JP2001508308A

JP2001508308A - 核酸配列決定

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Publication number: JP2001508308A
Application number: JP53394498A
Authority: JP
Inventors: シュミット、グンテル; ヒュージントムソン、アンドリュー
Original assignee: ブラックスグループリミテッド
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2001-06-26
Also published as: CA2277520A1; WO1998031831A1; US7094531B1; NZ336770A; AU5570298A; CA2277520C; AU728805B2; IL130886A0; IL130886A; EP0960215A1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡを配列決定する方法であって、該方法が、(a)配列決定すべき１又は２以上の一本鎖ＤＮＡを有するターゲットＤＮＡ集合を得る工程であって、各一本鎖ＤＮＡが独特の量で存在しかつ該ＤＮＡに結合する該ＤＮＡの二本鎖部分をもたらすプライマーを保持する工程；(b)該ＤＮＡ集合をハイブリダイゼーション・プローブのアレイに接触させる工程であって、各プローブが所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含む工程；(c)未結合のプローブをすべて除去する工程；を有し、その後に(d)結合したプローブを開裂させて各ラベルを遊離する工程：(e)各ラベルの質量を記録する工程；および(f)延長化二本鎖部分を活性化してそれへの結合を可能とする工程；を有し、(g)各ラベルの遊離の配列を求めることにより、前記一本鎖ＤＮＡ又は各一本鎖ＤＮＡの配列を求めるのに十分な回数、工程(b)〜(f)を繰り返す、上記方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列決定本発明はＤＮＡを配列決定する方法およびＤＮＡを配列決定するためのキットに関する。ＤＮＡのような核酸を配列決定する伝統的な方法は、しばしば宿主およびベクターの生物学的なサブクローニングを必要とする。かかる伝統的な方法は一般に、配列の情報を得るためにゲルクロマトグラフィーを必要とする。したがって、これらの伝統的な方法はしばしば、時間もかかり且つ労力も要する複雑な多段階の工程である。 PCT/US96/05245号は、一本鎖鋳型に沿った二本鎖延長という、反復工程を基礎とする核酸配列決定法を開示している。二本鎖延長は、初期化オリゴヌクレオチドを用いてプライマーをつけた鋳型領域に、プローブを結合させることによリ行なわれる。上記の方法のプローブは、好ましくは蛍光色素を用いてラベルされる。この色素は、結合部位の一つの塩基を同定する。プローブは、その一端に除去可能なブロッキング基を有することにより、制御されない延長から免れる。 PCT/GB95/00109号は、プライマーを、一度に所定の塩基数だけ連続して延長し、加えた塩基が、配列決定される塩基に対し相補的であるようにすることを含む、核酸配列決定法を示唆している。これは、核酸をラベルしたアダプターと接触させ、このラベルが該アダプターの塩基配列に特異的であるようにすることで成し遂げられる。所定の塩基数について、可能な順列をすべて含むオリゴヌクレオチド配列を有するアダプター集団が用いられる。本発明はＤＮＡを配列決定する方法を提供するが、該方法は： (a)配列決定すべき１又は２以上の一本鎖ＤＮＡを含むターゲットＤＮＡ集合を得る工程であって、各一本鎖ＤＮＡが独特の量で存在しかつ該ＤＮＡに結合する該ＤＮＡの二本鎖部分をもたらすプライマーを有する工程； (b)該ＤＮＡ集合をハイブリダイゼーション・プローブのアレイに接触させる工程であって、各プローブが所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含み且つ該塩基配列が互いに結合せず、二本鎖部分に近接する一本鎖ＤＮＡに相補的な塩基配列を保持するプローブを各々のＤＮＡの二本鎖部分に結合する条件で、該接触をリガーゼの存在下で行い、それによってさらにプローブと結合することができない延長化二本鎖部分を形成する工程；及び (c)未結合のプローブをすべて除去する工程；を有し、その後に、 (d)結合したプローブを開裂させて各ラベルを遊離する工程； (e)各ラベルの量を記録する工程；及び (f)延長化二本鎖部分を活性化してそれへの結合を可能とする工程；を有し、 (g)各ラベルの遊離の配列を求めることにより、前記一本鎖ＤＮＡ又は各一本鎖ＤＮＡの配列を求めるのに十分な回数、工程(b)〜(f)を繰り返す方法である。ある態様において、アレイは、可能性のある塩基配列のすべてを共に含む複数のサブアレイを含んでおり、工程(b)にしたがって各サブアレイをＤＮＡ集合に接触させ、工程(c)にしたがって未結合プローブを除去し、かつ工程(d)の前にこれらの工程を繰り返してサブアレイのすべてをＤＮＡ集合に接触させるようにする。この方法では、ハイブリダイゼーション・プローブのアレイはＤＮＡ集合に対して段階的に提供される。例えば、塩基配列の所定の長さが４であれば、可能な全塩基配列数は256（４⁴）であり、アレイの相補的な４量体(4-mer)間のクロスハイブリッド形成は、当該ＤＮＡ集合を最初の128個のプローブのサブアレイと接触させ、さらに未結合プローブをすべて除去した後に二番目の128個のプローブのサブアレイと接触させることによって避けることができる。ターゲットＤＮＡ集合は、初期ＤＮＡサンプルを副集合に分類し、ターゲットＤＮＡ集合として副集合のうちの１つを選択することにより得ることができる。したがって、もし初期ＤＮＡ集合が大きい場合、この分類工程によってサイズを減じることもできる。好ましい態様において、初期ＤＮＡサンプルを、その各々が既知の長さであり未知の配列である粘着性末端を有するフラグメントであって、典型的には２〜６、好ましくは約４塩基の長さのフラグメントに切断する。このフラグメントを、その粘着性末端配列にしたがって副集合に分類してもよい。４塩基の塩基配列をもつプローブを用いて、少なくとも60フラグメントの集合または副集合を、許容される誤り率で平行して配列決定することが可能であると考えられる。好ましくは各一本鎖ＤＮＡは、通常一端が、例えばビーズ（bead）のような固形の支持体上に固定されている。このことは、不必要な物質の除去を溶液中で起こすことができ、かつプローブからのラベルの分離が促進されるという利点をもつ。ターゲットＤＮＡは工程(b)に先立ち固相支持体上に固定されていることが好ましい。該固相支持体はプライマーに都合よく結合されていてもよい。ラベルは、蛍光ラベル、放射線ラベル又は質量ラベルのような、どの適切なラベルでもよい。ラベルの同定は、各々の塩基配列により指定されるべきであり、このラベルの同定が塩基配列を同定するようにする。好ましい態様においては、各プローブのラベルは質量ラベルを含む。各々の質量ラベルは、質量分析器を用いて他のあらゆる質量ラベルと関連させて独特に同定することができる。代表的には、各々の質量ラベルは他のあらゆる質量ラベルとは異なる質量を有し、かつ好ましくは質量分析器での分析のｐＨにおいて単一のイオン化状態を有する。各々の質量ラベルは、質量分析器において分解しないことが好ましい。好ましい質量ラベルは、この配列決定法におけるリガーゼの作用又は本発明に用いられる他のいかなる分子生物学の工程によっても妨げられない。ラベルが質量ラベルである場合、結合したハイブリダイゼーション・プローブに相当する各ラベルの量を、工程(d)のラベルの遊離の後に、工程(e)で記録する。ラベルが蛍光ラベルである場合、工程(e)を工程(d)に先行してもよく、また結合したプローブ上に存在する蛍光ラベルの量を、該ラベルが遊離する前に記録する。