、過剰に加
えられ、未反応の量は、単純洗浄工程によって再度除去される〔R.B.Mer
rifield,J.Amer.Chem.Soc.1963,85,2149
〕。一時的な保護基の除去;および、例えば、対称無水物法に従う、保護された
モノマー単位のカップリングからなる繰り返しサイクルは、樹脂上にオリゴマー
を生ずる。合成の終わりに、末端保護基を除去し、樹脂からそのオリゴマーを開
裂させ、好ましくは、クロマトグラフィー法を使用し、精製する。分析HPLC
を使用し、合成生成物の単離されたHPLC画分をそれらの純度についてチェッ
クし、エレクトロスプレー質量分析法を使用して、明瞭に特性決定した。
を含み、それらが、概して、2’−−>4’結合するCAN(シクロヘキシルヌ
クレオオリゴアミド)と称されるオリゴマーである。
酸部分(例えば、DNA、RNA)を記載したペアリングシステムの助けをかり
て、結びつけるためには、概して、適当なリンカーが結合される。好ましくは、
オリゴマーペアリングシステムにおけるいずれかの所望される位置にリシンが組
込まれるが、リシンに限定されるものではなく、末端に組込むのが非常に好まし
い。その遊離アミノ基により、リシンは、非常に多くの結合可能性を有する。本
発明に従うオリゴマーへの組込みは、例えば、Boc−リシン(Fmoc)によ
って行われ、そのFMOC基は、DMF中、ピペリジンを使用して除去すること
ができる。
は、リシンリンカー、とりわけ、末端リシンリンカーを含有するオリゴマーに係
る。
リンカー、例えば、ヨードアセチルスクシンイミド(A)またはビス(ヒドロキ
シスクシニミジル)グルタレート(B)によって誘導することができ、これらは
、ついで、好ましくは、生理学的媒体、特に、所望により、有機可溶化剤の添加
された水性緩衝溶液中で、分子種のHS基、例えば、ペプチドまたは蛋白質のシ
ステイン基と(A)を介して、または、分子種のアミノ基と、(B)を介して反
応させ、化学的に安定な供給結合形を形成する。
ルスクシンイミドおよび/またはビス(ヒドロキシスクシニミジル)グルタレー
トで誘導されるオリゴマーを含む。
、水にわずかに溶解するのみである。テトラマーの場合、100マイクロモルの
濃度、ペンタマーの場合、10マイクロモルの濃度、ヘキサマーの場合、ほぼ1
マイクロモルの濃度範囲が達成される。これらは、おおよその値であり、配列に
より、甚だしく上回ったり、少なすぎたりする。AAATTの溶解度は、例えば
、1マイクロモルであり、AATATについての溶解度は、50マイクロモルで
ある。
ホスホリル化することのできるヒドロキシル官能基を導入することが可能である
。かくして得られるリン酸化したオリゴマーは、慣用的に、約pH7で、水に、
少なくとも1000倍より多く溶解可能である。溶解度は、概して、UV分光法
によって検出される。したがって、本発明は、また、リン酸化されたオリゴマー
に係る。
役体である。 生体分子は、本発明に従えば、例えば、ペプチド、ペプトイドまたは蛋白質、
例えば、レセプター、抗体またはその官能性部分または酵素、および、核酸、例
えば、DNAまたはRNA、もしくは、細胞構成成分、例えば、脂質、グリコ蛋
白質、フィラメント構成成分、または、ウイルス、ウイルス構成成分、例えば、
カプシド、ウィロイド、ならびに、それらの誘導体、例えば、アセテートを意味
すると理解される。
ckthun (1988) Science 240,1038)、単鎖Fv
フラグメント(scFv; Bird et al (1988),Scien
ce 242,423;Huston et al.(1988) Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879)またはFabフ
ラグメント(Better et al.(1988) Science 24
0, 1041)である。エフェクター分子;および、好ましくは、ペプチドの
本発明に従う共役体は、PNAとは対照的に、選択的であり、可逆的に、超分子
アセンブリを合成する場合には、調節可能なペアリングシステムが有益であり、
その作用、例えば、結合、抑制、生理学的効果の誘発は、個々のエフェクター分
子の作用とは異なる。
結合する物質Iを決定し、ついで、第2の蛋白質と結合する第2の物質IIを決
定し、ついで、2つの蛋白質のニ量化を誘発するように、リンカーにより、2つ
の物質IおよびIIを共有結合させることによって、蛋白質の多重結合(mul
timerization)による生物学的作用を誘発する物質を見出すための
方法を記載している。このニ量化は、ついで、所望される生物学的な効果を生ず
る。このような方法は、2つの物質IおよびIIの結合が非共有結合的に生ずる
が、本発明に従うオリゴマーまたは共役体のようなペアリングシステムによる場
