JP2001507123A - アテローム性動脈硬化症／動脈硬化症に対する分子モデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アテローム性動脈硬化症及び動脈硬化症を模倣するため及び／又はアテローム硬化の及び動脈硬化の危険性を検出するための、又は薬剤組成物の抗アテローム性硬化／動脈硬化の影響を研究するための化合物の疎水性表面と巨大分子とを結合することよって調製される基材に関する。本発明は、更にそのような基材の調製方法、アテローム性動脈硬化症及び動脈硬化症を模倣するための方法、並びにアテローム性硬化／動脈硬化の危険性を認識するため又は薬剤組成物の抗アテローム性硬化／動脈硬化の影響を検出するための試験系を製作するための基材の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アテローム性動脈硬化症／動脈硬化症に対する分子モデル 本発明は、アテローム性動脈硬化症及び動脈硬化症を模倣するため及び／又は アテローム硬化の及び動脈硬化の危険性を検出するための試験基材、当該基材を 調製する方法、当該基材を含む試験系及びアテローム硬化の危険性並びに前記候 補薬剤の効果を検出及び試験する方法に関する。 動脈硬化症は、動脈壁が肥厚になり、弾性を失う多数の疾病に対する一般的な 用語である。アテローム性動脈硬化症は、これらの疾病で最も重要なものである 。脳、心臓、腎臓、他の生体の器官及び四肢に対するアテローム性動脈硬化症の 影響において、血管の疾病は、罹患率及び死亡率の主な理由である。アテローム 性動脈硬化症の主な危険因子は、特に高血圧、高い低密度リポタンパク質（ＬＤ Ｌ）のような高い血清脂質及び低下した高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベ ルである。 アテローム性動脈硬化症は、中及び大動脈に影響し、動脈内腔を侵食し、最も 重篤な形態では、閉塞を生じる内膜下(subintima)のまばらな壁内肥厚によって 特徴づけられる。アテローム硬化プラークは、細胞内及び細胞外の脂質、カルシ ウム塩、マクロファージ、平滑筋細胞、結合組織及びプロテオグリカンの蓄積か らなる。 アテローム性動脈硬化症の最も早期の病変は、脂質の詰まった泡沫細胞の脂肪 性線条であり、これは、循環から脈管内膜の内皮下層中へ単核細胞として移動す るマクロファージであって、結合組織と細胞内及び細胞外の脂質とに囲まれた内 膜平滑筋細胞からなる線維プラークに発展する。 アテローム硬化血管で、収縮期の膨張(systolic expansion)が低下し、及び脈 波伝達が異常に速くなる。高血圧被検者の硬化性動脈では、弾力性も低下し、こ の弾力性は、アテローム性動脈硬化症が進展すると、更に低下する。 ２つの主な仮説が、アテローム性動脈硬化症の病因を説明するために提案され た。脂質仮説では、ＬＤＬが上昇するとＬＤＬが動脈壁に侵入し、平滑筋細胞及 びマクロファージ（泡沫細胞）中に脂質蓄積を引き起こすとされる。ＬＤＬは、 また、成長因子に応答して平滑筋細胞の過成形を増大する。ＬＤＬは、血管壁細 胞膜の近傍で生じた酸素フリーラジカルの存在下でｏｘＬＤＬに酸化され、更に アテローム形成的な性質を獲得する。慢性的な内皮損傷仮説では、内皮の損傷に よって、内皮の損失、血小板の内皮下層への接着、血小板の凝集、単核細胞及び Ｔ−細胞リンパ球の走化性、及び中膜から内膜への平滑筋細胞の移入を誘導する 血小板及び単核細胞由来の成長因子の遊離を生じるとされる。 アテローム硬化プラークは、何年にもわたってゆっくりと成長し、重大な狭窄 症又は全体の閉塞を生じ得る。経時的に、このプラークは石灰化し、自然発生的 に亀裂又は破裂が起こり得、この内容物が流血にさらされる。破裂したプラーク は、血栓症を刺激する。即ち、血栓は、塞栓を形成し、急速に内腔を塞ぎ、又は 徐々にプラーク中に取り込まれ、崇高くしかつ閉塞的な性質を与えるかもしれな い。 