JP2001512333A

JP2001512333A - 滅菌法

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Publication number: JP2001512333A
Application number: JP53494998A
Authority: JP
Inventors: ジラドット，ジーン−マリー．; ジラドット，マリー−ナディア．
Original assignee: バイオメディカルデザインインコーポレイテッド
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-09
Publication date: 2001-08-21
Anticipated expiration: 2018-02-09
Also published as: JP4271262B2; CA2279625A1; AU6056798A; EP0986405A2; US5911951A; WO1998034650A2; DE69814070T2; DE69814070D1; AU735988B2; CA2279625C; WO1998034650A3; EP0986405B1

Abstract

(57)【要約】低級アルカノールの存在下でアミンとカルボン酸との間にアミド結合を形成することが知られているカップリング剤を利用した処理により、心臓や他の器官の置換用具（例：心臓弁）および人工組織または合成人工器官材料を効果的に滅菌できる。このような処理を４０℃で１時間以上行うと、殺菌作用が得られることが確認されている。本滅菌処理法では、イソプロパノールまたはこれと同等のアルカノールの存在下で、任意選択でスルホＮＨＳまたはＮＨＳなどのカップリング促進剤と共に、ＥＤＣを水溶性カップリング剤として利用するのが好ましい。また、この滅菌処理は緩衝水溶液中で室温以上の温度で行うことが好ましい。本滅菌処理では、非毒性で生体適合性の物質以外の残留物がなく、温度変化による変性や蛋白分解酵素による消化に対する組織の抵抗性に影響を与えないだけでなく、驚くべきことに固定した生物組織の石灰化に対する抵抗性が増す。

Description

【発明の詳細な説明】滅菌法本出願は、１９９７年２月１０日に提出された米国仮特許出願第６０／０３７，５２８号から優先権を主張する。この出願の開示は参照により本明細書に組み込む。発明の分野本発明は、滅菌法に関し、より詳細には器官代用物などの生物材料に特に適しており、殺滅が困難な細菌および芽胞に対して有効性を発揮する滅菌法に関する。発明の背景滅菌は、食品加工などの産業や医療において広く利用されている重要な技術である。１１０℃以上の飽和水蒸気が、芽胞など微生物の殺滅にしばしば利用されている。ある種の物品、特に医療用に使用される物品は蒸気滅菌の湿熱に耐えられず、またこれらの物品は電離放射線による滅菌にも適していないと考えられることが多い。その結果、比較的低い温度で機能するガス滅菌法が開発され、蒸気滅菌に代わる魅力的な滅菌法が提供された。最もよく使われているガス滅菌剤のひとつはエチレンオキサイドであり、これは、医療用具の滅菌や他の滅菌プロセスに利用されている。しかし、残留エチレンオキサイドの存在は、たとえ少量であっても有害であると考えられる場合があり、そのために改良された滅菌法、特に医療用具の改良された滅菌法が以前から求められている。発明の概要アミンとカルボン酸との間にアミド結合を形成することが知られ、殺菌性があることが証明されているカップリング剤を用いた処理により、生物組織や代用器官、ポリマーや金属を含む合成人工器官材料などの物品の滅菌を効果的に行えることが明らかになった。この滅菌処理にはカップリング促進剤を使用してもよく、本滅菌処理は、カップリング剤を微生物の細胞内に浸透させるのに有効な量のイソプロピルアルコールまたはこれと同等のアルコールを含有する緩衝液中で室温以上の温度で行うことが好ましい。このような滅菌処理の残留物は毒性がなく、生体適合性があり、水溶性であるため、人体へ移植する前に組織から容易に洗い流すことが可能である。驚くべきことに、この方法で滅菌した生物組織は、生体内への移植後の石灰化に対して抵抗性を示すことが明らかになった。好ましい実施態様の詳細な説明「カップリング剤」という用語は、本明細書では、アミド結合の形成を促進する化学試薬の意味で使用する。アミド結合は、酵素上や蛋白質上の反応性カルボキシルと反応性アミンとの間や、生物学的人工組織上や生物学的人工組織内の反応性カルボキシル部分または反応性アミン部分と形成されてもよい。ペプチド合成や関連技術分野の技術者は、水溶性カルボジイミドやスクシニミドなどのこのような化学試薬になじみがあるだろう。