本発明の方法のどの１サイクルにおいても、一つのプローブの塩基配列のみが各ＤＮＡの二本鎖部分に結合するということが肝要である。したがってアレイのプローブの塩基配列は、互いに結合することができないため、結合の後に形成された延長化二本鎖部分は、さらなるプローブと結合することはできない。これに続く工程(f)では、延長化二本鎖部分を活性化して、次のサイクルのさらなるプローブがそれに結合できるようにする。活性化を必要とすることによるか、あるいはブロックすることによりそれに対する結合を妨げるようにするか、のいずれかにより該塩基配列相互の結合ができないようにしてもよい。本発明の一つの態様において、既知の塩基配列はその3'ＯＨがブロックされている。この態様によれば、プライマー延長配列決定は5'から3'の方向に起こる。本発明のもう一つの態様では、塩基配列は、リン酸化により活性化した場合のみ互いに結合することができる。この態様によれば、各プローブの塩基配列は3'及び5'末端の双方でリン酸化されておらず、活性化工程(f)が延長化二本鎖部分の5 '-ＯＨ末端をリン酸化することを含み、それに対する結合を可能にすることを含む。都合のよいことに、結合したプローブを開裂して各ラベルを遊離する工程(d) は、工程(f)による延長化二本鎖部分の3'-ＯＨをブロックしない。言い替えれば、工程(d)と工程(f)とは同一である。各プローブのラベルは塩基配列の3'-ＯＨに開裂可能に結合しているのが好ましい。したがって、当該プローブからのラベルの開裂は3'ＯＨ末端をブロックせず、次の配列決定サイクルにおいて、新たなハイブリダイゼーション・プローブがそれに対して結合できるようにする。塩基配列の所定の長さは、理論的にはリガーゼの適合度（fidelity）についての考慮によってのみ制限される。塩基配列が長いほど、プローブの塩基配列と一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは強くなる。したがって、１０または１１という長さはリガーゼの適合度が非許容となるまでのおよその最大値であると考えられる。しかしながら実のところ、この長さの配列決定は、有用であるためにはあまりにも多くの独特のラベルを必要とし、それに対し、より短い塩基配列はより少ない独特のラベルを必要とする。塩基配列の所定の長さは２〜６であるのが好ましく、さらに好ましくは４である。本発明は、ＤＮＡを配列決定するためのキットであって、該キットがその各々が所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有するハイブリダイゼーション・プローブのアレイを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含み、且つ塩基配列が互いに結合することができない、上記キットをさらに提供する。ハイブリダイゼーション・ブローブのアレイは、上記で定義したようなものであるのが好ましい。キットはさらに、ＤＮＡを配列決定する方法において用いるための説明書を含んでもよい。したがって当該キットの使用は、ＤＮＡを配列決定する方法、特に上記の方法のために提供される。ここに本発明を、添付図面を単なる例として参照し、さらに詳しく説明する。図１ａ及び図１ｂは、各々本発明の好ましい工程の１回目（first cycle）及び２回目（second cycle）を示し；図２ａ及び図２ｂは、各々本発明の別法の工程の１回目及び２回目を示し；図３は、本発明で使用するための代表的なアダプター分子を示し；図４は、本発明にしたがって配列決定するための、ターゲットＤＮＡの好ましい製造法を示し；図５は、４量体配列決定実験の最初のサイクルのデータを描いている棒グラフを示し、シリーズ１はリガーゼ無しであり、シリーズ２はリガーゼがあり；図６は、４量体配列決定実験の第２サイクルのデータを描いている棒グラフを示し、シリーズ１はリガーゼ無しであり、シリーズ２はリガーゼがあり；さらに、図７は、４量体配列決定実験の第３サイクルのデータを描いている棒グラフを示し、シリーズ１はリガーゼ無しであり、シリーズ２はリガーゼがある。プライマー延長配列決定法により分類された核酸集合の平行配列決定法：本発明は種々の手段により生じた核酸フラグメントの異種集合を同時に配列決定することを可能にする方法である。この方法は、宿主およびベクターを生物学的にサブクローニングする必要性を潜在的に回避することができるゲノムＤＮＡを配列決定するための新規な戦略を提供する。本文に記した配列決定法は、核酸フラグメントの集合を再生可能な方式で産生できるようにし、それは次いでサブセットに分類することができ、最終的には固定化された一本鎖ＤＮＡ分子への、プローブの結合の反復工程によって配列決定されるようにする。混合された核酸 → サブセットへ → サブセット内で同時集合の産生分子を分類するに分子を配列決定する配列決定工程の概要。この配列決定工程は、固定化された鋳型核酸フラグメントの一本鎖の配列をプローブするために、所定の長さの、短い一本鎖オリゴヌクレオチドを用いる。プライマーをつけられた領域に近接する一本鎖領域は、該プローブオリゴヌクレオチドを該プライマーに結合させ、且つ該オリゴヌクレオチドによって運ばれるタグに基づき、それらの正体を決定することにより決定される。ラベルは、該オリゴヌクレオチドプローブの配列を決定する。核酸フラグメントは雑多なセットとしてプローブされ、配列情報は、正しくハイブリダイズし且つ結合したプローブのラベルの量を測定することにより決定される。 5'から3'へのフォーマットか、または3'から5'へのフォーマットのいずれかにより配列決定を行なうことができる。5'から3'へのフォーマットにおける制御されない延長は、延長しているプライマーにプローブを添加する前にこのプローブの末端の3'-ＯＨを可逆的にブロックすることで防止される。プライマーにプローブを結合させた後、未結合のプローブをすべて洗い流す。結合したプローブの量を測定し、3'末端をブロックしないで、次のプローブするサイクルが延長されたプライマー上で行なわれるようにする。3'から5'へのフォーマットにおいては、プライマーの制御されない延長は、リン酸化の工程を用いて、延長しているプライマーの5'-ＯＨ基にトリホスフェート本体を添加することにより制御する。5 '末端にリン酸基がない状態でプローブが合成されるため、延長するプライマーにプローブを添加するたびに、その後に5'末端をリン酸化してさらなる延長を可能にしなければならない。個々のフラグメントの配列決定は、配列決定工程の各サイクルにおけるプローブの各タイプのラベルの量を、サイクル前後において得られる量と比較することにより測定される。本発明は、雑多な核酸の副集合を、それらを空間的に分解することなく分析する方法を提供する。これは、配列決定をそれらの相対的な量に基づいて同定することができるシグナル獲得およびシグナルプロセッシング法によって行なわれる。この方法は、配列の情報を得るために伝統的なゲル法を必要としない。全工程が溶液中で起こり、かつ反復工程であるため、必要な工程を液体操作ロボットにより行なうこともできる。大きい核酸分子の配列決定法：分子の配列を決定するためには、必ずしも分子全体を一度に配列決定する必要はないが、このことは、染色体のように大きい分子を配列決定することは現時点では実践上困難であるため幸いである。ヒトのゲノム内では、17塩基対の長さのどのような任意の配列も、独特であると計算されている。同様の計算を、大きさの異なるゲノムについて行なうことができる。この考察は、大きい核酸またはゲノム全体を17塩基対より大きい長さの、短い重複するフラグメントに分解し、次にそれを配列決定し、そこからコンティーグ（contig）重複を決定するソフトウェアを用いて全ゲノム配列を再構築することによって、配列決定することができることを意昧する。配列決定するための核酸の調製：かなりの大きさのある完全な核酸を配列決定することは、実践上非常に困難である。この方法は、ターゲット核酸のフラグメント化と、同時配列決定を可能にするために十分に小さい副集合に分類することとを必要とする。分類法についての種々の態様は、the Gene Profilingの特許出願、および配列決定することについての先願において記述されている。