JP2001507213A

JP2001507213A - 核酸の診断検出

Info

Publication number: JP2001507213A
Application number: JP51690698A
Authority: JP
Inventors: ビー．アーノビッツ，ハワード
Original assignee: ビー．アーノビッツ，ハワード
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2001-06-05
Anticipated expiration: 2017-10-03
Also published as: EP0960210A4; US20010014445A1; AU4667297A; US20030077588A1; JP4044142B2; CA2268069A1; EP0960210A1; US6344317B2; WO1998014617A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的サンプル、たとえば細胞流体における標的ヒト核酸の検出のための敏感な核酸ハイブリダイゼーションアッセイ方法を提供する。前記方法は特に、慢性疾患の初期診断において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の診断検出発明の分野本発明は、疾病状態に関連する核酸の検出に関する。特に、本発明は、慢性疾病及び感染性疾患についての診断アッセイとして無細胞生物学的流体における核酸の検出を提供する。発明の背景慢性疾患、たとえば自己免疫疾患、慢性疲労症候群、及び同様のものは、世界じゅうの数百万の人々を苦しめている。環境及び他の要因（たとえば遺伝子毒性 (gonotoxic)化合物、感染性レトロウィルス、後退要素（retroelement）及び同様のものが、DNAを直接的に破壊し、そして／又は損傷を与え、そして多くの慢性疾患の進行において役割を演じることができることは知られている。遺伝子物質に対する損傷がそれらの疾疾の開始を誘導する機構は十分には理解されていない。ゲノムにおける一定の部位（たとえば弱い部位）はそのような修飾に対して特に敏感であることが知られている。たとえば、レトロウィルス及び後退要素のための挿入部位の分布はランダムではなく、そして弱い部位がしばしば好ましいことが知られている（たとえば、Craigic Trends in Genetics 8:187(June 1992 );De Ambrosisなど．Cancer Genet．Cytogenet．60:1-7(1992);Durnamなど．and Romaniなど．Gene 135:133-160(1993)を参照のこと）。弱い部位自体は結合した疾病である。たとえば、反復したCCGトリプレットのブロックの長さの延長及びＸ染色体上の特定の弱い部位におけるCpG島のメチル化は、弱いＸ症候群及び遺伝された精神遅滞に関連付けられている（たとえば、Sutherland and Richards，Proc．Nat．Acad．Sci．U SA 92:3636-3641（1995）を参照のこと）。病原体、たとえば細菌、寄生体及びウィルスからの核酸の検出は、疾病の診断のための通常使用される方法である。たとえば、ウィルス配列の検出は、疾病の診断において有用である。腸内ウィルスは、広範囲の疾病を担当するヒト病原体及び日和見病原体の他のグループであり、そしてピコルナウィルス科内の大きな属を構成する。前記属は、ポリオウィルス、コクサッキーウィルス、エコーウィルス、及びヒト及び他の霊長類から単離された多くの特徴づけられていない腸内ウィルスを包含する。ピコルナウィルスの分類の概観のためには、Virus Taxono my:Classification and Nomenclature of Viruses Murphyなど.，eds(Springer Verlag，1995）を参照のこと。ピコルナウィルスの他のメンバーのように、腸内ウィルスは、小さな、一本鎖の非エンベロープRNAウィルスである。腸内ウィルスは、酸におけるそれらの安定性及び通過及び伝達のそれらの便−経口路によってピコルナウィルスの他のメンバーから区別される。ポリオウィルス（少なくとも３種血清型として存在する）は、発展途上の国々の子供に麻痺性疾患を引き起こす、世界中の腸内ウィルスの最とも臨床学的に有意なものである。非−ポリオエンテロウィルス（NPEV）はまた、毎年、多数の症候性感染を担当している。それらは、髄膜炎及び非特異的な発熱性疾病を包含する多くの疾病の最とも共通する病因物質である。最近の報告は、慢性疲労症候群とNPEVを関連づけている（Clementsなど.，J．Med．Virol．45:156-161（1995）。先進国においては、ポリオウィルスは、1950年代の後期にワクチンの導入により抑制されて来た。ワクチンは典型的には、非経口投与される不活性化されたポリオウィルス又は経口投与される弱毒化された生存ポリオウィルスのいづれかを含む。不活性化されたワクチンは、不活性化された又はホルムアルデヒドにより殺された、組織培養物由来のポリオウィルスを使用する。弱毒化されたウィルスワクチンは、それが疾病を引き起こすその能力を失なうまで、細胞培養物におけるウィルスの継代により調製される。弱毒化された生存ウィルスは、保護抗体応答を誘発するために腸において複製する。それらのワクチンのために使用されるウィルスは、アフリカミドリザルの腎細胞において典型的には培養される。上記のように、多くの十分に特徴づけられていない腸内ウィルスが、霊長類、たとえばサルから単離されている。現在、ポリオウィルスの培養に使用する前、他のウィルス（たとえばSV40）により感染されたサルの細胞を同定するための方法が適所に存在する。それらの分子変化がいかにして疾病を誘導するかの理解は、当業界において十分には理解されていない。それらの疾病の病因論において初期に存在する細胞機構、特に核酸の変化の高い理解は、有用な治療及び診断手段の開発に対して重要である。さらに、ポリオワクチン調製物におけるウィルス、たとえばエンテロウィルスの同定は、ポリオワクチンの安全性を確かめるために重要である。さらに、サルの細胞又はヒト腸からの他のウィルスとポリオウィルスとの組換えに起因する新規ウィルスが存在する可能性は、明白な公衆衛生上の関心事である。本発明は、それらの及び他の関心事に取り組む。発明の要約本発明は、患者における疾病状態をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、患者からの生物学的材料（たとえば生検）又は生物学的流体（たとえば無細胞生物学的流体、たとえば血清又は血漿）を含むサンプルを供給し、そしてこのサンプルと、標的核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする核酸とを接触せしめることを含んで成る。次に、その標的核酸が検出される。いくつかの態様において、標的核酸は、ヒトゲノム、特に反復DNAにおける弱い部位からの配列を包含する。いくつかの態様において、標的配列は、弱い部位（fragil e site）におけるAlu配列に由来する。他の態様において、標的核酸は、微生物起源及び多くの場合、ヒト起源の新規複合材料であり得る。標的核酸は、通常少なくとも約100個の長さのヌクレオチド、時々、約500個〜約1500個の長さのヌクレオチドである。前記方法は通常、慢性疾患を検出するために使用される。慢性疾患の例は、癌、たとえば多発性骨髄腫を包含する。他の疾病は、自己免疫疾患、神経変性疾患、心臓疾患及び同様のものを包含する。特定の好ましい態様において、標的ヒト核酸は、増幅される（たとえばPCRにより）。