Ｃ₂またはＣ₄アルカノールあるいはこれと同等の他のアルコールの存在下でこの結合が行われた場合、滅菌が生じ、細菌および芽胞が破壊される。特に生物組織材料を滅菌する際は、滅菌処理を水溶液中で行えるように、カップリング剤および任意選択で使用されるカップリング促進剤は水溶性であるのが好ましい。好ましいカップリング剤は１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であるが、他の適切なカップリング剤にはＮ−ヒドロキシスクシニミドや他の水溶性カルボジイミドが含まれる。生物組織を処理する際は水溶性カップリング剤の使用が好ましい。ＥＤＣをカップリング剤として使用する場合、好ましいカップリング促進剤はＮ−ヒドロキシスルホスクシニミド（スルホＮＨＳ）であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）などの他の適したカップリング促進剤を代わりに使用することもできる。カップリング剤およびカップリング促進剤（使用する場合）の濃度はいくらか変化させることができるが、当業者は適切な濃度を容易に決定できる。ある特定のカテゴリーの細菌のみを対象とする場合、カップリング剤は低い濃度でも有効であるが、通常遭遇する細菌および芽胞すべてを確実に破壊するには、好ましくは約５ミリモル（ｍＭ）から約１００ｍＭ、さらに好ましくは約１５ｍＭから約５０ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭから約４０ｍＭの濃度で使用する。任意選択のカップリング促進剤は、好ましくは０．５ｍＭから約３０ｍＭ、さらに好ましくは約１ｍＭから約５ｍＭの濃度で使用する。使用する溶液はすべて使用前に０．４５μｍ以下のフィルターでろ過することが好ましい。溶液は、好ましくは少なくとも約１０体積％、より好ましくは約１０体積％から約３０体積％のＣ₂〜Ｃ₄アルカノールまたはこれと同等のアルコールを含有する。体積％は、溶液の体積に対するアルコールの体積を意味する。使用できる他のアルコールには、エタノール、プロパノール、１−ブタノール、２ −ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノールおよびｔ−ペンチルアルコールが含まれる。低級アルカノールは一般に、カップリング剤が細菌や芽胞などの微生物の細胞内に浸透するのを効果的に助ける量で使用する。溶液１００ｍＬ当たり少なくとも約１０ｇに等しい量でイソプロパノールを使用することが好ましく、溶液が約１５％から約２５％のイソプロパノールを含有していることがさらに好ましく、約２０体積％のイソプロパノールを含有していることが最も好ましい。もちろん、滅菌する材料に適合する範囲内で、さらに高いアルコール濃度を使用することができ、その場合は処理に必要な時間を短縮することができる。この処理は、生物組織の損傷リスクを伴わずに滅菌を行えるのみならず、移植する組織の固定に多少寄与することもできる。驚くべきことに、この処理により、生体内での石灰化に対する生物組織の抵抗性が増す。滅菌の反応条件は、使用する具体的なカップリング剤によって多少異なる可能性がある。一般に、滅菌処理は、当業者に周知の緩衝水溶液から選択した緩衝水溶液中で行う。適切な緩衝液の例にはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）や３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。緩衝液のｐＨおよび濃度も、使用するカップリング剤によって異なる可能性がある。生物学的人工組織材料などに対する有害性が最も低いと同時に、効果的な滅菌環境を提供する緩衝液濃度およびｐＨを選択する。例えば、ＥＤＣをカップリング剤として使用する場合、カップリング促進剤スルホＮＨＳまたはＮＨＳの使用の有無に関わらず、使用する緩衝液のｐＨは約６．０から約７．０である。滅菌溶液の温度は約２５℃から５５℃の範囲内に保つことができるが、滅菌する材料に適合する範囲内で、さらに高い温度を使用することもできる。滅菌は３５ ℃から４５℃で、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも約５時間、より好ましくは少なくとも約１２時間行う。ポリマー材料や金属材料の場合、滅菌する材料に有害でない限り、５５℃より高い温度を使用することができ、その場合には処理時間を短縮することができる。この滅菌処理法は様々な人工器官材料および生物学的人工器官材料に対して有用であると考えられているが、適切な固定を行ってある動物組織から作製した器官構成要素（例：心臓弁）の代用品の滅菌に特に有用であると考えられている。滅菌前にまず冷却食塩水ですすぐことが好ましいことがある。通常、滅菌は最終段階であるため、組織固定をまず最初に行う。