合に、より大きな柔軟性を達成することができる。例えば、温度またはpHによ
るこのペアリングの調節可能性により、蛋白質のニ量化プロセスを観測すること
ができ、その度合いを調節することができる。本発明に従うペアリングシステム
は、それらがヌクレアーゼ安定である点で、例えば、WO96/13522から
のシステムと比較して、利点を有する。
を使用する試みは、例えば、WO94/28173に記載されている: 固定された配列の会合ペプチドは、(ヘキサ−またはヘプタペプチド)は、エ
フェクター単位、例えば、蛋白質を結びつけて、超分子単位を与える。このよう
な方法は、この会合プロセスの調節可能性により、より高い柔軟性を達成するこ
とができ、これは、概して、会合ペプチドでは実現することはできないが、本発
明のペアリングシステムでは有益である。
、ペアリングシステムおよび/または試験システムにおける本発明に従う共役体
の使用に関し、例えば、WO94/28173、WO96/13522、WO9
6/13613、R.L.Letsinger,et al.,Nature,
1996,382,607−9;P.G.Schultz et.al.,N
ature,1996,382,609−11またはA.Lombardi,J
.W.Bryson,W.F.DeGrano,Biomolekuls(Pe p.Sci)1997,40,495−504に詳細に記載されており、概して
、上記説明した。
よび/または本発明に従う共役体を固定するキャリヤーであり、特に、上記詳細
に記載したように、ペアリングシステムおよび/または試験システムに使用され
るキャリヤーである。
例えば、直鎖構造の分子、特に、ペプチド、ペプトイド、蛋白質、直鎖オリゴ−
またはポリサッカライド、核酸およびそれらの類縁体;または、モノマー、例え
ば、ヘテロ環、特に、窒素ヘテロ環;あるいは、非直鎖構造の分子、例えば、分
岐したオリゴ−またはポリサッカロイド;または、抗体およびそれらの官能性部
分、例えば、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント(scFv)またはFa
bフラグメントの会合によって、共有結合、準共有結合または超分子結合を形成
することを意味すると理解される。
、プラスチックス、結晶質物質;または、キャリヤーの薄層であり、特に、列挙
した物質の薄層、または、(生体)分子フィラメント、例えば、セルロース、構
造蛋白質である。
較して、以下の利点を有する: 本発明に従うオリゴマーまたは共役体の2重構造は、DNA、RNAおよびp
−RNAのそれらよりも有意により安定である。オリゴマー物質は、化学的およ
び酵素による分解に対して有意により安定であり、DNAまたはRNAと対を形
成せず、単純な方法において比較的大量に製造することができる。両エナンチオ
マーは、合成的キロジェニック(chirogenic)工程によって容易に到
達可能である。本発明に従う化合物は、したがって、従来公知のペアリングシス
テムより、選択的な“分子接着剤”として優れている。
ので、本発明を何ら限定するものではない。 実施例 実施例 1 カップリング可能なチミン単位の合成 1−〔(S,S,S)−8−アザビシクロ〔3.3.1〕ノナン−7−オン− 2−イル〕−3−〔(ベンジルオキシ)メチル〕チミン(13b)の製造 1. 処方 65%強のNaH懸濁液148mg(4.00mmol)を保護ガスでフラッ
シュし、各5mlの無水ペンタンで2回洗浄した50ml乾燥レーベンタールフ
ラスコに導入し、20mlのDMFで懸濁させた。3−(ベンジルオキシ)メチ
ルチミン493mg(2.00mmol)を最初に小分けして加え、ガスの発生
が鎮まった後、530mg(2.00mmol)の化合物9を加えた。室温で2
0分間攪拌した後、淡黄色の反応溶液が形成され、これを室温で一晩攪拌した。
減圧で、注意深く除去し、ついで、バルブ−チューブ蒸留(bulb−tube
destillation)(70℃/0.5torr)によって除去した。
1.71gの黄色−オレンジ色に着色したオイルが得られ、150gのシリカゲ
ル60上MPLクロマトグラフィーによってこれを精製した(CH2Cl2/Me
OH30:1)。かくして得られた固体を少量のEt2Oで温浸し、濾去し、細 かく砕き、オイルポンプ減圧で乾燥した。これにより、無色の粉末m.p.16
0−162℃として、405mg(53%)の化合物13bを生成した(ent
−13b:50%;rac−13:51%)。THF/シクロヘキサンから結晶
させることによって、分析試料が得られた。
−イル〕−3−〔(ベンジルオキシ)メチル〕チミン(13b):
行った。
コ中で溶解し、2.59ml(18.7mmol,1当量)のNEt3および8.