血管の流量依存膨張のメカニズムは、これまで知られていない。しかしながら 、内皮及び平滑筋細胞膜中並びに細胞外基質に固着したセンサー巨大分子が血管 弛緩を開始するとの指摘が増えている。 以前の研究では、電解質が、多くの巨大分子系の物理化学的挙動において、重 要な役割を担うことが示されている。生体系において、電解質は、例えば自己会 合、巨大分子高次構造、ゲル形成及び吸着に影響することがわかっている。生体 巨大分子系における電解質の効果は、全く異なる物理化学的な起源の３つの寄与 に細分できる。これらは、リオトロピックの効果、一般的静電効果及び特定のイ オン結合効果である。 上記の一般的な静電的と非特異的なリオトロピック電解質効果のみならず、特 異的なイオン結合効果は、多くの生体系において、特に重要であることもわかっ た。これらイオン特異的効果の起源は、系が異なると変化するが、しばしばアニ オンよりカチオンを含む。 この種のカチオン特異的イオン結合を示すと考えられる生物学的巨大分子の、 １つの特定の類は、プロテオグリカン類である。これらは、タンパク質コアに共 有結合した、高度にカルボキシル化されかつ硫酸化されたグリコサミノグリカン 鎖からなるアニオン性の生体巨大分子である。それ自体として、高い直線的電荷 密度を有する強い高分子電解質である。ポリアニオン性及び親水性のグリコサミ ノグリカン鎖は、プロテオグリカンの物理的性質を支配する。この鎖は、組織水 和と弾性のみならず、負の電荷による対イオン誘引力にも強く影響する。プロテ オグリカンの例には、プロテオヘパラン硫酸、プロテオデルマタン硫酸及びプロ テオコンドロイチン硫酸がある。混成プロテオヘパラン／コンドロイチン硫酸は 、タンパク質コアのα−らせん部分からなるその疎水性領域を介して、血管中の 内皮細胞膜中に取り込まれる。血液溶液中に突出する親水性の細胞外領域は、グ リコサミノグリカン側鎖が結合したタンパク質主鎖で構成される。 大型及び中型の動脈内のアテローム動脈硬化プラーク中の、コレステロールの ような脂質物質、カルシウム塩、マクロファージ、平滑筋細胞及び結合組織の付 着による血管閉塞及び血流機能障害等は不可逆的反応なので、これらの機能障害 の早期検出が、重要な研究の対象である。これまで、そのような検出又は認識の ための系又は物質は、従来技術において記載されていない。 アテローム硬化プラーク形成の不可逆性及びその致命的な副作用から見て、好 ましくは早い段階で血管の疾病の進行の危険を検出することが可能な試験系を提 供することが、本発明の目的である。 ある側面において、本発明は、アテローム性動脈硬化症及び動脈硬化症を模倣 するため、及び／又はアテローム性動脈硬化／動脈硬化の危険性を検出するため の試験基材を調製するための方法を提供する。 他の側面において、本発明は、アテローム硬化の危険性の存在を本発明の試験 基材を使用して分析するための方法に関する。 更に、本発明は、血管閉塞、血流機能障害等の疾病に対する危険性を認識する ための方法における有用性を見いだし、基材表面におけるリポタンパク質の付着 ／結合及び／又は、カルシウム関連の結合／付着並びに他のカチオンに関連した 結合／付着をモニターして(図表で明らかにした)、アテローム性動脈硬化症の危 険性を探索するための診断試験で使用する試験系内の基材を提供する。 更に、本発明は、カルシウム結合又はリポタンパク質付着／結合及び石灰化を 遅らせる、迅速で費用効率的な薬剤の試験方法を含む。 疎水性物質の表面修飾、特に、プロテオグリカン組成物、好ましくはプロテオ ヘパラン硫酸と結合することによるメチル化シリカ表面の修飾は、血管内膜及び 中膜中のアテローム性動脈硬化症及び動脈硬化症、基礎膜の硬化、並びに肝臓、 膵臓、肺等のような細胞基質の硬化過程の模倣に対して優れた結果を生むことは 、驚くべきことである。