ここでは、核酸の包括的な集合において別個の末端を提供するためのアダプターの使用における、小さい変形についてのみ議論する。核酸集合における特異末端の固定化：一つの重要な因子は、核酸の一端の固定化である。このことは、任意に生成されたフラグメントが方向性をもつことを必要とする、すなわち二つの区別できる末端を必要とする。このことは、アダプターを用いることにより達成することができる。二つの別個の末端を同定するためには、二つのタイプのアダプターが必要である。代表的なアダプターを、添付図面に示す。アダプター１は、固定化と、ブラント末端フラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼII型の認識部位とを提供し、この実例で選択された酵素はメチル化感受性のＢｓｕＲＩである。配列決定すべきＤＮＡは5-メチルシトシンを用いて合成される一方、アダプターばメチル化されていないシトシンを用いて合成し、アダプターのみがＢｓｕＲＩによる開裂に感受性があるようにする。アダプター２は制限エンドヌクレアーゼII s型の認識部位、または別法として第二の通常の制限エンドヌクレアーゼII型の制限部位を提供する。アダプターは核酸フラグメントに結合することが必要である。結合の実施は、当該集合をフラグメント化するために用いられる手段に依存するが、既知の粘着性末端を生じる何らかの種類のヌクレアーゼを用いたランダムなフラグメント化であると仮定すれば、相補的な配列をもっている両アダプター型の種類の結合が有効となるか、あるいはブラント末端アダプターを図３に示すように用いることもできる。これにより三つの型のフラグメントを生じる。即ち、両端にアダプター１をもつフラグメント、両端にアダプター２をもつフラグメント、および一端にアダプター１を、且つ他端にアダプター２をもつ第三のフラグメント、である。統計学的には、第三の型のフラグメントが過半数を占めるであろう。もしアダプター１上の固定化のエフェクターがビオチンであれば、アビジンを用いて変性した（derivitised）固相マトリックスの上にアダプター１をもっているフラグメントを固定することができる。両端にアダプター２をもつフラグメントは洗い流すことができる。二つの固定化アダプターをもつフラグメントは、フラグメントの長さに依存して両端が固定されてもよい。アダプター２によってその結合部位が運ばれているエンドヌクレアーゼIIs型を用いた開裂では、両者の型のアダプターを保持するフラグメントの一端に不明瞭な粘着性末端を生じるであろう。二つのＩ型アダプターをつけているフラグメントは変化しないだろう。開裂したアダプターフラグメントは、次いで制限エンドヌクレアーゼIIs型を用いて洗い流すことができる。アダプター１にその開裂部位がある通常のエンドヌクレアーゼII型を用いた第２の開裂は、その端に各アダプターの１つのコピーを保持した、残りの固定されたフラグメントを放出するであろう。それらのフラグメントは、アダプター２を保持した末端において不明瞭な粘着性末端をもつはずであり、したがって後述するように分類することができる。アダプター１のを２つのコピーを保持したフラグメントはブラント末端をもち、アレイとは結合しないであろうし、したがって洗いさることができる。このようにして、核酸フラグメントの集合を、配列決定するために調製した他の末端と共に一端において特異的に固定化することができる。各々の配列の複数のコピーが存在する以上、統計学的には、膨大な大多数の配列は、両アダプターを保持する集合の部分において表されるべきであり、したがって各配列は少なくとも１回は配列決定されるはずである。コンティーグ再構成法では、ギャップが明らかになるはずであり、当該ギャップのフランキング配列にターゲットされたプライマーを用いて特異的に調べることができる。別法として、アダプター２が、既知の付着末端を生じる通常の制限エンドヌクレアーゼII型の開裂部位を保持した場合、後の段階まで分類を残しておくことができる。好ましくは、これを行なうためにはメチル化感受性制限酵素が必要とされる。得られたフラグメントを次に、さらなる増幅のようなさらなるプロセッシングのため、または該フラグメントを一本鎖にするためにビーズ上に固定することができる。当業者は、別の末端について行なう他の方法をほとんど確かに思いつくであろう。なお、もしターゲットＤＮＡについての制限地図が知られていれば、フラグメントの末端の識別についてのアダプターまたはプロトコールの設計は、より簡単になるであろう。プライマー延長配列するための一本鎖ＤＮＡの生成：この配列決定システムが作動するためには、一本鎖ＤＮＡフラグメントが必要である。このことは比較的平凡な方法で行なわれる。末端のリン酸基をそのむき出しの5'鎖にもたない二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて変性したビーズを用いることだけが必要である。配列決定すべきＤＮＡフラグメントを、5'ホスフェートを残す酵素で開裂するか、またはこれらのフラグメント上に5'ホスフェート基を生じるキナーゼを使用することが、これらのフラグメントをビーズに結合することを生じさせるのに必要である（図４参照）。この結合により、ニックのある固定されたオリゴヌクレオチドの5'末端に結合した鎖が残されることになる。温度を上げることによるか、または他の方法で変性させる条件を作ることにより、ニックの入った鎖は除去され、固定された一本鎖ＤＮＡが残されることになる。Ｍ13ファージからのＤＮＡは一本鎖であり、しばしば配列決定ベクターとして、サンガー（Sanger）配列決定用の一本鎖の鋳型を作るために用いられる。サブセットへの分子の分類：一旦フラグメントの集合が増幅され、且つ各フラグメントについて別個の末端が確立されれば、上記のように不明瞭な粘着性末端をもつフラグメントを分類することができる。分類は、the Gene Profilingの出願、GB 9618544.2号に記述されたものと同じ方法で、生じたかもしれない可能な粘着性末端に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて変性したビーズを用いて成し遂げられる。この分類法は、最初に分類された集合について、別の末端の制限エンドヌクレアーゼIIｓ型部位を提供するアダプターを用いて繰り返すことができる。これにより不明瞭な粘着性末端の別のセットを生じることになり、核酸フラグメントの集合が不明瞭でない配列決定に適する大きさになるまでさらに副分類（sub-sort）することが可能になる。オリゴヌクレオチドチップを用いて分類し、フラグメントの同時分析を可能にすることもできる。これは、必要とされる試薬の量が一連のウェル用よりもずっと少ない場合に特に望ましい。この分類法は、検出手段としての蛍光に匹敵する。一端に不明瞭な粘着性末端をもつＤＮＡフラグメントの集合は、むき出しの粘着性末端をその相補体に結合することによりオリゴヌクレオチドチップ上に分類することができる。したがって、４塩基対の付着末端については、その表面上の別々の場所に256個の可能な４量体を有するチップが必要となる。上記の本分類法では、４塩基対の不明瞭な粘着性末端について256個の副集合を生じる。これは、配列決定を始めるのに十分小さい核酸の集合を生じてもよく、あるいはさらなる副分類を必要としてもよい。核酸フラグメントの雑多な集合のプライマー延長および平行配列決定法：一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーに結合することにより一個の分子を配列決定する方法：この方法は、まず一個の核酸の場合についてそれを説明することにより理解することができる。固定された不溶性のマトリックスに一端を固定された一個の核酸を考える。この分子は、この分子の固定された末端で短い二本鎖ＤＮＡである以外は一本鎖として描かれる。このプライマー配列は、当該末端を固定するために用いたアダプターによって提供されることが可能である。この一本鎖分子の配列を決定するためには、４塩基オリゴヌクレオチドの可能性のある256個の一本鎖の一つ一つを用いて固定された核酸をプローブすることができる。