グルタルアルデヒドや他の固定技術、例えばポリエポキシド架橋形成または光酸化を行うこともできるが、米国特許第５，４４７，５３６号（１９９５年９月５日）および１９９５年２月１６日出願の特許出願ＷＯ９５／２２３６１号に詳細に説明されているタイプの固定法を使用することが好ましい。通常、滅菌する材料を滅菌溶液と約５時間から７２時間接触させる。このような処理は、殺菌が困難な細菌および芽胞さえも効果的に不活化することが明らかとなり、強力な殺菌性を有することが証明される。さらに、この滅菌処理は、恐らく滅菌される材料の収縮温度を下げることにより、あるいはコラーゲナーゼまたはプロテアーゼによる蛋白分解変性に対する材料の抵抗性を低下させることにより、生物学的人工組織に有害な作用を及ぼさない。また、驚くべきことに、この滅菌処理は石灰化に対する抵抗性を高めることが明らかになっている。本発明については、後述の実施例でさらに詳しく説明する。実施例は、本発明の精神および範囲をどんな方法でも決して限定するものではない。人体に移植する装置は、あらゆる微生物を効果的に破壊する方法で滅菌する必要がある。滅菌プロセスに使用する液体化学薬品の適用は独特であるため、滅菌プロセスに強い抵抗性を示す可能性のある微生物の検出やスクリーニング、テストでは用心する必要がある。液体化学滅菌剤に対して強い抵抗性を示すことが今までに確認されている標準微生物の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ、Ｃｈａｅｔｏｎｉｕｍｇｌｏｂｏｓｏｍ、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓの芽胞ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅ、ＭｅｔｈｙｌｂａｃｔｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓおよびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｑｕａｔｉｌｅなどの代表的な栄養細胞などがある。このうち、最も強い抵抗性を示すのはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞であろう。後述の実施例で使用されるカップリング剤は１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で、カップリング促進剤は、使用するのであればＮ−ヒドロキシスルホスクシニミド（スルホＮＨＳ）またはヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）であり、これらはすべて市販されている。脱イオン水１ＬにＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅｌｇを溶解してペプトン水を調製した。次いで、０．２μのフィルターでペプトン水を滅菌ボトルにろ過する。ｐＨ６．５の０．８５％塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液にすべての薬品を溶解する。濃度はｍＭ（溶液１Ｌ当たりの化学薬品のミリモル数）または％（溶液１００ｍＬ当たりのグラム）で示す。温度は℃（摂氏）で示し、室温は約２０〜２５℃とする。米国特許第５，４４７，５３６号に記載されている方法に従い、ブタの大動脈根を架橋形成により固定する。固定後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコール中にｐＨ７．４および４℃で心臓弁を保存する。後述の実施例に記載されている滅菌性テストは、ほとんどの場合、生物学的人工心臓弁組織の存在下で行われたが、このような組織が存在しなかった場合は、漏斗（フィルター漏斗）に付いている０．４５μのフィルターで溶液をろ過した。次いで、このフィルターをペプトン水ですすぎ、テストする微生物の増殖を阻止する可能性のある膜に残留する化学薬品を除去した。次に、この膜フィルターを約３２℃から３３℃、例えば３２．５℃でＴＳＡ平板上で培養した。テストのために微生物を大動脈弁に接種してから滅菌した場合には、溶液を前述の方法でろ過した。次いで、固有の芽胞または微生物をすべて組織から抽出するため、Ｔｗｅｅｎ８０を含有するペプトン水の存在下で、往復運動式振とう器内で大動脈弁組織を２０分洗浄した。この溶液をろ過し、前述の方法で培養した。汚染を防ぐため、微生物学的検査はすべて生物学的層流フード内で行う。収縮温度テストおよび蛋白分解（コラーゲナーゼおよびプロテアーゼ）変性テストは、’５３６号特許に記載されている方法で行う。石灰化に対する抵抗性は、やはり’５３６号米国特許に記載されている方法に従い、滅菌した弁葉および大動脈壁片を幼若ラットの皮下に移植して調べる。