JP2001508689A

JP2001508689A - Lyophilized collagen-based biomaterials, their preparation process and use

Info

Publication number: JP2001508689A
Application number: JP53704498A
Authority: JP
Inventors: エイチ．シエラ，デイビッド; フリーマン，アビー; デルストロ，フランク; プライアー，ジェフ
Original assignee: コヘージョンコーポレイション
Priority date: 1997-01-16
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 2001-07-03
Also published as: AU1576497A; EP1019106A1; AU716137B2; WO1998031403A1; CA2277814A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、コラーゲンベースの生体材料を凍結乾燥する方法に関し、この凍結乾燥物は、再構成される場合に、止血活性を保持し、そして押し出され得る。本発明はまた、凍結乾燥されたコラーゲンベースの生体材料の放射線殺菌の方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for lyophilizing a collagen-based biomaterial, wherein the lyophilizate, when reconstituted, retains hemostatic activity and can be extruded. The present invention also relates to a method for radiation sterilization of freeze-dried collagen-based biomaterial.

Description

【発明の詳細な説明】凍結乾燥コラーゲンベースの生体材料、それらの調製プロセスおよび使用技術分野本発明は、生体接着性材料の一般的な分野である。より具体的には、本発明は、凍結乾燥コラーゲンベースの材料ならびにそれらの調製および使用の方法に関する。必要に応じて、凍結乾燥コラーゲンベースの材料は、放射線殺菌され得る。本発明の凍結乾燥コラーゲンベースの材料は、組織封止剤の形成に有用である。発明の背景生体材料は、人体に移植され、創傷組織治癒および固体組織治癒の支持体として働くように使用されてきた。外科的接着性フィブリン封止剤は、歴史的に２成分系として設計されており、２成分エポキシ接着剤に類似している。第１成分は、フィブリノーゲンおよび第XIII因子からなり；トロンビンおよび塩化カルシウム溶液が第２成分中に存在する。これらの成分は、連続してまたは同時に注射器または噴霧によって適用され得る。フィブリン封止剤は、ヘパリン欠乏または凝固欠乏で処置される患者における止血および組織封着に用いられてきた。これらは、滲出を減少させることにより創傷治癒を促進し、そして創傷部位において体液密封を産生することにより空気漏れを制御している。フィブリン接着剤は、部分的または全体的に縫合の使用を防止し得、それによって炎症反応を回避し得る。（DePalma,L.ら、（1993）Transfusion 33(9):717-720）。フィブリン封止剤接着系の歴史および使用の詳細な概要については、Sierra，D.H．(1993)J．Biom aterials Appl．7:309-352を参照のこと。初期の外科的接着剤は、高含量のフィブリノーゲン（約８〜10％）を含有し、このブリノーゲンはフィブリノーゲン凍結乾燥物(lyophilate)からかろうじて調製され得るのみであった。これらは一般的に不安定であり、それ故、使用まで-2 0℃〜５℃で保存する必要があった。これらの初期の接着剤の例としては、商標 France）で市販される組成物が挙げられる。これらは多量のスクリーニングされた集団ドナー供給ヒト血漿から調製された。患者自家性かつ単一ドナー供給されたフィブリン封止剤は、市販の集団ドナー供給フィブリン封止剤のウイルス疾患伝染にわたる関係に対応して、米国において発展した。これらの試みは、ウシトロンビンが容易に入手可能であったので、濃縮フィブリノーゲンの生成に的が絞られた。 1983年、GestringおよびLernerは、寒冷沈降反応生成法を記載した。この方法は、少量の患者自己血液を利用した。（GestringおよびLerner（1983）Vasc．Su rg．294-304）。これらの組成物および使用法は、大量の患者血液の有効性、調製時間（この時間は１時間から一晩の範囲であり得る）ならびに装置および訓練された病院職員の専門技術によって制限される。この方法は大量生産のために改変された。（DresdaleおよびRose、米国特許第4,627,879号）。接着性止血剤、または他の血液因子成分を組み込んだ他の生体材料組成物が記載されている。米国特許第4,061,731号は、内因性トロンビンと組み合わせて患者自己血漿および細分割化コラーゲンおよび/またはゼラチンを含む組成物を記載している。米国特許第5,290,552号は、フィブリノーゲン、第XIII因子、コラーゲン、トロンビン、および使用の直前に共に混合されるカルシウムイオンの供給源を含む、二重成分系(dual-component system)を記載する。米国特許第4,600 ,574号は、フィブリノーゲンおよびマトリックスを形成するように凍結乾燥された第XIII因子の溶液でコーティングされた平坦網様(flat-web-like)コラーゲン、ゼラチンまたは多糖類を含む、外科的接着剤を記載する。米国特許第4,453,93 9号は、創傷治癒のための組成物を記載し、この組成物はコラーゲンから構成される「網様」キャリアを含み、これは以下の混合物を用いて一方の側面にコーティングされる：（１）フィブリノーゲンおよび第XIII因子を含むフィブリノーゲン成分；ならびに（２）トロンビン含有成分。凝固は、「網」の患者への挿入時に開始される。トロンボプラスチン（これはまた組織因子プロテイン(TF)と呼ばれる）は、凝固障害の治療薬または診断薬として記載されている。米国特許第5,091,363号は、血友病Ａの処置のための組成物および方法を記載する。第VIII因子、アンチトロンビンIII、リン脂質、カルシウムイオン供給源および第IX因子が混合され、そして15〜30秒の部分的トロンボプラスチン時間（PT）を得るまでの期間維持される。ポリオールが添加されて、組成物が完成される。新規の組織封止剤を開発する新たな試みが現在進行中である。そしてフィブリノーゲンおよびコラーゲンの複合接着剤が、止血有効性および機械的強度の両方を有することが、出願者によって近年示されている。（Jackson（1996）Nature Medicine 2(5):637-638）。 Ciocaの米国特許第4,515,637号は、コラーゲンとトロンビンとを塩基性pHで混合し、混合物を凍結乾燥することによって形成したコラーゲン-トロンビンスポンジを記載する。このコラーゲン-トロンビン混合物は凍結乾燥されてスポンジを形成し、そして創傷への適用前に流動性スラリーに再構成されない。一旦湿潤すると、この凍結乾燥されたコラーゲン-トロンビン混合物はスポンジとして安定なままである。 Nigamの米国特許第4,948,540号は、機械的に安定な適合したコラーゲン創傷包帯剤シート材料を記載する。コラーゲンは、可溶性およびネイティブコラーゲン線維を凍結乾燥し、そして得られる多孔性パッドを高圧で加圧することにより作製される。シート材料は凍結乾燥後、トロンビンを含浸され得る。感染の危険を最小化するために、組織封止剤は使用前に滅菌されなければならない。FDAは、10^-6の無菌保証レベルを達成するための終端滅菌が、組織接着剤を含む生体材料において望ましいと指摘している。終端滅菌はまた、製造の観点から実用的であり、なぜならそれは製造中の無菌技術の必要性を低下させるからである。Liuら（1989）J．Biomedical Materials Research 23:833-844は、ペプシン抽出ヒト羊膜コラーゲンに対する2.5〜25KGyのγ線照射用量を調査し、そして照射用量の増加に伴って中性PBSでの溶解性が低下することを見出した。γ線を用いた放射線殺菌コラーゲンに対する他の試みは、成功していない。なぜなら 10KGyの低さの用量は、コラーゲンの切断および変性を生じることが示されているからである（Cheungら（1990）J．Biomedical Materials Research 24:581-58 9）。さらに、照射前に乾燥したコラーゲンは、水の存在下で照射したコラーゲンよりも大きな構造的損傷を示す（Grantら（1973）J．Anat．115(1):29-43）。同様に、可溶性コラーゲンは不溶性コラーゲンよりもγ線照射に対して耐性であることが示されている（Ramanathanら（1965）Biochim．Biophys．Acta 102:533 -541）。高用量では、コラーゲンのγ線照射はゲル化を生じる（Labout（1972） Int．J．Radlat．Biol．21(5):483-492）。上記の参照はいずれも、再構成した場合に止血性であり、針または他の細い口径の開口部（１mm以下）から押し出され得る、凍結乾燥コラーゲン/トロンビン組成物を形成する方法を記載していない。再構成されたコラーゲンベースの組成物はまた、フィブリノーゲンと合わせられて、組織封止剤を形成し得る。凍結乾燥コラーゲンベースの生体材料を放射線殺菌する方法、および凍結乾燥コラーゲンベースの生体材料の組成物はまた、文献に記載されていない。凍結乾燥混合物は、その最終送達デバイスまたは容器に保存され得、簡便性を非常に改良し、そして調製時間を減少させる。発明の開示従って、本発明の１局面は、有効な量のプロセスされたコラーゲンと有効な量のトロンビンとを、約１mg/mL〜約10mg/mLのコラーゲンの均一な分散物、および好ましくは５mL〜９mLのコラーゲン、および最も好ましくは約6.5mL〜8.5mLのコラーゲンを達成するのに適切な条件下で混合し、そして濃縮した混合物を適切な条件下で乾燥することにより生成される、創傷治癒および組織封着に有用である止血性コラーゲンベースの生体材料を調製するためのプロセスを提供する。コラーゲンは、必要に応じて、遠心分離または透析により、例えば、コラーゲンとトロンビンとの混合前に濃縮され得る。乾燥された混合物は、コラーゲンベースの生体材料を得る条件下で、再構成され得る。ここで、この生体材料は止血性であり、そして１mm以下の直径を有する開口部を介して押し出され得る。凍結乾燥後、再構成が行われ、その結果コラーゲンおよびトロンビンの濃度はもとの分散物よりも高くなる。１実施態様において、均一な分散物は10mg/mLよりも高いコラーゲンおよび約６〜約2000U/mLのトロンビンの最終濃度を有し、そして均一な分散物のpHは約p H5.5〜約pH8.0の範囲で維持される。他の実施態様において、コラーゲン分散物は、遠心分離または透析によって濃縮され、トロンビンが添加され、そして混合物は、凍結乾燥、フリーズドライ(freeze-drying)または減圧乾燥のいずれか１つまたはそれらの組み合わせによって乾燥される。さらに別の実施態様において、混合工程はさらに、治療剤、サイトカイン、増殖因子またはいずれかの薬剤のアナログもしくは混合物からなる群から選択された薬剤の有効量を添加する工程を包含する。あるいは、薬剤が様々な機械的および/または熱プロセス工程に感受性である場合、それは再構成後に生体材料に添加され得る。別の好ましい実施態様において、再構成工程は乾燥された混合物と有効量のカルシウムイオンの水性供給源（例えば、約10mM以上の濃度の水性CaCl₂）とを混合する工程を包含する。別の局面において、本発明は、創傷治癒および組織封着に有用な、滅菌された止血性コラーゲンベースの生体材料の調製のためのプロセスを提供し、このプロセスは、有効量のプロセスされたコラーゲンと有効量のトロンビンとを、均一な分散物を得るために適切な条件下で混合する工程、必要に応じて、例えば、遠心分離または透析によって均一な溶液を濃縮し、固体コラーゲンを回収する工程、次いで、コラーゲン混合物を混合して、約１mg/mL〜約10mg/mLのコラーゲンおよび好ましくは約５mg/ml〜約９mg/mL、および最も好ましくは約6.5mg/mL〜8.5mg/ mLのコラーゲンを得る工程による。混合物を適切な条件下で乾燥し、次いで、滅菌プロセスにかけ、再構成した場合に止血性であり、流動性であり、そして開口部を通して押し出され得る組成物を得る。この組成物は、コラーゲンベースの生体材料を得るための条件下で再構成され得、ここで、この生体材料は、止血性であり、そして、１mm以下の直径の開口部を通して押し出され得る。１実施態様において、均一の分散物は、10mg/mLより高いコラーゲンおよび約６〜約2000U/mLのトロンビンの最終濃度を有し、そして均一な分散物のpHは約pH 5.5〜約pH8.0の範囲に維持される。他の実施態様において、均一な分散物は、遠心分離または透析によって濃縮され、そして凍結乾燥、フリーズドライまたは減圧乾燥のいずれか１つまたはそれらの組み合わせにより乾燥される。さらに別の実施態様において、混合工程はさらに、抗酸化剤、治療剤、サイトカイン、増殖因子またはこれらの薬剤のいずれかのアナログもしくは混合物からなる群から選択された薬剤の有効量を、最初のコラーゲン/トロンビン混合物に添加する工程を包含する。引き続くプロセス工程によって、薬剤が分解および/または不活化に供される場合、生体材料が再構成されるときおよび押出の前に、それは添加され得る。再構成工程は、乾燥された混合物と有効量のカルシウムイオンの水性供給源（例えば、５mM以上のCaCl₂）とを混合する工程を包含し得る。１実施態様において、滅菌プロセスは、約10KGy〜約40KGyの範囲の用量の電子線照射またはγ線照射を包含する。必要に応じて、混合物は約-80℃〜約10℃の範囲の温度で滅菌され得る。この材料はまた、低線量率でγ線照射され得るか、またはドライアイス上で40KGyまでの標準的用量でγ線照射され得る。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるプロセスによって生成される生体材料を提供する。さらに別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるプロセスにより生成される適切な量の生体材料と、有効量のフィブリノーゲンベースの溶液とを、創傷への適用前に混和することによって、止血性生体材料を調製するプロセスを提供する。１実施態様において、フィブリノーゲンベースの溶液は、フィブリノーゲン、全血から単離されるかまたは組換え技術によって得られるフィブリノーゲンアナログまたはそれらの誘導体である。第XIII凝固因子は、必要に応じてフィブリンネットワークを安定化するために存在し得る。別の局面において、本発明は創傷を処置する方法を提供し、この方法は、創傷と、有効量の本明細書中に記載のプロセスにより生成される生体材料のいずれかとを、創傷を処置するための条件下で接触させる工程を包含する。これらの条件は当業者に周知である。凍結乾燥物は調製され、次いで、その最終容器に移され得るか、または容器内で直接、同時凍結乾燥され得る。それぞれの最終容器は、それ自体が送達デバイス（例えば、注射器）であり得る。希釈液は別の注射器に保存され、そして二股のストップコックを介して凍結乾燥物の注射器に取り付けられ得るか、または２つのチャンバの注射器に保存され得る。明らかとなるように、本発明の１局面の好ましい特性および特徴は、本発明の任意の他の局面に適用可能である。発明の実施形態定義本明細書中で使用されるように、特定の用語は定義された意味を有するように使用される。本明細書中で使用されるように、用語「止血」(コラーゲンベースの生体材料に関する)は、出血の阻止または減少、または凝血の促進を意味するように意図される。「止血剤」は、出血の阻止または凝血の促進に寄与する任意の化合物または材料を指す。本明細書中で使用されるように、用語「共凍結乾燥(co-lyophilization)」は、以下の任意の組み合わせまたは処方物中の混合された構成成分の制御された凍結および乾燥を指す：フィブリノーゲン、トロンビン、第XIII因子、Ca²⁺、コラーゲン、トロンボプラスチンもしくは他の凝血因子、誘導体、ハイブリッド、あるいはアナログ。本明細書中で使用されるように、用語「単一成分」は、外科的接着性組成物が、投与前に活性化剤、混合物または成分との混合を必要としないことを意味するように意図される。対照的に、２つの要素として提供される従来の「二重成分」系は、凝血カスケードの活性化およびインサイチュのフィブリン形成のために投与前または投与と同時に接触させることを必要とする。「押し出され」得る材料は、直径1mm未満の開口部(例えば、20ゲージまたはそれより小さい針またはスプレー開口部)を通る材料を意味することが意図される。本明細書中で使用されるように、用語「アナログ」は、本質的に天然に存在する、またはネイティブ供給源から精製されるものと同じ材料の類似の化学的または物理的な形態を有する材料を意味するように意図される。本明細書中で使用されるように、用語「放射線殺菌された」は、微生物を伝搬する可能性を顕著に減少させるために放射線に曝露された材料を意味するように意図される。用語「放射線」は、電磁放射線(例えば、Ｘ線、紫外線、γ線および他の形態(例えば、α粒子、β粒子、およびヘリウム核または電子のような原子粒子)を含む。本明細書中で使用されるように、用語「再構成された」および「再水和された」は、以前の状態に類似の状態に物質を復元することを意味するように意図される。従って、再構成された凍結乾燥材料は、液体または流体形態に復元されたものである。再構成に適切な水性溶液は当業者に公知であり、そして例えば、水、緩衝化生理食塩水または水性CaCl₂を含む。本明細書中で使用されるように、用語「減圧」は、大気圧より規模の小さい、より好ましくは約500mTorr未満の気体圧を意味するように意図される。1Torr減圧は、1mmHgまたは133.322パスカル(Pa)に等しい。本明細書中で使用されるように、用語「包含する」は、生体材料、プロセスおよび方法が記載された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味するように意図される。生体材料、プロセスおよび方法を定義するために使用される場合、「から実質的になる」は、組み合わせに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。従って、本明細書中で定義された要素から実質的になるインプラントは、単離あるいは精製方法由来の微量混入物、または薬学的に受容可能なキャリア(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、防腐剤など)を排除しない。「からなる」は、他の成分および本発明の生体材料を用いるための実質的なプロセスまたは方法工程の微量要素より多くを排除することを意味する。これらの読み換え用語それぞれによって定義された実施態様は、本発明の範囲内である。止血性コラーゲン/トロンビン化合物コラーゲンベース外科的組織処方物は、本明細書中に記載され、これは単一成分系として利用可能である。単一成分組織接着性組成物は、その必須要素として、有効量のコラーゲン；トロンビン、トロンボプラスチンまたはトロンボプラスチン等価物；およびカルシウムを含有する。さらに、フィブリノーゲン、第II因子、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第XIII因子、脂質、それらのアナログ、ハイブリッドまたは結合体が組成物中に提供され得る。１つの局面において、単一成分系は、水性塩化カルシウム溶液中コラーゲンおよびトロンビンを混合することによって得られる。接着剤は、組織および/または血液に接触するまで流動性を保持する。血液中のフィブリノーゲンおよび血小板は、コラーゲン、トロンビンおよびCa(II)と反応して、フィブリンの形成を達成し、従って適用部位で血流を止める。あるいは、適用または投与部位で見られる血液中の種々の因子が反応を開始する。コラーゲン、凍結乾燥コラーゲン、組換えコラーゲン、コラーゲンアナログ、改変コラーゲン、誘導体化コラーゲンまたはコラーゲン含有結合体が使用され得る。コラーゲンは、アテロペプチド(atelopeptide)コラーゲンまたはテロペプチドコラーゲンであり得る。動物またはヒトベースのコラーゲンは適切に使用され、そして当業者に周知で、そして例えば米国特許第4,233,360号に記載の方法を用いて精製され得る。これらのコラーゲン調製物はまた、Collagen Corp.(Palo Al は、刊行されたInani,M.H.へのPCT国際公開番号WO94/16085号(これは本明細書中で参考として援用される)に記載されるようなハイブリダイズしたまたは結合したタンパク質からなり得る。改変または誘導体化コラーゲンは、任意の化学的に改変されたコラーゲン(例えば、Miyataらによる米国特許第4,164,559号および同 4,271,070号に記載されるメチル化、スクシニル化またはグアニジン化コラーゲン)であり得る。トロンビン、トロンボプラスチンまたはトロンビンアナログは、本発明で使用され得る。トロンビンはフィブリノーゲンに関する触媒として作用し、フィブリン(不溶性ポリマー)を得る。トロンビンは、種々の宿主動物供給源(ウシ、ブタ、ウマまたはヒトを含む)から単離され得、または細胞発現技術またはトランスジェニック動物のような組換え手段によって誘導され得る。トロンビンは当業者に周知の方法で調製され得、そして代表的にはプロトロンビンから調製される。医学的使用に認定された医用等級トロンビンは、「topical thrombin USP」として公知である。トロンビンは、種々の供給源から市販されており(Thorombin-JMI^TM を含む)、通常、バイアル中で緩衝液塩および安定剤とともに凍結乾燥される。Thorombin-JMI^TMトロンビンの各バイアルは、代表的には1000、5000または500 00ユニットのトロンビンを含む。接着剤を生成するために、コラーゲンおよびトロンビンは、最も高い予想活性を有し、そして適切な場合、ウイルスが不活性化されている可溶性形態で最初に生成される。