これらの各々は、その既知の４塩基対の配列に対応する独特の同定用のラベルを保持している。5'から3'へのフォーマットの場合（図２ａおよび図２ｂ参照）、3'-ＯＨにラベルを結合させることができ、そのさらなる延長を効果的にブロックするようにするか、さもなければ別のブロックする基を用いて当該分子のどこか他の場所にラベルを結合させてもよい。3'から5'へのフォーマットでは（図１ａおよび図１ｂ参照）、可能性は小さいがもしプローブの末端にそれが添加された場合にはリガーゼと相互作用する場合を除き、プローブのどの特定の部分にも質量ラベルをつけることになんら特別の利点がない。もしオリゴヌクレオチドをリガーゼの存在下に添加すると、プライマーをつけた二本鎖領域に隣接する４つの塩基の配列に相補的なオリゴヌクレオチドが当該プライマーに結合することになる。次に、固定されたマトリックスを洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去することができる。プライマーに結合した４塩基のオリゴヌクレオチドの配列を決定するためには、オリゴヌクレオチドの3'末端に結合したラベルを分析することだけが必要である。本発明に関して使用するためのラベルシステムは、本願と同時に提出されたPCT特許出願に記述されている（Page WhiteおよびFarrer Ref：86359）。これはラベルの質量がその担体を同定する「質量ラベル法」について記述しているものである。かかるラベルは感光性であるか、または特異的な薬剤により開裂可能であることができる。ラベルが開裂すると、溶液中にラベルが遊離し、そこでそれを分析用にエレクトロスプレー（electrospray）質量分析計に注入することができ、これにより当該オリゴヌクレオチドの配列と、さらにその質量が決定されることになる。好ましい態様において、光分解性リンカーが質量ラベルを3'-ＯＨに結合し、それが開裂した場合にはできるだけ高い効率で3'-ＯＨを再生する。プライマーは既知の４つの塩基によってその時すでに延長されており、このサイクルを繰リ返して配列の次の４つの塩基を決定することができる。この工程を、分子全体が配列決定されるまで反復的に繰り返すことができる。各々の４量体オリゴヌクレオチドの3'-ＯＨにおける光分解性質量ラベルを用いるための別の実施法は、リン酸基を用いて3'-ＯＨをキャップすることでもよい。質量ラベルは、3'末端の脱キャップ反応とは無関係に遊離されることが可能な、当該分子の別の部分に結合してもよい。3'末端の脱キャップは、キャップを形成しているホスフェートを3'-ＯＨから容易に除去して配列決定工程の次のサイクルのためにそれを残すアルカリホスファターゼを用いて、固定したＤＮＡを洗浄することにより成し遂げることもできる。多分このシステムは、他のラベル機構を用いても実施することはできるであろうが、他のほとんどのラベル機構では、実用的であるために十分且つ独特のラベルを生じない。蛍光を用いて同じシステムを実行することができたが、４つの良好な色素が市販されているだけであるため、４塩基対のオリゴヌクレオチドはすべてを同時にではなく、４個からなる64群において調べなければならないであろう。同様の考察が、放射能ラベルの使用にもあてはまるが、ここでは、各オリゴヌクレオチドは一度に添加されることになる。他のラベルには、炭水化物、中でもビオチンが含まれる。実際には、質量ラベルしたオリゴヌクレオチドはおそらく128個の２セットとして添加され、最初のセットの各々のメンバーが、もう一つのセットにおいてその相補体をもつようにする。このことは、相補的な４量体の間のクロスハイブリダイゼーションの問題を克服する。核酸フラグメントの集合の配列決定法同じ方法を、固定された核酸の雑多な集合にも適用することができ、それらを平行して分析することができる。核酸の集合に適用した場合に成功するためには、この方法は、統計学的に全集合の256個の分子のうち１個が二本鎖プライマー領域に隣接する、可能性のある４塩基対配列の各々を保持するであろうという仮説による。仮に、核酸集合を、256個未満のフラグメントの扱やすいサブセットに副分類するとすれば、ほとんどすべてが異なる多義の粘着性末端をもつことが予想され（もし100個の別個の配列が同時に分析されると、任意の点において、同じ４塩基対配列を有する２つの別個のＤＮＡが存在する確率は約1000に１である）、したがってほとんどの目的について、一つのハイブリダイゼーションシグナルが一つのＤＮＡ型に対応すると仮定することができる。これはすべて、ＤＮＡ配列が塩基のランダムな配列であると仮定したものであり、それは厳密に言えば正確ではないが、本発明の目的のためには十分な仮説である。明らかに1000に１は小さい確率ではなく、配列はしばしば一つの配列決定サイクルにおいて同一の４量体を有するであろう。しかしながら本発明は、このことの発生によって引き起こされる、可能性のあるいかなるあいまいさの大部分も解決することができるアルゴリズムを含む。ターゲット核酸の配列を再構成する：プライマー延長サイクルの繰り返しは、各々の可能性のあるプローブに対応するラベルの量のマトリックスを生じるであろう。以下に、４つの塩基対の長さのすべてのプローブについての可能性のあるマトリックスを示す。これらのラベルの量が対応する配列を再構成するため、本発明ではかかるデータマトリックスを分析するためのアルゴリズムを取り入れてもよい。かかるアルゴリズムおよび該アルゴリズムを用いるためのコンピュータープログラムは、PC T/GB97/02734号に詳細に記述されている。アルゴリズムは、ある配列をその頻度に基づいて、すなわちある任意の頻度で存在する配列が、続いて起こるあらゆるものを同一の頻度で存在させるであろうということに基づいて、同定することを試みる。このアルゴリズムは、マトリックスの各コラムをあちこち調べ、ラベルの量を解明しようとするが、それは原子量に対する配列の頻度の合計でよく、原子量の同一のセットがすべてのコラムに現われるようにする。このアルゴリズムは、各々後および前のコラムとしか比較することができない最初と最後のコラムを除き、任意のコラムのラベルの量をその前後のコラムにおけるものと比較することによって、このことを成し遂げる。したがって、すべてのコラムに出ている任意の原子量は、独特の配列に対応するものと考えられる。もし二つの配列が、配列の特定の一点において同じｎ量体をもつとすれば、これらはこのシステムの量的な性質により解明することができ、ある特定の結合におけるある特定のｎ量体の量が、同一の点において当該二つの配列が当該ｎ量体を共有する二つの配列の量の合計となるようにする。これらは、あるサイクルをその前後の結合サイクルと比較してかかる合計を同定することにより、広く解明することができる。このことは、もし分析されている配列がＰＣＲによって、最少量の配列が、最大頻度をもつ配列の半分以上の量で存在するように増幅されていれば、すなわちもし配列の頻度がある量Ｎと２Ｎとの間の範囲にあれば、特に簡単に行なわれる。このことは、いかなる頻度の合計も２Ｎより大きくなるように、またそれゆえ容易に検出できるようにすることを意味している。時に部分的な配列の解明のみを与える不明瞭性があるかもしれない。さらなる解明は、各サンプルについて同じ配列決定工程を２回繰り返して行なうことによって得ることができる。各々の場合に、プローブの長さは異なり、最初の配列決定の試みに対しては４塩基対のプローブを用い、且つ二回目については５塩基対のプローブを用いてもよい。二つのマトリックスの比較により、不明瞭性がはるかに少ない配列決定の解明が可能になるであろう。発明の実施：この方法の実施についての実際の詳細を以下に記述する。アダプター、ＰＣＲプライマー、およびオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチド、アダプター、プライマー、その他の構成：オリゴヌクレオチドの構成についての詳細および総説は、今日までの多くのテキストにおいて入手することができ、それにより当業者は、本発明に必要なプライマー、アダプター、および他のいかなるオリゴヌクレオチドも構築することがでるであろう：・Gait,M．J．