実施例１ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣｈｅｌｏｎａｅＡＴＣＣ３５７５２（〜１０⁵）を滅菌カップに接種した。２０％イソプロピルアルコールの存在下またはこれが存在しない条件下で、１０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホＮＨＳを含有し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．８５％ＮａＣｌからなるｐＨ６．５の溶液を、さまざまな時間滅菌カップの細菌に接触させた（処理時間）。カップを室温で放置した後、溶液をろ過した。次に、ＴｒｙｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＡｇａｒ（ＴＳＡ）平板またはＴｒｙｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＢｒｏｔｈ（ＴＳＢ）を用いて、フィルターを約３２〜３３℃で最高６週間培養した（培養期間）。接種はすべて２回行った。このテストの結果は、２０％イソプロピルアルコールの存在下での、ＥＤＣおよびスルホＮＨＳによる室温での処理が滅菌処理１２時間以内にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅをすべて殺菌することを示している。実施例２その一部に米国特許第５，４４７，５３６号に従って固定した架橋心臓弁を含有する滅菌カップに接種したＢａｃｉｌｌｕｓＳｕｂｔｉｌｉｓ芽胞（〜１０⁶ ）を用いて、実施例１と同様の滅菌プロセスを行う。２０％イソプロピルアルコールの存在下で、２０ｍＭのＥＤＣおよび１ｍＭのスルホＮＨＳを含有し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．８５％ＮａＣｌからなるｐＨ６．５の溶液をさまざまな時間加えた（処理時間）。この処理の間、カップおよび心臓弁は４０℃に保った。次いで、溶液をろ過し、ＴｒｙｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＡｇａｒ（ＴＳＡ）平板を用いて、フィルターを約３２〜３３℃で最高７日間培養した（培養期間）。接種はすべて２回行った。このテストの結果は、ブタ大動脈弁組織の存在の有無に関わらず、この滅菌法によりＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞が不活化されることを示している。実施例３前述の２つの実験では、カップリング促進剤（スルホＮＨＳ）を滅菌プロセス中にＥＤＣに加えたが、以下の実験は、カップリング促進剤ありまたはなしの条件下でＥＤＣの有効性を調べるために計画された。滅菌テストは、約５．７〜６．６×１０⁵個のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ９３７２芽胞を用い、これを滅菌カップに１０分間接種して行った。２０ｍＭのＥＤＣと、１ｍＭのスルホＮＨＳまたは１ｍＭのＮＨＳまたはカップリング促進剤なしのいずれかを含有し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコールからなるｐＨ６．５の溶液を各カップに加えた。カップを４０℃ で７２時間（処理時間）インキュベートした後、カップ内の溶液をろ過した。残留ＥＤＣや残留カップリング促進剤を除去するため、フィルターを０．１％ペプトン水ですすぎ、次いでＴｒｙｐｔｉｃａｓｅＳｏｙＡｇａｒ（ＴＳＡ）平板上で培養した。接種はすべて２回行った。結果を表Ａに示す。このテストの結果は、スルホＮＨＳやＮＨＳのようなカップリング促進剤の存在の有無に関わらず、ＥＤＣおよびイロプロパノールがＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞に対して強力な殺菌剤であることを示している。実施例４この実験は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞の不活化に対するＥＤＣの濃度と培養の温度および時間の影響を調べるために計画された。検討したＥＤＣ濃度は５ｍＭ、１２．５ｍＭおよび２０ｍＭであり、培養温度は２５℃、３２．５℃および４０℃であり、インキュベーション時間は４時間、２４時間および４４時間であった。テストは表Ｂに示した条件下で行った。’５３６号特許に記載された固定法で架橋を形成した組織にＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞（１サンプル当たり約２．５×１０⁵個）を接種した。