当業者に公知であるように、成分がネイティブまたは天然供給源から精製される場合、これらは精製された、または実質的に精製された形態で提供される。「精製された」とは、目的のタンパク質または因子が、細胞または体液中のそのネイティブなまたは天然の環境でタンパク質または因子に通常関連する細胞および他の生物学的成分を実質的に含まないことを意味する。トロンビンの場合には、純度はタンパク質1mg当たりのユニットで定義される。コラーゲンに関して、純度はコラーゲンタイプ(タイプI以外)または他の混入タンパク質、プロテオグリカンまたはグルコサミノ-グリカンを有意に(＞95％)含まないものとして定義される。従って、用語「精製された」は、それらのネイティブな環境から単離された、または生物学的、非天然存在環境(例えば、American Type Cultu re Collection(ATCC)12301 Parklawn Drive、Rockville、MD．20852から市販されているチャイニーズハムスター卵巣細胞のような宿主細胞中で組換えによってそれらが生成される場合)から単離されたタンパク質および因子を記載するために使用され得る。本明細書中で使用されるように、加工されたコラーゲンは、動物または組換え供給源のいずれかから得られ、そして水性媒体中で分散され得るフィブリルを形成するように処理されたコラーゲンを含むことが意図される。この分散物は、狭い直径の開口部(1mm以下)を通って流動可能であるか、またはスプレーされ得る。加工されたコラーゲンは、アルコールまたはアセトンを添加することによってpH、温度または溶媒条件を変化させて希釈コラーゲン溶液からフィブリルを沈殿させることを含む種々の方法によって調製され得る。あるいは、真皮、腱または他のコラーゲン豊富な組織が粉砕され得る。これらの材料の例は、米国特許第4,374,121号および同4,412,947号で見られ得る。「単離された」タンパク質または因子は、物質がタンパク質または因子とともに天然に存在する少なくともいくつかの他の成分を欠くことを意味する。従って、単離された因子は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を用いて調製され得る。濃縮は絶対基準(例えば、溶液体積当たりの重量)で測定され得、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的に妨害する物質に関して測定され得る。コラーゲンおよびトロンビンは合わせられて混合物を形成する。好ましい実施態様において、コラーゲンとトロンビンの割合は、溶液１mL当たり少なくとも25 0ユニットのトロンビンに対して約25mgのコラーゲンである。正確な割合は重要であるとは考えられていないが、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリルに変換するのに十分な量で、かつ速いまたは遅い重合を必要とする用途の変化に臨床的に有利であるような割合で存在しなければならない。コラーゲンベースの混合物は、水性形態で使用され得、または以下に記載のように貯蔵のために凍結乾燥され得る。１つの実施態様において、コラーゲン/トロンビン混合物は、水性CaCl₂中で提供される。コラーゲン/トロンビン/CaCl₂組成物は、例えばシリンジ、スプレーなどを含む当該分野で公知の任意の方法によって創傷部位に適用され得る。混合物は、毛細血管出血血液を有する組織部位上にスプレーされ得、またはフィブリノーゲン調製物と合わせられ得、二成分組織接着剤を得る。共凍結乾燥物(co-lyophilate)もまた、経皮的経管的冠動脈形成術(PCTA)などのような手順の後、静脈または動脈のアクセス部位をシールするために「現状のまま」または再構成されるかのいずれかで使用され得る。「有効量」の個々の成分は、本明細書中で処方されるように合わせられた場合、フィブリンまたはフィブリン血餅の形成を誘導する量である。大半の因子に関する適切な濃度は、通常ヒト血漿に存在し、かつ本明細書中に提供される範囲に対応する。常に明示的に記載されているが、「有効量」の成分が使用され、そして本発明の組成物に取り込まれると想定されるべきである。トロンビン、コラーゲン、フィブリノーゲンまたは本明細書中で定義され、そして本発明の主題である処方物中に使用される他のタンパク質は、同じ機能を果たす他の天然存在あるいは合成化合物または組成物によって置換され得る。常に明示的に記載されるわけではないが、本発明の組成物が事実上(すなわち、「精製された」状態で)それらが明らかである形態の因子に加えて、タンパク質または因子のアナログ、ムテイン、結合体、およびホモログを含み得、ただし因子の生物学的活性は実質的に損なわれない。タンパク質または因子の生物学的活性は、適切な実験調査によって決定されたポリペプチドの任意の特徴を含む。この実験調査は、凝血時間およびインサイチュのフィブリンの形成を促進する能力に関する本明細書中に記載された実験を含むが、これに限定されない。「実質的に損なわれる」は、ネイティブなまたは天然のタンパク質または因子と比較して、アナログ、ホモログまたはムテインの生物学的活性に50％以上の減少を含む。本発明に関連する当業者に明白であるように、本発明の組成物は、標準的なキャリアおよび防腐剤と組み合わされ得る。これらの薬学的組成物は、本発明の範囲内である。従って、インサイチュでのフィブリンの形成を促進および/または誘導するための医薬を調製するためのこれらの成分の使用は、さらに本発明の範囲内である。現在ふさわしい従来の二成分フィブリン封止剤系に対して単一成分系は利点がある。ヒトまたは他の供給源の外来性フィブリノーゲンは、特に大量には必要とされない。これは、ウイルス伝染性外来因子(例えば、HIVまたは肝炎)に対する懸念を排除する。組成物およびその使用の他の重要な利点は、材料の硬化およびそれに続く強度を保証するために触媒の均一な混合の必要性を排除することである。利便性は、１つの送達デバイスまたは投薬ユニットのみが、材料を調製しそして適用するために必要とされる点で改良される。本発明はまた、他の構成成分(例えば、安定剤、防腐剤、治療剤、コラーゲン、コラーゲンアナログおよびコラーゲン結合体)と組み合わせた単一組織接着剤を含む組成物を提供する。患者への投与において、組織接着剤の活性を維持するように機能する任意の安定剤は、本発明を実施する際に使用され得る。このような安定剤の例は以下を含むが、これらに限定されない：Tris(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)、PIPES(ピペラジン-N,N-ビス(2-エタン-スルホン酸、1.5 ナトリウム塩)、イミダゾール、およびMOPS(3-(N-モルホリン)プロパンスルホン酸)。適切な防腐剤は、アジ化ナトリウム、チメロサール、BHA、BHTを含む。成分系に損傷を与える微生物の増殖を妨げるように機能する他の防腐剤は、接着性組成物に適切に添加される。治療的添加剤が添加され得、そして生体材料がこれらの成分についてのビヒクルとして働き得る。EGF、TGF-α、TGF-β、FGF、PDGFのような増殖因子が添加され得る。インターロイキンまたは幹細胞因子のようなサイトカインもまた、適切に添加され得る。抗生物質が添加され得、そして接着剤が口の潰瘍および熱傷のような露出した創傷部位に適用される場合に特に有用である。外科的接着剤組成物もまた、（自己の、培養されたまたは改変された、同種または異種の）細胞と混合され得る。他の生体材料（ヒドロキシアパタイト、鉱質除去された骨、およびヒアルロン酸を含むがこれらに限定されない）が、その材料の機械的または生物学的特性を改変するために添加され得る。これらの材料は、材料の製造の過程の間に添加され得るか、または適用の間に添加され得る。この材料は、特に有利であり得る。なぜなら、コラーゲンは一般に使用される細胞増殖支持マトリックスであるからである。種々の他の治療薬剤および生物学的改変剤（例えば、ラジオアイソトープ、抗過剰増殖薬物、カルモジュリンなど）もまた、取り込まれ得る。当業者に明らかなように、添加された成分の量は、接着剤の使用およびレシピエントにより変化するが、処置にあたっている医師によって容易に決定される。本発明はまた、フィブリノーゲンとの二成分系におけるコラーゲン/トロンビン生体材料の使用を提供する。コラーゲンベースの組成物は、本明細書中に記載されるように調製され、そして凍結乾燥後に再構成され得る。フィブリノーゲンは、商業的供給源から入手可能である。あるいは、ヒトまたは動物の血漿は、遠心分離による血液の細胞成分の除去の後に使用され得る。あるいは、ヒトまたは動物の血漿は、凍結、解凍、およびさらなる遠心分離によって、血漿寒冷沈降物を調製するためにさらにプロセスされ得る。これらの構成要素画分を得る方法は、米国特許第5,290,552号に記載され、これは本明細書中で参考として援用される。結晶もしくはアモルファス形態において、または凍結乾燥物として用いられ得る。例えば、ウシフィブリノーゲンは、Sigma Chemical Co．（製品番号4754 ）から市販されているか、またはフィブリン封止剤調製物（例えば、Immuno AG ，Vienna，子成分は、同種、自己、血漿調製物から得られる得か、または組換え手段によって得られ得る。凍結乾燥させたコラーゲン/トロンビン混合物本発明はまた、再構成された凍結乾燥材料が止血性の特性を保持し、そして直径1mm未満の開口部から押し出され得るように、止血性コラーゲンベースの生体材料を凍結乾燥するプロセスに関する。従って、本発明は、再構成され得、そして組織封止剤または止血物質として使用され得る保存安定（storage-stable）コラーゲン化合物を製造するためのプロセスを提供する。１つの局面において、コラーゲンベースの生体材料は、コラーゲンおよびトロンビンから構成される。コラーゲン/トロンビン混合物は、適切な容器（例えば、型枠、トレイ、またはディッシュ）中におかれ得、そして同時凍結乾燥され得る。最終送達容器（例えば、シリンジ）における混合物の凍結乾燥もまた可能である。また、混合物は大量でおよび細切れにして凍結乾燥され得る。混合物を、一面の液体N₂を通して混合物を滴下し、顆粒を形成し、そして大量に凍結乾燥することによって凍結され得る。一般的な凍結乾燥手順は、当業者に公知である。凍結乾燥したコラーゲン/トロンビン混合物は、室温で保存され得るか、またはさらなる操作に供され得る。本発明はまた、本明細書中に記載される任意の生体材料を、生体材料の凍結乾燥に適切な容器中に、ならびに調製およびその使用のための説明書を提供する。凍結乾燥したコラーゲン/トロンビン組成物は、使用前に水性形態に再構成され得る。１つの実施態様において、凍結乾燥物は、水、生理食塩水、またはPBS 中で再構成される。好ましい実施態様において、40mM水性CaCl₂は、凍結乾燥物を再水和するために使用される。任意の他の薬学的緩衝化溶液もまた、約5.0〜約8.5の範囲のpHで使用され得る。容量オスモル濃度は、低張、等張、または高張であり得る。他の適切な水溶液は、当業者に公知である。凍結乾燥物は、例えば、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する能力によって測定され得るトロンビン活性を保持する。本発明の凍結乾燥されたコラーゲンベースの生体材料は、組織封止剤としてそれ自体で有用であるか、またはフィブリノーゲンの供給源と組み合わせた場合に有用である。従って、再構成された場合に、凍結乾燥された材料は、約1mm未満の直径を有するニードルを通して押し出され得ることが本発明の１つの局面である。当該分野で公知であるように、組織封止剤は、封止剤の成分を含有するシリンジに取り付られたニードルまたはスプレーノズルを使用して創傷部位にしばしば適用される。従って、再水和された本発明の凍結乾燥物は、1mm未満の直径を有する開口部（例えば、内視鏡デバイスにおけるスプレーノズルまたは30ゲージもしくはより大きなニードル、カテーテルまたは送達ポート）を通して押し出され得る。凍結乾燥したコラーゲン/トロンビン化合物の放射線殺菌本発明はまた、凍結乾燥したコラーゲンベースの生体材料を放射線殺菌する方法を提供する。本発明の重要な局面は、滅菌した凍結乾燥化合物が、次いで例えば、組織封止剤としての使用のために、水性形態へと再構成され得ることである。凍結乾燥したコラーゲンベースの材料が無菌的にプロセスされ得るので、従って、無菌のまま維持され、そして末端滅菌の必要性を排除する。再構成された滅菌化合物はまた、フィブリノーゲンの供給源と組み合わされて組織封止剤を形成し得る。さらに、共凍結乾燥物は、投与前に、コラーゲンおよび/またはトロンビンと化学的に不適合性である他の２つの成分の治療薬剤と混和され得る。架橋剤はまた、フィブリノーゲンに類似の様式で取り込まれ得る。電子ビーム照射（e-ビーム照射）は、文献に記載されるように行われ得る。使用される照射のタイプは、重要であるとは考えられないが、好ましい実施態様では、凍結乾燥した材料は、認定された施設でe-ビーム照射に曝露される。１つの実施態様において、照射は、０℃および周囲（室）温との間で行われ得る。製品における熱の蓄積は、例えば、産物を照射プロセスの間ドライアイスの上に置くことによって防止し得る。別の実施態様において、凍結乾燥された材料は、照射プロセスの間冷たく保たれる（すなわち、周囲温度または室温未満）。凍結乾燥したコラーゲンベースの材料は、10KGy〜40KGyの間、好ましくは10KGyと25KGyとの間、そしてより好ましくは20KGy未満に曝露される。本明細書中で使用される「Grey(Gy)」は、吸収される放射線量の単位であり、ここで１greyは、吸収材料１グラムあたり10エルグ（10^-5ジュール）に等しい。照射に対するコラーゲンおよびトロンビンの安定化は、フリーラジカルの増殖を妨害し得る抗酸化剤化合物の添加によって改善され得る。このような材料は周知であり、そしてチロシン、トリプトファン、アスコルビン酸、クエン酸、システイン、メチオニン、ビタミンＥ、BHA、およびBHTを含み得る。これらの賦形剤は、好ましくは、照射の間低温を伴って使用される。（Negre-Salvayre，A.ら、 Biochem，Pharma．42:450-453(1991)ならびにTaylorおよびRichardson，J．Foo d Sci．45:1223-1227(1980)を参照のこと）従って、組織接着剤の末端滅菌は、製造コストを低減させ、そして効率を増大させる利点を有した。なぜなら、製造プロセスにおける無菌技術に対する必要性を排除するからである。本発明の放射線殺菌法はまた、FDA標準を満たし、このことは10^-6のSterility Assurance Levelを示唆する。本明細書中に記載される組成物が、任意の適切な使用のための（例えば、組織修復および/または治療薬剤の放出のため）医薬品の調製にとって有用であることは、当業者に明らかである。本発明は、その好ましい特定の実施熊様に関連して記載されているが、上記の説明および以下の実施例が、本発明の範囲を例示するが限定しないことが意図されることは理解されるべきである。他の局面において、本発明の範囲内の利点および改変は、生体医学的移植の分野における当業者に明らかである。実施例実施例１−プロセスされたコラーゲンおよびトロンビンの共凍結乾燥：沈降したコラーゲン末端滅菌ありまたはなしで、コラーゲンおよび局所用トロンビンの共凍結乾燥した処方物の止血効果を評価するために、コラーゲンを以下のように単離した： Collagen Corp．(「CSF」)から市販されている4.5リットルの可溶化コラーゲン溶液を、0.45ミクロンフィルターを通して室温で滅菌濾過し、そして８リットルのNalgeneビーカーに注ぎ入れた。CSFを、475mLの100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH11.2）でpH7.4に滴定した。CSFを、15時間室温で混合した。次いで、CSFを9,000rpmで30分間遠心分離して、沈殿物を除去し、そして上清を捨てた。コラーゲンペレットを、１つの遠心分離ジャーに回収し、そして水溶液中に再び分散した。タンパク質濃度は、13.1mg/mLであり、そして収量は96％であった。コラーゲン材料を２Ｌ Nalgene容器に移した。コラーゲンを、精製水および再構成したトロンビンの組み合わせで7.0mg/mLに希釈した。トロンビンを再構成するために、１ボトルの50,000ユニットのトロンビンを50mLの精製水で希釈した。混合物を、３インチの撹拌器（7.5cm）の刃で約50rpmで撹拌した。コラーゲン/トロンビンホモジネートのアリコートを、フィル（fill）の全体にわたって時間間隔をおいて採取し、トロンビン活性が維持されていることを示した。表１は、凍結乾燥の前に混合している間に、トロンビンがその活性を維持することを示す。表１：ホモジネートのトロンビン活性材料を、Filmaticフィラー（filler）を使用して型枠中に分配した。型枠をステンレススチールの凍結乾燥パン(pan)に置き、そして-80℃のフリーザーに移した。パンを-80℃で２時間凍結させ、次いで標準的な薬学的凍結乾燥器に移し、そして標準的な凍結/乾燥プログラムを使用してプロセスした。凍結乾燥チャンバーを、不活性ガスでパージし、そしてサンプルを50％の湿度を有する部屋でパッケージ化した。サンプルは、十分に形成され、そして乾燥しているようであった。次いで、凍結乾燥物を種々の様式（計量された量でシリンジに充填すること、 15KGyのe-ビーム照射で照射すること、およびインビボ止血モデルにおいて試験することを含む）でパッケージ化した。CaCl₂溶液で再構成された場合に、コラーゲンの通常の濃度は、25mg/mLであり、そしてトロンビン濃度は、500U/mLであった。実施例２−遠心分離管におけるコラーゲンベースの材料の凍結乾燥型枠に充填することの代替として、コラーゲン−トロンビン混合物を、実施例１に記載のように調製した。シリンジと類似の直径を有する遠心分離管を、コラーゲン−トロンビン混合物（7.5mg/ml）で充填した。遠心分離管中の材料を、凍結乾燥し、そして得られる産物を40mM CaCl₂水溶液中で再懸濁した。産物を、迅速かつ均一に再懸濁し、そして直径の小さなノズルスプレーヘッドを通して噴霧した。実施例３−凍結乾燥したコラーゲン/トロンビンに対するe-ビーム照射の効果コラーゲン-トロンビンを、実施例１に記載されるように凍結乾燥し、3mLシリンジ中に装填し、ポジティブクロージャーで閉鎖し、標識し、放射線ドットを適用し、ポリエチレンバッグ中に配置し、そして熱で封着した。材料を10、12.5、 15、17.5、もしくは20KGyで室温で、または15もしくは20KGyでシリンジをドライアイスの上に置くことによって凍結したサンプルにおいて（約-78℃）e-ビームで照射した。DSC ピーク融解温度に対する凍結乾燥の影響照射した産物は、複合物に対してシリンジで2mlの精製水を添加することによって再水和させ、そして補助剤ミキサーに40回通過させて混合した。サンプルの一部を、天秤で秤量し、そして参照としてPBSを使用して、ピーク融解温度を測定した。異なる示差走査型熱量計を使用して測定されたピーク融解温度を、表２に示す。表２：ピークDSC温度に対する電子線の影響これらの結果は、電子線照射への曝露が増加するにつれて、ピークDSC融解温度が減少したことを示す。DSC温度の減少を、電子線照射への曝露中にドライアイスベッド上に物質をおくことにより緩和し得る。従って、コラーゲンのネイティブのらせん性を、より容易に維持し得る。トロンビン活性に対する凍結乾燥の影響トロンビン活性に対する凍結乾燥および電子線の影響を試験するために、サンプルを水で再水和し、そして約５ユニット/mlに希釈した。トロンビン活性を、イを、市販のロットのトロンビンに対して較正した。電子線を照射したサンプルのトロンビンの活性を、表３に示す。表３：凍結乾燥サンプルのトロンビン活性これらの結果は、電子線照射が、トロンビン濃度またはトロンビン活性についての影響がほとんどないか全くないことを示す。電子線照射を用いて、最終的に凍結乾燥複合物を滅菌し得る。止血に対するコラーゲンベースの材料の凍結乾燥の影響全血をアッセイの当日にドナーから採取した。血液を1000gで５分間バキュテイナー（vacutainer）チューブ中で遠心分離し、血小板富化血漿を得た。血漿を、3ccのシリンジ中に採取した。凍結乾燥したコラーゲン/トロンビン複合物を40 mM CaCl₂水溶液で再水和し、そして補助剤ミキサーを用いて約40回混合した。特注で設計したミキサーを結合部に取り付け、そして市販の噴霧器の頭部をミキサーに取り付けた。この物質の止血の質を、New Zealand Whiteウサギの腎臓および脾臓に規定された長さおよび深さの切開部を含む拡散器官出血モデルを用いて評価した。ウサギを麻酔し、脾臓および腎臓を露出させ、そして2mmの深さで15m m長の切開部を両方の器官に作製した。インビボでの止血試験の結果を、表４に示す。止血は、コラーゲン/トロンビン同時凍結乾燥物を、20kGy未満の照射に曝露する場合に、優れている。15kGyの電子線への曝露の影響を、照射中の産物の温度を下降させることにより緩和し得る。融点温度の維持とインビボでの止血との間に正の相関が認められた。コラーゲンのネイティブのらせん構造を維持することが、止血という成果に重要であるようである。止血結果止血の質は、上記のようにウサギで評価した。止血を達成する時間は、各試験材料について最小の６つの部位で測定した。以下の結果は、表４で示されるように観察された。表４電子線用量の増加は、止血効力の減少と相関した。この影響を、ドライアイス上で凍結された同時凍結物を照射することにより最小化した。プロセスを拡大した場合、15KGyで照射した凍結乾燥物は、止血（部位の75％）において改善した。実施例４：凍結乾燥されたサンプルのインビトロ試験実施例１に記載のように調製した２つの別々のバッチの物質を、重要な生化学的パラメーターおよび性能パラメーターを特徴づけるように設計した、一連のインビトロ試験で評価した。これらの試験の結果を、各バッチについてそれぞれ表５および表６に示す。再懸濁試験実施例１および２からの凍結乾燥サンプルを、1.5mlの精製水で再水和し、そして30秒間振盪した。シリンジの表示を覆って、データの解釈の偏りを防止した。そして内容物を均質性について肉眼で調べた。押出し凍結乾燥したサンプルを水和し、そして1mlのBDシリンジに移し、そして22、2 7および30ゲージの針を取り付けた。シリンジを、プランジャーを一定速度（10c m/分）に抑制し、そして一定速度を維持するのに必要な力が記録される押出しテスター上に取り付けた。