00ml(37.4mmol,2当量)のBoc2Oで連続して処理した。続い て、2.28g(18.7mmol,1当量)のDMAPをスパチュラによって
加え、黄色の反応溶液を室温で4時間攪拌した。3.89ml(28.1mmo
l,1.5当量)のNEt3、12.0ml(56.1mmol,3当量)のB oc2Oおよび3.43g(28.1mmol,1.5当量)のDMAPを、再 度、連続して加えた。水を除去しつつ、一晩攪拌した後、痕跡の出発物質が、T
LCチェック(シリカゲル60;CH2Cl2/MeOH15:1)に従い、なお
存在した。したがって、4時間の間隔で、各2.00ml(9.35mmol)
のBoc2Oを再度加えた。水を除去しつつ、混合物を再度攪拌し、続いて、ロ ータリーエバポレータ中、減圧で、溶剤および試薬を除去した。これにより、1
9.5gのオイル状の黄色の固体を生成し、これを275gのシリカゲル60(
AcOEt/n−ヘプタン2:1)上でクロマトグラフィーにかけた。8.50
gの幾分黄色に着色した固体が得られた。50mlのTHFおよび100mlの
シクロヘキサンから再結晶すると、m.p.124−126℃の無色の小さな結
晶として、7.81g(86%)の化合物13cを生成した(ent−13c:
87%,rac−13c:85%)。
〔3.3.1〕ノナン−7−オン−2−イル〕−3−〔(ベンジルオキシ)メチ
ル〕チミン(18):
行った。
中、225mlのTHFに溶解し、50mlの水で処理し、氷浴により0℃まで
冷却した。7.33g(64.8mmol)の30%強の過酸化水素、続いて、
1.36g(32.3mmol)のLiOH・1水和物の25mlの水溶液を加
えると、その後、溶液は、濁った。氷浴を除去し、反応混合物を45分間攪拌し
た。反応溶液を1.5MのNa2SO3水溶液25mlおよびNaHCO3飽和溶 液75mlで処理した。続いて、ロータリーエバポレータ中、減圧で、THFを
大部分除去した。溶液を350mlの水に注ぎ、少量の2Nの水酸化ナトリウム
溶液を使用して、pH>12に調整した。ミルク状の懸濁液を各回350mlの
CH2Cl2で3回抽出し、MgSO4を使用して、合わせた有機相を乾燥させた 。ロータリーエバポレータ中、減圧で、溶剤を除去した後、2.00gの不純な
化合物13bを得、これを30mlのTHFおよび60mlのシクロヘキサンか
ら再結晶した。かくして、1.55g(25%)の化合物13b(ent−13
b:27%;rac−13b:30%)を回収することが可能であった。
0mlのAcOEtで3回抽出した。Na2SO4を使用して乾燥後、ロータリー
エバポレータ中、減圧で、溶剤を除去し、50mlのEt2Oで温浸し、濾過し 、オイルポンプ減圧で乾燥し、5.09g(63%)の化合物14a(ent−
14a:60%;rac−14a:65%)を、m.p.89−91℃の微細な
結晶質固体として得た。
シカルボニル)アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル〕チミン(1
4a):
行った。
を懸濁させ、混合物を水素で45分間飽和させた。続いて、2.01g(4.0
0mmol)の化合物14aの30mlTHF溶液を加え、水素雰囲気下で、9
0分間、混合物を激しく攪拌した(TLCチェッキング;CH2Cl2/MeOH
15:1)。
溶剤を除去した。1.96gの無色の発泡体が得られ、これを90mlの無水M
eOHに溶解させ、454mg(8.40mmol)のNaOMeで処理した。
水を排除しつつ、混合物を室温で一晩攪拌した。それを6mlのNH4Cl飽和 水溶液で処理し、ロータリーエバポレータ中、減圧で、溶剤を大部分除去した。
残渣を50mlの水に注ぎ、2Nの塩酸を使用して、水相のpHを1−2に調整
し、水相を各回50mlのAcOEtで4回抽出した。Na2SO4を使用して乾
燥後、ロータリーエバポレータ中、減圧で、溶剤を除去し、得られる発泡体を2
0mlのEt2Oで温浸した。沈殿を濾過し、オイルポンプ減圧で乾燥後、1. 43g(94%)の化合物14b(ent−14b;90%;rac−14b:
88%)がm.p.231−233℃の無色の固体として得られた。MeOH/ 水から再結晶することによって、分析試料が得られた。
ボキシメチル)シクロヘキシル〕チミン(14b):
でき、これは、NMR試料を加熱すると、消える。 1H,1H−COSYスペクトルの助けを借りて、シグナルのアサインメントを
行った。
のNaH(60mmol)懸濁液を入れた。7.18gの6−N−ベンゾイルア
デニン(30mmol)を小分けして加え、ガスの発生が鎮まるまで、混合物を
供給した。15分後、7.95gのヨードラクタム9(30mmol)を加え、