この目的のために、疎水性表面、特にシラン結合を介し てメチル化したシリカ表面、チオール含有自己集合単一層で修飾した金、又はラ ングミュアー・ブロジェット法を介すか、あるいは例えばモノ、ジ、トリグリセ リド、コレステロール又はリン脂質のような親油性物質又は例えばポリスチレン のような疎水性ポリマーの他の沈着法を介して修飾された物質を使用できる。更 に、本質的に疎水性の物質、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボ ネート等のようなプラスチックは、表面を修飾するための基材として使用されて もよい。これらの基材は、プロテオグリカンのような巨大分子と結合され、それ によって、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及び植物又は動物源のポリサッカラ イド、タンパク質(例えば免疫グロブリン)、ヒアルロナン又は疎水的に修飾した ヒアルロナン又はヘパリン、又はこのポリサッカライドを含む糖タンパク質を使 用し得る。更に、細胞表面レセプター及び、例えば、ＮＣＡＭ及び前記巨大分子 のすべてのイソ型のような免疫グロブリン上科の細胞接着分子、並びにアテロー ム硬化プラーク形成に関与し、そうでなければプラーク形成に対する危険性を引 き起こす成分に対する抗体も含まれる。 前記表面と前記分子との結合は、非吸着巨大分子を後に除去し又は除去せずに 、クレブス液、修飾クレブス液及び他の生理的なｐＨの塩水溶液のような水性緩 衝血液代替溶液からの付着(attachment)に基づく。 上述の修飾した基材は、次いで、試料からアテローム硬化の危険性の存在を分 析するための方法に使用され、この試料は、血清タンパク質が除去された血液か ら、及び／又は他のアテローム硬化の危険の可能性がある血液成分、例えばホモ システイン、ホモシステイン酸から、又は全血清からの、全体又は個々のリポタ ンパク質の画分である。この方法は、以下の工程を含む。 (a)好適な、特に疎水性の化合物の修飾表面を調製する工程、 (b)巨大分子を疎水性表面に結合する工程、 (c)被分析試料を添加する工程であって、リポタンパク質の結合／付着及び／又 は、カルシウム関連の結合／付着及び／又は他のカチオン関連の結合／付着を、 分光化学的又は顕微鏡的な分析によって検出し得る工程、及び (d)リポタンパク質の付着及び/又はカルシウム関連の結合／付着及び／又は他の カチオン関連の結合／付着の分光化学的又は顕微鏡的な応答を測定して、試料の アテローム硬化の性質を示す工程。 被分析試料は、層状の内皮細胞、基礎膜及び／又は、血管、肝臓、膵臓、肺等 からなる群より選ばれる組織基質を含む。 さらに、上述の修飾した基材は、薬剤組成物の抗アテローム硬化及び抗動脈硬 化の影響を研究するための分析方法において使用し得る。この方法は、以下の工 程を含む。 (a)好適な、特に疎水性の化合物の修飾表面を調製する工程、 (b)巨大分子を疎水性表面に結合する工程、 (c)被分析試料を添加する工程であって、リポタンパク質の結合／付着及び／又 は、カルシウム関連の結合／付着及び／又は他のカチオン関連の結合／付着は、 分光化学的又は顕微鏡的な分析によって検出し得る工程、及び (d)リポタンパク質の付着及び／又はカルシウム関連の結合／付着及び／又は他 のカチオン関連の結合／付着の分光化学的又は顕微鏡的な応答を測定して、薬剤 の抗アテローム性動脈硬化／動脈硬化の性質をモニターする工程。 本発明の修飾した基材は、いかなる血液及び組織組成物のアテローム硬化活性 の研究にも有用である。 本発明の試験基材は、更に、アテローム性動脈硬化症／動脈硬化症を模倣する ため及び／又はアテローム性動脈硬化／動脈硬化の危険性を検出するため、又は 薬剤の抗アテローム性動脈硬化／動脈硬化の影響をモニターするための試験系の 製作に使用される。 