力のスパイクが40ニュートンを超えない場合、物質が押し出されたとみなした。これらの結果は、類似の様式（しかし、トロンビンと凍結乾燥は除く）で調製した、コントロールのコラーゲンスラリーで得られた結果と比較した。コントロールをこれらの実施例を通してずっと「湿潤」と称する。SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルを、蒸留水で再水和した。SDS-PAGEを、Laemmliの方法（Nature 227 ：680-685(1970)、これは、本明細書中に参考として援用される）に従って実施した。ゲルをクーマシーブルーを用いて染色した。タンパク質濃度サンプルを、コラーゲンタンパク質標準を使用したPierce BCA Protein Assay を使用して試験した。DSC サンプルを、蒸留水で約30mg/mlに再水和し、そしてMettler Differential Sc anning Calorimeter(DSC)を用いて、10℃/分の走査速度で０から80℃まで実施した。融点温度を記録した。物理学的分析、化学的分析、およびインビボ分析：表５：サンプル調製物１表６：サンプル調製物２ ^*各DSC積分曲線の形状もまた評価した。「湿潤」（非凍結乾燥、非照射）物質は、非常に良好に規定された鋭いピークを有した。凍結乾燥した物質のピークもまた、鋭く、良好に規定されたピークであったが、約45℃でショルダーを有した。 10KGyでは、ピークは、拡がりを開始した。分散は、20KGyで増加し、そして30KG yにより、DSC曲線は、分散しかつほとんど規定されなかった。DSC曲線での拡がりは、一般的に、サンプル内で起こる変性の指標であり、そしてピーク温度以上で拡散が生じる場合、架橋している指標である。SDS-PAGE の結果「湿潤」および凍結乾燥（非照射コラーゲン）からのαおよびβのバンドは、クーマシーブルー染色を用いて、それぞれ100キロダルトン(KD)および200KDのMW ではっきりと規定された。照射されたサンプルは、レーンの長さに沿ってサンプルが尾を引いたので、両マーカーでの規定を喪失した。10KGyの曝露で、両方のバンドは、可視であったが、非常に薄かった。20KGyでは、バンドはほとんど識別不能であった。30KGyでは、バンドの全てが認められなかった。そしてサンプルは、分子量の範囲全体に沿って拡散しているようであった。開始のバンドでタンパク質の全てが認められず、従って、最小量の架橋が生じ、そしてこのタンパク質の全てが、ゲル中に移動したと推測された。表５および６に提示する結果は、ピーク融解温度Tmが、凍結乾燥および漸増用量の照射に対する曝露で減少することを実証する。Tmにおけるこの減少は、Liu ら（1989）によって記載のように線維の鎖切断に対応し得る。DSC走査はまた、照射が増加するにつれて、ピークが拡散することをも示す。サンプルの不均一性の増加は、線維の変性に対応し得る。密集して架橋したフィブリル、およびより大きな直径のフィブリルは、より高いピーク融点値を有することを示している。より低いピーク融点温度は、断片化またはより小さな直径のフィブリルに対応し得る。Tmにおけるこの減少は、凍結乾燥したコラーゲンに対する照射の主要な効果が、架橋ではなく、鎖切断であることを示す。コラーゲン複合物の押出し特性は、凍結乾燥または漸増量の照射で変化しなかった。照射用量の増加で凍結乾燥小片の懸濁液特徴における変化もなかった。これらの結果は、鎖切断と一致する。ウサギ拡散器官出血モデルに示されるような止血は、照射が増加するにつれて減少した。80％、25％、および17％の止血を、それぞれ、０、15、および20KGy で観察した。これらの結果に基づくと、10KGyの照射でさえも、コラーゲン複合物の物理的特徴を変化させるのに十分であることが明らかである。しかし、物理学的な変化は、再懸濁液の押出し特性または物質の止血特性に有意に影響を与えないようである。これは、産物の照射が、架橋ではなく鎖切断を主に引き起こすことを示す。この特徴は、インビボでの移植物の残留性を減少させるに価値があることの証明であり得る。実施例５：プロセスされたコラーゲンおよびトロンビンの同時凍結乾燥：粉砕されたコラーゲン線維性コラーゲン（Semed F,Kensey-Nash Corporation，Exton，PA，米国特許第4,374,121号）を、３〜５％固体（w/w）で蒸留水に懸濁した。線維性懸濁液の pHは、HClを使用してpH２±0.2に調整する。コラーゲン分散物を、時折混合しながら２〜３日間５℃でインキュベートする。必要に応じて、さらなるHClを添加し、pHを２付近に維持する。次いで分散物を以下の任意のいくつかの方法で粉砕する：１）種々の直径（例えば、1mm）の開口部のコネクターを使用してシリンジとシリンジとの間での分散物の混合およびポンピング；２）例えば、ワーリングブレンダーでの湿潤粉砕。サンプルは、これらの操作の間コラーゲンの変性を回避するために約15℃未満である。酸での粉砕および膨潤を、上記実施例３に記載のように、分散物が、小さなゲージの針を通して押し出され得るまで継続する。さらにpH２のHClでの分散物の希釈を用いて分散を容易にする。しかし、最小の固体％を、0.5％（w/w）より多くに保つべきである。27番ゲージ針を通して、40ニュートン未満の力（1ml のシリンジを通して）で押し出され得る分散物を、十分に粉砕されたとみなす。 Battistaに対して米国特許第3,628,974号は、コラーゲンの機械的分解によって、長さが１ミクロン未満でおよび直径が約2.5オングストローム〜数百オングストローム単位で変化する、凝集したトロポコラーゲン単位の束からなる微結晶性のコラーゲンを生じることを記載する。この方法は、コラーゲンの全てを微細結晶とはし得ない。そして、より大きな線維から微細に粉砕されたコラーゲンの分離は、小さなゲージの針から押し出され得る調製物を得るために必要であり得る。 pHを、7.2±0.2に上昇させ、固体％を、0.5％〜1.0％に調整し、そして冷却しての粉砕を、必要に応じて、27番ゲージ針を通しての押出し性を維持するために継続した。実施例１に記載のように水で再構成したトロンビンを、固体コラーゲン1mgあたり、20ユニットのトロンビン活性の最終濃度になるように懸濁液に添加する。より高いかまたはより低いトロンビンの濃度を、２成分封止剤の一部として使用した場合、所望の止血能力または設定時間に依存して添加し得る。分散物を、凍結し、凍結乾燥し、そして実施例１のように照射により滅菌する。凍結乾燥されたスポンジ形態のコラーゲンを、40mM CaCl₂水溶液で2.5％固体（w/w）で再構成し、そしてシリンジとシリンジとの間の混合によって十分に分散させる。ついで、このような分散物を、必要に応じて血漿または他のもの、フィブリノーゲン溶液と混合し、そして噴霧するかまたは出血創傷上に押し出す。あるいは、分散物単独を、創傷上に噴霧して、そして血液が処方物と混合する場合、血液中のフィブリノーゲンは、トロンビンと反応し、血餅を形成する。凝固はまた、血小板およびコラーゲン分散物を有する他の血液凝固因子との接触によってもたらされる。化学分野、材料科学分野、医学分野および関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための上記の態様の改変は、以下の請求の範囲の範囲内であることを意図する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Lyophilized collagen-based biomaterials, their preparation process and use Technical field The invention is in the general field of bioadhesive materials. More specifically, the present invention Lyophilized collagen-based materials and methods of their preparation and use I do. If desired, the lyophilized collagen-based material can be radiation sterilized . The lyophilized collagen-based material of the present invention is useful for forming tissue sealants . Background of the Invention The biomaterial is implanted in the human body and serves as a support for wound and solid tissue healing. Have been used to work. Surgical adhesive fibrin sealants have historically been two components. Designed as a split system, similar to a two-component epoxy adhesive. The first component is , Fibrinogen and factor XIII; thrombin and calcium chloride A solution is present in the second component. These components can be injected sequentially or simultaneously Or it can be applied by spraying. Fibrin sealants are heparin deficient or It has been used for hemostasis and tissue sealing in patients treated with solid deficiency. these Promotes wound healing by reducing exudation, and Air leaks are controlled by creating a liquid seal. Fibrin glue, part Can prevent the use of sutures, either partially or totally, thereby avoiding an inflammatory response . (DePalma, L. et al., (1993) Transfusion 33 (9): 717-720). Fibrin sealant For a detailed overview of the history and use of adhesive systems, see Sierra, D.H. (1993) J.C. Biom aterials Appl. See 7: 309-352. Early surgical adhesives contained a high content of fibrinogen (about 8-10%), This brinogen is barely prepared from the lyophilate of fibrinogen. It could only be made. These are generally unstable and therefore -2 until use It had to be stored at 0-5 ° C. Examples of these early adhesives include the trademark France). These are screened in large quantities Prepared from human donor fed human plasma. Patient autologous and single-donor supplied fibrin sealant is commercially available U.S.A. responds to the relationship of supply fibrin sealant over viral disease transmission Evolved. These attempts were based on the fact that bovine thrombin was readily available, The focus was on the production of concentrated fibrinogen. In 1983, Gestring and Lerner described a cryoprecipitation reaction production method. This way Utilized a small amount of patient autologous blood. (Gestring and Lerner (1983) Vasc. Su rg. 294-304). These compositions and methods of use may be useful for the preparation, Production time (this time can range from 1 hour to overnight) and equipment and training Limited by the expertise of hospital staff provided. This method has been modified for mass production. Changed. (Dresdale and Rose, U.S. Pat. No. 4,627,879). Adhesive hemostats or other biomaterial compositions that incorporate other blood factor components are noted. It is listed. U.S. Pat.No. 4,061,731 discloses a combination of Record the composition containing self-plasma and finely divided collagen and / or gelatin. It is listed. U.S. Pat.No. 5,290,552 discloses fibrinogen, factor XIII, collagen Source, thrombin, and calcium ions mixed together immediately before use. Describe a dual-component system, including sources. U.S. Patent 4,600 No. 574 is lyophilized to form fibrinogen and matrix Factor-III-coated flat-web-like collagen A surgical adhesive is described, comprising a gelatin, or a polysaccharide. U.S. Patent No. 4,453,93 No. 9 describes a composition for wound healing, which composition is composed of collagen Include a “net-like” carrier, which is coated on one side with the following mixture: (1) Fibrinogen containing fibrinogen and factor XIII And (2) a thrombin-containing component. Coagulation occurs when the "net" is inserted into the patient Started. Thromboplastin, also called tissue factor protein (TF), It is described as a therapeutic or diagnostic agent for solid disorders. U.S. Pat.No. 5,091,363 , Compositions and methods for the treatment of hemophilia A are described. Factor VIII, Antitro Binbin III, phospholipids, calcium ion source and factor IX Maintain the period until you get a partial thromboplastin time (PT) of 15-30 seconds You. The polyol is added to complete the composition. New attempts to develop new tissue sealants are ongoing. And fibri Noogen and collagen composite adhesives provide both hemostatic efficacy and mechanical strength Have recently been shown by the applicant. (Jackson (1996) Nature Medicine 2 (5): 637-638). Cioca, U.S. Pat.No. 4,515,637, discloses mixing collagen and thrombin at a basic pH. And freeze-dry the mixture to form collagen-thrombin Describe the image. This collagen-thrombin mixture is lyophilized and sponge And does not reconstitute into a flowable slurry prior to application to the wound. Once wet The lyophilized collagen-thrombin mixture is then turned into a sponge. Remains constant. Nigam U.S. Pat.No. 4,948,540 discloses a mechanically stable, adapted collagen wound dressing. A band sheet material is described. Collagen is soluble and native collagen The fibers are lyophilized and formed by pressing the resulting porous pad with high pressure. Made. After lyophilization, the sheet material can be impregnated with thrombin. Tissue sealants must be sterilized before use to minimize the risk of infection Absent. FDA is 10^-6Terminal sterilization to achieve a sterile assurance level of tissue adhesive Are preferred in biomaterials containing Terminal sterilization is also a manufacturing perspective Practical because it reduces the need for sterile technology during manufacturing It is. Liu et al. Biomedical Materials Research 23: 833-844 The gamma irradiation dose of 2.5-25 KGy for human extracted human amniotic collagen was investigated, and It was found that the solubility in neutral PBS decreased with increasing irradiation dose. gamma rays Other attempts at radiation sterilized collagen using have been unsuccessful. Because A dose as low as 10KGy has been shown to cause collagen cleavage and denaturation (Cheung et al. (1990) J. Biomedical Materials Research 24: 581-58) 9). In addition, collagen dried before irradiation can be collected from collagen irradiated in the presence of water. (Grant et al. (1973) J. Anat. 115 (1): 29-43). Similarly, soluble collagen is more resistant to gamma irradiation than insoluble collagen. (Ramanathan et al. (1965) Biochim. Biophys. Acta 102: 533). -541). At high doses, gamma irradiation of collagen causes gelation (Labout (1972) Int. J. Radlat. Biol. 21 (5): 483-492). Any of the above references are hemostatic when