芽胞を組織に１０分間接触させた後、前述のいずれかの濃度のＥＤＣ溶液５０ｍＬを組織と芽胞を含む各カップに加え、各温度および各時間でインキュベーションした。４時間、２４時間、４４時間のいずれかの時間でインキュベーションを行った後、溶液をろ過して芽胞を回収し、その芽胞をＴＳＡ平板上で３２〜３３℃で２週間培養した。界面活性剤を含む溶液で組織サンプルを洗浄して組織から芽胞を十分抽出し、得られた溶液をろ過した。０．１％ペプトン水で洗浄した後、フィルターをＴＳＡ平板上で３２〜３３℃で２週間培養し、組織上または組織内の生存菌数を数えた。ＥＤＣ溶液および組織洗浄溶液の両方について、コロニーを数え、その結果（コロニー形成単位数）を加えた。陽性対照および陰性対照はこのテストが有効であることを示した。結果を表Ｂに示す。このテストの結果は、ＥＤＣの殺菌活性がＥＤＣの濃度や培養の温度および時間に依存することを示している。また、濃度が２０ｍＭのＥＤＣは、４０℃で４時間から４４時間で、架橋形成組織上の芽胞をすべて殺滅することがわかる。４０℃で４時間培養した後の対数減少値は約４．７で、４４時間の培養後は生存芽胞を認めなかった。さらに、わずか５ｍＭのＥＤＣ存在下で４０℃で４４時間培養した後の対数減少値は約４であり、これはＥＤＣが強力な殺菌剤であることを示している。実施例５この実験は、１サンプル当たり少なくとも１×１０⁶個のＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞の２連続接種を使用してＥＤＣ処理の殺菌活性を調べるために計画された。最初の段階では、前述の特許および特許出願に記載された方法で架橋を形成したブタ心臓弁４５個に１．４３×１０⁶個（Ｌｏｇ₁₀＝６．２）の芽胞を１０分間接種し、これを３回繰り返した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコールに２５ｍＭのＥＤＣを加えた、ｐＨ６．５の溶液を、弁サンプルを含むカップに注いだ。４０℃での培養２時間後、４時間後、６時間後、８時間後に、サンプル（溶液＋組織）１２個から総生存芽胞数を求めた。培養８時間後、さらに１．２×１０⁶個（Ｌｏｇ₁₀＝６．１）の芽胞を残りのサンプル３３個に加えた。つまり、これら残りのサンプル３３個には、ｔ＝０に１．４３×１０⁶個の芽胞を、そしてｔ＝８に１．２×１０⁶個の芽胞を接種した。多様な設定の培養時間の後（詳細は表Ｃ参照のこと）、溶液中および弁組織上の生存芽胞をろ過で取り除き、前述のようにＴＳＡ平板上で培養した。陽性対照および陰性対照はこのテストが有効であることが示された。結果を後述の表Ｃに示す。このテストの結果は、イソプロパノールの存在下でのＥＤＣと共に培養すると６時間以内にＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞の対数減少値が６．２（生存なし）になること、そして再攻撃後６時間以内に対数減少値がさらに６．１になることを示している。この方法で、組織弁サンプルおよび溶液は完全に滅菌された。実施例６ここまでの実験は、細菌を接種した生物組織をテストすることにより、あるいは滅菌カップに接種した同量の細菌を単にテストすることにより、ＥＤＣ＋低級アルカノールの滅菌効果が等しく確認されることを一般に示している。ここまでの確認を考慮し、滅菌カップを用いて他の細菌に対するこの滅菌プロセスの有効性をテストした。カップを４０℃のインキュベーターに入れる前に、２５ｍＭのＥＤＣを含有するが、カップリング促進剤を含まない、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ２０ｍＬ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロパノールからなるｐＨ６．５の溶液を各カップに加える。溶液温度が約３８℃に達した時点で、約１０⁵〜１０⁶個の微生物を溶液中に接種した。このテストを３回繰り返した。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ３５８４、ＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＡＴＣＣ２７１４２、ＣｈａｅｔｏｎｉｕｍｇｌｏｂｏｓｏｍＡＴＣＣ６２０５、ＭｉｃｒｏａｓｃｕｓｃｉｎｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１６５９４の４種類の分離株を、芽胞懸濁液の形でテストした。