溶液を暗闇で22時間攪拌した。ついで、溶液を0℃まで冷却し、1MのHCl
水溶液(24ml)を加えることによって、中和した。減圧(0.3ミリバール
、浴温60℃)下、溶剤を除去した。生じた残渣を100mlのMeOHに溶解
させ、15gのシリカゲル上に予め吸着させた。CH2Cl2/MeOH(12:
1)を使用して7×15cmのシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけると、
17gの黄色のオイルを与え、これを15mlのMeOH中で再結晶すると、無
色の固体として8.2gの化合物15a(22mmol;73%)を与え、これ
は、さらなる反応のために十分な純度であった。分析試料は、MeOH/Et2 Oから再結晶することによって得られた。
2ml)および250mlの乾燥メタノールを入れた。15aが完全に溶解する まで、懸濁液を加熱した。1.62gのNaOMeの5.5リットルMeOH溶
液をついで加え、混合物を室温で19時間攪拌した。生成する懸濁液を濾過し、
沈殿をEt2Oで洗浄した。イオン交換樹脂(Amberlite IR−12 0,H+形)を加えることによって、濾液を中和した。樹脂を濾去し、減圧下で 溶剤を除去した。残渣を4mlのMeOHに溶解させ、30mlのEt2Oを加 えることによって、沈殿させた。沈殿を濾過し、合わせた沈殿を減圧で乾燥させ
ると、5.8gの化合物15b(21mmol,97%)を与え、これは、さら
なる反応のために十分な純度であった。分析試料は、MeOH/H2Oから結晶 させることによって得られた。
)、200mlの乾燥DMFおよび17.1mlのジメチルホルムアミドジエチ
ルアセタール(100mmol)を入れた。混合物を80℃に3時間加熱した。
生ずる透明な溶液を減圧(0.4ミリバール、60℃浴温)下で濃縮すると、6
.9gの粗製の化合物15cを与え、これは、さらに精製することなく使用した
。
20mmol)と100mlの乾燥CH2Cl2とを入れた。攪拌しつつ、2.8
mlのトリエチルアミン(20mmol)を加え、続いて、8.7gのBoc2 O(40mmol)と2.44gのDMAP(20mmol)とを加えた。全て
の出発物質が消費されるまで、溶液を室温で16時間攪拌した。減圧下、溶剤を除
去し、生ずる残渣をクロマトグラフィー(7×16cmシリカゲル、溶離液CH 2 Cl2/MeOH20:1)によって精製すると、8.2gの黄色の固体を与え
、これを100mlの丸底フラスコに移した。ついで、50mlのEt2Oを加 え、還流下、混合物を2時間超音波処理した。室温まで冷却後、混合物を濾過し
、Et2Oで沈殿を処理し、超音波でもう1回処理した。濾過すると、6.66 gの幾分黄色がかった固体の化合物15d(78%)を与え、これは、さらなる
反応のために十分な純度であった。
.5mmol)と150mlの乾燥CH2Cl2とを入れた。11.55gのp−
トルエンスルホン酸ヒドラジド(62.0mmol)をついで加え、続いて、1
.47gのTsOH(7.75mmol)を加えた。溶液を室温で44時間攪拌
した。150mlのCH2Cl2を加えた後、溶液を水で3回洗浄し、2MのNa
OHを加えることによって、pH>12に調整した。合わせた洗浄溶液を100
mlのCH2Cl2で抽出し、合わせた有機相をMgSO4上で乾燥させた。濾過 後、減圧下で溶剤を除去し、生ずる残渣をクロマトグラフィー(5.2×20c
mシリカゲル、溶離液:CHCl3/MeOH30:1)によって精製すると、 4.96gの化合物15e(86%)を与え、これは、さらなる反応のために十
分な純度であった。分析試料は、THF/シクロヘキサンから結晶させることに
よって得られた。
13.3mmol)と60mlの乾燥CH2Cl2とを入れた。5.35mlの乾
燥ピリジン(66.5mmol)をついで加え、続いて、1.59gのDMAP
(1.3mmol)を加えた。0℃まで冷却後、5.4mlの4−メトキシベン
ゾイルクロライド(39.9mmol)を滴下し、混合物を0℃で15分間攪拌
した。氷浴を除去し、反応混合物を室温で22時間攪拌した。ついで、反応混合
物を0℃まで再度冷却し、35mlのMeOHを滴下した。0℃で30分後、8
0mlのNH3飽和MeOH溶液を滴下した。白色の沈殿が形成され、これは、 溶液を完全に加えた後、溶解した。30分後、氷浴を除去し、反応物を室温でさ
らに2時間攪拌した。ついで、減圧下、溶剤を除去し、生ずる残渣を200ml
のCH2Cl2に溶解させた。NaHCO3飽和溶液およびクエン酸水溶液(20 %,2×100ml)で連続して溶液を洗浄し、MgSO4上で乾燥し、濾過し 、減圧で濃縮した。生ずる残渣をクロマトグラフィー(5.2×18cmシリカ