上記分析方法は、 ・表面における巨大分子の吸着、又は ・表面における試料の吸着、又は ・試験系における試料の吸着、例えば、表面における巨大分子の吸着、又は ・試験系の界面構造、 の研究のための、いかなる光学的又は分光化学的方法で行われてもよく、例えば 、偏光解析法、反射率計、表面プラスモン共鳴（surface plasmonresonance、Ｓ ＰＲ）、全反射蛍光分光法（total internal reflectance fluorescence spectr oscopy、ＴＩＲＦ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）がある。更に、系に おけるカルシウム及び／又は他のカチオン及び／又はリポタンパク質に関連する 結合／付着の他の探索方法には、原子間力顕微鏡のようなもの及びあらゆるタイ プの顕微鏡が含まれる。一般的に、上述に従って処理し、モデルを使用して模倣 され得るカルシウム及び／又は他のカチオン及び／又はリポタンパク質に関連す る結合／付着がより広範になることは、アテローム硬化プラーク形成の危険性が より高くなることに相当する。 例えばヘパラン硫酸プロテオグリカン(ＨＳＰＧ)及びデルマタン硫酸プロテオ グリカン(ＤＳＰＧ)のようなプロテオグリカンは、例えば、メチル化シリカ表面 又はラングミュアー・ブロジェット沈着を通じて疎水性化したマイカのような疎 水性表面に吸着するのに対して、対応するＧＡＧは吸着しない。再現性があり、 良好に定義された飽和吸着値を、２時間未満の後に得る。１０％未満の吸着され たプロテオグリカンは、飽和吸着後に溶液中のプロテオグリカンを除去すると脱 着される。吸着は、疎水性でかつ負に帯電した表面、例えばシリカでは起こらな い。従って、疎水性表面における吸着が、表面とタンパク質部分との疎水的相互 作用によって進むのに対して、直接表面力測定値で示されるように、ＧＡＧ鎖が 水溶液の方へ指向される。 生物学的環境におけるプロテオグリカンの挙動に類似して、表面に付着したプ ロテオグリカンは、強力なイオン特異性の方法で電解質と相互作用することもわ かった。特に、Ｎａ⁺とＣａ²⁺は、この相互作用を示し、吸着したプロテオグリ カンの吸着と界面高次構造の双方を制御することがわかった。血管弾性の調節に おける並行実験は、これらのイオンが単離された人の血管小片中でも特に重要で あることがわかったので試験系の生物学的関連性を支持することを示す。 電解質依存性吸着は、ある化合物の添加によって調節され得る。特に、Ｃａ²⁺ 誘導増加プロテオグリカン吸着並びに界面構造の変化は、例えばニンニク抽出物 のような、アリシン及びアジョエン(ajoene)のような活性成分を含む公知の抗ア テローム硬化薬剤組成物によって減少され得る。並行実験により、この減少は、 少なくとも部分的に、減少したプロテオグリカン−カルシウム結合のためとわか った。従って、生体系におけるそれぞれの巨大分子に結合しているカルシウムに 対する種々の化合物の効果がシミュレートされ得る。 ホモシステインのようなアテローム性動脈硬化症に対する公知の危険因子は、 試験系と相互作用すること及び特に試験系とのカルシウム相互作用で強く修飾す ることがわかった。 リポタンパク質、例えばＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ及びＬｐ(a)は、試験系と相互に 作用し、及び高度に種依存性の方法(species-dependent manner)で界面沈着を形 成することがわかった。従って、この試験系は、内皮細胞膜における自然結合部 位で、及びアテローム性動脈硬化症の組織基質、主要な特徴及び強力な開始剤で の脂質沈着の迅速かつ費用効率的なin vitro研究が認められる。 本発明の基材と方法を使用する有利な知見を、図１及び図２並びに図３ａ、３ ｂ、３ｃに示す。この中でΓは、２種のカルシウム濃度Ｃａ１及びＣａ２(図３ ａ)並びに抗アテローム硬化薬剤１及び２(図３ｂ)及びリポタンパク質(図３ｃ) の存在下における総吸着量[mg/m²]を表す。 本発明は、本発明の範囲を限定することなく、図４〜１４に参考として詳細に 示す。基材および試験系を修飾するための手順の詳細な説明を以下に示す(実施 例を参照)。 