代表的な標的配列は、配列番号23において提供される。この配列は、多発性骨髄腫の診断に使用され得る。本発明はさらに、生物学的サンプル及びポリオワクチン調製物におけるウィルス核酸を検出するための改良された方法を提供する。１つの態様においては、本発明は、ポリオウィルス及び非ポリオウィルス、通常非ポリオエンテロウィルスからの核酸配列を含んで成る、組換えウィルス核酸を検出するための方法を提供する。前記方法は、組換えウィルス核酸を含むと思われる生物学的サンプルと、ピコルナウィルスゲノムにおける保存された配列に対して特異的にハイブリダイズする第１プライマー及びポリオウィルス核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする第２プライマーとを接触せしめることを含んで成る。次に、組換えウィルス核酸である増幅された生成物の存在が検出される。多くのプライマーが本発明において使用され得る。たとえば、プライマーの１つ又は両者は、ピコルナウィルスゲノムの５’非翻訳領域に対して特異的にハイブリダイズするプライマーであり得る。前記５’非翻訳領域はピコルナウィルス間に保存されているので、プライマーは、ほとんどのピコルナウィルス、特に腸内ウィルスに対して特異的にハイブリダイズするであろう。プライマーPG01及び PG02（配列番号１又は２に示される）が、この目的のために便利に使用される。プライマーの１つ又は両者は、ポリオウィルスゲノムのＰ２−Ｐ３領域に対して特異的にハイブリダイズすることができる。好ましいプライマーは、ヌクレオチド4922−4941又はヌクレオチド5467−5487に対して特異的にハイブリダイズするプライマーである。プライマーPG03及びPG04（配列番号３又は４に示される）が、この目的のために便利に使用される。プライマーの１つ又は両者はまた、ポリオウィルスゲノムのＰ２領域に対しても特異的にハイブリダイズすることができる。好ましいプライマーは、ヌクレオチド4460−4478又はヌクレオチド4634−46 53に対して特異的にハイブリダイズするプライマーである。プライマーPG07及び PG08（配列番号５又は６に示される）が、この目的のために便利に使用される。プライマーの好ましい組合せは、PG02及びPG03である。前記方法は、核酸の臨床的分析のために通常使用される多くの生物学的サンプルを用いて実施され得る。便利なサンプルは、ヒト血清、血漿又は白血球細胞である。多くの方法が組換えウィルス核酸の存在を検出するために使用され得る。いくつかの態様においては、検出は、ポリオウィルス核酸のみを含むことが知られている対照サンプルに存在しない増幅されたフラグメントを同定するためにゲル電気泳動を用いて実施される。第１プライマーがポリオウィルスゲノムのヌクレオチド443−460（たとえばPG02）に対して選択的にハイブリダイズし、そして第２プライマーがポリオウィルスゲノムのヌクレオチド4922−4941（たとえばPG03）に対して選択的にハイブリダイズする場合、約400個の長さのヌクレオチドの増幅されたフラグメントが、組換えウィルス核酸の存在を検出するために使用され得る。本発明はまた、ポリオワクチンサンプル中の非ポリオウィルス核酸を検出するための方法も提供する。この方法は、前記ワクチンサンプルと、ポリオウィルス核酸配列に対して特異的ハイブリダイズする少なくとも２種のプライマーとを接触せしめることを含んで成る。それらの方法においては、１つのプライマーは、腸内ウィルスゲノムにおける保存された配列、たとえば５’非翻訳領域に対して特異的にハイブリダイズするプライマーであり得る。典型的なプライマーは、ヌクレオチド163−178又はヌクレオチド443−450に対して特異的にハイブリダイズするプライマーを包含する。そのようなプライマーは、PG01及びPG02（配列番号１及び２に示される）を包含する。プライマーはまた、ポリオウィルスゲノムに対して特異的な配列、たとえばポリオウィルスゲノムのＰ２−Ｐ３領域、たとえばヌクレオチド4922−4941又はヌクレオチド5467−5487に対して特異的にハイブリダイズするプライマーでもあり得る。そのようなプライマーは、PG03及びPG04（配列番号３及び４に示される）を包含する。プライマーはまた、ポリオウィルスゲノムに対して特異的な配列、たとえばポリオウィルスゲノムのＰ２領域、たとえばヌクレオチド4460−4478 又はヌクレオチド4634−4653に対して特異的にハイブリダイズするプライマーでもあり得る。そのようなプライマーは、PG07及びPG08（配列番号５及び６に示される）を包含する。そのような方法においては、非ポリオウィルス核酸は、ポリオウィルス核酸のみを含むことが知られている対照ワクチンサンプルに存在しない増幅されたフラグメントを同定するためにゲル電気泳動を用いて検出され得る。本発明はさらに、本明細書において同定された新規組換えウィルスからの核酸分子を提供する。請求される分子は、下記に定義されるように、緊縮条件下でその例示された配列に対してハイブリダイズするそれらの能力により同定され得る。核酸は、完全なウィルスゲノム、又はそのフラグメントであり得る。核酸は、生物学的サンプルから単離され得、そしてヒト染色体DNAに組込まれ得ない。定義 “無細胞生物学的流体”とは、細胞を実質的に欠いている生物学的な流体である。典型的には、そのような流体は、細胞（たとえば全血液）を通常含む生物学的流体からの細胞の除去により調製される流体である。典型的な処理された無細胞生物学的流体は、処理された血液（血清及び血漿）、尿、唾液、汗、涙、粘液質、脳骨髄液、精液、便及び同様のものを包含する。 “保管された（archived）核酸配列”は、他の生物、特に病原体、たとえば細菌（クラミジア（Chlamydia）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ネイセリア（N eisseria）、トレポネマ（Treponema）、スタフィロコッカス（Staphylococcus ）、ストレプトコッカス（Streptococcus）属及び同様のもののメンバー）、寄生体（たとえば、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）、プネウモシスチス・カリニ（Pneumocyetis carinii）、トリコモナス（Trichomonas）、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)）、ウィルス（たとえばヘルペスウィルス、腸内ウィルス、ポリオーマウィルス、ポックスウィルス、たとえば伝染性軟属腫ウィルス、レトロウィルス、たとえばHIV、及び同様のもの）からのサブ配列を含むヒトゲノムDNAにおけるキメラ配列である。従って、本発明の保管された（arc hived）核酸を検出するよう核酸（たとえばプロープ又はPCRプライマー）を企画する場合、それらの病原体のゲノムに基づく配列が便利には使用される。理論により結びつけられることは所望しないが、保管された核酸配列は通常、弱い部位（fragile ite）で挿入されると思われる。用語“生物学的サンプル”とは、本明細書において使用される場合、生物又は生物の成分（たとえば細胞）から得られるサンプルを意味する。サンプルは、いづれかの生物学的組織又は流体のものであり得る。時おり、サンプルは、患者に由来するサンプルである“臨床的サンプル”であろう。そのようなサンプルは、唾液、血液、血清、血漿、血液細胞（たとえば白血球細胞）、組織又は細かな針状生検サンプル、尿、腹水、及び胸水、又はそれらからの細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の断片、たとえば組織学的目的のために取られる凍結された断片も包含することができる。 “慢性疾患”とは、数カ月〜数年間続く疾病、徴候又は症候群である。慢性疾患の例は、癌（たとえば多発性骨髄腫、白血症、乳癌、卵巣癌、頭及び首癌、脳癌、頸部癌、精巣癌、Hodgkins病及び同様のもの）、前癌性状態（たとえば腺腫性結腸ポリポーシス(APC)）、慢性疲労症候群、自己免疫疾患（たとえば、関節炎、多発性硬化症、狼瘡、硬皮症及び同様のもの）、糖尿症、喘息、心臓疾患、神経筋内疾患（たとえば線維筋肉痛）、神経変性疾患（たとえば、ALS、アルツハイマー病、及びパーキンソン病）、AIDS、ペルシア湾戦争関連疾患及び慢性肝炎を包含する。 “弱い部位（fragile site）”とは、DNA鎖切断の頻度部位であるヒトゲノム内の遺伝子座である。弱い部位は典型的には、不良な染色の結果としてギャップ又は不連続性として細胞遺伝学的に同定される。弱い部分は、一般的な又はまれなものとして分類され、そしてさらに、それらを誘発するために使用される剤に従って分けられる。弱い部位及びそれらの分類の一般的な記載のためには、Suth erland GATA8:1961-166（1991）を参照のこと。本明細書に開示される、例示される配列は、弱い部位でヒトゲノム中に明らかに挿入されているウィルスゲノムからの配列を包含する。従って、弱い部位は、広範囲の病原体、たとえば細菌、寄生体及びウィルスに起因する“保管された核酸配列”を含むことができる。本発明の“標的ヒト核酸”は、ヒトゲノムDNA(たとえば染色体DNA、ミトコンドリアDNA及び他の染色体外DNA）に起因する核酸分子である。本明細書において使用される場合、ヒトゲノムDNAは、生殖系（germline）DNAを意味し、そしてまた、病原性微生物による個人の感染の結果として個人中に導入される核酸（たとえば、感染の後、又は生存ウィルス感染を通してゲノム中に組込まれる外来性ウィルスDNA）を包含することができる。従って、本発明の標的ヒト核酸はヒト起源のものであるが、それにもかかわらず、それらは他の病原性生物、たとえばウィルスにより共有される配列を含むことができる。そのような配列は時々、ヒト／ウィルスキメラ配列又は“保管された配列”として本明細書において言及される。ヒトゲノム“由来の”のDNAは、ゲノムDNAのサブ配列から成るDNA 分子、及びヒトゲノムDNAから転写されたRNA分子を包含する。本発明の方法において検出されるRNA分子は、一本鎖又は二本鎖の遊離分子であり得、又はタンパク質と複合体を形成していてもよい。そのようなRNA分子は、遺伝子から転写される必要はないが、しかし染色体DNAにおけるいづれかの配列から転写され得る。典型的なRNAは、核内低分子RNA(snRNA)，mRNA，tRNA及びr RNAを包含する。用語“特異的にハイブリダイズする”とは、オリゴヌクレオチド（たとえばプライマー又はラベルされたプローブ）と標的配列との間での相補的ハイブリダイゼーションを意味する。この用語は、PCRポリメラーゼのための所望するプライミング又はハイブリダイゼーションシグナルの検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体の緊縮性を減じることによって適合され得るマイナーなミスマッチを特に包含する。 “核酸”とは、一本鎖又は二本鎖形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして特にことわらない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似する態様で機能することができる天然ヌクレオチドの既知類似体を包含する。用語“オリゴヌクレオチド”とは、複数のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、たとえばプライマー、プローブ、検出されるべき核酸フラグメント及び核酸対照から構成される分子を意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多くの要因、及びオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は使用に依存する。用語“プライマー”とは、天然又は合成にかかわらず、核酸鎖に対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件下で、すなわち４種の異なったヌクレオシド三リン酸、及び適切な緩衝液中での及び適切な温度での重合のための剤（すなわちDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で、DNA合成の開始の点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド配列である。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、しかし典型的には、約15〜約30個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に、鋳型と共に十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を表わす必要はないが、しかし鋳型と特異的にハイブリダイズするために十分に相補的であるべきである。 “プローブ”は、標的核酸のサブ配列に対して相補的塩基対合を通して結合するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブが典型的には、ハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠いている標的配列を実質的に結合するであろうことは、当業者より理解されるであろう。プローブは、典型的には、直接的にラベルされ（たとえば同位体又は螢光成分により）、又はジゴキシゲニン又はビオチンにより間接的にラベルされる。プローブの存在又は不在についてアッセイすることによって、標的物の存在又は不在を検出することができる。用語“制御配列(regulatory sequence)”とは、構造配列（たとえば、読み取り枠）の効果的な転写のために必要なシス−作用配列（５’又は３’側）を言及する。それらの配列は、プロモーター、エンハンサー、及び効果的な転写及び翻訳のために重要な他の配列（たとえばポリアデニル化部位、mRNA安定性制御配列及び同様のもの）を包含する。特定のウィルス種又は株（たとえばポリオウィルス）に“対して特異的な配列 ”は、当該種又は株に対してユニークである、すなわち他のすでに特徴づけられている種又は株により共有されない配列である。ウィルスに対して特異的な配列に対して相補的な配列を含むプローブ又はプライマーは、典型的には、緊縮条件（たとえば、２×SSC，0.1％SDSにおいて約60℃、好ましくは65℃、そしてより好ましくは約70℃で固体支持体を洗浄する）下で、他のウィルスのゲノムのその対応する部分に対してハイブリダイズしないであろう。用語“実質的に同一”とは、複数のヌクレオチド配列がそれらの配列の主要部分を共有することを示す。一般的に、これはそれらの配列の少なくとも約90％、そして好ましくはそれらの配列の約95％であろう。配列が実質的に同一であるもう１つの表示は、それらが緊縮条件下で同じヌクレオチド配列に対してハイブリダイズするかどうかである（たとえば、Sambrookなど.，Molecular Cloning-A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York,1985を参照のこと）。