ゲル;溶離液:EtOAc/MeOH40:3)により精製すると、5.93g
の化合物15f(88%)を与えた。
15f(10.36mmol)と200mlのTHFとを入れた。0℃まで冷却
した後、50ml水中2.17gのLiOH×H2O(51.8mmol)溶液 を20分間かけて滴下した。ついで、30mlのMeOHを加え、氷浴を除去し
、反応混合物を室温で1時間攪拌した。イオン交換樹脂(Amberlite
IR−120,H+形)をついで加え、pH7に到達させた。濾過によって、樹 脂を除去し、溶液を減圧下で濃縮し、体積100mlとした。200mlのH2 Oをついで加え、1MのHCl水溶液を加えることによって、pHを2に調節し
た。溶液をEtOAc(3×200ml)で抽出し、合わせた有機抽出物をMg
SO4上で乾燥させ、濾過し、減圧で濃縮した。生ずる残渣を25mlの高温M eOHに溶解させた。ついで、10mlのH2Oを加えることによって、生成物 を沈殿させた。沈殿を濾過し、H2Oで洗浄し、P4O10上で乾燥させると、1.
95gの化合物16を与えた。母液および洗浄溶液からさらに0.57gを得る
ことができ、合計収率46%を与えた。
コポリマー(Tentagel S HMB,0.23mmol/g)であり、
これは、水溶液中でも有機溶剤中でも良好な膨潤性を有する。ポリマーのアミノ
エチル官能基は、ヒドロキシメチルベンジル(HMB)リンカーで誘導され;第
1のA単位での負荷は、対称無水物法(DICの2.5当量およびDMAPの2
.5当量の添加)に従い5倍量使用し、DCM中20時間の過程で行う。
保護されたモノマー単位のカップリングとからなる繰り返しサイクルによって行
う。合成の終了時において、N−末端Boc保護基は、50%のTFA/DCM
を使用して除去し、オリゴマーは、2NのHCl/MeOHを使用してHMBリ
ンカーから開裂させ、さらなる変換実験のためにHPLCによって精製される。
、50%TFA/DCM(30分)を使用して除去され、ついで、樹脂は、DCM
で洗浄され、1MのDIEA/DMFで中和され、アミンがなくなるまでDMF
で洗浄される。カップリングは、各々、DMF中、HATU(3当量)でモノマ
ー単位(3当量)の予備活性化後に1MのDIEA/DMF(6当量)と2Mの
ルチジン/DMF(12当量)の添加で行われる。カップリング時間は、室温で
3時間である。カップリングサイクルの完了後、未反応のアミノ官能基は、ピリ
ジン(10当量)を添加した無水酢酸(20当量)を使用してキャップされる。
HPLCによって反応をモニターするためには、各カップリング工程後、数個の
樹脂ビーズを取りだし、Boc保護基の除去のために、50%TFA/DCMで
処理した。ついで、それぞれのオリゴマーを、2NのNaOH/MeOH(15 分間、室温)を使用して除去し、取り出した溶液は、HClを使用して中和し、
RP−HPLCによって分析した。
5℃に2.5時間保つことによって達成される。精製は、除去溶液のHClでの
中和後にRP−HPLCによって行われる。合成生成物の単離したHPLC画分
は、分析HPLCを使用して、それらの純度についてチェックし、エレクトロス
プレー(ESI)質量分光法を使用して、明瞭に特性決定し、可逆的なUV遷移
曲線は、265nm(5mMのトリス/HCl中cATATA=27.9μM;pH7
.0)で記録し(図4)、それにより、ペアリングシステムとしての適性が立証 される。
30分) 吸収極大:263nm
とBoc−リシン(Fmoc)単位とをカップリングさせる。DMF中40%の
ピペリジンを使用して、Fmoc基を除去し、固相をDMFで洗浄し、ついで、
DMF中ヨード酢酸(20当量)およびDIC(20当量)で処理する。室温で
15時間後、溶液を濾去し、樹脂をDMFで洗浄し、DMF中ペプチドCYSK
VGで処理する。それを室温で15時間放置し、溶液を濾去し、樹脂をDMFお
よびMeOHで洗浄する。樹脂からの除去は、2MのNaOH水溶液とMeOH
(1:1)とを使用して行い、除去溶液を55℃に2.5時間加熱する。冷却後
、それを2Mの塩酸で中和し、RP−HPLC(0.1%強のTFA水中10〜
40%のアセトニトリルで30分)を使用して、生成物を単離する。減圧でアセ
トニトリル画分から生成物画分を遊離させ、500μlの水溶液に濃縮する。こ
の溶液をSepPak Plus C18カートリッジ(Waters)により
脱塩し、1mlの水溶液に調整する。オリゴマーの濃度は、c=140μmol
/l(265nmでのE=1.004、70℃で測定した)であった。
モダイマーとして存在し、他方、40℃以上では、ホモダイマーは、検出するこ
とができないことを示す。この平衡は、可逆的であり、ホモダイマーの画分は、