編、‘Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach’、IR L Press、オックスフォード、1990 ・Eckstein編、‘Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach’、 IRL Press、オックスフォード、1991 ・Kricka編、‘Nonisotropic DNA Probe Techniques’、Academic Press、サンディエゴ、1992 ・Haugland、‘Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals’，M olecular Probes，Inc.、ユージーン（Eugene）、1992 ・KellerおよびManack、‘DNA Probes、第２版’、Stockton Press、ニューヨーク、1993 ・Kessler編、‘Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules’、 Springer-Verlag）ベルリン、1992。最も重要なことは、プローブであるオリゴヌクレオチドの3'-ＯＨをキャップするために用いる化学的性質である。酸不安定性且つ塩基不安定性の基は周知であり、上記のテキストに述べられている。リン酸基を用いたキャッピングも上記のテキストを用いれば可能であり、かかる基は次いで、容易に入手できるアルカリホスファターゼのようなホスファターゼを用いて制御可能に除去することができる。オリゴヌクレオチド構成体を使用するための条件：核酸プローブについてのハイブリダイゼーション条件の影響についての詳細は、以下の参考文献に見ることができる：・Wetmur，Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,26,227- 259，1991 ・Sambrook等、‘Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第２版’、Cold Sp ring Harbour Laboratory、ニューヨーク、1989 ・Hames，B．D.，Higgins，S．J．‘Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach’，IRL Press、オックスフォード、1988 結合: オリゴヌクレオチドの結合は、本発明の考慮されるべき重大な面である。結合の化学的方法は既知である：・Ferris等、Nucleosides and Nucleotides 8，407-414，1989 ・Shabarova等、Nucleic Acids Research 19，4247-4251，1991 好ましくは酵素的結合が、これが非常に高い適合度を有するという理由から用いられてもよい。好ましいリガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、E．coliＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびＴｔｈリガーゼであってもよい。参考文献を以下に記す：・Lehman，Science 186，790-797，1974 ・Engler等、‘DNA Ligases’，3-30頁、Boyer編、‘The Enzymes，第15B巻’、 Academic Press、ニューヨーク、1982 リガーゼの使用に関するプロトコールは、以下のものに見られる：・Sambrook等、上記で引用・Barany，PCR Methods and Applications，1:5-16，1991 ・Marsh等、Strategies 5，73-76，1992 核酸のリン酸化：リガーゼと制限エンドヌクレアーゼとを用いる場合、核酸の骨格である糖分子の5'ホスフェートに変化を生じる。結合されたオリゴヌクレオチドによるプライマーの延長が、配列決定工程の各サイクルにおいてただ一つだけのオリゴヌクレオチドが各々の延長しているプライマーに結合すべく厳密に制御されていることは、本発明にとって重要である。この工程の変形において、オリゴヌクレオチド、アダプター、またはターゲット核酸のリン酸化の状態を、それらの合成の際または合成後で変更することも可能である。ホスファターゼ、キナーゼ、および化学的方法の使用に関する参考文献が含まれる：・HornおよびUrdea，Tetrahedron Lett．27，4705，1986 ・Sambrook等、上記で引用オリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル基は、塩化ホスホリル(POCl₃)によって化学的にリン酸化することができる。制限エンドヌクレアーゼ：数多くのII型およびIIs型の制限エンドヌクレアーゼが存在しており、本発明に用いることができる。以下の表１は、その例の一覧であるが決して包括的なものではない。制限エンドヌクレアーゼの著作物での総説は、Roberts，R.，J.Nuc l．Acids Res．18，2351-2365，1988に見ることができる。新しい酵素がある増加率で発見されており、最新の一覧表はネットスケープ（Netscape）またはモザイク（Mosaic）というようなソフトウェアパッケージを用いてインターネット上で容易にアクセスされるREBaseのような専門のデータベースに記録され、ワールド・ワイド・ウェブ（World Wide Web）アドレス： http://www.neb.com/rebase/で見ることができる。REBaseはすべての制限酵素を、それらが発見されると表に載せ、定期的にアップデートしており、またさらに、認識部位、各酵素のアイソシゾマー、製造業者ならびに供給者、および科学文献におけるそれらの参考文献を一覧表にしている。プロトコールは用いられる制限エンドヌクレアーゼIIs型にかかわりなく全く同一でよいが、任意の酵素の認識部位のアダプター内での空間の取り方は、必要によりまた酵素の切断反応により適合させてもよい。（上記の図ｎ参照）酵素名認識配列切断部位 Fokl GGATG 9/13 BstFsl GGATG 2/0 SfaNI GCATC 5/9 HgaI GACGC 5/10 BbvI GCAGC 8/12 表１：制限エンドヌクレアーゼIIs型のサンプルこの工程の必要性は、分析される核酸の末端に不明の粘着性末端を生じることである。このことはまた、5'から3'エキソヌクレアーゼの制御された使用によっても行なうことができる。明らかに、かかる粘着性末端を作り出すどのような方法も、この工程を満足させるであろう。同様に、本発明に必要な通常の制限エンドヌクレアーゼII型は、前文に一覧した参考文献の情報源に見出すことができる。メチル化感受性および酵素作用を調節する他の手段についての詳細は、ＲＥＢａｓｅに提供された参考文献に見出すことができるか、又は製造業者から得ることができる。固相支持体：固相支持体についての十分な議論は、BrennerのPCT/US95/12678号、12〜14頁に見ることができる。これは、多数の配列を決定するための蛍光定量法の使用において重要な問題点であり、支持体の設計は、この方法を有効にするため最大限にしなければならない蛍光シグナルの獲得に影響するだろう。オリゴヌクレオチド上のラベルの質量分析：エレクトロスプレー質量分析は、オリゴヌクレオチドに結合したラベルの同定のための好ましい技術であるが、その理由は、それが非常に穏やかな技術であり、且つ本発明に用いられる液相分子生物学に直接結び付けることができるからである。質量分析技術についての十分な議論き関しては、以下を参照のこと：・ R．A．W．JohnstoneおよびM．E．Rose，“Mass Spectrometry for chemists an d biochemists”第２版、Cambridge University Press，1996 質量ラベル：実用的または商業的に有用などのシステムにとっても、できるだけ少ない試薬と可能な限りのプロセッシング工程を用いて、ラベルの構成をできるだけ簡単にすることが重要である。