JP2001506849A - 骨刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ ＨｉｓＴｈｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＡｓｎＴｈｒ Ｌｅｕ Ｈｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｉａ Ａｌａ Ｇｌｕ ＴｈｒＬｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏおよび配列、特に、Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ＡｌａＡｓｐ Ｃｙｓ Ｌｙｓの骨成長を刺激するポリペプチド、および関連する核酸配列、調製および使用方法、抗体およびキット。

Description

【発明の詳細な説明】 骨刺激因子 本出願は、１９９６年１２月１１日出願の米国特許出願第０８／７６３，４５ ８号の優先権を主張するものであり、参照によって本明細書に組み込むものとす る。 本発明は、骨の成長を刺激するポリペプチドに関する。 骨の成長および強さに係わる問題に対する理解は、ここ数年深まってきている が、その概要は、１９９４年９月１５日に国際特許公開第ＷＯ９４／２０６１５ 号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ９４／００１４４号に記載され ている。 骨量の減少およびそれに伴う異常症に関係する疾患については、様々な治療法 が特許文献に例証されている。例えば、１９８９年１０月３１日発行の米国特許 第４，８７７，８６４号には、ヒトおよびウシの「骨誘導因子」についての記載 がある。１９９２年９月１７日公開の国際特許出願第９２／１５６１５号には、 血清カルシウムレベルの上昇を引き起こす骨異常症の治療用の、血清カルシウム レベル低下作用を有するブタの膵臓由来のタンパク質についての記載がある。１ ９９２年９月２３日公開の欧州特許出願第５０４９３８号には、骨疾患の治療に おいて、システインプロテアーゼを阻害するジペプチドまたはトリペプチドの使 用についての記載がある。１９９２年９月３日公開の国際特許出願第９２／１４ ４８１号には、アクチビンおよび骨形成因子を含有する、骨の成長を誘導する組 成物を開示している。１９９２年８月１９日公開の欧州特許出願第４９９２４２ 号には、骨芽細胞増殖を引き起こすために、骨量減少に係わる骨の疾患に有用で あると考えられている細胞成長因子組成物の使用についての記載がある。１９９ ２年６月２５日公開の国際特許出願第９２／１０５１５号は、ヒトＮ末端パラト ルモン（ＰＴＨ）フラグメント１〜３７を含有する薬剤を記載している。１９９ １年９月１６日公開の欧州特許出願第４５１８６７号には、骨粗鬆症など、カル シウムまたはリン酸に関連する代謝異常治療用のパラトルモンペプチド拮抗剤に ついての記載がある。エルサレム、ヘブライ大学のＹｉｓｓｕｍ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙによる１９９５年１０月２４日 発行の米国特許第５，４６１，０３４号には、骨髄の再生から同定した骨形成性 成長ポリペプチドについての記載がある。 ＰＴＨは血清中の半減期が比較的短いこと、および間欠的なＰＴＨの注射によ る骨体積に関する陽性効果から、本発明の研究者は、ＰＴＨ注射が何等かの方法 で循環系に別の因子を誘導しているのではないかとの仮説を立てた。したがって 、ラットおよびヒトの血清中のこのような別の因子の存在について研究をおこな った。 ＰＴＨ産生能を欠くラット（上皮小体摘除ラット）に投与して、観察される骨 ミネラル付加速度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ ｒａｔ ｅ）を増加させるポリペプチド物質をラットの血清から単離することが可能なこ とが判明している。このラットペプチドのアミノ酸配列に基づいて核酸プローブ を合成し、これを使用して、ヒト肝ｃＤＮＡフィータルライブラリー(ｈｕｍａ ｎ ｌｉｖｅｒ ｃＤＮＡ ｆｅｔａｌ ｌｉｂｒａｒｙ)をスクリーニングし 、ヒトの骨付加ペプチドをコードするヒト核酸配列を単離した。この核酸配列に 由来するポリペプチドを、その由来する配列としてのＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ− Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ− Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号１）に従い化学的 に合成した。健全なラットにおける骨付加速度は、この化学合成された化合物を 投与すると、用量に依存して増加することが観察された。卵巣摘除を行ったラッ トで通常見られる骨成長の低下は、卵巣摘除後２週間目から４週間にわたってこ のポリペプチドを投与した後のラットについては、発症が認められなかった。卵 巣摘除後８週間目から８週間にわたってこのポリペプチドを投与した卵巣摘除ラ ットでは、骨カルシウム密度が維持されていることが判明した。 活性ポリペプチドは上記配列のダイマーである可能性が考えられ、先に示した 配列を有する２つのポリペプチド間のジスルフィド架橋によると推定される、か なりのダイマー形成の証拠がある。 