図４(純水)及び図５(クレブス液)は、膜貫通の疎水性コア領域近傍のメチル化 シリカ表面における、プロテオグリカン硫酸塩の沈着を示す。吸着量を縦軸に示 す。Ｃａ²⁺イオンが、負のグリコサミノグリカン鎖を保護するので、生理学的Ｃ ａ²⁺濃度がたった１.２５mmol/lであっても、イオン種は、プロテオヘパラン硫 酸塩の吸着を促進する。 図６は、全く異なる時間経過を示すシリカ及びメチル化シリカにおけるＬＤＬ 及びｏｘＬＤＬの吸着を図で示すものである。メチル化シリカについては、最初 の初期吸着の後、約１時間の脱着が続くと思われる。その後、吸着は一定であっ た。 図７は、Ｃａ²⁺イオンが、Ｃａ²⁺のないクレブス液からのＬＤＬ吸着に、プ ロテオヘパラン硫酸塩に対して説明され得るように影響するか否かの研究を示す 。Ｃａ１(２.５mmol/l)はＬＤＬ吸着を変化しないか、又は実施例には示してい ないが、僅かに増加し、Ｃａ２(１０mmol/l)は、おそらく凝集に関連したメカニ ズムによって、吸着を劇的に促進する。 図８は、生理学的シナリオのシミュレーションを示す図である。リポタンパク 質がメチル化シリカにおいてＣａ²⁺のないクレブス液から予め吸着されたヘパラ ン硫酸プロテオグリカンに結合すると、最初の２５分間、ＬＤＬに対するさらな る吸着量はなかったが、その後ＬＤＬ凝集により、吸着度は、９５分間で１４mg /m²に増加した。 図９は、これとは対照的にｏｘＬＤＬがプロテオヘパラン硫酸塩／ｏｘＬＤＬ 複合体の吸着量を２時間以内で０.６５mg/m²に着実に低下することを示す。従っ てｏｘＬＤＬは、プロテオヘパラン硫酸塩に強く結合し、おそらく酸素フリーラ ジカルの介入によって、プロテオヘパラン硫酸塩のポリアニオン性グリコサミノ グリカン結合部位に変化すると考えられる。 図１０は、図８及び図９に示された測定結果を要約する。予め吸着されたプロ テオヘパラン硫酸塩に結合するＬＤＬ及びｏｘＬＤＬは、大きな違いを示すと考 えられる。ＬＤＬは吸着度を強力に増加する一方で、ｏｘＬＤＬは、吸着したプ ロテオヘパラン硫酸塩／ｏｘＬＤＬ複合体の量を減少する。 図１１は、ｏｘＬＤＬのこの積極的な効果を示す。Ｃａ²⁺のないクレブス液か らのプロテオヘパラン硫酸塩の吸着度は、Ｃａ²⁺イオンの添加によって、従って 吸着を妨げる静電気的相互作用を遮断することによって非常に明確になった。ｏ ｘＬＤＬの介入は、数時間にわたって連続的に起きる直接脱着を開始した。 図１２は、どのように上述した効果がカルシウムイオンに修正されるのか、及 びプロテオグリカン／リポタンパク質複合体の石灰化が起きるのかどうかを解明 するための実験を示す。ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するＨＤＬ(高密 度リポタンパク質)は、Ｃａ²⁺イオンの段階的な添加によってわずかに増加する だけである。さらに、ＨＤＬは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに強力に結合す ると思われる。 図１３は、図１２で示された実験の結果と対照的に、Ｃａ²⁺イオンがプロテオ ヘパラン硫酸塩／ＬＤＬ相互作用を劇的に変化することを示す。プロテオヘパラ ン硫酸塩の予備吸着後、ＬＤＬは、観測時間の枠内での吸着量を有意に変化する ことはなかった。しかしながら、２.５mmol/lのＣａ²⁺イオンを添加すると、プ ロテオヘパラン硫酸塩／ＬＤＬ相互作用が促進される。 更に、ＨＤＬの保護的役割を試験するための研究を計画した。結果を図１４に 示す。Ｃａ²⁺のないクレブス液からのプロテオヘパラン硫酸塩の吸着後、ＨＤＬ は、生理学的濃度におけるＬＤＬの添加によって影響されない脱着を引き起こし た。最も驚くべきことに、Ｃａ²⁺イオンは、１０mmol/lの濃度であっても、この 影響を全く有さないことがわかった。さらに、ＬＤＬ(２倍の血清濃度)を繰り返 し添加しても、吸着は変化しなかった。 