緊縮条件は、配列依存性であり、そして異なった環境において異なるであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及び pHで特定の配列に関して熱溶融点（Tm）よりも約５℃低く選択される。Tmは、完全に適合したプローブに対して標的配列の50％がハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的には、緊縮条件は、塩濃度がpH７で約0.2モル濃度であり、そして温度が少なくとも約60℃である条件である。たとえば、本発明の核酸又はそのフラグメントは、緊縮条件下で本明細書に開示される核酸を用いて、標準のフィルターハイブリダイゼーションにより同定され得、ここで前記緊縮条件は、少なくとも約60℃、通常約65℃、時々70℃の温度で20 分間、0.2×SSCにおいての少なくとも１回（通常２回）の洗浄、又は同等の条件を包含する。本明細書において使用される場合、“ウィルス核酸”とは、ウィルスに由来する核酸配列を含んで成る核酸分子である。下記に記載されるように、本明細書に開示されるウィルス核酸は組換え現象に由来すると思われるので、本発明のウィルス核酸は、他の微生物又は細胞配列に由来する配列を含むことができる。 “完全なウィルスゲノム”を含んで成る核酸は、完全な感染性ウィルス粒子を構成するために必要とされるすべてのポリペプチド生成物をコードする核酸分子である。たとえば、腸内ウィルスの場合、完全なウィルスゲノムは、図１に同定されるすべてのタンパク質生成物をコードする核酸である。本明細書において使用される場合、完全な、感染性ウィルス粒子は、十分な長さのゲノム、及び実質的に十分な長さ（たとえば90％、好ましくは95％の完全な）のゲノムである配列によりコードされ得る。図面の簡単な説明図１は、腸内ウィルスのゲノム構造及び遺伝子機構を示す。５’末端でのぬりつぶされた丸は、ゲノム−結合タンパク質VPg(また、３Ｂ遺伝子生成物としても言及される)であり、続いて５’非翻訳領域（５’NTR;実線）がある。空白のボックスは、ポリタンパク質をコードする長いORFを示し、続いて３’非翻訳領域（線）及びポリ（Ａ）トラック（角をなす線）がある。ポリタンパク質の最終的な切断生成物は、ボックスにおいて垂直な線により示される。Ｐ１領域は、それぞれVP4，VP2，VP3及びVP1として通常言及される構造タンパク質IA，IB，IC及び IDをコードする。図２は、活性疾患(700ntバンドを有するか又は有さないかのいづれか)を有する骨髄腫患者の百分率を示す棒グラフである。好ましい態様の記載本発明は、生物学的流体における新規ヒト及び保管された核酸の驚くべき発見に一部基づいている。それらのこれまで検出されていないヒト核酸の検出は、疾病、特に慢性疾患の初期診断及び連続したモニターリングにおいて有用である。さらに、それらの核酸が失なわれる細胞の標的化された破壊は、それらの疾病を治療するために使用され得る。本発明の検出方法はまた、疾病の治療の成功をモニターするためにも使用され得る。本発明のいくつかの態様において、標的配列は、染色体の弱い部位に見出される配列である。理論により結びつけられることは所望しないが、特定の染色体領域（たとえば弱い部位）における核酸は、疾病進行において又は疾病進行の間、疾病又は損傷細胞から初期に、選択的に放されると思われる。前記核酸は、細胞に対して損傷を作り出る剤、特に遺伝子材料（遺伝子毒性剤）との接触を包含する多くの現象の結果として放出され得る。そのような現象は、ウィルスDNA又はレトロ要素の組込み及び／又は発現、及び遺伝子毒性剤、たとえばアフラトキシン、有機リン酸毒物（たとえば農薬、神経ガス剤、窒素マスターバガス）、他の戦争用化学物質、ベンゼン、タバコ発癌性物質、ジゴキシン、ジオキシン、生物トキシン、UV光、放射性粒子、及び他の細胞損傷放射線照射との接触を包含する。反復DNA配列が通常、弱い部位と関連している。従って、本発明のいくつかの態様においては、反復配列が本発明において検出される。代表的な反復配列は、反復DNAのAlu及びKpnファミリーを包含する。反復配列はまた、長い散在（inter spersed）要素（LINE）及び短い散在要素（SINE）に分類され得る（Wilkinsonなど，The Retroviridae Vol．3，J．A．Levy(ed.)，pp.465-535，PlenumPres s，New York(1994)を参照のこと）。Kpn要素は、LINEの例であり、そしてAlu要素はSINEの例である。SINEとは異なってLINEは、逆転写酵素活性を有するタンパク質をコードする読取り枠を含む。LINE及びSINEの両者は、レトロ要素のサブカテゴリーであるレトロポゾン、すなわちRNA中間体を通して転移する、ゲノムにおける転移性要素の例である。レトロポゾンは、長い末端反復体(LTR)の不在によりレトロトランスポゾン（また、ヒト内因性レトロウィルス又はHERVとしても言及される）から区別される。HERVと種々の疾病状態との間の関係、及びHERVと抗原に対する抗体の診断検出は、WO95／32311号に論ぜられている。本発明のいくつかの態様においては、Alu配列又は要素は、本発明の方法において検出される。Alu要素は、ヒトゲノムにおいて10⁵〜10⁶個のコピーで存在する。個々の要素は、約300個の長さの塩基対であり、そして３’末端でポリＡトラックを含む。前記配列は、粗面小胞体上に位置するシグナル認識粒子の成分である７SL構造RNAをコードする遺伝子に由来すると思われる。いくつかの好ましい態様においては、弱い部位からのAlu配列に由来するRNA分子が検出される。下記に提供される例においては、染色体22(22q12−13)の長いアーム上の弱い部位からのAlu配列が検出される。下記に示されるように、それらの配列の検出は、多発性骨髄腫に関連している。トランスロケーション及び他の異常性は、精神分裂病を包含する多くの疾病とこの領域とを関連づけて来た（たとえば、Stermanなど.，Int．J．Cancer 62:398-402（1995）を参照のこと）。上記に示されたように、弱い部位は、反復配列を含むことができる。反復配列は、核タンパク質を結合し、そして遺伝子発現の調節において効果的である配列を含むことが知られている。移動性要素、たとえば反復DNAのセグメント(たとえばレトロウィルス及びAlu配列からのLTR )がゲノムにおける種々の部位に挿入されており、そして遺伝子発現の調節に影響を及ぼしている証拠が示されている（たとえば、Brittenなど.，Proc．Nat．A cad．Sci．USA 93:9374-9377（1996）を参照のこと）。理論により拘束されることを所望しないが、レトロ要素又は遺伝子毒性剤の挿入によるそれらの配列の変更が、ゲノム内の配列の変更された発現を導びくと思われる。本発明の方法において検出される核酸は、典型的には、約100〜数千個の長さのヌクレオチドである。通常、核酸は約200〜約1500個のヌクレオチドである。本発明はまた、非ポリオウィルス核酸(NPVNA)、及びポリオウィルスと他のウィルスとの間の組換え体の検出にも向けられる。いくつかの態様においては、非ポリオウィルスは、ピコルナウィルス科の他のメンバー、たとえば非ポリオエンテロウィルス（HPEV）である。特に、本発明は、NPVNA、及びポリオワクチンに潜在的に由来する組換えウィルスを検出するための敏感な方法(たとえばポリメラーゼ鎖反応PCR)を提供する。腸内ウィルスゲノムの図解が、図１に提供される。腸内ウィルスは、典型的には約７〜約8.5Kbのサイズの、感染性でポジティブ・センスのssRNAの１つの分子を含む。