reconstituted, and may require a needle or other Lyophilized collagen / thrombin that can be extruded through a diameter opening (less than 1 mm) No method for forming the composition is described. Reconstituted collagen-based composition The object can also be combined with fibrinogen to form a tissue sealant. Freeze drying Radiation sterilization of dried collagen-based biomaterials and lyophilized collagen The composition of biobased biomaterials has also not been described in the literature. Lyophilized mixture Can be stored in its final delivery device or container, greatly improving convenience and To reduce the preparation time. Disclosure of the invention Thus, one aspect of the present invention relates to an effective amount of processed collagen and an effective amount. From about 1 mg / mL to about 10 mg / mL of a homogeneous dispersion of collagen; and Preferably between 5 mL and 9 mL of collagen, and most preferably between about 6.5 mL and 8.5 mL of collagen. Mix under appropriate conditions to achieve the lagen and concentrate the Useful for wound healing and tissue sealing, produced by drying under conditions A process for preparing a hemostatic collagen-based biomaterial is provided. Kora The source is optionally centrifuged or dialyzed, for example, with collagen and toxin. It can be concentrated before mixing with the thrombin. The dried mixture is collagen-based It can be reconstituted under the conditions to obtain the biomaterial. Here, the biomaterial is hemostatic. And can be extruded through an opening having a diameter of 1 mm or less. After lyophilization Reconstitution takes place, so that the concentration of collagen and thrombin is reduced to the original dispersion Higher than. In one embodiment, the homogeneous dispersion has a collagen content of greater than 10 mg / mL and about 10 mg / mL. It has a final concentration of thrombin of 6 to about 2000 U / mL, and the pH of the homogeneous dispersion is about p It is maintained in the range of H5.5 to about pH 8.0. In another embodiment, a collagen dispersion Is concentrated by centrifugation or dialysis, thrombin is added, and mixed The material can be freeze dried, freeze-dried or dried under reduced pressure. One or a combination thereof. In yet another embodiment The mixing step may further include the step of treating a therapeutic agent, a cytokine, a growth factor or any drug. Adding an effective amount of a drug selected from the group consisting of analogs or mixtures Is included. Alternatively, the drug may be sensitive to various mechanical and / or thermal process steps. If receptive, it can be added to the biomaterial after reconstitution. Another preferred implementation In an embodiment, the reconstitution step comprises drying the dried mixture with an effective amount of calcium ion in water. Source (eg, aqueous CaCl at a concentration of about 10 mM or more)_Two) And the step of mixing You. In another aspect, the present invention provides a sterilized, useful for wound healing and tissue sealing. This process provides a process for the preparation of hemostatic collagen-based biomaterials. Seth will provide an effective amount of processed collagen and an effective amount of thrombin in a uniform Mixing under appropriate conditions to obtain the dispersion, if necessary, for example, centrifugation A step of concentrating the homogeneous solution by separation or dialysis and collecting solid collagen, The collagen mixture is then mixed to provide about 1 mg / mL to about 10 mg / mL of collagen and And preferably from about 5 mg / mL to about 9 mg / mL, and most preferably from about 6.5 mg / mL to 8.5 mg / mL. Depends on the process of obtaining mL of collagen. The mixture is dried under appropriate conditions and then destroyed. It is hemostatic, fluid, and open when subjected to bacterial processes and reconstituted Obtain a composition that can be extruded through the part. This composition is a collagen-based raw Can be reconstituted under conditions to obtain a body material, wherein the biomaterial is hemostatic and Yes, and can be extruded through openings of 1 mm or less in diameter. In one embodiment, the homogeneous dispersion comprises more than 10 mg / mL collagen and about It has a final concentration of thrombin of 6 to about 2000 U / mL, and the pH of the homogeneous dispersion is about pH Maintained in the range of 5.5 to about pH 8.0. In another embodiment, the uniform dispersion is Concentrated by cardiac separation or dialysis and freeze-dried, freeze-dried or reduced It is dried by any one of pressure drying or a combination thereof. Yet another In embodiments, the mixing step further comprises an antioxidant, a therapeutic agent, a cytokine, an enhancer. Growth factors or analogs or mixtures of any of these agents Add an effective amount of the selected drug to the initial collagen / thrombin mixture. Process. Subsequent process steps may break down and / or inactivate the drug When subjected to biochemistry, it is added when the biomaterial is reconstituted and before extrusion. Can be done. The reconstitution step consists of drying the dried mixture and an aqueous solution of an effective amount of calcium ions. Source (eg, 5 mM or more CaCl_Two)). One embodiment In some embodiments, the sterilization process comprises e-beam irradiation or doses ranging from about 10 KGy to about 40 KGy. Includes gamma irradiation. If necessary, the mixture may be at a temperature in the range of about -80 ° C to about 10 ° C. Can be sterilized. This material can also be gamma-irradiated at low dose rates or Gamma irradiation can be performed at standard doses of up to 40 KGy on eIce. In another aspect, the present invention is directed to a process produced by the process described herein. The biomaterial to be provided. In yet another aspect, the invention relates to the process described herein. Combine the appropriate amount of biomaterial produced and an effective amount of a fibrinogen-based solution. The process of preparing a hemostatic biomaterial by mixing before application to the wound I will provide a. In one embodiment, the fibrinogen-based solution comprises fibrinogen. Nogen, fibrino isolated from whole blood or obtained by recombinant technology Gen analogs or their derivatives. Coagulation factor XIII as needed May be present to stabilize the fibrin network. In another aspect, the invention provides a method of treating a wound, the method comprising: And an effective amount of any of the biomaterials produced by the processes described herein. And contacting under conditions for treating the wound. These conditions Is well known to those skilled in the art. The lyophilisate is prepared and then transferred to its final container It can be obtained or co-lyophilized directly in a container. Each final container is As such, it can be a delivery device (eg, a syringe). Diluent in another syringe Stored, and attached to lyophilized syringe via bifurcated stopcock Or stored in a two-chamber syringe. As will be apparent, preferred features and characteristics of one aspect of the invention are that of the invention. Applicable to any other aspects.Embodiment of the Invention Definition As used herein, certain terms have their defined meanings. used. As used herein, the term "hemostasis" (collagen-based biomaterial Is intended to mean prevent or reduce bleeding, or promote clotting Is done. A "hemostatic agent" is any compound or compound that contributes to preventing bleeding or promoting clotting. Or material. As used herein, the term "co-lyophilization" Controlled freezing of the mixed components in any combination or formulation below Refers to setting and drying: fibrinogen, thrombin, factor XIII, Ca²⁺, Kola Genes, thromboplastins or other clotting factors, derivatives, hybrids, Or analog. As used herein, the term "single component" refers to a surgical adhesive composition Means that no mixing with the activator, mixture or ingredient is required prior to administration Intended to be. In contrast, the traditional "dual component" provided as two elements The system is used to activate the coagulation cascade and to generate in situ fibrin. Requires contact before administration or at the same time as administration. Materials that can be "extruded" include openings less than 1 mm in diameter (e.g., 20 gauge or Is intended to mean a material that passes through a smaller needle or spray opening) . As used herein, the term “analog” is essentially naturally occurring. Or similar chemical or material of the same material that is purified from a native source. Is intended to mean a material having a physical form. As used herein, the term "radiation-sterilized" To mean material exposed to radiation to significantly reduce the likelihood of Intended. The term "radiation" refers to electromagnetic radiation (e.g., X-rays, ultraviolet, And other forms (e.g., alpha particles, beta particles, and elements such as helium nuclei or electrons). Child particles). As used herein, the terms "reconstituted" and "rehydrated Is intended to mean restoring a substance to a state similar to its previous state You. Thus, the reconstituted lyophilized material has been restored to a liquid or fluid form. It is. Aqueous solutions suitable for reconstitution are known to those skilled in the art, and include, for example, water, Buffered saline or aqueous CaCl_Twoincluding. As used herein, the term "reduced pressure" refers to a sub-atmospheric pressure, More preferably, it is intended to mean a gas pressure of less than about 500 mTorr. 