JP2001516877A - 高度グリケーション最終産物の測定および除去方法 - Google Patents

高度グリケーション最終産物の測定および除去方法

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アル−アベド，ユーセフ
ブカーラ，リチャード
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Abstract

(57)【要約】 高度グリコシル化最終産物(AGE) の形成を測定するための手段を提供するキットを標準化する手段が開示されている。本発明はさらに、抗原性であり、診断アッセイにおいて有用性を有する抗体を形成するため、かつ診断アッセイを標準化するために有用である新規な単離されたAGE を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の技術分野） 本発明は、in vivo およびin vitroで形成される高度グリケーション最終産物
(AGE) と免疫交差反応性を示すAGE 架橋物(crosslink) を提供する。詳細には、
本発明は、試料中のAGE 濃度を測定する、抗体に基づく診断アッセイを標準化す
る方法であって、規定量のある種のAGE 縮合生成物を加えることを含む方法を提
供する。
【０００２】 （発明の背景） グリケーション反応は、食物の調理中に褐色色素の出現によって明白であり、
メイラード(Maillard)によって1912年に同定された。メイラードは、グルコース
または他の還元糖が、アミノ含有化合物（アミノ酸およびペプチドを含む）と反
応して付加物を形成し、この付加物は、一連の脱水および転位を受けて、安定な
褐色色素を形成することを観察した。熱処理した食物は、グルコースとポリペプ
チド鎖との反応の結果、非酵素的褐色化を受ける。かくして、タンパク質のグリ
コシル化の結果発生する褐色の色の発生の原因となる色素は、特徴的スペクトル
および蛍光特性を持っていた。
【０００３】 還元糖とアミノ含有基質との初期の反応後、非酵素的なメイラード反応経路（
種々の脱水、酸化、脱離、縮合、開裂および他の化学変化を含む）で次の反応が
生じて、おびただしい一連の「早期の」かつ「後期の」グリケーション付加物を
生成する。より高度なグリケーション付加物は、時には、分子内および分子間架
橋活性を有するある種の黄褐色の蛍光色素として記載される。特定のグリケーシ
ョン存在物は、高度グリケーション最終産物( またはAGE)の広く発散したプール
内に低い発生量で生じる。かなりの研究活動にもかかわらず、後者のグリケーシ
ョン付加物および生成物は、ほんの少ししか分子構造が決定されていない。さら
に、これらの同定された、in vivo で形成された高度グリケーション構造の生物
学的プロセスに対する寄与は、不十分にしか理解されていない。したがって、AG
E を同定し、その生物学的特性を決定する必要性がある。
【０００４】 高度グリケーションのプロセスは、アミノ基を有する還元糖の可逆の相互作用
から、変化したスペクトルおよび共有架橋性を有する、より複雑な不可逆に結合
した構造へと導く。これら後者の生成物（高度グリケーション最終産物またはAG
E と呼ばれる）は、メイラード反応について最初に記載された〔レドル(Ledl)お
よびシュライヒャー(Schleicher)、「Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 」29:565,
1990およびメイラード、C. R. Hebd. 「Seances Acad. Sci.」154:66 1912 〕化
学の原理によって、in vitroまたはin vivo で生じる。しかし、生体系における
メイラード型反応の潜在的重要性は、たった最近15年にわたって認識されただけ
であり、高度グリケーションという語は、マクロ分子を含み、生理学的条件下で
生じるメイラード化学のこれらの面で、特に言及するようになってきた。種々の
状況下で生体組織中にAGE が生じること、および、それらが、タンパク質代謝回
転、組織改造(remodelling) および糖尿病の病理学的後遺症および老化において
重要な役割を演じることが明らかである〔ブカラ(Bucala)およびセラミ(Cerami)
、「Adv. Pharm. 」23:1 1992 〕。
【０００５】 タンパク質のグリケーションにおける初期の出来事は、還元糖例えばグルコー
スと、タンパク質のN-末端もしくはリシンのε‐アミノ基とが反応して、アルジ
ミンまたはシッフ塩基を形成することである。シッフ塩基は、加水分解してその
反応体へ戻るか、またはアマドリ転位を受けて、より安定なN epsilon - （1-デ
オキシ-1- フルクトシル）リシン（アマドリ生成物、AP）を形成することができ
る。反応性の架橋部分へ到る反応経路（すなわち、AGE 形成）は、APのさらなる
転位または分解によって始まる。AP前駆体からグルコース‐誘導されたタンパク
質架橋物に至る可能な経路は、in vitroでAPの結末を調べるモデル研究によって
のみ示唆された。
【０００６】 １つの経路は、脱水によるAPの4-ヒドロキシ基の喪失によって進んで、1,4-ジ