実験により、ＨＤＬが、高い親和力でヘパラン硫酸プロテオグリカンと結合し 、ポリアニオン性プロテオグリカンに対する静電誘引力からＬＤＬを排除するこ とがわかる。さらに、プロテオヘパラン硫酸塩／ＬＤＬの「石灰化(calcificati on)」は、抑制されると思われる。従って、この結果は、高密度リポタンパク質 の直接の抗アテローム硬化及び抗動脈硬化への影響を強調する。 さらに、現在、広範な動物実験によるアテローム性動脈硬化症／動脈硬化症に 対する新しい候補薬剤の高価で長い開発期間を減少することが、本発明の試験系 によって可能である。抗アテローム硬化薬剤に存在する公知の副作用を有するア テローム硬化症の不可逆性から見て、試験系は、アテローム硬化症の進行に対す る危険性の早期検出のための情報を提供し得る。さらに、試験系は、アテローム 性動脈硬化症／動脈硬化症並びに抗アテローム動脈硬化／動脈硬化薬剤の効果の 分子メカニズムの研究に対する研究手段を提供し得る。 以下に、基材の修飾方法をより詳細に記述するが、本発明は、これらの方法に 限定されるものではない。 実施例 材料 超純水が、この実験には使用されるべきである。従って、水は、深さろ過法(d epth filtration)、炭素吸着及び逆浸透法に先立つ非焼成法を含むMilli-RO 10P LUS前処理ユニットによってまず精製する。引き続いて、Milli-Q PLUS 185ユニ ットに通す。このユニットは、活性炭素ユニットに続いて混合床イオン交換器、 オルガネックス・カートリッジ、及び最後の０.２２mm Millipak 40フィルター を含むQ-PAKユニットに導入する前に、供給水を紫外光(185nm及び254nm)で処理 するものである。しかしながら、他の水精製方法を適用してもよい。 プロテオヘパラン硫酸塩(Ｎａ⁺塩)は、Schmidt，A.，Schafer，E.，Buddecke ，E.の"Isolation and characterization of two proteoheparan sulfate speci es of calf arterial tissue"Eur．J．Biochem．173、661〜666頁、1988年によ って既に記載されたように調製した。この生体分子は、平均分子量１７５ｋＤを 有し、高く負に電荷した巨大分子である［全分子の９５％が、１６５〜１８５ｋ Ｄの範囲にある］。この生体分子は、いくつかのヘパラン硫酸塩側鎖（Ｍ_r≒３ ５ｋＤ）が、共有結合的に連結されているタンパク質コア(Ｍ_r＝３８ｋＤ)を含 む。このヘパラン硫酸塩側鎖は、プロテオヘパラン硫酸塩から徹底的なタンパク 分解性消化によって又はβ脱離反応によって得てもよく、ウロン酸(１−４)グル コサミンジサッカライドの繰り返しからなるが、グルクロン酸／イズロン酸の比 、Ｏ−硫酸エステル基の数及び位置、並びにＮ−硫酸塩／Ｏ−硫酸塩の比に関し て、広い化学的及び立体配置的可変性を示す。一つのジサッカライド単位は、平 均して１つのカルボキシルと０.５の硫酸基を含む。プロテオデルマタン／−コ ンドロイチン硫酸塩は、Schmidt，A.，Schafer，E.，Buddecke，E.の"Isolation and properities of proteoglycans from bovine aorta"Eur．J．Biochem．125 、95〜101頁、1982年で記載されたように調製した。このプロテオグリカンは、 Ｍ_rが１９００００で、２３％のタンパク質(Ｍ_r４６０００)からなり、３〜４の ハイブリッド鎖（Ｍ_r３９０００±４２００）が、タンパク質コアとアルカリ易 動性結合によって共有結合的につながっている。コンドロイチン硫酸塩／デルマ タン硫酸塩鎖は、コポリマー構造を有し、５３％のコンドロイチン硫酸塩及び４ ７％のデルマタン硫酸塩からなり、Ｏ−硫酸エステルはジサッカライド単位につ き０.９６の硫酸基と１のカルボキシル基を含む。しかしながら、他のプロテオ グリカン調製物もこのセンサーに適用できることは明記されるべきである。 