1 Torr reduction The pressure is equal to 1 mmHg or 133.322 Pascal (Pa). As used herein, the term "comprising" refers to biomaterials, processes and And methods include the stated element, but do not exclude other elements. Intended. When used to define biomaterials, processes and methods , "Consisting essentially of" means any other element of essential importance to the combination Means to eliminate. Thus, substantially from the elements defined herein Implants are trace contaminants from isolation or purification methods, or Do not exclude acceptable carriers (e.g., phosphate buffered saline, preservatives, etc.). No. “Consisting of” is substantially equivalent to using the other components and the biomaterial of the present invention. It means eliminating more than trace elements of a process or method step. these The embodiments defined by each of the replacement terms are within the scope of the present invention. .Hemostatic collagen / thrombin compound A collagen-based surgical tissue formulation is described herein, which comprises a single component. Available as a separation system. Single-component tissue adhesive compositions are an essential element An effective amount of collagen; thrombin, thromboplastin or thromboplus And a calcium equivalent. In addition, fibrinogen, factor II Offspring, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor XIII, lipids, Analogs, hybrids or conjugates can be provided in the composition. In one aspect, the single component system comprises collagen and aqueous calcium chloride solution. And thrombin. The glue is applied to the tissue and / or Maintains fluidity until it comes into contact with blood. Fibrinogen and small blood in blood The plate reacts with collagen, thrombin and Ca (II) to achieve fibrin formation. Blood flow at the application site. Or found at the site of application or administration Various factors in the blood begin to respond. Collagen, freeze-dried collagen, recombinant collagen, collagen analog, Modified collagen, derivatized collagen or collagen-containing conjugates can be used You. Collagen is atelopeptide collagen or telopepti Collagen. Animal or human based collagen is used properly And methods well known to those skilled in the art and described, for example, in U.S. Patent No. 4,233,360. And can be purified. These collagen preparations are also available from Collagen Corp. (Palo Al Is published PCT International Publication No.WO 94/16085 to Inani, M.H. Hybridized or bound as described in Protein. Modified or derivatized collagen can be any chemically Modified collagen (e.g., U.S. Pat. Methylated, succinylated or guanidinated collagen described in 4,271,070 ). Thrombin, thromboplastin or thrombin analog used in the present invention Can be done. Thrombin acts as a catalyst for fibrinogen, (Insoluble polymer). Thrombin is obtained from a variety of host animal sources (bovine, porcine, , Or horse or human) or cell expression techniques or trans It can be derived by recombinant means, such as a transgenic animal. Thrombin is skilled in the art And is typically prepared from prothrombin. Medical grade thrombin certified for medical use is referred to as “topical thrombin USP”. It is known. Thrombin is commercially available from various sources (Thorombin-JMI^TM Lyophilized, usually with buffer salts and stabilizers in vials . Thorombin-JMI^TMEach vial of thrombin is typically 1000, 5000 or 500 Contains 00 units of thrombin. Collagen and thrombin have the highest expected activity to produce the adhesive And, where appropriate, first in a soluble form in which the virus has been inactivated. Generated. As is known to those skilled in the art, whether a component is a native or natural source When purified from, they are provided in purified or substantially purified form Is done. "Purified" means that the protein or factor of interest is Usually associated with a protein or factor in its native or natural environment It is substantially free of cells and other biological components. Thrombin In cases, purity is defined in units per mg of protein. To collagen In terms of purity, the purity should be of collagen type (other than type I) or other contaminating proteins, Not significantly (> 95%) free of Roteoglycans or Glucosamino-glycans Is defined as Thus, the term "purified" refers to their native environment Or biological, non-naturally occurring environments (e.g., American Type Cultu re Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. Commercially available from 20852 Recombinantly in host cells such as Chinese hamster ovary cells To describe the proteins and factors isolated from them (if they are produced) Can be used for As used herein, processed collagen is a dynamic collagen. Product or recombinant source and can be dispersed in an aqueous medium It is intended to include collagen that has been treated to form fibrils. This Dispersion can flow through a narrow diameter opening (1 mm or less) or Can be played. For processed collagen, add alcohol or acetone PH, temperature, or solvent conditions to change the pH of the diluted collagen solution. It can be prepared by various methods, including precipitating the fibrils. Or, The dermis, tendons or other collagen-rich tissues can be crushed. Examples of these materials are And US Patent Nos. 4,374,121 and 4,412,947. "Isolated" A protein or factor is a substance or substance that naturally exists with a protein or factor. It means lacking at least some other components. Therefore, the isolated factor is Can be prepared using purification techniques to concentrate it from the source mixture. concentrated Can be measured on an absolute basis (e.g., weight per solution volume), or It can be measured for a second potentially interfering substance present in the substance. Collagen and thrombin are combined to form a mixture. Preferred practice In embodiments, the ratio of collagen to thrombin is at least 25 per mL of solution. About 25 mg of collagen per 0 units of thrombin. Exact proportions matter Is not believed to be, but thrombin converts fibrinogen to fibrils. Intended for changes in applications that are fast enough or slow enough to convert It must be present in a proportion that is floor-friendly. Collagen-based mixtures can be used in aqueous form, or as described below. Can be lyophilized for storage. In one embodiment, the collagen / The Rombin mixture contains aqueous CaCl_TwoProvided in Collagen / Thrombin / CaCl_Twoset The composition may be prepared by any method known in the art, including, for example, syringes, sprays, and the like. Can be applied to the wound site. The mixture is applied on the tissue site with capillary bleeding blood Can be sprayed on, or combined with a fibrinogen preparation, Get the adhesive. Co-lyophilates are also used in percutaneous transluminal coronary angiogenesis. After procedures such as surgery (PCTA), seal the venous or arterial access site. It can be used either "as is" or reconfigured. An "effective amount" of the individual components, when combined as formulated herein , Fibrin or the amount that induces the formation of a fibrin clot. For most factors Suitable concentrations are typically present in human plasma and within the ranges provided herein. Corresponding. Although always explicitly stated, an "effective amount" of the ingredient is used and Should be assumed to be incorporated into the compositions of the present invention. Thrombin, collagen, fibrinogen or as defined herein Other proteins used in the formulations that are the subject of the present invention perform the same function. It can be replaced by other naturally occurring or synthetic compounds or compositions. Although not always explicitly described, the compositions of the present invention may be substantially (i.e., (In a "purified" state), in addition to factors in the form in which they are apparent, Quality or factor analogs, muteins, conjugates, and homologs The biological activity of the factor is not substantially impaired. Biological of protein or factor Activity includes any characteristics of the polypeptide as determined by appropriate experimental investigations. This experimental study demonstrates the ability to promote clotting time and in situ fibrin formation. Includes, but is not limited to, the experiments described herein for forces. "The real Impaired '' is compared to the native or native protein or factor. hand, Includes a 50% or greater reduction in the biological activity of the analog, homolog or mutein. As will be apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains, the compositions of the present invention are prepared using standard keys. Carriers and preservatives. These pharmaceutical compositions are within the scope of the present invention. It is in the box. Thus, it promotes the formation of fibrin in situ and / or The use of these components to prepare a medicament for inducing is further described in the scope of the present invention. It is in the box. Single component systems have advantages over traditional two-component fibrin sealant systems that are now suitable is there. Exogenous fibrinogen from humans or other sources is particularly needed in large quantities. Not done. This is due to viral infectious exogenous factors (e.g., HIV or hepatitis). Eliminate concerns. Other important advantages of the composition and its use are the curing of the material and To eliminate the need for homogeneous mixing of the catalyst to ensure subsequent strength. You. Convenience is that only one delivery device or dosing unit prepares the material and It is improved in that it is required to be applied. The present invention also relates to other components (e.g., stabilizers, preservatives, therapeutic agents, collagen). , Collagen analogs and collagen conjugates) A composition comprising: Maintains tissue adhesive activity when administered to patients Any stabilizer that functions as such may be used in practicing the present invention. like this Examples of suitable stabilizers include, but are not limited to: Tris (Trishydroxy Methylaminomethane), PIPES (piperazine-N, N-bis (2-ethane-sulfonic acid, 1.5 Sodium salt), imidazole, and