デオキシ-1- アルキルアミノ-2,3- ヘキソジウロース（AP- ジオン）を与える。
アミノ-1,4- ジデオキシオソンの構造を有するAP- ジオンは、アミノグアニジン
（AGE 形成の阻害剤）でモデルAPを捕らえることによって単離された〔チェン(C
hen)およびセラミ(Cerami), 「J. Carbohydrate Chem. 」12:731, 1993〕。次に
、5-ヒドロキシの引き続く脱離が、1,4,5-トリデオキシ-1- アルキルアミノ-2,3
- ヘキシウロス-4- エン（AP- エン‐ジオン）を与え、これは、その1,2-エノー
ル形のトリアセチル誘導体として単離された〔エステンドルファー(Estendorfer
) ら、「Angew. Chem. Ent. Ed. Engl. 」29:536, 1990〕。AP- ジオンとAP- エ
ン‐ジオンとの両方が、タンパク質架橋反応において、例えばアルギニンからの
グアニジン部分またはリシンからのε‐アミノ基の付加のための標的として働く
ことによって、非常に反応性であることが期待される。
【０００７】 ジカルボニル含有化合物、例えばメチルグリオキサール、グリオキサールおよ
びデオキシグルコーソンは、アルギニンおよびリシンの側鎖との縮合反応に関与
する。例えば、メチルグリオキサールの、アルギニンのグアニジン部分への付加
は、イミダゾール-4- オン付加物〔ロー(Lo)ら、「J. Biol. Chem.」269:32299,
1994 〕およびピリミジニウム付加物〔アル‐アベッド(Al-Abed) ら、「Bioorg
. Med. Chem. Lett.」6:1577, 1996〕の形成に至る。１つの研究において、セル
(Sell)およびモニアー(Monnier) は、ヒトの硬膜のコラーゲンから、リシン、ア
ルギニンおよび還元糖前駆体の縮合生成物である、AGE の蛍光を発する架橋物で
あるペントシジンを単離した〔セル(Sell)およびモニアー(Monnier) 、「J. Bio
l. Chem.」264:21597, 1989 〕。ペントシジン形成のメカニズムは不明のままで
あるが、架橋は、リシンを結合した、グルコース‐誘導された中間体が、アルギ
ニンのグアニジン基と不可逆に反応することができるジカルボニル官能性を含む
ことを必要とする。
【０００８】 証拠の数行は、AGE が生体組織に存在し〔ブカラ(Bucala)およびセラミ(Ceram
i)、「Adv. Pharm. 」23:1 1992 〕、in vivo で生ずる主なAGE 架橋物の同定は
なお不明なままであることを確認した。それにもかかわらず、近年の生理学に基
づくデータは、安定な架橋物形成におけるAP- ジオン経路の重要性を確認した〔
ヴァサン(Vasan) ら、「Nature」 382:275, 1996〕。AGE の構造に関する正確な
データの欠如は、タンパク質の主鎖を除去するために使用される標準加水分解法
に対するAGE 架橋物の変わりやすさおよび、架橋物それ自体の起こり得る構造的
不均質性によるものであった。さらに、病理学的に関連した架橋物はそれ自体蛍
光性でないことがあることを示唆するデータがあり〔ダイヤー(Dyer)ら、「J. C
lin. Invest.」91:2463, 1993 〕、これは、歴史的にAGE 形成と関連していて、
in vivo でのメイラード反応の指標としてほとんど例外なく使用されてきた特性
である。
【０００９】 AGE 架橋した抗原に対する高度免疫化法は、in vivo で形成されたAGE を認識
するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を生成した〔マキタ(Makit
a)ら、「J. Biol. Chem.」267:1997, 1992〕。これらの抗体は、特異性がなく、
従来の蛍光に基づくアッセイに関連する他の技術的問題をもたない免疫組織化学
のELIZA に基づく技術の発達を可能にし、生体系における高度グリケーションの
最初の感度のよい定量的な成績評価を与えた。これらの抗‐AGE 抗体は、in viv
o で優勢であるが、FFI 、ペントシジン、ピラリン、CML またはAFGPのような先
に特徴づけられていた構造とは免疫化学的に異なるある種のAGE を認識すること
がわかった〔マキタ(Makita)ら、「J. Biol. Chem.」267:1992, 1992〕。
【００１０】 これらの抗体によって認識された特異的AGE エピトープは、糖尿病または、種
々のタンパク質（例えばコラーゲン、ヘモグロビンおよびLDL ）上のタンパク質
年齢の結果として増加した〔マキタ(Makita)ら、「J. Biol. Chem.」267:1997,
1992；マキタ(Makita)ら、「Science 」258:651, 1992 ；ウォルフェンブッテル
(Wolffenbuttel) ら、「The Lancet」347, 513, 1996；およびブカラ(Bucala)ら
、「Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 」91:9441, 1994 〕。１つの特定のポリク
ローナル抗体種（「RU」と称する）が、ヒトの臨床試験でテストされたELIZA ア
ッセイにおいて使用された。免疫反応性のAGE は、生理学的阻害剤であるアミノ