そのゲノムは、種々の長さの５’非翻訳領域(５’NTR)、続いて、構造タンパク質（Ｐ１）及び有力な非構造タンパク質（Ｐ２，Ｐ３）までのポリタンパク質前駆体(240〜250Kd)をコードするORF、続いて短い非コード配列、及び種々の長さのポリ（Ａ）トラックを含んで成る。ビリオンタンパク質は、それぞれ VP4，VP2，VP3，VP1としても言及される、Ｐ１領域の遺伝子生成物（IA，IB，IC ，ID）である、それぞれ４種のカプシドタンパク質の60のコピーを含む。種々の腸内ウィルスの完全なヌクレオチド配列は、科学文献、及びGenBankのようなデータベースから入手できる。この情報を用いれば、当業者は、NPV又はポリオウィルスゲノムの所望する領域を標的化する適切なプライマー及びプローブを企画することができる。たとえば、ポリオウィルス型１，２及び３の配列は、GenBank Accession Numbers POLIOS1（Sabin株１）、PIPOLS2（Sabin株２）、 POL3L12CG（Sabin株３）から入手できる。それらの配列はまた、Toyodaなど.，J ．Mol．Biol．174:561-585（1984）にも開示される。本発明は、ポリオウィルスワクチン調製物における汚染性NPVNAの驚くべき発見に一部基づかれている。それらのこれまで検出されていないウィルス成分の検出は、ポリオに対する完全な効果的ワクチンを維持することにおいて明らかに重要である。さらに、本発明は、ワクチン調製物における弱毒化されたポリオウィルスが新規で且つ可能性ある病原性ウィルスを生成するために、宿主の腸又はワクチンに存在するNPVNAと組換えすることができることを示唆する証拠を提供する。下記に提供される証拠は、湾岸戦争症候群として診断された湾岸戦争退役軍人におけるそのような組換え体の存在を示唆した。そのような組換え体の存在はまた、他の疾病として診断された患者においても検出される。例としては、多発性骨髄腫、前立腺癌、パーキンソン病、多発性硬化症及び同様のものを挙げることができる。本発明に使用されるプライマーの選択は、何の標的配列が検出されるかに基づかれている。汚染性NPEVが検出される場合（たとえば、ポリオウィルスワクチン調製物において）、腸内ウィルスゲノムのいづれかの部位に対して特異的にハイブリダイズするプライマーが使用され得る。典型的には、腸内ウィルスゲノムにおける保存された領域に対して特異的なプライマーが使用される。適切な標的配列の例は、ゲノムの５’非翻訳領域に存在する配列である。この目的のための典型的なプライマーは、ポリオウィルスゲノムのヌクレオチド163−178又は443−4 60に対してハイブリダイズするプライマーを包含する。 NPV−ポリオウィルス組換え体が検出される場合、ポリオウィルス配列に対して特異的なプライマーは、ピコルナウィルスゲノム、たとえば腸内ウィルスゲノムに保存される配列に対してハイブリダイズするプライマーと組み合わせて使用される。ポリオ−特異的プライマーは典型的には、ポリオウィルスゲノムにおけるポリタンパク質前駆体Ｐ１，Ｐ２及びＰ３をコードする遺伝子に対してハイブリダイズするであろう。典型的なプライマーは、ポリオウィルスゲノムのヌクレオチド4460−4478，4634−4653，4922−4941、又は5467−5487に対してハイブリダイズするプライマーである。本発明の診断方法は典型的には、生物学的流体（たとえば血清又は血漿）からの標的核酸を増幅するための方法に依存する。標的核酸のPCR増幅が典型的には、使用される。しかしながら、当業者は、サンプルにおける標的配列の増幅がいづれかの既知の方法、たとえばリガーゼ鎖反応(LCR)、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、転写増幅及び自立配列複製（それらの個々は、十分な増幅を提供する）により達成され得ることを認識するであろう。 PCR方法は、当業界において良く知られていおり、そして従って、本明細書においては詳細には説明されない。PCR方法及びプロトコールの概説のためには、たとえば“Innis，など．eds．PCR Protocols，A Guide to Methods and Applic ation(Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1990)を参照のこと。PCR試薬及びプロトコールはまた、商人、たとえばRoche Molecular Systemsからも入手できる。本発明のいくつかの態様においては、RNA分子が検出され得る（たとえば腸内ウィルス配列の検出）。検出されたRNA分子はまた、ゲノム配列から転写されるR NAでもあり得るが、しかし機能的ポリペプチドをコードしない。増幅における最初の段階は、増幅されるべき領域のＤＮＡコピー（cDNA）の合成である。逆転写は、別の段階として、又は相同逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（RT−PCR）、すなわちRNAを増幅するためのポリメラーゼ鎖反応の変法において実施され得る。リボ核酸のPCR増幅のための適切な方法は、Romero and Rotbart in Diagnostic Mo lecular Biology:Principles and Applications pp.401-406，Persingなど.，ed s.，(Mayo Foundation，Rochester，MN．1993);Rotbartなど．アメリカ特許第5, 075,212号及びEggerなど.，J．Clin．Microbiol．33:1442-1447（1995）に記載されている。本発明の方法に使用されるプライマーは好ましくは、少なくとも約15〜約50個の長さのヌクレオチド、より好ましくは約15〜約30個の長さのヌクレオチドである。 PCRによりサンプルにおける標的核酸配列を増幅するためには、配列は増幅システムの成分に接近しやすくすべきである。一般的に、この接近容易性は、サンプルから核酸を単離することによって確かめられる。生物学的サンプルから核酸、特にリボ核酸を抽出するための種々の技法は、当業界において知られている。上記で示されたように、本発明のサンプルは、無細胞生物学的流体である。 PCRの個々のサイクルの第１段階は、プライマー延長により形成される核酸複合体の分離を包含する。鎖が分離されると、PCRにおける次の段階は、標的配列を端に有するプライマーにより前記分離された鎖をハイブリダイズすることを包含する。次に、プライマーが、標的鎖の相補的コピーを形成するために延長される。好結果をもたらすPCR増幅のためには、プライマーは、個々のプライマーが複合配列にそってハイブリダイズする位置が、１つのプライマーから合成される延長生成物が、鋳型（相補体）から分離される場合、他のプライマーの延長のための鋳型として作用するよう存在するために企画される。変性、ハイブリダイゼーション及び延長のサイクルは、所望する量の増幅された核酸を得るために必要な回数、延復される。 PCR方法の好ましい態様において、鎖分離は、複合体の変性を引き起こすが、しかしポリメラーゼの非可逆的変性を引き起こさない十分な時間、十分に高い温度に反応を加熱することによって達成される（アメリカ特許第4,965,188号を参照のこと）。PCRにおけるプライマーの鋳型−依存性延長は、適切な塩、金属カチオン及びpH緩衝システムから成る反応媒体における適切な量の４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（典型的には、dATP，dGTP，dCTP及びdTTP）の存在下で重合剤により触媒される。適切な重合剤は、鋳型−依存性DNA合成を触媒することが知られている酵素である。本発明においては、プライマー延長のための初期鋳型は典型的にはRNAである。