MOPS (3- (N-morpholine) propanesulfone acid). Suitable preservatives include sodium azide, thimerosal, BHA, BHT. Success Other preservatives that function to prevent the growth of microbes that damage the system are adhesive Appropriately added to the composition. Therapeutic additives may be added, and the biomaterial may be a vehicle for these components. Can work as Growth factors such as EGF, TGF-α, TGF-β, FGF, PDGF Can be Cytokines such as interleukin or stem cell factor are also appropriate May be added. Antibiotics can be added, and the glue may cause ulcers and burns in the mouth. It is particularly useful when applied to such exposed wound sites. Surgical adhesive composition An object is also associated with a cell (autologous, cultured or modified, allogeneic or xenogeneic). Can be mixed. Other biomaterials (hydroxyapatite, demineralized bone, and And hyaluronic acid), but the mechanical or raw It can be added to modify physical properties. These materials are used in the material manufacturing process It can be added during or during application. This material is particularly advantageous Can be Because collagen is a commonly used cell growth support matrix This is because Various other therapeutic and biological modifiers (eg, radioactive O-isotopes, anti-hyperproliferative drugs, calmodulin, etc.) You. As will be apparent to those skilled in the art, the amount of added Varies with pient, but easily determined by the treating physician . The present invention also relates to collagen / thrombi in a two-component system with fibrinogen. Provide use of biomaterials. Collagen-based compositions are described herein And can be reconstituted after lyophilization. Fibrinogen Is available from commercial sources. Alternatively, human or animal plasma is It can be used after removal of cellular components of blood by cardiac separation. Or human or Animal plasma is plasma cryoprecipitated by freezing, thawing, and further centrifugation. Can be further processed to prepare How to get these component fractions No. 5,290,552, which is incorporated herein by reference. You. Used in crystalline or amorphous form or as a lyophilizate obtain. For example, bovine fibrinogen is available from Sigma Chemical Co. (Product number 4754 ) Or a fibrin sealant preparation (eg, Immuno AG , Vienna, Offspring can be obtained from allogeneic, autologous, plasma preparations, or by recombinant means. Can be obtained.Lyophilized collagen / thrombin mixture The present invention also provides that the reconstituted lyophilized material retains hemostatic properties and A hemostatic collagen-based living organism so that it can be extruded through an opening less than 1 mm in diameter It relates to a process for freeze-drying the material. Therefore, the present invention can be reconfigured and Storage-stable core that can be used as a tissue sealant or hemostat A process for producing a lagen compound is provided. In one aspect, the collagen-based biomaterial comprises collagen and toro. Consists of bins. The collagen / thrombin mixture is placed in a suitable container (eg, , Molds, trays, or dishes) and can be co-lyophilized You. Lyophilization of the mixture in the final delivery container (eg, syringe) is also possible is there. Also, the mixture can be lyophilized in bulk and chopped. The mixture One surface of liquid N_TwoThrough the mixture, form granules, and lyophilize in large quantities Can be frozen. General lyophilization procedures are known to those skilled in the art. The lyophilized collagen / thrombin mixture can be stored at room temperature, or It can be subjected to further operations. The present invention also provides for the lyophilization of any of the biomaterials described herein. Provide in a container suitable for drying, and instructions for preparation and use. The lyophilized collagen / thrombin composition is reconstituted in aqueous form before use. Can be In one embodiment, the lyophilizate is water, saline, or PBS. Reconstructed in In a preferred embodiment, 40 mM aqueous CaCl_TwoIs a freeze-dried product Used to rehydrate. Any other pharmaceutical buffered solution is also about 5.0-5.0 A pH in the range of about 8.5 can be used. Osmolality is hypotonic, isotonic, or high Can be Zhang. Other suitable aqueous solutions are known to those skilled in the art. Lyophilized material, for example Can be measured by the ability to convert fibrinogen to fibrin Retains bottle activity. The lyophilized collagen-based biomaterial of the present invention can be used as a tissue sealant. Useful by itself or when combined with a source of fibrinogen Useful. Thus, when reconstituted, the lyophilized material is less than about 1 mm It is an aspect of the invention that it can be extruded through a needle having a diameter of You. As is known in the art, a tissue sealant is a silicone sealant containing components of the sealant. The wound site using a needle or spray nozzle attached to the If applicable. Thus, the rehydrated lyophilizate of the present invention has a diameter of less than 1 mm. Having an opening (eg, a spray nozzle or 30 gauge in an endoscope device) Or extruded through a larger needle, catheter or delivery port) Can beRadiation sterilization of lyophilized collagen / thrombin compounds The present invention also provides a method for radiation sterilizing lyophilized collagen-based biomaterials. Provide the law. An important aspect of the present invention is that the sterilized lyophilized compound is then If it can be reconstituted into an aqueous form for use as a tissue sealant . Since lyophilized collagen-based materials can be processed aseptically, To maintain sterility and eliminate the need for terminal sterilization. Reconstructed destruction Bacterial compounds also combine with sources of fibrinogen to form tissue sealants I can do it. In addition, the co-lyophilizate can be used prior to administration of collagen and / or tron. It can be mixed with two other components of the therapeutic agent that are chemically incompatible with the bottle. Crosslinking The agent may also be incorporated in a manner similar to fibrinogen. Electron beam irradiation (e-beam irradiation) can be performed as described in the literature. Use The type of irradiation used is not considered critical, but in a preferred embodiment. The lyophilized material is exposed to e-beam irradiation at a certified facility. One In embodiments, the irradiation may be performed between 0 ° C. and ambient (room) temperature. Product Heat build-up, for example, placing the product on dry ice during the irradiation process Can be prevented by doing so. In another embodiment, the lyophilized material is irradiated Keep cold during the process (ie, below ambient or room temperature). freeze drying Collagen based material is between 10KGy and 40KGy, preferably between 10KGy and 25KGy And more preferably less than 20 KGy. As used herein "Grey (Gy)" is a unit of absorbed radiation dose, where 1 grey is an absorbing material 10 ergs per gram (10^-FiveJoules). Collagen and thrombin stabilization to irradiation increases free radical growth Can be improved by the addition of antioxidant compounds that can interfere with Such materials are Know, and tyrosine, tryptophan, ascorbic acid, citric acid, cis May include tein, methionine, vitamin E, BHA, and BHT. These excipients Is preferably used with a low temperature during the irradiation. (Negre-Salvayre, A. et al. Biochem, Pharma. 42: 450-453 (1991) and Taylor and Richardson, J. et al. Foo d Sci. 45: 1223-1227 (1980)) Thus, terminal sterilization of tissue adhesives reduces manufacturing costs and increases efficiency Had the advantage of Because of the need for aseptic technology in the manufacturing process Is excluded. The radiation sterilization method of the present invention also meets FDA standards and That is 10^-6Suggests the Sterility Assurance Level of The compositions described herein can be used for any suitable use (eg, tissue Be useful for the preparation of pharmaceuticals (for repair and / or release of therapeutic agents) Is obvious to those skilled in the art. Although the present invention has been described in connection with its preferred specific embodiment, The description and examples below are intended to illustrate but not limit the scope of the invention. It should be understood that In another aspect, the advantages and benefits within the scope of the present invention are provided. Modifications will be apparent to those skilled in the field of biomedical transplantation. Example Example 1-Co-lyophilization of processed collagen and thrombin: sedimented collagen Co-lyophilization of collagen and topical thrombin with or without terminal sterilization To evaluate the hemostatic effect of the formulated formulation, collagen was isolated as follows: Collagen Corp. 4.5 liters of solubilized collagen commercially available from (`` CSF '') The solution is sterile filtered at room temperature through a 0.45 micron filter and Poured into a Nalgene beaker. CSF with 475 mL of 100 mM sodium phosphate buffer (PH 11.2) and titrated to pH 7.4. CSF was mixed for 15 hours at room temperature. The CSF was then centrifuged at 9,000 rpm for 30 minutes to remove the precipitate and the supernatant Was thrown away. Collect the collagen pellet in one centrifuge jar and add It was dispersed again in the liquid. The protein concentration is 13.1 mg / mL and the yield is 96% Met. The collagen material was transferred to a 2 L Nalgene container. Collagen to 7.0 mg / mL with a combination of purified water and reconstituted thrombin Diluted. One bottle of 50,000 units of throne to reconstitute thrombin The bottle was diluted with 50 mL of purified water. Mix the mixture with a 3-inch stirrer (7.5 cm) blade Stirred at about 50 rpm. Aliquots of collagen / thrombin homogenate are Collected at