グアニジンの投与により、形成が阻害されること〔マキタ(Makita)ら、「Scienc
e 」258:651, 1992 ；およびブカラ(Bucala)ら、「Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A. 」91:9441, 1994 〕ならびに、糖尿病による腎臓疾患に相関する重要な徴候
の情報を与えることがわかった〔バイシュウェンガー(Beisswenger) ら、「Diab
etes」44:824, 1995〕。
【００１１】 アテローム硬化症、腎不全およびアミロイド沈着として、そのような年齢に関
連し、かつ糖尿病に関連する状態の病因における高度グリケーションの経路を含
意する多数のデータの増加にもかかわらず、in vivo で生じる病理学的に重要な
AGE 架橋物の構造の解明は、挑戦中の問題であった。in vivo で生じるAGE の研
究は必然的に、架橋部分を、マクロ分子の主鎖から離して精製する化学的方法を
あてにしていた。これらの研究は、in vivo で生じる主な架橋物はたいてい酸で
変性しやすく、非蛍光性であるという認識に到った〔ブカラ(Bucala)およびセラ
ミ(Cerami)、「Adv. Pharm. 」23:1, 1992；セル(Sell)およびモニアー(Monnier
) 、「J. Biol. Chem.」264:21597, 1989 ；およびダイヤー(Dyer)ら、「J. Cli
n. Invest.」91:2463, 1993 〕。
【００１２】 しかしながら、予言的な抗体に基づく(ELIZA) 診断アッセイのために、そのよ
うな診断アッセイを標準化し、かつ改善することの両方に使用することができる
免疫原AGE を単離し、同定する必要性が当分野にある。本発明は、前記のゴール
を達成するための努力をした。さらに、タンパク質の老化がひどく有害であるす
べての用途において、高度グリコシル化最終産物の形成を測定する必要性が当分
野にある。これは、例えば食物技術の領域（すなわち、食物損傷の量の測定）、
タンパク質および他のアミノ含有生体分子の腐敗性または貯蔵寿命の測定ならび
に薬剤組成物を包含する。
【００１３】 （発明の概要） 本発明は、診断アッセイとして、AGE の形成を測定するための手段を提供する
キットを標準化する手段を提供する。本発明はさらに、抗原性でありかつ診断ア
ッセイにおいて有用性を有する抗体を形成するため、かつ診断アッセイを標準化
するために有用である、新規な単離されたAGE を提供する。 本発明は、リシン成分、アルギニン成分および還元糖成分を含む、高度グリケ
ーション最終産物(AGE) 縮合生成物を提供する。好ましくは、縮合生成物は、式
Ｉ：
【化４】 に従うAGE である。ここで、リシン成分は、囲って区別した「K 」で示され；ア
ルギニン成分は、囲って区別した「R 」で示され；かつ還元糖成分は、囲われて
おらず；Ｒ1 およびＲ4 は独立して、Ｈまたは、アミノ酸残基もしくはペプチド
鎖へのアミド結合であり；Ｒ2 およびＲ3 は独立して、ＯＨまたは、アミノ酸残
基もしくはペプチド鎖へのアミド結合であり；Ｒ5 は、Ｈ、ＣＨ2 ＯＨまたはＣ
ＨＯＨＣＨ2 ＯＨであり；Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 またはＲ4 のうちの１つより多くが
アミド結合であるなら、リシン「K 」成分およびアルギニン「R 」成分は、同じ
または異なるペプチド鎖のアミノ酸残基であり得る。最も好ましくは、縮合生成
物は、以下の反応スキームの左に示した構造ＩＩを有するALI （arg-lys-イミダ
ゾール結合）である：
【化５】 ここで、ＺはＨ、カルボキシベンゾイルまたは、Arg およびLys 基に結合した
ポリペプチドの残余であり、Ｙは、ＯＨまたはポリペプチドの残余である。 本発明はさらに、高度グリコシル化最終産物のマクロファージ認識および除去
を増加する方法であって、治療量の式Ｉの化合物を哺乳動物に投与することを含
む方法を提供する。
【００１４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、in vivo で生じるAGE と反応性の抗-AGE抗体の特異性を利用して、
AGE の合成混合物中に含まれる新規な架橋部分を同定することによってなされた
。この選択方法は、反応体としてグルコースおよびＮalpha - ブロックされたジ
ペプチド（Ｎalpha -Z-arg-lys）からなる合成混合物中に0.6 ％収率で形成され
る単一の免疫反応性AGE を見出した。ALI は、抗-AGE抗体「RU」と非常に反応性
であり、ナノモル量で急勾配の結合曲線を示す。
【００１５】 本発明は、lys-arg 型のジペプチドを用いて、ペントシジン型のAGE の形成の
ためのモデル系において隣接する残基の分子内架橋に基づく、新規な種類のAGE
（ALI と称する）を見出した。特に、本発明は、診断アッセイとして、AGE の形
成を測定するための手段を提供するキットを標準化する手段を提供する。本発明
はさらに、抗原性でありかつ診断アッセイにおいて有用性を有する抗体を形成す
るため、かつ診断アッセイを標準化するために有用である、新規な単離されたAG