一連の単量体分子の単位を互いの複数の組み合わせで使用することができる、組合せアプローチもある。アミノ酸：この技術に周知の標準的なペプチド合成技術を用いて、グリシン、アラニンおよびロイシンのような少数のアミノ酸で質量の異なる小さいペプチドを多数作ることができる。より多くのアミノ酸を用いることにより、さらに多くのラベルを合成することができる。・E．AthertonおよびR．C．Sheppard編、‘Solid Phase Peptide Synthesis： A Practical Approach’，IRL Press、オックスフォード炭水化物：同様に炭水化物分子は、質量を異にするヘテロポリマーに合成され得る有用な単量体単位であるが、これらはＥＳＭＳに特に従わない。・Gait,M．T．編、‘Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach’，IR L Press、オックスフォード、1990 ・Eckstein編、‘Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach’， IRL Press、オックスフォード、1991 他のラベル化学：明らかにほとんどどの分子も、ラベルとして他のものの上に付けることが可能である。質量分析計においては、かかるラベルの特性は明らかに異なるだろう。生体分子の分析という見地から、先に議論したように、ラベルは不活性、その他であることが重要であろう。コレステロール類およびグリセロール類が使用できる可能性があるが、これらは本質的に比較的大きい分子及び範囲である。有利な質量分析目的をもつ分子の設計：標準的な有機化学の技術を用いてラベルを合成することができる。かかるラベルは、もし陽イオンを得ようとするのであれば、アミン誘導体、４級アンモニウムイオン又は陽性の硫黄中心を保持するはずである。これらは、きれいで明確なシグナルを発生する極めて良好な検出特性を有している。同様に、負に帯電したイオンを用いることができ、しががってカルボキシレート部をもつ分子を用いることができる。ＭＡＬＤＩ質量分析用のラベルは、いくつかの誘導体がすでに市販されているシナピン酸（sinapinnic acid）またはケイ皮酸のような、ＵＶレーザー光線により励起され得る既知の分子を変性することにより生成することができる。有機化学のテキストについては以下を参照のこと：・Vogelの“Textbook of Organic Chemistry”第４版、B.S．Furniss，A．J．Ha nnaford，V．Rogers，P.W.G．SmithおよびA.R．Tatchellにより改訂、Longman、 1978。リンカー：本発明の重要な特徴は、ラベルをそれに関連する生体分子に結合することであり、かつ5'から3'へ配列決定する態様においては、除去可能なブロッキング基の必要性もまた重要である。これらの問題点の詳細については以下を参照のこと：・ Theodora W．Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，1981，W iley-Interscience 蛍光定量法：この方法のある態様は、蛍光性ラベルをつけたオリゴヌクレオチドを使用することができる。蛍光性シグナルの検出は、容易に入手できる光学装置を用いて行うことができる。蛍光性ラベルは通常、励起に最適な周波数をもっており、励起状態から基底状態に戻るとき、特異的な波長の蛍光を発する。励起は特異的な周波数のレーザーを用いて行なうことができ、蛍光は、コレクションレンズ、ビームスプリッター、およびシグナル分配光学を用いて検出する。これらは、蛍光性シグナルを光電子増倍管システムに向かわせて、このシステムにより光学シグナルを電子シグナルに変換し、この電子シグナルを適切なエレクトロニクスシステムを用いて解釈することができる。 BrannerのPCT/US95/12678号第26〜28頁は、十分な議論を与える。液体操作ロボット：この方法が実際に有用であるためには、オートメーションが必須であり、Appl ied Biosystemsのような種々の源から液体操作ロボットを入手することができる。実施例−４量体の連結による配列決定配列決定プライマーを延長させて、４量体の段階的な連結により１本鎖DNA鋳型にハイブリダイズする実験を行った。一般に、４量体は、４量体の配列、従って鋳型が由来し得るラベルを含む。可能な全ての変形を包含するために256個の４量体が必要とされる。各４量体は、各サイクルで、確実に１つのみの４量体が配列決定プライマーに連結されるために、ブロッキング基、好ましくは、同定化ラベルを3'ヒドロキシル基に含まなければならない。首尾良い連結後、ブロッキング基（異なる場合はラベル）を化学的手段または他の手段によって除去して、４量体の3'ヒドロキシルを曝露する。次いで、ラベル、従って配列が同定される。次いで、４量体は、第２のサイクルにおける次の４量体の連結に利用可能となる。連結された４量体からの3'ブロッキング基の除去の有効性を実証するために、ブロックされていない４量体を別の反応における配列決定プライマーに連結し、次いでこれを次のサイクルの鋳型として使用した。実験を、以下の模式的な形態で記載する：配列決定鋳型−ビオチン分子（Ｂ）を介して、ストレプトアビジンでコートされたプレートに捕獲されるサイクル１ 5'PO4-TGTC-3'TAMのみが連結して、鋳型の最初の４塩基（'3ACAG'5）を同定するシグナルを生じる。上記の種の脱保護を模擬するために、以下の反応を行った：次いで、上記の種を、サイクル２の鋳型として使用した。サイクル２ 5'PO4-TACT-3'FAMのみが連結して、鋳型の次の４塩基（'3ATGA'5）を同定するシグナルを生じる。また、上記の種の脱保護を模擬するために、以下の反応を行った：次いで、上記の種を、サイクル３の鋳型として使用した。サイクル３ 5'PO4-TACA-3'FAMのみが連結して、鋳型の次の４塩基（'3ATGT'5）を同定するシグナルを生じる。それゆえ、４量体の連結の３サイクルを介して、鋳型の配列ACAGATGAATGTが推定される。材料：オリゴヌクレオチド：配列決定プライマー使用した４量体 5'PO4-TGTC-3'FAM、5'PO4-TACT-3'FAM、5'PO4-TAGA-FAM、5'PO4-TACA-FAM、5' PO4-TGTC-3'OH、5'PO4-TACT-3'OH 全てのオリゴを、Oswel DNA（UK）によって合成した。溶液: 洗浄溶液 50mM Tris-HCl pH7.6 10mM MgCl₂ 結合溶液 50mM Tris-HCl pH7.6 10mM MgCl₂ 1M NaCl リガーゼ緩衝液 50mM Tris-HCl pH7.6 10mM MgCl₂ 10mM DTT １mM ATP 50μg/ml BSA 方法：鋳型への配列決定プライマーのハイブリダイゼーションそれぞれ５pmol/μ1の配列決定プライマーおよび鋳型を含有する、0.5倍の結合溶液の500μｌを含む、アリコートを、95℃で５分間加熱し、次いで２時間にわたって、室温に冷却させた。次いで、これらを４℃で１時間インキュベートし、使用するまで-20℃にて凍結した。これを、さしあたり「配列決定鋳型」と呼ぶ。配列決定鋳型の捕獲結合溶液20pmol（４μl）＋21μlを、黒の（black）ストレプトアビジンでコートした96ウェルマイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim）の各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、洗浄溶液200μｌで、２回、およびリガーゼ緩衝液50μｌで１回、ウエルを洗浄した。次いで、プレートを使用するまで4℃で保存した。サイクル１反応体の３つの群、特異的な４量体（TGTC）を有する１つの群、および非特異的な４量体（TACTおよびTAAA）を有する２つの群を、以下のように調製した。以下の４量体、即ち5'PO4-TGTC3'-FAM、5'PO4-TACT3'-FAMおよび5'PO4-TAAA3' -FAMについて、４つの反応体を調製した。