また、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｈｅｌｏｎａｅＡＴＣＣ３５７５２、ＭｅｔｈｙｌｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓＡＴＣＣ４３６４５、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｑｕａｔｉｌｅＡＴＣＣ２２３１０の３種類の分離株を栄養細胞としてテストした。接種した系を１時間、５時間または２４時間培養した後、０．４５μのフィルターで溶液をろ過した。すすぎ後、実施例１と同様にフィルターをＴＳＡ平板上に置いた。陽性対照および陰性対照は、このテストが有効であったことを示している。結果を表Ｄに示す。接種材料中のＣＦＵ数は、底が１０の対数として表わしてある（例：３．４×１０⁵＝５．５）。このテストの結果は、培養１時間後に特定の細菌が完全に殺滅されたと同時に、他の細菌にも非常に大きな対数減少が認められたことを示している。また、このテストは、多くの形態の細菌に対して、イソプロパノール存在下でＥＤＣが、約３８℃で時間に依存して芽胞の不活化を示す非常に優れた滅菌剤であることを示している。実施例７この滅菌が組織の収縮温度に対して持つ潜在的な有害作用を調べるため、係属出願ＷＯ９５／２２３６１に記載されている方法に従い、カップリング促進剤スルホＮＨＳまたはＮＨＳの存在下でＥＤＣ処理によってブタの大動脈弁に架橋を形成し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコールからなるｐＨ６．５の溶液中の２５ｍＭのＥＤＣを用いて弁を４０℃で２４時間滅菌した。この培養時間は、連続試験でＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓの芽胞の対数減少を２回も約６にすることが表Ｃに示されている。’５３６号特許に記載されているように、弁葉を切除し、各弁葉について熱変性温度を測定した。結果を表Ｅに示す。このテストの結果は、使用する固定法の種類に関わらず、この滅菌法が組織の収縮温度に対して悪影響を及ぼさないことを示している。滅菌後に収縮温度が変わらないことが表Ｅからわかる。組織の蛋白分解変性傾向に対してこの滅菌が持つ潜在的な作用を調べるため、カップリング促進剤スルホＮＨＳまたはＮＨＳの存在下で、係属出願に記載されている方法に従って同様に架橋を形成させたブタ大動脈弁を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８５％ＮａＣｌ、２０％イソプロピルアルコールからなるｐＨ６．５の溶液中の２５ｍＭのＥＤＣを用いて、弁を４０℃で２４時間滅菌した。大動脈弁葉および大動脈壁片を切除し、これらを用いて標準的なコラーゲナーゼプロテアーゼ変性テストを行った。このテストについては、前述の特許および特許出願に詳しく説明されている。コラーゲナーゼ消化テストの結果は、乾燥組織のｍｇ当たりの遊離されたアミンのナノモルで表わし、表Ｆに示す。結果は６つのサンプルの平均値アＳＥＭで示してある。滅菌前と滅菌後の弁葉に有意差は認められず、ＮＨＳではｐ＝０．７１８、スルホＮＨＳではｐ＝０．９９４である。一方、大動脈壁は、滅菌後にコラーゲナーゼに対して有意に高い抵抗性を示しており、ＮＨＳではｐ＝０．０４６、スルホＮＨＳではｐ＝０．００９９である。したがって、コラーゲナーゼ消化に対する抵抗性はＥＤＣ滅菌の影響を受けないのみならず、増強されることがある。比較のため、同様の条件下で行われた過去の実験を見ると、新鮮組織から遊離されるアミンの濃度は、弁葉が約２１５０ｎｍｏｌ／組織ｍｇ、大動脈壁片が約４３０ｎｍｏｌ／組織ｍｇであった。プロテアーゼ消化テストの結果を表Ｇに示す。比較のため、グルタルアルデヒド固定組織の結果も示す。ＮＨＳまたはスルホＮＨＳをカップリング促進剤として使用した場合、特許出願ＷＯ９５／２２３６１に記載されている方法に従って架橋を形成した組織の滅菌結果に有意差は認められない。弁葉または大動脈壁の滅菌にＥＤＣを用いた後に得られた結果は、有害作用を示しておらず、またグルタルアルデヒド固定の場合と同等の抵抗性を示している。石灰化に対する抵抗性に対して本滅菌が持つ潜在的な作用を調べるため、（ａ）グルタルアルデヒド固定ブタ大動脈弁葉のサンプルおよび（ｂ）’０７６号特許出願の方法に従って架橋を形成したブタ大動脈弁葉のサンプルを、前述の収縮温度実験に記載されているとおり、イソプロパノール存在下でＥＤＣを用いて滅菌し、幼若ラットの皮下に４週間移植した。その後、移植サンプルを回収し、原子吸光光度法を用いて定量的カルシウム分析を行った。結果は、表Ｈに、条件ごとにサンプル６個の平均値アＳＥＭで示す。このテストの結果は、２０％イソプロピルアルコール存在下で２５ｍＭのＥＤＣを４０℃で用いる滅菌法が石灰化に対するブタ大動脈弁組織の抵抗性に悪影響を及ぼさないことを示している。さらに、驚くべきことに、この結果は、滅菌したサンプルが滅菌しなかったサンプルより石灰化に対して高い抵抗性を有することを示している。