E を提供する。
【００１６】 本発明は、リシン成分、アルギニン成分および還元糖成分を含む、縮合生成物
の高度グリケーション最終産物(AGE) を提供する。好ましくは、縮合生成物は、
式Ｉ：
【化６】 に従うAGE である。
【００１７】 ここで、リシン成分は、囲って区別した「K 」で示され；アルギニン成分は、
囲って区別した「R 」で示され；かつ還元糖成分は、囲われておらず；Ｒ1 およ
びＲ4 は独立して、Ｈまたは、アミノ酸残基もしくはペプチド鎖へのアミド結合
であり；Ｒ2 およびＲ3 は独立して、ＯＨまたは、アミノ酸残基もしくはペプチ
ド鎖へのアミド結合であり；Ｒ5 は、Ｈ、ＣＨ2 ＯＨまたはＣＨＯＨＣＨ2 ＯＨ
であり；Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 またはＲ4 のうちの１つより多くがアミド結合である
なら、リシン「K 」成分およびアルギニン「R 」成分は、同じまたは異なるペプ
チド鎖のアミノ酸残基であり得る。最も好ましくは、縮合生成物は、構造：
【化７】 を有するALI である。ここで、ＺはＨ、カルボキシベンゾイルまたは、Arg およ
びLys 基に結合したポリペプチドの残余であり、Ｙは、ＯＨまたはポリペプチド
の残余である。式Ｉの化合物は、１以上の、Arg およびLys を含むポリペプチド
を、還元糖、例えばリボース、グルコース、フルクトース、アスコルベートまた
はデヒドロアスコルベートと共に、生理的pHにて10〜300 時間、任意に短時間昇
温して、インキューベートすることによって製造される。好ましい化合物、例え
ば式ＩＩのALI は、Ｎalpha - ブロックされたジペプチド（例えば、Ｎalpha -Z
-arg-lysジペプチド、Ｎalpha -CBZ-arg-lys）を、還元糖、例えばリボース、グ
ルコース、フルクトース、アスコルベートまたはデヒドロアスコルベートと共に
、生理的pHにて10〜300 時間、任意に短時間昇温して、インキューベートするこ
とによって製造される。好ましいアミン保護基は、除去の容易さおよび、操作中
に立体化学的配置を保持する故に、CBZ （カルボキシベンジル）基である。形成
されたAGE は、例えばHPLCにより精製されて、式Ｉまたは式ＩＩのAGE を与える
。
【００１８】 AGE の生物学的活性の中で、安定な架橋物を形成することは、それらの最も重
要な病理学的徴候であると考えることができる。イミダゾールに基づく式ＩのAG
E は、in vivo で生じる病理学的に重要なAGE 架橋物の主な種である。ALI 付加
物の形成のメカニズムは、重大な反応性中間体としてのAP- ジオンの重要性を示
し、さらに、この中間体ならびに、不可逆のタンパク質‐タンパク質架橋におけ
るその脱水生成物、AP- エン- ジオンを含んだ先の製薬的に基づく研究を確認す
る〔ヴァサン(Vasan) ら、「Nature」382:275, 1996 〕。これらの中間体はまた
、リン脂質の高度グリケーションと関連する酸化的反応に参加するのに十分なレ
ドックスの能力を示すことができる環化生成物サイペントジン〔ツァン(Zhang)
およびウルリッヒ(Ulrich), 「Tetrahedron Lett. 」37:4667, 1996 〕の形成に
含まれていた〔ブカラ(Bucala)ら、「Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 」90:643
4, 1993 ；およびブカラ(Bucala)、「Redox Reports 」2, 291, 1996〕。
【００１９】 アマドリ生成物前駆体からグルコース‐誘導されたタンパク質架橋物へ到る幾
つかの可能なin vivo の合成経路がある。出願人らは、in vitroでアマドリ生成
物の結末を調べるモデルを試験した。例えばアマドリ生成物は、脱水を受けて1,
4-ジデオキシ-1- アルキルアミノ-2,3- ヘキソジウロース(AP-ジオン）を与える
（図２）。ジペプチドＮalpha -Z-arg-lysは、AGE 形成のための典型的な出発物
質として使用された。アルギニンおよびリシン残基が互いに近接していることは
、安定な分子内架橋形成を促進した。Ｎalpha -Z-arg-lysジペプチドは、10当量
のグルコースと共に、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.4 ）中で、37℃にて５週間インキ
ュベートされた。この反応混合物は、HPLCによるこの混合物の分画後に認められ
た少なくとも25個の別個の反応生成物を生成した。
【００２０】 各画分を分離し、濃縮し、ポリクローナル抗-AGE抗体（RU）（先に、高血糖症
の結果in vivo で増加し、高度グリケーション阻害剤であるアミノグアニジンで
治療することによってヒト対象で形成が阻害される、ある種のAGE を認識するこ
とが示されている）との反応性について分析した。１つの画分内に存在する生成
物（1.5 ％収率）は、投与量依存様式でAGE についての競合ELIZA アッセイにお
いて、抗体結合をブロックすることがわかった。したがって、式I の化合物は、
標準の標的もしくは標準の競争物またはその両方として、AGE に基づく診断アッ