温度および濃度の選択によって調整することができる。
験条件下で行った。CNA Ac−CNA(AATAT)−Lys−OH(1)
のペプチドH−Cys−Ser−Lys−Val−Gly−OH(3)との共役
を以下に記載する。
メチルスルホキシド中150当量のN−スクシニミジルヨードアセテート(10
2μmol,28.9mg)と、遮光して2時間振盪した。生成物Ac−CNA
(AATAT)−Lys(Nε-ヨート゛アセチル)−OH(2)は、分取用RP−HP LCにより、直接、精製し、RP−C18カートリッジ上で脱塩した。 分析RP−HPLC:Rt=17.93分 ESI−MS:MI(計算値)=1699.7,MI(測定値)=1699.4 6.2 化合物2のH−Cys−Ser−Lys−Val−Gly−OH(3
)との共役 化合物3(127nmol,83μg,含量約70%)の0.5Mリン酸塩緩
衝液、20mMのEDTA pH6.0の30μl溶液を化合物2(106nm
ol)の20μlの水/ジメチルホルムアミド(1:1)溶液に加え、混合物を
、遮光しながら、振盪した。1時間後、ペプチドは、実際、完全に反応したが、
CNAは、約50%反応したのみであった。同じ量のペプチドを緩衝液に再度加
え、遮光しつつ1時間振盪することにより、化合物2は、完全に反応した。CN
A−ペプチド共役体は、RP−HPLCにより、直接、精製し、RP−C18カ
ートリッジ上で脱塩した。 分析RP−HPLC:Rt=16.93分 ESI−MS:MI(計算値)=2227.6,MI(測定値)=2227.4 実施例 7 リン酸化による溶解度の改良 7.1.1. DMT−保護−4−ヒドロキシ酪酸(Hba)のAATAT−
HMB樹脂へのカップリング 0.15mmol/gの樹脂(0.015mmol)の塗膜を有するAATA
T−HMB樹脂100mgを、最後のBoc保護基の除去後、DMF中1MのD
IPEA溶液5mlを使用して、フリットを有する5mlのシリンジ内で中和し
、DMFで4回洗浄した。0.15mmol(61mg)のDMT−Hba(M
=406.48)と0.15mmol(57mg)のHATU(M=380.2
)とを2mlのNMPに溶解させ、振盪した。10分後、0.9mmolのDI
PEA(DMF中1M溶液900μl)を加え、振盪した。カップリング溶液を
樹脂に加え、樹脂を有するシリンジを(約0.5回転/秒で)短いシリンジ軸の
周りに4時間回転させて、良好な混合を生じさせた。溶液をシリンジから押出し
、樹脂を4mlのDMFで4回および4mlのDCMで2回洗浄した。
Mで4回洗浄し、乾燥アクリロニトリル(ACN)で3回洗浄した。樹脂をデシ
ケーター中、P2O5上で乾燥させた。
び酸化 乾燥ACN中、0.5Mのピリジニウム塩酸塩2mlを使用して、アルゴン下
、樹脂を膨潤させた。10当量(0.15mmol,41mg)のビス(2−シ
アノエチル)N,N,−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト(M=271
.3)を加え、混合物を20分間回転させた。樹脂を4mlの乾燥ACNで4回
洗浄し、デカリン中6Mのt−BuOOH0.5mlおよびACN1mlで30
分間酸化した。ついで、それを乾燥ACNで4回洗浄した。
いで、それをACNで6回洗浄した。
れをさらに2mlの水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、生ずる溶液を55℃に3時
間保った。2MのHClで中和後、化合物をRP−HPLC(溶離液:0.1%
のTFAを含む水/アセトニトリル)で精製した。
ようにして、脱塩し、室温および減圧で濃縮乾固させた。
に独立に、同一または異なり、H;または、CnH2n+1(ここで、nは、1−1 2の整数に等しい。)である。]に等しく; R2は、CmH2m−C(X)−Y[ここで、Xは、=O、=Sまたは=Nに等し く、Yは、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、R3およびR4は、上記した意
味を有する。)に等しいか;または、Xは、NR3R4およびOR3、特に、NR3 R4、とりわけ、NH2に等しく、mは、1−4の整数である。]に等しいか;ま たは、 R2は、CmH2m−Z−Y’[ここで、Zは、スルホニル、ホスホニル、エーテ ルまたはアミノ基に等しく、ここで、Zがスルホニルまたはホスホニル基に等し
い場合、Y’は、H;CnH2n+1、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、n、 R3およびR4は、上記した意味を有する。)に等しく、Zがエーテルまたはア