電解質は、すべて分析級であり、更に精製することなく使用した。他の質の電 解質も適用してよいことは注目すべきである。 表面 シリカ表面は、研磨されたシリコンスライドから得られた。つまり、スライド を酸素中で熱的に酸化し、その後アルゴン流中で徐冷及び冷却して、厚さ約３０ nmの酸化層を得た。このスライドを、次いで、２５％ＮＨ₄ＯＨ、３０％Ｈ₂Ｏ₂ 及びＨ₂Ｏ（容積比で１：１：５）の混合物中で８０℃、５分間洗浄し、次いで 、３２％ＨＣｌ、３０％Ｈ₂Ｏ₂及びＨ₂Ｏ（容積比で１：１：５）の混合物中で ８０℃、５分間洗浄した。このスライドをその後、水、エタノール、トリクロロ エチレン(pro analysi，Merck)の順で２回すすぎ、その後、トリクロロエチレン 中、Ｃｌ₂(ＣＨ₃)₂Ｓｉの０．１重量％溶液(Merck)で９０分間処理した。最後に 、このスライドをトリクロロエチレン及びエタノールで再度４回すすいだ。この 操作は、それぞれ９５°と８８°の一定角度に前進及び後退することによって、 スライドに疎水性を与えた。スライドは、使用するまでエタノール中で保持した 。しかしながら、使用された技術によって、異なる表面及び表面修飾の範囲を使 用してもよいことは明記されるべきである。 方法 偏光解析測定法に基づき、操作を例示的に説明する。すべての前記分光法及び 顕微鏡法が使用され得ることは明記されるべきである。 偏光解析測定法は、Azzam，R.M.A．、Bashara，N.M．“Ellipsometry and pol arized light”North-Holland，Amsterdam、1989年に記載されたような零点偏光 解析法(null ellipsometry)を用いて行った。使用した器具は、パーソナル・コ ンピューターで制御された自動化ルドルフ薄膜偏光解析器436型であった。4015 Åにフィルターされたキセノンランプを、光源として使用した。実験装備の詳細 な説明は、Malmsten，M.、Siegel，G、“Electrostatic and ion-binding effec tson the adsorption of proteoglycans.”J．Colloid Interface Sci．170、12 0〜127頁、1995年に示されている。すべての測定は、光成分の欠陥の影響を減少 するために４つの領域の零点偏光解析法によって行われた。表面の光学分析の後 、プロテオグリカン溶液をキュベットに加え、偏光の変化を記録した。２つの測 定の最大の時間分解能は、３〜４秒である。最後に、電解質組成物及び／又は全 体溶液のリポタンパク質濃度を、非吸着分子を除去するために前記すすぎをして 又はせずに変化した。終始、組成物の変化による全部の溶液の屈折率を変えるた めに校正を行った。撹拌は、マグネチックスターラーで約３００rpmで行った。 吸着量(Γ)は、吸着層の厚さ及び平均反射率データを、プロテオヘパラン硫酸 塩及びプロテオデルマタン／−コンドロイチン硫酸塩の双方に対して０.１６cm³ /gのdn/dcの値を使用して測定して得られた。すべての測定は、一定の全体のプ ロテオグリカン濃度０.１mg/ml（プラトー吸着と一致）を使用して行った。さら に、測定は、生体系の中で、異なる電解質濃度で行った。通常の血液代替溶液( クレブス液)は、Na⁺151.16;K⁺4.69;Ca²⁺2.52;Mg²⁺1.1;Cl^-145.4;HCO₃ ^-16.31及び H₂PO₄1.38mmol/lからなる。終始、ｐＨは、重炭酸塩／リン酸塩緩衝液によって 、及び９５％Ｏ₂−５％ＣＯ₂又は９４％Ｎ₂−６％ＣＯ₂ガス混合物キュベット溶 液（Aga、Sweden）の連続通気によって、７.２４±０.０１に保持した。後者は 、これらの実験を通して良好に制御され、時には非酸化条件で、分解とリン酸カ ルシウムの沈殿の双方を防止するために、ｐＨを保持することが必要であるため に含まれる。