セイを標準化するのに有用である。HPLCによるこの分画のさらなる精製は、１つ
の主な（0.6 ％収率）免疫反応性化合物の存在を示した。UV、ESMSおよび1H-NMR
スペクトルによるこの付加物の特性決定は、分子内arg-lys ‐イミダゾール架橋
物( 式ＩＩのALI)の存在を示した。この架橋物は、非蛍光性で、酸で変わりやす
く、かつ、in vivo で生じる重要な種類の免疫反応性AGE-架橋物を表すことがで
きる。
【００２１】 種々のハプテン、抗原および接合した(conjugated)免疫原（本発明のAGE に対
応し、実施例１に記載したAGE ALI を含むが、これに限定されない）は、インキ
ュベーション混合物からの単離によってか、または直接合成の方法によって、便
利に製造することができる。例えばＮalpha -Z- アルギニン‐リシンジペプチド
を、還元糖、例えばグルコースと、in vitroで、特に実施例１および２に記載さ
れたようにしてインキュベートして、AGE の混合物を形成することができ、この
混合物から、式ＩＩの特異的AGE ALI を、例えば実施例１および２に記載したHP
LC法を含む幾つかの便利な方法の１つによって精製することができる。このAGE
ALI を次に、免疫原として使用して、特異的なエピトープまたはその分子の特徴
を認識する種々の抗体を生じさせることができる。
【００２２】 好ましい実施態様においては、AGE ALI それ自体がハプテンと考えられ、これ
はCBZ 部分を有してまたは有しないで製造され、多数の公知の２価のカップリン
グ試薬、たとえばカルボジイミドのうちの任意のもの、または他のカップリング
反応を用いて、当分野で広く流布しているプロトコルにしたがって、幾つかの好
ましい担体タンパク質（例えば、鍵穴吸着物(KLH) であるヘモシアニン、サイロ
グロブリンおよび、最も好ましくはウシ血清アルブミン(BSA) を含む）の任意の
ものに結合される。あるいは、所望のAGE を、最初から合成することができる。
供給源にかかわりなく、ALI または関連するAGE （単独か、または担体タンパク
質に結合して）を、任意のよく知られた免疫化プロトコルで使用して、ALI ハプ
テンまたはALI 含有免疫原の分子の特徴についての抗体の特異性のために多くの
用途において有用な、抗体および関連する免疫試薬を生成することができる。
【００２３】 好ましいプロトコルにしたがって、数種の動物（例えば、マウス、ラット、ハ
ムスター、ヤギ、ウサギおよびニワトリを含む）の任意のものを免疫して、ALI
担体タンパク質接合体(conjugate) に対するポリクローナル抗血清を生成するこ
とができる。前記の動物種のうちの最初の３種は特に、次の、ハプテン‐特異的
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生成のために望ましい選択であ
る。免疫した動物の脾臓細胞からの該ハイブリドーマの生成は、当分野で一般に
行われている幾つかのプロトコルのうち任意のプロトコルによって、便利に成し
遂げることができ、このプロトコルは、適当な細胞系、例えば骨髄腫細胞系を用
いた融合による、免疫した脾臓細胞の不死化のために適当な条件を記載する。ハ
イブリドーマ生成のためのそのようなプロトコルはまた、免疫性の脾臓細胞／骨
髄腫細胞ハイブリドーマを選択し、クローン化する方法および、所望のエピトー
プに対する抗体を安定に分泌するハイブリドーマクローンを同定する方法を提供
する。
【００２４】 ウサギやヤギのような動物種は、ポリクローナル抗血清の生成のために、より
普通に使用されるが、結局ポリクローナル抗血清が望ましいのかモノクローナル
抗体が望ましいのかにかかわらず、ハプテン変性した担体タンパク質は典型的に
は、完全フロイントアジュバントのようなアジュバントと一緒に初めに投与され
る。免疫処置は、幾つかの経路（典型的には、腹腔内、筋肉内または皮内）のう
ち任意の経路で投与することができ；免疫されるべき種および製造されるべき最
終的な抗体の型に従って、当分野における特定の経路が好ましい。
【００２５】 次に、追加の免疫処置が一般に、アジュバント、例えばミョウバンまたは不完
全フロイントアジュバントと共に投与される。最初の免疫処置の後間隔をおいて
、追加の免疫処置を投与し；一般に、１ヶ月が適当な間隔であり、各追加免疫処
置後１週間と２週間の間に、血液試料を採取する。あるいは、優先的に抗担体タ
ンパク質抗体に対する抗ハプテン抗体を製造する努力において、種々のいわゆる
「高度免疫処置(hyperimmunization) 」スケジュール（一般に、時間において近
い間隔をとった追加の免疫処置を特徴とする）を時には使用する。
【００２６】 追加免疫後の血液試料中の抗体力価は、例えばオクタロニー拡散ゲルおよび直
接ELIZA プロトコルを含む幾つかの便利な形式の任意の形式で、ハプテン特異的
な免疫力価について比較することができる。典型的な直接ELIZA においては、規
定された抗原をアッセイウェル（典型的には96ウェルまたはミクロタイター(mic
rotiter)プレートの形で）表面上に固定化した後、アッセイウェル表面を洗い落
として、結合していない結合相手を除去することによって分離した一連のインキ
ュベーションを行う。