ミン基に等しい場合、Y’は、CnH2n+1に等しい。]に等しく; A、BおよびDは、相互に独立に、同一または異なり、CR5R6、O、NR7 またはS[ここで、R5、R6、R7は、相互に独立に、H;または、CnH2n+1( ここで、nは、上記した意味を有する。)である。]であり; Cは、CR8またはN[ここで、R8は、独立に、R5の意味を表す。]に等しい が、A−B、B−CまたはC−Dは、2つの同一のヘテロ原子ではないが; ただし、基A、B、CおよびDは、全て、同時に、所望により、置換された炭
素原子ではなく; ヌクレオ塩基は、チミン、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、イソシ
トシン、イソグアニン、キサンチンまたはヒポキサンチンを表す。〕 で表される化合物。
に独立に、同一または異なり、H;または、CnH2n+1(ここで、nは、1−1 2の整数に等しい。)である。]に等しく; R2は、CmH2m−C(X)−Y[ここで、Xは、=O、=Sまたは=Nに等し く、Yは、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、R3およびR4は、上記した意
味を有する。)に等しいか;または、Xは、NR3R4およびOR3、特に、NR3 R4、とりわけ、NH2に等しく、mは、1−4の整数である。]に等しいか;ま たは、 R2は、CmH2m−Z−Y’[ここで、Zは、スルホニル、ホスホニル、エーテ ルまたはアミノ基に等しく、ここで、Zがスルホニルまたはホスホニル基に等し
い場合、Y’は、H;CnH2n+1、OR3、NR3R4またはSR3(ここで、n、 R3およびR4は、上記した意味を有する。)であり、Zがエーテルまたはアミン
基に等しい場合、Y’は、CnH2n+1に等しい。]に等しく; A、BおよびDは、相互に独立に、同一または異なり、CR5R6[ここで、R5 、R6は、相互に独立に、H;または、CnH2n+1(ここで、nは、上記した意味
を有する。)である。]であり; Cは、CR8[ここで、R8は、独立に、R5の意味を表す。]に等しく; ヌクレオ塩基は、チミン、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、イソシ
トシン、イソグアニン、キサンチンまたはヒポキサンチンを表す。〕 で表される化合物。
〜請求項22の1項に記載のオリゴマー、請求項23または請求項24に記載の
共役体および/または請求項25に記載のキャリヤーのペアリングシステムおよ
び/または試験システムにおける使用。
Claims (25)
- 【請求項1】 式Iの化合物: 【化1】 [式中、 R1はNR3R4、OR3またはSR3であり、R3およびR4は互いに独立して、 同一かまたは異なり、HまたはCnH2n+1であり、ここでnは1〜12の整数で あり; R2はCmH2m−C(X)−Yであり、Xは=O、=Sまたは=Nであり;Yは
OR3、NR3R4またはSR3であり、ここでR3およびR4は前記の意味を有し、
またはXはNR3R4およびOR3、特にNR3R4、殊にNH2であり;mは1〜4
の整数であり;あるいは R2はCmH2m−Z−Y′であり、Zはスルホニル基、ホスホニル基、エーテル
基またはアミン基であり、その際、Zがスルホニル基またはホスホニル基である
場合、Y′はH、CnH2n+1、OR3、NR3R4またはSR3であり、ここでn、 R3およびR4は前記の意味を有し、Zがエーテル基またはアミン基である場合、
Y′はCnH2n+1であり; A、BおよびDは互いに独立して、同一かまたは異なり、CR5R6、O、NR 7 またはSであり、R5、R6およびR7は互いに独立して、HまたはCnH2n+1で あり、ここでnは前記の意味を有し; CはCR8またはNを意味し、R8は独立してR5の意味を有し、ただしA−B 、B−CまたはC−Dは2つの同一異種原子を意味せず;そして 核酸塩基はチミン、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、イソロイシン
、イソグアニン、キサンチンまたはヒポキサンチンを意味する]。 - 【請求項2】 R1がNR3R4またはOR3であり、R2がCmH2m−C(X)−
Yであり、XがNR3R4またはOR3であり、かつYがOR3またはNR3R4であ
ることを特徴とする、請求項1記載の化合物。 - 【請求項3】 R1がNH2であり、R2がCH2−COOHであることを特徴と
する、請求項1または2記載の化合物。 - 【請求項4】 [2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル]−