他の操作もセンサーの適用に良好に許容されてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．疎水性基材と結合した巨大分からなることを特徴とする、アテローム性動脈 硬化症／動脈硬化症を模倣するため、及び／又はアテローム性動脈硬化／動脈 硬化の危険性を検出するための基材。 ２．巨大分子が、非吸着巨大分子をその後除去し又は除去しないで、水性緩衝血 液代替溶液からの付着により、疎水性基材に結合される、請求項１に記載のア テローム性動脈硬化／動脈硬化の危険性を検出及び／又は認識するための試験 基材を調製する方法。 ３．親水性巨大分子が、プロテオグリカン、ヒアルロナン又は疎水的に修飾した ヒアルロナン又はヘパリンを含むポリサッカライド、又はこのポリサッカライ ドを含む糖タンパク質、又はこれらのイソ型、並びに細胞表面レセプター及び 免疫グロブリン上科の細胞接着分子、特にＮＣＡＭ及び前記巨大分子の全イソ 型、並びにアテローム硬化プラーク形成に関与するか、そうでなければプラー ク形成に対する危険性を引き起こす成分に対する抗体からなる群より選ばれる 、請求項２に記載の方法。 ４．疎水性表面を有する化合物が、特に、シラン結合によってメチル化したシリ カ、チオール含有自己集合単一層で修飾した金、又はラングミュアー・ブロジ ェット法により、又はモノ、ジ、トリグリセリド、コレステロール又は、リン 脂質を含むリポタンパク質物質の他の沈着法、又は、ポリスチレンを含む疎水 性ポリマーの沈着法、特にポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等 のプラスチックを含む本質的に疎水性の物質の他の沈着法により修飾された物 質である、請求項２に記載の方法。 ５．前記緩衝血液代替溶液が、生理的なｐＨの塩水溶液、クレブス液、修飾クレ ブス液から選ばれる、請求項２に記載の方法。 ６．分光化学的及び／又は顕微鏡的な分析によって、試料におけるアテローム性 動脈硬化症／動脈硬化症を模倣するため、及び／又はアテローム性動脈硬化／ 動脈硬化の危険性を評価するするための方法であって、 (a)好適な、特に疎水性の化合物の修飾表面を調製する工程、 (b)巨大分子を疎水性表面に結合する工程、 （c）被分析試料を添加する工程であって、リポタンパク質の結合／付着及び ／又は、カルシウム関連の結合／付着及び／又は他のカチオン関連の結合／ 付着は、分光化学的又は顕微鏡的な分析によって検出し得る工程、及び (d)リポタンパク質の付着及び／又はカルシウム関連の結合／付着及び／又は 他のカチオン関連の結合／付着の分光化学的又は顕微鏡的な応答を測定して 、試料のアテローム硬化の性質を示す工程、 を含むことを特徴とする方法。 ７．被分析試料が、血管、肝臓、膵臓、肺等からなる群より選ばれる層状の内皮 細胞、基礎膜及び／又は、組織基質を含む、請求項６に記載の方法。 ８．薬剤の抗アテローム性動脈硬化症／動脈硬化症の影響を検出するための方法 であって、 （a）好適な、特に疎水性の化合物の修飾表面を調製する工程、 （b）巨大分子を疎水性表面に結合する工程、 （c）被分析試料を添加する工程であって、リポタンパク質の結合／付着及び ／又は、カルシウム関連の結合／付着及び／又は他のカチオン関連の結合 ／付着を、分光化学的又は顕微鏡的な分析によって検出し得る工程、及び (d)リポタンパク質の付着及び／又はカルシウム関連の結合／付着及び／又は 他のカチオン関連の結合／付着の分光化学的又は顕微鏡的な応答を測定し て、薬剤の抗アテローム動脈硬化／動脈硬化の性質をモニターする工程、 を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。 ９．アテローム性動脈硬化症／動脈硬化症を模倣するため、及び/又はアテロー ム性動脈硬化症／動脈硬化症の危険性を検出するため、又は、薬剤組成物の抗 アテローム動脈硬化／動脈硬化の影響をモニターするための試験系の調製のた めの、請求項１に記載の試験基材の使用。