【００２７】 例として、アッセイプレートのウェルは、ハプテン／担体接合物(conjugate)
（好ましくは担体タンパク質が、試験されるべき抗体生成動物を免疫化するのに
用いたものとは異なる）の希釈緩衝水溶液を受け入れることができ；例えばALI/
KLH 接合物で免疫化した動物からの血清を、固定化したALI/BSA 接合物で装飾し
たアッセイウェルに対して試験することができる。あるいは、アッセイ表面は、
ハプテンだけとインキュベーションすることによって修飾され得る。一般に、ア
ッセイウェル表面を次に、無関係なタンパク質、例えばカゼインの溶液にさらし
て、プラスチック表面のふさがれていない部位をブロックする。非特異的な相互
作用を最小にするために、典型的には塩および洗剤を含む中性の緩衝液で洗い落
とした後、ウェルを次に、関心のある血液試料から調製した血清（一次抗血清）
の一連希釈の１つと接触させる。再び洗い落とした後、所望のハプテンまたはハ
プテン／担体接合物との相互作用によりアッセイウェル上に固定化した試験抗体
の範囲を、市販されていて入手可能な酵素‐抗体接合物とインキュベートするこ
とによって見積ることができ、ここで、この二次接合物の抗体部分は、一次抗血
清を製造するのに使用された種に対するものであり、例えば一次抗血清をウサギ
で生じさせたなら、ヤギで生じさせた、幾つかの酵素、例えばホースラディシュ
ペルオキシダーゼのうちの１つと接合させた抗ウサギ抗体の市販の調製品を二次
抗体として使用することができる。
【００２８】 製造者によって特定された手順にしたがって、一次抗体との相互作用によって
アッセイプレートに固定されたこの二次抗体の量を次に、比色アッセイで、結合
された接合酵素の活性によって、定量的に見積ることができる。多くの関連する
ELIZA または放射線免疫測定プロトコル、例えば競合的ELIZA またはサンドウィ
ッチELIZA （そのすべてが当分野で良く知られている）は、任意に置き換えられ
て、高力価の所望の抗血清；すなわち、高希釈（例えば、1/1000より大、より好
ましくは1/10,000より大）で真の陽性の結果を与える特定の抗血清を同定するこ
とができる。
【００２９】 同様の免疫測定プロトコルを使用して、免疫化した動物の脾臓細胞から調製し
たハイブリドーマからの培地上澄中の抗体の力価を見積ることができる。抗血清
またはハイブリドーマ上澄をそのように特徴づけることにおいて、偽陽性および
偽陰性の結果から抗体の特異性および力価の信頼性ある測定を確認するために、
免疫測定手順において種々の試薬を省略して、例えば、関連するが構造的に別個
のハプテンまたは抗原である異なる担体タンパク質を用いた種々の対照インキュ
ベーションを用いることが望ましい。これに関して使用するための対照インキュ
ベーションの型はよく知られている。また、次いで、同じ一般的免疫測定のプロ
トコルを、上記の手順によって同定された、高力価を有し、本発明のAGE におけ
る特異的構造決定子に対するべきものである抗血清と共に使用することができる
。これらの望ましい抗体を種々の用途において、特に生体試料、食料品または他
の関心のあるアミン含有物質および分子におけるAGE の存在および範囲を定量す
るために使用することができる。
【００３０】 所望の抗ALI 抗体のそのような後者の用途は、ポリクローナルにせよモノクロ
ーナルにせよ、指示と共に、任意に他の有用な試薬および希釈物と共に、（限定
されないが）AGE ALI の一組の分子標準を含んで、実験者の便利のためにキット
の形態で提供することができる。
【００３１】 実施例１ この実施例は、Arg-Lys-イミダゾール(ALI) を製造するための合成法を説明す
る。10mlの水性0.2Mリン酸緩衝液（pH 7.4）中のＮalpha -Z-arg-lys（1g、0.01
3 ミリモル）の溶液に、D-グルコース（0.13ミリモル）を加えた。反応混合物を
、37℃にて５週間撹拌した。間隔をあけて、10μl の反応混合物を、分析用プラ
イムスフェアー(Primesphere) カラム（5C18 MC 、5 ミクロン、250 x 4.6 mm、
Phenomenex、Torrance、CA）および２成分の溶媒勾配（0.05％TFA ／H2O （溶媒
A ）およびメタノール（溶媒B ）からなる）を用いてHPLCで分析した。溶媒を、
1ml/分の流速で次のように送出した。
【００３２】 0 〜30分：A:B (95:5)〜A:B (25:75) の直線勾配；30〜45分：A:B (25:75) 〜
A:B (0:100) の直線勾配。検出は、λ214 、254 、280 、320 および350nm での
UV吸収を監視することによった。HPLCによりこの混合物を分画すると、少なくと
も25個の別個の反応生成物が同定された。同様のHPLC法（プライムスフェアーカ
ラム 5C18 MC 、5 ミクロン、250 x 21.2 mm 、Phenomenex、Torrance、CA）を
用いて、より多い量のこれらの生成物を分画した。上記したのと同じ勾配を用い
て、10ml/ 分の流速で、溶媒を送出した。AGE 架橋物は、34.0分に、３成分の混
合物として溶出した。同じ方法を用いたこのサブフラクション(subfraction) の
さらなる精製により、高純度（＞95％）で所望の化合物が得られた。