RNA鋳型からcDNAを合成するために適切な逆転写酵素（RT）は良く知られている。 PCRは、熱安定酵素による自動化された方法として通常実施される。この方法においては、反応混合物の温度は、変性領域、プライマーアニーリング領域及び延長反応領域を通して自動的に循環される。この目的のために特別に適合される機械は、Roche Molecular Systemsから市販されている。本発明の標的ヒト核酸はまた、当業者に良く知られている他の標準技法を用いても検出され得る。検出段階は典型的には増幅段階の後に存在するが、増幅は本発明の方法に必要とされない。たとえば、核酸は、サイズ分別（たとえばゲル電気泳動）により同定され得る。サンプルにおける異なった又は追加のバンドの存在は、対照と比較される場合、本発明の標的核酸の存在の表示である。他方では、標的核酸は、良く知られている技法に従って配列決定することによって同定され得る。他方では、標的核酸に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、特定のフラグメントの存在を検出するために使用され得る。下記に詳細に説明されるように、本発明の方法により生成される増幅されたフラグメントのサイズは典型的には、NPV又はポリオウィルス組換体のいづれかとポリオウィルスとを区別するために十分である。従って、本発明のいくつかの態様においては、与えられたサンプルにおいて生成される増幅されたフラグメントのサイズ分別（たとえば、ゲル電気泳動）は、注目の他のウィルスとポリオウィルスとを区別するために使用され得る。これは典型的には、注目のサンプルを増幅するために使用される同じプライマーにより、既知のウィルス（たとえば、単離されたポリオウィルス）を含む対照を増幅することによって実施される。アガロース又はポリアクリルアミドゲルにおいて前記増幅された配列を試験し、そして良く知られている技法（Sambrookなど．を参照のこと）に従って臭化エチジウムによりラベルした後、サンプル及び対照におけるバンドのパターンが比較される。サンプルにおける異なった又は追加のバンドの存在は、対照に比較される場合、NPV又はポリオウィルス組換え体の存在の表示である。配列−特異的プローブハイブリダイゼーションは、細胞、生物学的流体及び同様のもを含んで成るサンプルにおける所望する核酸を検出するための良く知られた方法である。十分な緊縮性のハイブリダイゼーション条件など、プローブは、実質的に相補性の配列に対してのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性は、種々の量の配列ミスマッチに耐えるよう緩和され得る。標的物が最初に増幅される場合、増幅された生成物の検出は、正しい増幅された標的物のみの検出を確かにするためにこの配列−特異的ハイブリダイゼーションを利用し、それにより、関連する生物からの相同配列又は他の汚染性配列の存在により引き起こされる誤った陽性の機会を低める。当業界において良く知られている多くのハイブリダイゼーションフォーマットは、たとえば溶液相、固相、混合された相、又は現場ハイブリダイゼーションアッセイを包含するが、但しそれらだけには限定されない。溶液（又は液体）相ハイブリダイゼーションにおいては、標的核酸及びプローブ又はプライマーの両者は、反応混合物において自由に相互作用する。固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、標的物又はプローブのいづれかが、それらが溶液において相補的核酸とのハイブリダイゼーションのために利用できる固体支持体に結合される。典型的な固相フォーマットは、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット及び同様のものを包含する。現場技法は、染色体材料（たとえば中期又は間期細胞）における標的核酸を検出するために特に有用である。次の文献は、種々のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットの概観を提供する：Singerなど. ，Biotechniques 4:230(1986);Haaseなど.，Methods in Virology，Vol．VII，p p.189-226(1984);Wilkinson，Insitu Hybridization，D．G．Wilkinson ed.，IR L．Press，Ox ford University Press，Oxford;及びNucleic Acid Hybridizatio n:APractical Approach，Hames，B．D．and Higgins，S．J.，eds.，IRLPress（ 1987）．ハイブリダイゼーション複合体は、よく知られている技法に従って検出され、そして本発明の決定的な観点ではない。標的物に対して特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブは、ハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために典型的に使用されるいくつかの方法のうちのいづれか１つの方法によりラベルされ得る。検出の１つの通常の方法は、³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ，¹⁴Ｃ又は³²Ｐ、又は同様のものによりラベルされたプローブを用いてのオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択される同位体の合成の容易性、安定性及び半減期のための研究選択性に依存する。他のラベルは、螢光団、化学発光剤及び酵素によりラベルされる抗リガンド又は抗体に結合する化合物（たとえばビオチン及びジゴキシゲニン）を包含する。他方では、プローブは、ラベル、たとえば螢光団、化学発光剤又は酵素により直接的に接合され得る。ラベルの選択は、必要とされる感度、プローブとの接合性の容易性、安定性の必要条件、及び利用できる装備に依存する。本発明のプローブ及びプライマーは、良く知られている技法を用いて合成され、そしてラベルされ得る。プローブ及びプライマーとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter，D．R.，など．1984，Hucleic Acids Re s.，12:6159-6168に記載されるように、自動合成機を用いて、Beaucage，S．L． and aruthers，M．H.，1981，Tetrahedron Letts.，22(20):1859-1862により記載される固相ホスホラミジットトリエステル方法に従って化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Rearson，J．D．and Regnier，F．E.，1983，J ．Chrom.，255:137-149に記載されるように、アクリルアミドゲル電気泳動又はアニオン−交換HPLＣのいづれかによってである。本発明はまた、キット、すなわち本発明を実施するために有用な成分を含んで成る複数容器ユニットも提供する。有用なキットは、組換えウィルス又はNPVのいづれかから、所望する標的核酸を検出するためのプローブを含むことができる。いくつかの場合、プローブは適切な支持膜に固定され得る。キットはまた、RT−PCRのためのプライマーも含むであろう。キットの他の任意の成分は、たとえば逆転写酵素又はポリメラーゼ、基質ヌクレオチシド三リン酸、ラベルするために使用される手段(たとえば、アビジン−酵素接合体及び酵素基質及び色原体(ラベルがビオチンである場合))、及び逆転写、PCR又はハイブリダイゼーション反応のための適切な緩衝液を包含する。