time intervals throughout the fill to maintain thrombin activity Has been shown. Table 1 shows that thrombin was mixed before lyophilization. Maintain its activity. Table 1: Thrombin activity of homogenates The material was dispensed into the mold using a Filmatic filler. Slide the formwork Place in a stainless steel lyophilized pan and transfer to -80 ° C freezer Was. The bread is frozen at -80 ° C for 2 hours, then transferred to a standard pharmaceutical freeze dryer and And processed using a standard freeze / dry program. Lyophilization chamber Purged with an inert gas and the sample was purged in a room with 50% humidity. It was caged. The sample appeared to be well formed and dry . The lyophilizate is then filled in various ways (filling the syringe in metered amounts, Irradiation with 15KGy e-beam irradiation and tested in in vivo hemostasis model To include). CaCl_TwoWhen reconstituted in solution, The normal concentration of gen is 25 mg / mL, and the thrombin concentration is 500 U / mL. Was.Example 2-Lyophilization of collagen based material in a centrifuge tube As an alternative to filling the formwork, a collagen-thrombin mixture is Prepared as described in 1. Place a centrifuge tube with a diameter similar to that of the syringe -Gen-thrombin mixture (7.5 mg / ml). Freeze the material in the centrifuge tube. Freeze and dry the resulting product to 40 mM CaCl_TwoResuspended in aqueous solution. The product Resuspend quickly and uniformly and spray through a small diameter nozzle spray head did.Example 3-Effect of e-beam irradiation on freeze-dried collagen / thrombin Collagen-thrombin was lyophilized as described in Example 1 and 3 mL Loaded, closed with a positive closure, labeled, and And placed in a polyethylene bag and sealed with heat. 10, 12.5, Dry the syringe at room temperature at 15, 17.5 or 20KGy, or at 15 or 20KGy E-beam on samples frozen by placing on ice (about -78 ° C) Irradiation.DSC Effect of freeze-drying on peak melting temperature The irradiated product was added to the complex by adding 2 ml of purified water with a syringe. And remixed by passing through an adjuvant mixer 40 times. sample Aliquot the balance and measure the peak melting temperature using PBS as a reference. Specified. Table 2 shows the peak melting temperatures measured using different differential scanning calorimeters. Shown in Table 2: Effect of electron beam on peak DSC temperature These results indicate that as exposure to electron beam radiation increases, the peak DSC melting temperature Indicates that the degree has decreased. The decrease in DSC temperature was observed during the exposure to electron beam irradiation. This can be alleviated by placing the substance on a bed. Therefore, collagen collagen The helix of the live can be more easily maintained.Effect of lyophilization on thrombin activity To test the effect of lyophilization and electron beam on thrombin activity, The pull was rehydrated with water and diluted to about 5 units / ml. Thrombin activity A was calibrated against a commercial lot of thrombin. Sample irradiated with electron beam Are shown in Table 3. Table 3: Thrombin activity of lyophilized samples These results indicate that electron beam irradiation does not affect thrombin concentration or thrombin activity. Indicates little or no effect. Finally, using electron beam irradiation The lyophilized complex can be sterilized.Effect of freeze-drying of collagen-based materials on hemostasis Whole blood was collected from the donor on the day of the assay. Vacute the blood with 1000g for 5 minutes Centrifugation in a vacuum tube gave platelet-enriched plasma. Plasma , Collected in a 3 cc syringe. 40 freeze-dried collagen / thrombin complex mM CaCl_TwoRehydrate with aqueous solution and mix approximately 40 times using adjuvant mixer. Special Attach the mixer designed in the note to the joint and attach the head of a commercial sprayer to the mixer Attached. The hemostatic quality of this substance is determined by the kidney and kidney of New Zealand White rabbits. Diffusion Organ Bleeding Model Including Incisions of Defined Length and Depth in the Spleen evaluated. Anesthetize the rabbit, expose the spleen and kidneys, and 15m at a depth of 2mm Incisions of m length were made in both organs. Table 4 shows the results of the in vivo hemostasis test. Show. Hemostasis can be achieved by exposing the collagen / thrombin co-lyophilisate to irradiation of less than 20 kGy. Excellent when exposed. Reduce the effects of exposure to 15 kGy This can be alleviated by lowering the temperature. Maintenance of melting temperature and hemostasis in vivo A positive correlation was observed between the two. Maintains the native helical structure of collagen Seem to be important for the outcome of hemostasis.Hemostasis results Hemostasis quality was assessed in rabbits as described above. The time to achieve hemostasis depends on each test The material was measured at a minimum of six sites. The following results are shown in Table 4. Was observed. Table 4 Increased e-beam dose correlated with decreased hemostatic efficacy. The effect of dry ice Minimization was achieved by irradiating the co-frozen material frozen above. Expand the process Lyophilizate irradiated at 15KGy improved in hemostasis (75% of site) .Example 4: In vitro testing of lyophilized samples Two separate batches of material prepared as described in Example 1 were Set of features designed to characterize dynamic and performance parameters It was evaluated by an in vitro test. The results of these tests are tabulated for each batch. 5 and Table 6.Resuspension test The lyophilized samples from Examples 1 and 2 were rehydrated with 1.5 ml of purified water and And shaken for 30 seconds. Covered syringe display to prevent bias in data interpretation . The contents were then visually inspected for homogeneity.Extrusion The lyophilized sample is hydrated and transferred to a 1 ml BD syringe and 7 and 30 gauge needles were attached. Syringe and plunger at a constant speed (10c m / min) and record the force required to maintain a constant speed. Mounted on a star. If the force spike does not exceed 40 Newtons, the material will Was deemed to have been issued. These results were obtained in a similar manner (but with thrombin and frozen The results obtained with the control collagen slurry prepared in And compared. The control is referred to as "wet" throughout these examples.SDS Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) The sample was rehydrated with distilled water. SDS-PAGE was performed by the method of Laemmli (Nature 227). : 680-685 (1970), which is incorporated herein by reference). did. The gel was stained using Coomassie blue.Protein concentration Samples were collected using the Pierce BCA Protein Assay using collagen protein standards. Tested usingDSC The sample was rehydrated with distilled water to about 30 mg / ml and the Mettler Differential Sc Use an anning Calorimeter (DSC) to scan from 0 to 80 ° C at a scan rate of 10 ° C / min. Was. The melting point temperature was recorded.Physical, chemical, and in vivo analysis: Table 5: Sample preparation 1 Table 6: Sample preparation 2 ^*The shape of each DSC integral curve was also evaluated. "Wet" (non-lyophilized, non-irradiated) substances Had a very well defined sharp peak. Lyophilized substance peaks It was a sharp, well-defined peak but had a shoulder at about 45 ° C. At 10KGy, the peak began to spread. Dispersion increases at 20KGy, and 30KG With y, the DSC curve was scattered and poorly defined. Expansion in DSC curve Is generally an indicator of denaturation that occurs in the sample and is above the peak temperature. When diffusion occurs in the above, it is an indicator of crosslinking.SDS-PAGE Result The α and β bands from “wet” and lyophilized (non-irradiated collagen) Using Coomassie Blue staining, 100 kilodaltons (KD) and 200 KD MW, respectively. Stipulated clearly. The illuminated sample is sampled along the length of the lane. Le lost the rules on both markers. At 10KGy exposure, both The band was visible but very faint. At 20KGy, the band is almost intellectual It was inseparable. At 30KGy, not all of the bands were observed. And sump Seemed to be diffused throughout the molecular weight range. Start with band Not all of the protein is found, and therefore minimal cross-linking occurs and this protein It was speculated that all of the matrix had migrated into the gel. The results presented in Tables 5 and 6 show that the peak melting temperature Tm was Demonstrates that it decreases with exposure to a dose of radiation. This decrease in Tm is due to Liu (1989) can respond to strand breaks in fibers. DSC scanning also It also shows that the peaks diffuse as the irradiation increases. Sample heterogeneity May correspond to fiber degeneration. Densely cross-linked fibrils, and more Larger diameter fibrils indicate higher peak melting points. Lower peak melting temperatures correspond to fragmentation or smaller diameter fibrils. obtain. This decrease in Tm is the main effect of irradiation on lyophilized collagen. The result indicates that the strand breaks, not the crosslinks. Extrusion properties of collagen composites do not change with lyophilization or increasing doses of irradiation Was. There was no change in the suspension characteristics of the lyophilized pieces with increasing irradiation dose. This These results are consistent with strand breaks. Hemostasis, as shown in the rabbit diffuse organ bleeding model, increases as irradiation increases Diminished. 