【００３３】 実施例２ この実施例は、式ＩのAGE の発見および分離を説明する。アルギニンおよびリ
シン残基の接近した会合は、架橋形成を促進する有意の近接効果を与えるので、
ジペプチドＮalpha -Z-arg-lysを標的として選択した。さらに、過去に、arg-ly
s ジペプチドを用いる合成法を成功して用いて、環状ペントシジンが高収率で分
離された〔バイスウェンガー(Beisswenger) ら、「Diabetes」44:824, 1995〕。
Ｎalpha -Z-arg-lys（13ミリモル）を0.M リン酸緩衝液（pH 7.4）中の10当量の
グルコースと共に、37℃にて５週間インキュベートした。逆相HPLCによりこの混
合物を分画すると、少なくとも25個の別個の反応生成物が同定された。
【００３４】 各画分を分離し、濃縮し、ELIZA により抗-AGE抗体との反応性について分析し
た〔マキタ（Makita）ら、「J. Biol. Chem.」267:1992, 1992〕。簡単に、HPLC
画分および精製した化合物は、先に記載した方法に従うAGE 特異的ELIZA によっ
て分析した〔マキタ（Makita）ら、「J. Biol. Chem.」267:1992, 1992〕。この
ELIZA は、リボヌクレアーゼの多量AGE 架橋調製物(heavily AGE-crosslinked p
reparation) に対する高度免疫化によって生じさせられたポリクローナル抗AGE
抗体を使用した。全IgG は、タンパク質‐G アフィニティクロマトグラフィーに
よって調製され、リボヌクレアーゼ主鎖特異性は免疫吸収により除去された。AG
E 免疫反応性をアッセイするために、96ウェルの丸底ミクロタイタープレート（
EIA/RIA プレート、Costar, Cambridge, MA ）をまず、４℃で一晩インキュベー
ションすることによりAGE-BSA （3 mg/ml 、0.1 M 重炭酸ナトリウムに溶解した
、pH9.6 ）でコーティングした。
【００３５】 洗浄後、結合していない部位を、製造者の推奨（Pierce, Rockford, IL）に従
い、SuperBlock（商標）でブロックした。洗浄後、試験抗原の希釈物を抗AGE Ig
G と共に加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを
再度洗浄し、二次抗体（アルカリホスファターゼ‐接合した抗ウサギIgG ）と共
に、37℃で１時間インキュベートした。結合していない抗体を大量の洗浄によっ
て除去し、結合した抗体をp-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)基質と共に30〜
60分間インキュベートし、ELIZA リーダー（EL309 、Bio-Tek Instruments Inc.
, Burlington, VT）により405nM で光学密度を記録することにより検出した。結
果を［実験のOD−バックグラウンドのOD（すなわち、抗体なし）］／［全OD（す
なわち競合なし）−バックグラウンドのOD］として計算したB/B0として表した。
【００３６】 １つの別個の画分内に含まれる生成物（1.5 ％収率で存在する）は、投与量依
存の形式で抗体結合をブロックすることがわかった。この画分のHPLCによるさら
なる精製は、１つの主な免疫反応性化合物（0.6 ％収率）と、２つの少量の化合
物の存在を示した。単離した主な生成物のUVおよび蛍光スペクトルは注目すべき
ところはなく、出発物質と同様であった。ESMSスペクトルは、m/z 545 [MH]+ の
分子イオンを示し、出発物質、Ｎalpha -Z-arg-lys（MW: 436 ）に比べて108 ド
ルトンの増加であった。D2O での1H-NMRスペクトルは、Ｎalpha -Z-arg-lysプロ
トンの他に、2.35〜4.65ppm で多重線として共鳴する５つの脂肪族プロトン（5H
）および、Z-基内に7.3ppmで共鳴する１個のオレフィンプロトンを示した。全体
的に、これらのデータは、環状のarg-lys イミダゾール架橋物（ALI, 式II、図
２）の構造と一致する。
【００３７】 実施例３ この実施例は、AGE 形成の提案されたメカニズムを説明する（図２）。まず、
リシン誘導AP（これらの反応条件下で18％収率で生じることが測定された）の脱
水は、必須のAP- ジオン反応性中間体を与える。グアニジン部分のジカルボニル
への可逆の付加は、2-アミノ-4,5- ジヒドロキシイミダゾール付加物を生じ、こ
れは次いで、脱水を受けて、安定な環状ALI を生ずる。重要なのは、この架橋物
が非蛍光性であり、酸で変わりやすく、かつ、アミノグアニジンにより形成を阻
止されることができることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 AGE 含量を測定するための、抗-AGE抗体に基づく競合ELIZA における合成ALI
の投与量依存活性を示す。結合曲線は急勾配であり、500 ナノモルで50％阻害を
示す。比較する目的で、FFI 、CML 、AFGP、ペントシジンおよび環状ペントシジ
ンならびに、関連するエピトープ構造を有するリガンド、例えばＮalpha -Z-arg