これはリガーゼ緩衝液25μｌ中に、５％PEG、リガーゼ（New England Biolabs）400単位、および４量体を100pmol含有した。また、同じ４量体について、４つの反応体を、同じ方法で調製したが、４量体の非特異的結合についてのコントロールにはリガーゼを含めなかった。脱保護された、配列決定鋳型に首尾良く連結された４量体を模擬するために、リガーゼ緩衝液25μｌ中に５％PEG、リガーゼ（New England Biolabs）400単位、および5'PO4-TGTC3'OHを100pmol含有する48個の反応体を調製した。次いで、上記の反応体を、配列決定鋳型を含有するマイクロタイタープレートのウエルに添加し、４℃で30分間、次いで16℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄溶液100μｌで３回洗浄した。洗浄溶液100μｌを、各ウェルに添加した。配列決定鋳型に連結された４量体の量を、Xperiment1.1.０ソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いたBiolumin 960蛍光マイクロタイタープレート読取り器（Molecular Dynamics）を使用して、存在する任意のFAM分子の蛍光を測定することによって、評価した。サイクル１についてのデータサイクル１についての以下のデータを、リガーゼを含んだ反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACT-FAM TGTC-FAM 10764 10878 120119 9815 9994 97638 11635 12543 98891 12031 11188 95931 平均 11069 11151 103145 サイクル１からの以下のデータを、リガーゼを含まない反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACT-FAM TGTC-FAM 14605 13987 15134 13638 13692 15370 13938 14823 16019 13826 13117 17849 平均 14002 13905 16093 これらのデータは、TGTC-FAMが配列決定鋳型に特異的に連結されていることを明らかに示す。他の４量体は、リガーゼの存在下で、非特異的なハイブリダイゼーションコントロール反応から得られたシグナルに類似のシグナルを生じた。それゆえ、この特異的なシグナルは、配列決定鋳型の最初の４塩基（3'ACAG5' ）を提供する。サイクル２以下の反応体を、脱保護／同定されている４量体を模倣するために、（サイクル１において記載されるように）特異的な5'PO4-TGTC-3'OH４量体が連結されている配列決定鋳型に適用した。反応体の３つの群、特異的な４量体（TACT）を有する１つの群、および非特異的な４量体（TGTCおよびTAAA）を有する２つの群を、以下のように調製した。以下の４量体、即ち5'PO4-TGTC3'-FAM、5'PO4-TACT3'-FAMおよび5'PO4-TAAA3' -FAMについて、４つの反応体を調製した。これはリガーゼ緩衝液25μｌ中に、５％PEG、リガーゼ（New England Biolabs）400単位、および４量体を100pmol含有した。また、同じ４量体について、４つの反応体を、同じ方法で調製したが、４量体の非特異的結合についてのコントロールにはリガーゼを含めなかった。脱保護された、配列決定鋳型に首尾良く連結された４量体を模擬するために、リガーゼ緩衝液25μｌ中に５％PEG、リガーゼ（New England Biolabs）400単位、および5'PO4-TACT3'OHを100pmol含有する24個の反応体を調製した。次いで、サイクル１に記載されるように、上記の反応体を、配列決定鋳型を含有しかつこれに5'PO4-TGTC-3'OHを連結したマイクロタイタープレートのウエルに添加し、４℃で30分間、次いで16℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄溶液100μｌで、３回洗浄した。洗浄溶液100μｌを各ウェルに添加した。配列決定鋳型に連結された４量体の量を、Xperiment 1.1.0ソフトウェア（M olecular Dynamics）を用いたBiolumin 960蛍光マイクロタイタープレート読取り器（Molecular Dynamics）を使用して、存在する任意のFAM分子の蛍光を測定することによって、評価した。サイクル２についてのデータサイクル２についての以下のデータを、リガーゼを含んだ反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACT-FAM TGTC-FAM 9238 24071 9693 8207 24455 9415 10312 23194 11071 9153 21641 10815 平均 9227 23340 10248 サイクル２からの以下のデータを、リガーゼを含まない反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACT-FAM TGTC-FAM 12532 16025 13917 11947 15651 13573 12040 17587 13049 11908 16464 12998 平均 12107 16432 13384 サイクル１と同様に、サイクル２は、非特異的な４量体の連結とリガーゼを欠損した非特異的なハイブリダイゼーションコントロール反応体とを比較して、特異的な４量体の連結から明らかなシグナルが生じる。それゆえ、サイクル２は、配列決定鋳型の次の４塩基（3'ATGA5'）を生成した。サイクル３以下の反応を、脱保護／同定されている４量体を模倣するために、（サイクル２において記載されるように）特異的な5'PO4-TACT-3'OH４量体が連結されている配列決定鋳型に適用した。反応体の３つの群、特異的な４量体（TACA）を有する１つの群、および非特異的な４量体（TGTCおよびTAAA）を有する２つの群を、以下のように調製した。以下の４量体、即ち5'PO4-TGTC3'-FAM、5'PO4-TACT3'-FAMおよび5'PO4-TAAA3' -FAMについて、４つの反応体を調製した。これはリガーゼ緩衝液25μｌ中に、５％PEG、リガーゼ（New England Biolabs）400単位、および４量体を100pmol含有した。また、同じ４量体についての４つの反応体を、同じ方法で調製したが、４量体の非特異的結合についてのコントロールにはリガーゼを含めなかった。次いで、サイクル２に記載されるように、上記の反応体を、配列決定鋳型を含有しかつこれに5'PO4-TACT3'OHを連結したマイクロタイタープレートのウエルに添加し、４℃で30分間、次いで16℃で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを、洗浄溶液100μｌで３回洗浄した。洗浄溶液100μｌを各ウェルに添加した。配列決定鋳型に連結された４量体の量を、Xperiment 1.1.0ソフトウェア（Mol ecular Dynamics）を用いたBiolumin 960蛍光マイクロタイタープレート読取り器（Molecular Dynamics）を使用して、存在する任意のFAM分子の蛍光を測定することによって、評価した。サイクル３についてのデータサイクル３についての以下のデータを、リガーゼを含んだ反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACA-FAM TGTC-FAM 8294 61002 10307 8136 52253 9659 10323 53848 11894 9424 51570 12443 平均 9044 54668 11076 サイクル２からの以下のデータをリガーゼを含まない反応体から得られた相対的な蛍光単位（RFU）として表す。 