80%, 25%, and 17% hemostasis at 0, 15, and 20 KGy, respectively Was observed. Based on these results, even at 10 KGy irradiation, the physical Obviously, it is sufficient to change the features. But physical changes Does not appear to significantly affect the extrusion properties of the resuspension or the hemostatic properties of the substance is there. This indicates that irradiation of the product predominantly causes strand scission rather than cross-linking . This feature proves to be valuable in reducing implant persistence in vivo. Can be clear.Example 5: Simultaneous freeze-drying of processed collagen and thrombin: ground Collagen Fibrous collagen (Semed F, Kensey-Nash Corporation, Exton, PA, US patent) No. 4,374,121) was suspended in distilled water at 3-5% solids (w / w). Fibrous suspension The pH is adjusted to pH 2 ± 0.2 using HCl. Do not mix collagen dispersion occasionally. Incubate at 5 ° C for 2-3 days. Add more HCl as needed And maintain the pH at around 2. The dispersion is then milled in any of several ways: 1) various diameters (e.g. For example, use a connector with a 1 mm) opening to separate the syringe from syringe to syringe. Mixing and pumping of powder; 2) wet milling, for example in a Waring blender . Samples should be kept below about 15 ° C to avoid collagen denaturation during these operations. is there. Grinding and swelling with acid was performed as described in Example 3 above, Continue until it can be pushed through a good gauge needle. Further dispersion with HCl at pH 2 Use a dilution of the material to facilitate dispersion. But the minimum solids percentage is 0.5% (w / w) Should be kept as high as possible. Through a 27 gauge needle, force less than 40 Newton (1ml The dispersion which can be extruded (through a syringe) is considered fully ground. U.S. Patent No. 3,628,974 to Battista claims that mechanical degradation of collagen , Less than 1 micron in length and about 2.5 Angstroms to hundreds of Angstroms in diameter Microcrystalline consisting of bundles of aggregated tropocollagen units that vary in tromes To produce collagen. In this method, all of the collagen It cannot be a crystal. And the fraction of finely ground collagen from the larger fibers Separation may be necessary to obtain a preparation that can be pushed out of a small gauge needle . Raise pH to 7.2 ± 0.2, adjust% solids to 0.5% -1.0%, and cool Milling, if necessary, to maintain extrudability through a 27 gauge needle Continued. Thrombin reconstituted with water as described in Example 1 was replaced with solid collagen Add the suspension to a final concentration of 20 units of thrombin activity per mg Add. Higher or lower thrombin concentrations may be combined with some of the two-component sealants. When used as such, it may be added depending on the desired hemostatic ability or set time. dispersion The material is frozen, lyophilized, and sterilized by irradiation as in Example 1. Frozen Dried sponge form of collagen was added to 40 mM CaCl_Two2.5% solids (w / w) in aqueous solution Reconstitute with and disperse well by mixing between syringes . Such a dispersion may then be added, if necessary, to plasma or other fibrino. Mix with the genogen solution and spray or extrude onto the bleeding wound. Or Spraying the dispersion alone onto the wound and, if the blood mixes with the formulation, the blood The fibrinogen therein reacts with thrombin to form a clot. Coagulation also Contact with other blood clotting factors with platelets and collagen dispersion Be sent. Obvious to those skilled in the chemistry, materials science, medicine and related fields, Modifications of the above embodiments for carrying out the invention are within the scope of the following claims. Intended to be.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デルストロ，フランクアメリカ合衆国カリフォルニア 94002, ベルモント，デコベンアベニュー 2517 (72)発明者プライアー，ジェフアメリカ合衆国カリフォルニア 94065, レッドウッドシティ，スパードライブ 602────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Delstro, Frank United States California 94002, Belmont, Decoven Avenue 2517 (72) Inventor Prior, Jeff United States California 94065, Redwood City, Spar Drive 602

Claims

[Claims] 1. A process for preparing a hemostatic collagen-based biomaterial useful for wound healing and tissue sealing, comprising: (a) providing an effective amount of processed collagen and an effective amount of thrombin at about 1 mg / gram; mixing under suitable conditions to achieve a uniform dispersion of collagen from about mL to about 10 mg / mL collagen; (b) drying the dispersion under suitable conditions; and (c) performing the step (b). Reconstituting the dried dispersion under conditions to obtain the collagen-based biomaterial, wherein the biomaterial is hemostatic and can be extruded through an opening. A process, comprising: 2. The process of claim 1, wherein the homogeneous dispersion has a final collagen concentration of about 5 mg / mL to about 9 mg / mL. 3. 2. The process of claim 1, wherein the appropriate conditions of step (a) include titrating the pH of the mixture from about pH 5.5 to about pH 8.0. 4. The process of claim 1, wherein the drying step (b) is by freeze drying, freeze drying, or drying under reduced pressure. 5. 2. The method of claim 1, wherein the mixing step (a) further comprises the step of adding an effective amount of a drug selected from the group consisting of a therapeutic agent, a cytokine, a growth factor, or an analog or mixture of any of these drugs. The process described in. 6. The process of claim 1, wherein the reconstituting step (c) comprises mixing the dry mixture with an effective amount of an aqueous source of calcium ions. 7. Aqueous source of said calcium ions is from CaCl ₂ solution, the process according to claim 6. 8. A process for preparing a sterile, hemostatic, collagen-based biomaterial useful for wound healing and tissue sealing, comprising: (a) providing an effective amount of processed collagen and an effective amount of thrombin; Mixing under conditions suitable to achieve a homogeneous dispersion of about 1 mg / mL to about 10 mg / mL collagen: (b) drying the dispersion under suitable conditions; (c) Subjecting the dried concentrated mixture of step (b) to a sterilization process; and (d) reconstituting the dried solution of step (c) under conditions to obtain the collagen-based biomaterial. Wherein the biomaterial is hemostatic and can be extruded through an opening. 9. 9. The process of claim 8, wherein said homogeneous solution has a final collagen concentration of about 5 mg / mL to about 9 mg / mL. 10. 9. The process of claim 8, wherein the suitable conditions of step (a) include titrating the pH of the mixture from about pH 5.5 to about pH 8.0. 11. 9. The process of claim 8, wherein said drying step (b) is by freeze drying, freeze drying, or drying under reduced pressure. 12. The mixing step (a) further comprises a step of adding an effective amount of a drug selected from the group consisting of an antioxidant, a therapeutic agent, a cytokine, a growth factor, or an analog or a mixture of any of these drugs. The process according to claim 8. 13. 9. The process of claim 8, wherein said reconstituting step (d) comprises mixing said dry mixture with an effective amount of an aqueous source of calcium ions. 14． Aqueous source of said calcium ions is from CaCl ₂ solution, the process according to claim 13. 15. The step (c) is carried out under the conditions for obtaining a composition which is hemostatic, flowable and can be extruded through an opening upon reconstitution of the dry concentrated mixture of the step (b). 9. The process of claim 8, comprising subjecting to a sterilization process comprising electron beam irradiation or gamma irradiation. 16. 16. The process of claim 15, wherein the sterilization process is electron beam irradiation, and wherein the conditions include about 10KGy to about 40KGy. 17． 16. The process of claim 15, wherein the sterilization process is between about 10KGy to about 20KGy. 18. 17. The process of claim 16, wherein said conditions include stabilizing said mixture at a low temperature prior to said sterilization process. 19. 17. The process of claim 16, wherein said low temperature comprises about -40C to about 10C. 20. 16. The process according to claim 8 or 15, wherein the sterilization process is low dose rate gamma irradiation. 21. A biomaterial produced by the process of claim 1. 22. Biomaterial produced by the process of claim 5. 23. Biomaterial produced by the process of claim 8. 24. A biomaterial produced by the process of claim 12. 25. A process for preparing a biomaterial comprising a hemostatic wound dressing, comprising applying an appropriate amount of the biomaterial of any of claims 21 to 24 to a fibrinogen-based solution prior to applying to the wound. A process comprising mixing with a suitable amount. 26. 26. The process of claim 25, wherein the fibrinogen-based solution is fibrinogen, a fibrinogen analog, or a derivative thereof. 27. 26. The process of claim 25, wherein the fibrinogen-based solution is plasma isolated from whole blood. 28. A biomaterial produced by the process of claim 25. 29. 25. A method of treating a wound, comprising contacting the wound with an effective amount of a biomaterial according to any of claims 21 to 24 under conditions for treating the wound. . 30. 29. A method of treating a wound, comprising contacting the wound with an effective amount of the biomaterial of claim 28 under conditions for treating the wound. 31. An effective amount of a biomaterial according to any of claims 21 to 24, which is provided in a container for preparing wound healing or tissue sealing, which is provided in a container suitable for freeze-drying said biomaterial. And instructions for the preparation and use of the biomaterial. 32. 29. An effective amount of the biomaterial of claim 28, and a preparation and use of the biomaterial, provided in a container suitable for lyophilizing the biomaterial, the kit for preparing wound healing or tissue sealing. A kit comprising instructions for the kit. 33. 29. Use of a biomaterial according to any of claims 21 to 24 or 28 for the preparation of a medicament for wound treatment or tissue repair.