上記成分の他に、キットはまた、本発明を実施するための説明書も含むことができる。本発明は、慢性疾患を治療するための方法を提供する。一般的には、その治療方法は、無細胞核酸の存在を有意に減じ、又は核酸が失なわれる細胞を選択的に破壊するよう企画された療法に依存する。多くの場合、そのような細胞は、特に癌の場合、異形性である。従って、そのような細胞を選択的に破壊することができる化合物は、疾病工程を阻害するために使用され得る。たとえば、標的異形性又は腫瘍細胞におけるアポプトシスを選択的に誘発する化合物が、このアプローチに使用され得る。そのような化合物の例は、スリンダック（sulindac）−由来の化合物、たとえばスリンダックスルホン、すなわち非ステロイド性抗−炎症薬物である。スタンダックは、広く使用される関節炎薬物、及び腺腫性結腸ポリポーシス(APC)を有する患者における結腸ポリプの増殖を低める抗炎症剤である。スリンダックスルホンの増殖阻害効果は、細胞周期を阻止することによってよりもむしろ、アポプトシスを通して細胞の死を選択的に増大するその化合物の能力に起因する。当業者に知られている知られているいくつかの数の抗−腫瘍化合物及び療法が本発明に使用され得る。そのような化合物は、多くの機構、たとえばプリン又はピリミジン合成の阻害、デオキシリボヌクレオチド合成の阻害、DN Aの架橋、微小管形成の阻害、及び同様のものにより作動する。種々の化学療法剤の説明のためには、Principles of Internal Medicine 12th ed．pp.1587-159 9，Wilsonなど．(eds.)，McGraw-Hill，Inc．1991を参照のこと。本発明への使用のための適切な医薬製剤は、Remingron's Pharmaceutical Sci ences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed．（1985）に見出される。化合物及び医薬的に許容できるキャリヤーを含んで成る種々の医薬組成物が調製され得る。注射できる製剤、たとえば滅菌された注射用水性懸濁液は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて既知の技法に従って配合され得る。滅菌された注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒における滅菌された注射用溶液又は懸濁液でもあり得る。使用され得る許容できるビークル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウムに溶液が存在する。さらに、滅菌された固定油が便利には、溶媒又は懸濁媒体として使用される。この目的のためには、いくつかの種類の固定油、たとえば合成モノー又はジグリセリドが使用され得る。さらに、脂肪酸、たとえばオレイン酸が注射用製剤に使用される。経口投与のための固体投与形は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒を包含する。そのような固体投与形においては、活性化合物は少なくとも１つの不活性希釈剤、たとえばスクロース、ラクトース又はスターチと共に混合され得る。そのような投与形はまた、通常の実施に良くあることではあるが、不活性希釈剤の他の追加の物質、たとえば滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウムも含むことができる。カプセル、錠剤及びピルの場合、投与形はまた、緩衝剤を含むことができる。錠剤及びピルはさらに、腸溶性抗膜により調製され得る。経口投与のための液体投与形は、当業界において通常使用される不活性希釈剤、たとえば水を含む、医薬的に許容できるエマルジョン、溶液、緩衝液、シロップ及びエリキシルを含むことができる。そのような組成物はまた、アジュバント、たとえば湿潤剤、乳化及び懸濁剤、甘味剤、風味剤、及び芳香剤を含むことができる。化合物を含む医薬組成物は、治療処置のために投与され得る。治療用途においては、組成物は、疾病の症候を低め、そして好ましくは治癒し、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量、上記のような疾病をすでに有する患者に投与される。これを達成するための適切な量は、“治療的有効用量”として定義される。この使用のための効果的な量は、投与される化合物、疾病の重症度、患者の体重及び一般的な状態、及び処方医の判断に依存するであろう。例例１．次の例は、湾岸戦争症候群として診断された湾岸戦争退役軍人に由来するサンプルのPCR研究の結果を提供する。PCR条件は、一般的に、Eggerなど.，J．Clin ．Microbiol．33:1442-1447（1995）に記載されるよう条件である。アッセイに使用されるプライマーは、下記表１に要約されている。表１はまた、マップ位置、予測される生成物及び個々のプライマーの特異性についての情報も提供する。使用されるプライマーの５’→３’配列は次の通りである：手短に言及すれば、増幅を次の通りにして実施した。0.25mlのサンプル（血清対血漿、好ましくはヘパリン化されていない）からのRNAを、0.75mlのTRIZOL LS 試薬（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）を用いて抽出し、そしてRNAを、キャリヤーとして10μgのRNアーゼーフリーのグリコーゲンにより沈澱せしめた。両方法は、製造業者のプロトコールに従って実施された。沈澱されたRNAを、４℃での遠心分離により70％エタノールにより１度、洗浄し、10μlのRNアーゼーフリーの蒸留水に再懸濁し、そしてMgCl₂(５mM)、１×PC R緩衝液II、RNアーゼインヒビター(2.5Ｕ)，MuLV逆転写酵素(2.5Ｕ)、ランダムヘキサマープライマー（2.5μＭ）及びそれぞれ１mMのdATP，dGTP，dCTP及びdTT Pを含むRT混合物（GeneAmp RNA PCRキット；Perkin-Elmer，Norwalk，Conn．）1 7μｌに添加した。その混合物を、Perkin-Elmer Thermocyclerを用いて、22℃で 10分間、42℃で30分間、95℃で５分間インキュベートした。次に、そのRT混合物を、バリヤーとして、溶融されたAmpliwaxビーズ（Perkin-Elmer，Norwalk，Con n.）を用いてHot Start PCRの上部PCR混合物に添加した。70μlの上部PCR混合物は、１×PCR緩衝液II及びAmplitaq(2.5Ｕ)を含む。30μlの下部PCR混合物は、１ ×PCR緩衝液II、2mMのMgCl₂及び適切なプライマー対（15μＭ）を含む。35サイクル（94℃で１分間、48℃で２分間、及び72℃で１分間）の後、PCR混合物８μ ｌを、Pre-Cast4−20％グラジエント、又はTBE緩衝液(45mMの硼酸、１mMのEDTA) (NOVEX，San Diego，CA)中、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて、それぞれ45 分及び60分間、200ボルトでの電気泳動にゆだねた。電気泳動の後、ゲルを、臭化エチジウム溶液の0.5μｇ／ml溶液において 20分間、染色し、そしてバンドをUV光下で写真を取った。表２に見出され得るように、それらのプライマーを用いての増幅は、多くの予想できない生成物を導びいた。たとえば、三価の経口ポリオワクチン(OPV)調製物（第２欄）においては、PG01及びPG02（両者とも５’NTRに対して特異的である）を用いての増幅が、約300bpのフラグメントを生成するために予測された。