TAAA-FAM TACA-FAM TGTC-FAM 11605 16641 14000 11417 15414 14704 11995 17719 14443 11959 16021 14381 平均 11744 16449 14382 サイクル１および２と同様に、サイクル３は、非特異的な４量体の連結とリガーゼを欠損した非特異的なハイブリダイゼーションコントロール反応とを比較して、特異的な４量体の連結から明らかなシグナルが生じる。それゆえ、サイクル３は、配列決定鋳型の次の４塩基（3'ATGT5'）を生成した。合計12塩基（3'ACAGATGAATGT5'）は、ゲル電気泳動の使用を必要としない蛍光システムを用いて、３回の連結によって首尾良く配列決定された。特異的な４量体（例えば、サイクル３におけるTACA）は一般に、非特異的な４量体と比較して、リガーゼを含まない非特異的なハイブリダイゼーション反応体において、わずかに高い読み取りを生じた。これは、これらが配列決定鋳型に対するこれらの特異的なターゲットにハイブリダイズし、かつ洗浄工程において十分に除去されないという事実に起因する。これらのわずかに高いシグナルは、イオン強度を減少するかまたは洗浄溶液の温度を上昇することによって、洗浄工程のストリンジェンシーを増大させることによって、非特異的な４量体のレベルに減少させることができた。リガーゼを有する反応体であって一致しない４量体の反応体について得られたシグナルは、非特異的なハイブリダイゼーションコントロール反応から得られたシグナルよりも低い。これは、おそらく洗浄工程で除去されないリガーゼ溶液中の物質の存在によるものであり、いくつかの蛍光を消失させる。この差異は、洗浄工程を改善することによって、またはこれらの反応体中に不活性化リガーゼ溶液を含めることによって、全ての反応体において同量の消失を保証することにより除去することができた。この方法を用いて、可能な限り最大限のサイクル数を行うことを確実にするために、各工程についての連結効率を非常に高くすることを確実化することが重要であり、それによって次のサイクルの十分な鋳型が生成される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年２月２３日（１９９９．２．２３）【補正内容】請求の範囲 1. ＤＮＡを配列決定する方法であって、該方法が、 (a) 配列決定すべき複数の一本鎖ＤＮＡを有するターゲットＤＮＡ集合を得る工程であって、各一本鎖ＤＮＡが独特の量で存在しかつ該ＤＮＡに結合する該ＤＮＡの二本鎖部分をもたらすプライマーを有する工程； (b) 該ＤＮＡ集合をハイブリダイゼーション・プローブのアレイに接触させる工程であって、各プローブが所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含み且つ該塩基配列が互いに結合せず、二本鎖部分に近接する一本鎖ＤＮＡに相補的な塩基配列を保持するプローブを各々のＤＮＡの二本鎖部分に結合する条件で、該接触をリガーゼの存在下で行い、それによってさらにプローブと結合することができない延長化二本鎖部分を形成する工程；及び (c) 未結合プローブをすべて除去する工程；を有し、その後に (d) 結合したプローブを開裂させて各ラベルを遊離する工程； (e) 各ラベルの量を記録する工程；および (f) 延長化二本鎖部分を活性化してそれへの結合を可能とする工程；を有し、 (g) 各ラベルの遊離の配列を求めることにより、各一本鎖ＤＮＡの配列を求めるのに十分な回数、工程(b)〜(f)を繰り返す、上記方法。 2. アレイが、可能性のある塩基配列を含む複数のサブアレイを有し、工程(b) にしたがって各サブアレイをＤＮＡ集合に接触させ、工程(c)にしたがって未結合プローブを除去し、かつ工程(d)の前にこれらの工程を繰り返してサブアレイのすべてをＤＮＡ集合に接触させるようにする請求項１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1．ＤＮＡを配列決定する方法であって、該方法が、 (a) 配列決定すべき１又は２以上の一本鎖ＤＮＡを有するターゲットＤＮＡ集合を得る工程であって、各一本鎖ＤＮＡが独特の量で存在しかつ該ＤＮＡに結合する該ＤＮＡの二本鎖部分をもたらすプライマーを有する工程； (b) 該ＤＮＡ集合をハイブリダイゼーション・プローブのアレイに接触させる工程であって、各プローブが所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含み且つ該塩基配列が互いに結合せず、二本鎖部分に近接する一本鎖ＤＮＡに相補的な塩基配列を保持するプローブを各々のＤＮＡの二本鎖部分に結合する条件で、該接触をリガーゼの存在下で行い、それによってさらにプローブと結合することができない延長化二本鎖部分を形成する工程；及び (c) 未結合プローブをすべて除去する工程；を有し、その後に (d) 結合したプローブを開裂させて各ラベルを遊離する工程； (e) 各ラベルの量を記録する工程：および (f) 延長化二本鎖部分を活性化してそれへの結合を可能とする工程；を有し、 (g) 各ラベルの遊離の配列を求めることにより、前記一本鎖ＤＮＡ又は各一本鎖ＤＮＡの配列を求めるのに十分な回数、工程(b)〜(f)を繰り返す、上記方法。 2．アレイが、可能性のある塩基配列を含む複数のサブアレイを有し、工程(b)にしたがって各サブアレイをＤＮＡ集合に接触させ、工程(c)にしたがって未結合プローブを除去し、かつ工程(d)の前にこれらの工程を繰り返してサブアレイのすべてをＤＮＡ集合に接触させるようにする請求項１記載の方法。 3．初期ＤＮＡサンプルを副集合に分類し、ターゲットＤＮＡ集合として副集合のうちの１つを選択することによりターゲットＤＮＡ集合を得る請求項１又は請求項２記載の方法。 4．初期ＤＮＡサンプルを、その各々が既知の長さであり未知の配列である粘着性末端を有するフラグメントに切断し、該フラグメントをその粘着性末端配列にしたがって副集合に分類する請求項３記載の方法。 5．各一本鎖ＤＮＡはその一端が固定されている上記請求項のうちのいずれか１項記載の方法。 6．各プローブのラベルが質量ラベルを有し、且つ各ラベルの質量を、工程(d)のラベルの遊離後、質量分析を用いて工程(e)にしたがって記録する上記請求項のうちのいずれか１項記載の方法。 7．既知の塩基配列はその3'ＯＨがブロックされている上記請求項のうちのいずれか１項記載の方法。 8．結合したプローブを開裂して各々のラベルを遊離する工程(d)が、工程(f)による延長化二本鎖部分の3'-ＯＨをブロックしない請求項７記載の方法。 9．各プローブのラベルが塩基配列の3'-ＯＨと開裂可能に結合する請求項８記載の方法。 10.各プローブの塩基配列が3'及び5'末端の双方でリン酸化されておらず、工程 (f)が延長化二本鎖部分の5'-ＯＨをリン酸化することを有する請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の方法。 11.塩基配列の所定の長さが２〜６である上記請求項のうちのいずれか１項記載の方法。 12.塩基配列の所定の長さが４である請求項11記載の方法。 13.ＤＮＡを配列決定するためのキットであって、該キットはその各々が所定の長さである既知の塩基配列と開裂可能に結合するラベルを有するハイブリダイゼーション・プローブのアレイを有し、該アレイが所定の長さである塩基配列の可能性のあるものをすべて含み、且つ塩基配列が互いに結合することができない、上記キット。 14.既知の塩基配列はその3'-ＯＨがブロックされている請求項13記載のキット。 15.各プローブが塩基配列の3'-ＯＨと開裂可能に結合しており塩基配列との結合を防止する請求項14記載のキット。 16.各プローブの塩基配列が3'及び5'末端の双方でリン酸化されていない請求項 13〜15のいずれか１項記載のキット。 17.各プローブのラベルが質量ラベルを有する請求項13〜16のいずれか１項記載のキット。 18.塩基配列の所定の長さが２〜６である請求項13〜17のいずれか１項記載のキット。 19.塩基配列の所定の長さが４である請求項18記載のキット。 20.ＤＮＡを配列決定する方法のための請求項13〜19のいずれか１項記載のキットの使用。