核酸塩基から選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の
化合物。 - 【請求項5】 1−[2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル
]−チミン、1−[2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル]−
ウラシル、1−[2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル]−シ
トシン、9−[2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル]−アデ
ニンまたは9−[2−アミノ−4−(カルボキシメチル)シクロヘキシル]−グ
アニンから選択されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の化
合物。 - 【請求項6】 化合物が鏡像異性体として純粋であることを特徴とする、請求
項1〜5のいずれか1項記載の化合物。 - 【請求項7】 R1および/または核酸塩基が保護基を有することを特徴とす る、請求項1〜6のいずれか1項記載の化合物。
- 【請求項8】 保護基がBOC−、BOM−、FMOC−、エーテル−または
アセタール保護基から選択されることを特徴とする、請求項7記載の化合物。 - 【請求項9】 核酸塩基がエクアトリアルに配置していることを特徴とする、
請求項1〜8のいずれか1項記載の化合物。 - 【請求項10】 ヨードシクロアルカンを保護された核酸塩基に結合させるこ
とを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の化合物の製造方法。 - 【請求項11】 ヨードシクロアルカンがヨードラクタムであることを特徴と
する、請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 次の工程で、前工程からのラクタムを活性化し、次いでラク
タム環を求核開環することを特徴とする、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 ヨードシクロアルカンが鏡像異性体として純粋な形で存在す
ることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項14】 ヨードシクロアルカンを、保護された核酸塩基に水素化物の
存在下で結合させることを特徴とする、請求項10〜13のいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項15】 ラクタムを保護基の導入により活性化することを特徴とする
、請求項11〜14のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項16】 ラクタム環を工程(c)に従ってヒドロペルオキシドにより
開環することを特徴とする、請求項11〜15のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項17】 請求項1〜9のいずれか1項記載の化合物を含むオリゴマー
。 - 【請求項18】 さらに少なくとも1種の連結基を含むことを特徴とする、請
求項17記載のオリゴマー。 - 【請求項19】 連結基がリシン−連結基であることを特徴とする、請求項1
8記載のオリゴマー。 - 【請求項20】 活性化した連結基で誘導体化されていることを特徴とする、
請求項17〜19のいずれか1項記載のオリゴマー。 - 【請求項21】 活性化した連結基がヨードアセチルスクシンイミドおよび/
またはビス(ヒドロキシスクシンイミジル)グルタレートであることを特徴とす
る、請求項20記載のオリゴマー。 - 【請求項22】 オリゴマーがリン酸化されていることを特徴とする、請求項
17〜21のいずれか1項記載のオリゴマー。 - 【請求項23】 請求項17〜22のいずれか1項記載のオリゴマーおよび生
体分子を含有する複合体。 - 【請求項24】 生体分子がペプチド、ペプトイド、タンパク質、細胞成分、
フィラメント成分、または核酸、およびその誘導体であることを特徴とする、請
求項23記載の複合体。 - 【請求項25】 少なくとも1種の請求項1〜9のいずれか1項記載の化合物
、および/または少なくとも1種の請求項17〜22のいずれか1項記載のオリ
ゴマー、および/または請求項23または24記載の複合体がそれに固定化され
ていることを特徴とする、キャリヤー。
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