-lys、Ｎalpha -Z-arg-lys-AP 、イミダゾリウム付加物、ピリミジニウム付加物
、ヒスチジンおよびlys-his の反応性を研究した（ここで、「Z 」はカルボキシ
ベンゾイルをいう）。ポリクローナル抗-AGE抗体「RU」についてのELIZA 競合曲
線は、マキタ(Makita)らにより記載された方法（「J. Biol. Chem.」 267:1992,
1992 ）に従った。アッセイは、グルコース‐誘導されたAGE-BSA を、吸収した
抗原として使用した。FFI ：4-フラニル-2- フロイル-1H-イミダゾール〔ポンジ
ャー(Ponger)ら、「Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 」81:2684, 1984 〕、CML
：カルボキシメチルリシン〔アーメド(Ahmed) ら、「J. Biol. Chem.」261:4889
, 1986〕、AFGP：1-アルキル-2- ホルミル-3,4- ジグリコシルピロール〔ファー
マー(Farmar)ら、「J. Org. Chem. 」53:2346, 1988 〕、PY：ピラリン〔ニョロ
ーグ(Njoroge) ら、「Carbohydrate Res. 」167:211, 1987 〕、P ：ペントシジ
ン〔セル(Sell)およびモニアー(Monnier) 、「J. Biol. Chem.」 264:21597, 19
89〕、CP：環状ペントシジン(CP)〔アル‐アベッド(Al-Abed) ら、「Bioorg. Me
d. Chem. Lett.」5:2929, 1995〕、AL：Ｎalpha -Z-arg-lys(AL)、ALAP：Ｎalph a -Z-arg-lys-AP 、H ：ヒスチジン、LH：lys-his 、PA：ピリミジニウム付加物
〔アル‐アベッド(Al-Abed) ら、「Bioorg. Med. Chem. Lett.」6:1577, 1996〕
およびIA：イミダゾリウム付加物〔ブリンクマン(Brinkmann) ら、「J. Chem. S
oc. Perkin Trans. 」I:2817, 1995〕は、RU抗-AGE抗体と、検出可能な交差反応
性を示さなかった。ALI を除いては、これらのハプテンのいずれも、in vivo で
生じるAGE と反応することを先に示した抗-AGE抗体と、検出可能な交差反応性を
示さなかった。
【図２】 中間体として新規な2-アミノ-4,5- ジヒドロキシイミダゾール付加物、次いで
、脱水反応を経たALI AGE 生成物を形成する概略図を示す。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料中のAGE 濃度を測定する、抗体に基づく診断アッセイを
    標準化する方法であって、規定量のAGE 縮合生成物を添加して抗体を結合するこ
    とを含み、ここで、AGE 縮合生成物は、リシン成分、アルギニン成分および還元
    糖成分を含むが、ただし、AGE はペントシジンまたは環状ペントシジンではない
    方法。
  2. 【請求項２】 縮合生成物が、式Ｉ： 【化１】 （ここで、リシン成分は、囲って区別した「K 」で示され；アルギニン成分は、
    囲って区別した「R 」で示され；かつ還元糖成分は、囲われておらず；Ｒ1 およ
    びＲ4 は独立して、Ｈまたは、アミノ酸残基もしくはペプチド鎖へのアミド結合
    であり；Ｒ2 およびＲ3 は独立して、ＯＨまたは、アミノ酸残基もしくはペプチ
    ド鎖へのアミド結合であり；Ｒ5 は、Ｈ、ＣＨ2 ＯＨまたはＣＨＯＨＣＨ2 ＯＨ
    であり；Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 またはＲ4 のうちの１つより多くがアミド結合である
    なら、リシン「K 」成分およびアルギニン「R 」成分は、同じまたは異なるペプ
    チド鎖のアミノ酸残基であり得る） に従うAGE 化合物である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 縮合生成物が、構造： 【化２】 （ここで、ＺはＨ、カルボキシベンゾイルまたは、アルギニンおよびリシン残基
    に結合したポリペプチドの残余であり、Ｙは、ＯＨまたは、アルギニンおよびリ
    シン基に結合したポリペプチドの残余である） を有するアルギニン‐リシン イミダゾール架橋（ALI ）化合物である請求項２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 高度グリコシル化最終産物のマクロファージ認識および除去
    を増加するための方法であって、哺乳動物に、治療量の式Ｉに従う縮合生成物を
    投与することを含む方法。
  5. 【請求項５】 縮合生成物が、式II： 【化３】 （ここで、ＺはＨ、カルボキシベンゾイルまたは、アルギニンおよびリシン残基
    に結合したポリペプチドの残余であり、Ｙは、ＯＨまたは、アルギニンおよびリ
    シン基に結合したポリペプチドの残余である） に従う化合物である請求項４記載の方法。
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