これに反して、約310〜約460bpの長さの範囲の一連の追加の予測できない生成物が観察された（表２に報告される長さは、ゲル電気泳動により決定される通りの長さである）。類似する結果が、PG07及びPG08が使用される場合に見出された。この結果は、ヒト細胞において増殖された、不活性化されたポリオワクチン(IPV )においては見出されなかった。それらの追加のフラグメントの存在は、他の汚染性ウィルスがワクチンに存在する強い証拠である。 PG01及びPG02を用いて生成された約360塩基対の１つの増幅されたフラグメントを配列決定した（配列番号７）。配列の分析は、そのフラグメントがSabin株１及び２からの配列を有する逆方向反復体により生じ得たことを示した。それらのプライマーにより生成された第２フラグメントをまた、４種の異なったクローン（配列番号８〜11）から配列決定した。さらに、VA病院からのペルシャ湾岸戦争関連疾病として診断された湾岸戦争退役軍人からの血清サンプルは、５’NTRに対して特異的なプライマーを用いて予測できないバンドを示した（表２、第４欄）。それらのプライマーがポリオウィルス配列に対して特異的なプライマーと組合して使用される場合、多くの予測できないフラグメントがまた見出された。保険申込者の対照グループ（表２、第５欄）は、予測できないフラグメントのより低い発生率及び数を有した。このグループにおけるいくつかの予測できないフラグメントの発生は、いくつかの組換え体がまた、このグループにおいても発生し得ることを示唆する。プライマーPG02及びPG03により増幅された特定の400bpのフラグメントが、カリフォルニアのMartinezにおけるVA病院での湾岸戦争退役軍人からの３種の血清サンプルのうち３種に見出された。このフラグメントを単離し、そして配列決定した（配列番号12〜16）。それらのサンプルにおける配列は、いづれかの既知の配列との有意な配列同一性を示さなかった。約1200塩基対の第２フラグメントをまた配列決定した（配列番号17）。３人の異なった退役軍人からの約750塩基対の第３フラグメントを見出し、そして配列決定した（配列番号18〜20）。２つの他のフラグメントをまた配列決定した（配列番号21〜22）。それらの結果は、増幅されたフラグメントが特徴づけられていないウィルスからの配列を含むことを示唆する。予測できないバンドが、他の疾病を有するとして診断された患者において観察された。たとえば、表２は、多発性硬化症（MS）及び前立腺癌を有する患者からの結果を示す。例２次の例は、多発性骨髄腫患者に由来する血漿サンプルのPCR研究の結果を提供する。この研究に使用されるプライマーは、腸内ウィルス配列を増幅するよう企画され、そして腸内ウィルスゲノムの配列に基づかれた(Eggerなど.，J．Clin． Microbiol．33:1442-1447(1995))。材料及び方法アッセイに使用されるプライマーは、下記に要約される：増幅は上記一般的に記載されるようにして実施された。結果４人の多発性骨髄腫患者からの血清サンプルにおける核酸の増幅は、約700塩基対の同じアムプリコンを生成した（配列番号23〜26）。それらの配列は、22q1 2で見出されるAlu配列を含む。国の異なった地域での３人の異なった患者における同じ核酸の存在は、それらの配列の検出が骨髄腫及び他の疾病の検出において重要であることを示す。さらに、同じサイズのバンドを32人の骨髄腫患者において検出し、それらの29 人が活性疾病を有した。バンドは、さらなる31人の骨髄腫患者においては検出されず、彼らの２人のみが活性疾病を有した。最終的に、バンドは、152人の健康な対照においては検出されなかった。結果は、図２においてグラフで示されている。例３上記に示されるように、骨髄腫患者に検出される配列を、腸内ウィルスゲノムにおける配列に基づくプライマーを用いて増幅した。例１のプライマーを用いての増幅を、上記のようにして実施した。その結果は表３に示される。表３において見出され得るように、それらのプライマーを用いての増幅は、多くの予測できない生成物を導びいた。上記例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の多くの変法は、当業者に容易に明らかになるであろうし、そして請求の範囲により包含される。本明細書に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、すべての目的のために引用により本明細書中に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 生物サンプルにおける標的ヒト核酸の存在についてスクリーニングするための方法であって、患者からの生物学的サンプルを用意し；前記サンプルと、標的ヒト核酸配列に対して特異的にハイブリダイズする核酸とを接触せしめ；そして前記標的ヒト核酸配列の存在を検出する：ことを含んで成る方法。 2. 前記標的ヒト核酸がヒトゲノムにおける弱い部位（fragile site）からの配列を含む請求の範囲第１項記載の方法。 3. 前記標的ヒト核酸が反復DNAに由来する配列を含む請求の範囲第１項記載の方法。 4. 前記標的核酸が保管された（archived）核酸配列を含む請求の範囲第１項記載の方法。 5. 前記反復DNAがAlu配列を含んで成る請求の範囲第３項記載の方法。 6. 前記標的ヒト核酸が制御配列を含む請求の範囲第１項記載の方法。 7. 前記標的ヒト核酸が少なくとも約100個の長さのヌクレオチドである請求の範囲第１項記載の方法。 8. 前記標的ヒト核酸が約500〜約1500個の長さのヌクレオチドである請求の範囲第７項記載の方法。 9. 前記標的ヒト核酸がRNAである請求の範囲第１項記載の方法。 10．前記標的ヒト核酸がDNAである請求の範囲第１項記載の方法。 11．前記生物学的サンプルが血漿である請求の範囲第１項記載の方法。 12．標的ヒト核酸の存在についてのスクリーニングが、疾病の処理をモニターするために使用される請求の範囲第１項記載の方法。 13．ヒト核酸の存在についてのスクリーニングが、疾病を診断するために使用される請求の範囲第１項記載の方法。 14．前記疾病状態が慢性疾患である請求の範囲第13項記載の方法。 15．前記慢性疾患が癌である請求の範囲第14項記載の方法。 16．前記癌が多発性骨髄腫である請求の範囲第15項記載の方法。 17．前記慢性疾患が自己免疫疾患である請求の範囲第14項記載の方法。 18．前記慢性疾患が神経変性疾患である請求の範囲第14項記載の方法。 19．前記標的ヒト核酸が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に示されるような配列を有するヒトゲノム配列に由来する請求の範囲第１項記載の方法。 20．前記接触段階が、標的ヒト核酸を増幅する段階を包含する請求の範囲第１項記載の方法。 21．前記増幅段階が、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用いて実施される請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記増幅段階が、配列番号１に示されるような配列を有するプライマーに対して実質的に同一であるプライマーの使用を包含する請求の範囲第21項記載の方法。 23．前記増幅段階が、配列番号２に示されるような配列を有するプライマーに対して実質的に同一であるプライマーの使用を包含する請求の範囲第21項記載の方法。 24．配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されるような配列を有する単離された核酸分子。 25．異形成細胞を選択的に破壊することを含んで成る、慢性疾患を処理するための方法。