また、前述の特許出願に従って架橋形成したサンプルはすべて、標準的なグルタルアルデヒド法で架橋形成したサンプルより有意に石灰化が少ない。これらの結果は、ＮＨＳまたはスルホＮＨＳの有無に関わらず、２０％イソプロピルアルコールの存在下で約４０℃のＥＤＣ溶液が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓや他の細菌の芽胞に対して強力な殺菌剤であることを示している。ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＣｈｅｌｏｎａｅの栄養細胞は、２０％イソプロピルアルコール存在下でＥＤＣ＋スルホＮＨＳにより室温で効果的に不活化され、他の様々な栄養細胞を用いたその後のテストは、２０％イソプロピルアルコール中の２５ｍＭのＥＤＣが生物組織の有効な滅菌剤であることを示した。イソプロピルアルコールまたはこれと同等のアルカノールの存在下でやや高い温度でカップリング剤を用いる処理は、任意選択でカップリング促進剤を併用するが、強力な殺菌作用を持ち、組織弁の処理に非常に適していると考えられ、ポリマーや金属などの滅菌にも適していると考えられている。また、組織弁の変性温度および蛋白分解変性に対する抵抗性は、１２時間以上の本滅菌処理の影響を受けないだけでなく、驚くべきことに、本滅菌法で滅菌したサンプルは、組織弁不全の主な原因である石灰化に対して有意に高い抵抗性を示すと思われる。標準的なグルタルアルデヒド法による組織固定に比べ、この滅菌法による心臓弁の滅菌は、石灰化抵抗性の増強という意外な結果をもたらし、これは商業的に非常に重要なことである。本発明は、本発明を実行するために発明者が現在知っている最良の態様を構成する、特定の好ましい実施態様に関して説明しているが、本明細書に添付されている請求の範囲に示されている発明の範囲から逸脱せずに、当業者に明らかな変更や改良を行うことができるものと理解されたい。例えば、本発明は、ブタ大動脈弁などの滅菌について説明しているが、ポリマー製心臓弁や金属製心臓弁の構成要素や人体に移植する他の構成要素の滅菌に使用してもよい。イソプロパノールのようなアルカノールの使用が好ましいが、滅菌する材料に対して有害でなく、同等であると考えられる他の有機溶媒（例：トルエン）を代わりに使用することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年２月８日（１９９９．２．８）【補正内容】１．形成されるアミド結合の数が増えるようにカップリング剤のアミド形成作用を増強するカップリング促進剤の任意の存在下で、微生物の細胞内に前記カップリング剤が浸透可能な有効量の低級アルカノールと、アミド結合を形成可能な少なくとも５ｍＭの水溶性カップリング剤の濃度とを含有する水溶液で材料を少なくとも１時間処理することから成り、前記材料が伝播する微生物を効果的に殺滅することを特徴とする前記材料の滅菌法。２．前記水溶液が少なくとも１０体積％のＣ₂からＣ₄アルカノールを含有することを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。３．前記処理が２５℃から５５℃の温度で行われることを特徴とする請求項１または２に記載の滅菌法。４．前記処理が３５℃から４５℃の温度で行われることを特徴とする請求項１または２に記載の滅菌法。５．前記処理が少なくとも５時間行われることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の滅菌法。６．前記カップリング剤が水溶性カルボジイミドであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の滅菌法。７．前記カップリング剤がＥＤＣであることを特徴とする請求項６に記載の滅菌法。８．前記カップリング剤が少なくとも２０ｍＭの濃度の前記溶液中に存在することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の滅菌法。９．前記溶液がカップリング促進剤として少なくとも１ｍＭのスルホＮＨＳを含有することを特徴とする請求項８に記載の滅菌法。１０．前記溶液がカップリング促進剤として少なくとも１ｍＭのＮＨＳを含有することを特徴とする請求項８に記載の滅菌法。１１．前記水溶液が前記アルカノールとしてイソプロパノールを含有することを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の滅菌法。１２．前記溶液がイソプロパノールを少なくとも２０体積％含有し、前記処理が３５℃から４５℃の範囲内で行われることを特徴とする請求項１１に記載の滅菌法。１３．アミド結合を形成可能な少なくとも約２５ｍＭの水溶性カルボジイミドカップリング剤を含有し、少なくとも約２０体積％のイソプロパノールを含有する水溶液で移植用の生物組織を約３５℃以上で少なくとも１時間処理することを含む、生物組織が有する微生物および芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓを含む）を効果的に殺滅することによる移植用の生物組織を滅菌し、石灰化に対する前記組織の抵抗性を高めることを特徴とする方法。１４．アミド結合を形成できる水溶性カップリング剤を４０〜１００ｍＭ含有する水溶液に、少なくとも３５℃の温度で４時間以上曝露することにより、予め化学的に固定した生物組織を処理することを含む、前記組織が有する微生物を効果的に殺滅することにより、架橋形成された生物組織を滅菌することを特徴とする方法。１５．少なくとも５０ｍＭの濃度の前記カップリング剤としてＥＤＣ水溶液で前記処理を行うことを特徴とする請求項１４に記載の滅菌法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジラドット，マリー−ナディア. アメリカ合衆国 30338 ジョージア州ダンウッディーノースピーチツリーロード 5328

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）カップリング剤のアミド形成作用を増強するカップリング促進剤および（ｂ）該カップリング剤が微生物の細胞内に浸透するのに効果的な量のアルカノールの任意の存在下で、アミド結合の形成を促進することが可能な有効量の前記カップリング剤を含有する水溶液で材料を効果的な長さの時間処理することを含む、前記材料が有する微生物を効果的に殺滅することを特徴とする前記材料の滅菌法。２．前記アルカノールがＣ₂からＣ₄アルカノールであり、溶液１００ｍｌ当たり少なくとも約１０グラム含まれていることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。３．前記処理が約２５℃から約５５℃の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。４．前記処理が約３５℃から約４５℃の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。５．前記処理が少なくとも約１時間行われることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。６．前記処理が少なくとも約５時間行われることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。７．前記カップリング剤が前記溶液中に少なくとも約５ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。８．前記カップリング剤が前記溶液中に少なくとも約２０ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。９．前記カップリング剤が水溶性カルボジイミドであることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。１０．前記カップリング剤がＥＤＣであることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。１１．ＥＤＣが少なくとも約２０ミリモルの濃度で存在することを特徴とする請求項１０に記載の滅菌法。１２．前記溶液がカップリング促進剤として少なくとも約１ｍＭのスルホＮＨＳを含有することを特徴とする請求項１１に記載の滅菌法。１３．前記溶液がカップリング促進剤として少なくとも約１ｍＭのＮＨＳを含有することを特徴とする請求項１１に記載の滅菌法。１４．前記水溶液がイソプロパノールを溶液１００ｍＬ当たり少なくとも約１０グラム含有することを特徴とする請求項１０に記載の滅菌法。１５．前記溶液がイソプロパノールを溶液１００ｍＬ当たり少なくとも約２０グラム含有し、前記処理が約３５℃から約４５℃の範囲内で行われることを特徴とする請求項１に記載の滅菌法。１６．溶液が低級アルカノールを溶液１００ｍＬ当たり少なくとも約１０グラム含有し、アミド結合の形成を促進することが可能な有効量のカップリング剤を含有する水溶液で材料を少なくとも約１時間処理することを含み、前記材料が有する細菌および芽胞を効果的に殺滅することを特徴とする前記材料の滅菌法。１７．前記溶液が、前記カップリング剤のアミド形成作用を増強する水溶性カップリング促進剤を少なくとも約１ｍＭ含有することを特徴とする請求項１６に記載の滅菌法。１８．前記溶液が溶液１００ｍＬ当たり少なくとも約２０グラムのＣ₃アルカノールを含有することを特徴とする請求項１６に記載の滅菌法。