このようにして、Ｃｙｓ−Ａｌａ置換を含んでいる上記ポリペプチドの修飾体 、すなわちＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ −Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ −Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ −Ｐｒｏ（配列番号３）を合成した。「通常の」ポリペプチド（配列番号１）の 骨刺激効果が、この修飾ポリペプチドの場合にも見いだされた。 これ以外の実験では、通常のポリペプチド（配列番号１）に対するウサギ抗体 を投与したラットでは、骨ミネラル付加速度が抑制されていることが判明した。 通常のポリペプチドと、これに対する抗体との両方を投与したラットでは、この 抑制が減弱されていることが判明した。 さらに、通常のポリペプチド（配列番号１）のポリペプチドフラグメントをい くつか合成した結果、各フラグメントは骨刺激効果を有することが判明した。 さらに、配列番号７と識別されたポリペプチドを８週間または１２週間にわた って投与すると、卵巣摘除されたラットの骨カルシウム含量が増加することが判 明した。 また、通常のポリペプチド（配列番号１）の他のポリペプチドフラグメントを 合成した結果、それらには、通常のポリペプチドに見いだされる骨刺激効果がな いことが判明した。 配列番号９と識別されたポリペプチドは、各末端に保護基を有するように修飾 した。すなわち、Ｎ末端をアセチル化し、Ｃ末端をアミド化した。配列番号２４ と識別されたこの保護されたポリペプチドの活性によって、ラットの骨ミネラル 付加速度は、配列番号１、配列番号７および配列番号９と識別された各ポリペプ チドに見られる骨ミネラル付加速度以上に増加することが判明した。 ヒスチジン残基およびシステイン残基は、触媒酵素なしでアスパラギニル含有 ポリペプチドおよびアスパラチル含有ポリペプチドを分解することができること が報告されている(Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ.、４ ５巻、５４７頁、５５３頁、１９９５年)。以下の配列番号９と識別されたポリ ペプチドのアナログを、その安定性および骨ミネラル付加速度について試験した 。 様々な条件下で試験した安定性に関しては、配列番号２５および配列番号２６ と識別されたポリペプチドが、配列番号９、７および２４と識別されたポリペプ チドより安定であることが判明した。配列番号２７と識別されたポリペプチドは 、配列番号が７、９、２４、２５および２６であるいずれのポリペプチドより安 定性が劣ることが判明した。 配列番号２４、２５、２６および２７と識別されたポリペプチドはいずれも、 対照ラットで観察される骨ミネラル付加速度に比べ、はるかに骨ミネラル付加速 度を増加させることが判明した。 末端アミノ酸残基が保護されていない、配列番号２５、２６および２７に対応 するポリペプチド配列を、本明細書ではそれぞれ配列番号２８、２９および３０ とする。 さらに、成分アミノ酸の側鎖に基づく全体的な電荷パターンは、配列番号９、 ２４、２５、２６および２７と識別された１０−アミノ酸配列の活性に重要であ ることが、一連の置換によって判明した。 アステリスクで示した各側鎖の場合、その側鎖は、生理的条件下では充分にイオ ン電荷を帯びていない。 配列番号３４、３５、３６、３７および３８である、電荷を帯びた側鎖を有す る各アミノ酸の代わりにアラニンを置換したポリペプチドは、骨刺激活性が欠如 しているか、または全体的な電荷パターンと空間的配置が充分保持されている一 群の化合物に比べて骨刺激活性が実質的に低いことが判明した。一方、２番目、 ３番目、６番目および７番目のアミノ酸配列をアラニン（または親配列である配 列番号９ではアラニンである７番目のアミノ酸の場合はグリシン）で置換した配 列では、骨刺激活性が大部分保持されていた。 ９番目のアミノ酸であるシステインをチロシンで置換したポリペプチド（配列 番号４３）は、骨刺激活性をある程度有していることが判明した。 したがって、本発明は、配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供され るアミノ酸側鎖電荷の電荷パターンを有するポリペプチドに由来する、哺乳動物 で骨刺激活性を有する化合物を含む。この化合物の主鎖は、配列番号９に対応す るアミノ酸配列のペプチド主鎖によって提供される主鎖と実質的に等配電子であ ることが好ましい。ある特定の態様においては、この化合物はポリペプチドそれ 自体である。 ある特定の態様、例えば、配列番号２４、２５、２６、２７、３９、４０およ び４１と識別されたポリペプチドにおいては、化合物の電荷パターンは本質的に 、配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供される電荷パターンから成る 。すなわちその化合物は、配列番号９のアミノ酸側鎖の順で、かつ配列番号９の アミノ酸側鎖と同じ空間的配置で側鎖電荷を帯びており、その他のアミノ酸は含 まない。本発明は、哺乳動物で骨刺激活性を保持する、配列番号９に対応する配 列の置換基を有する化合物を含む。 別の態様においては、本発明は、哺乳動物で骨刺激活性を有し、哺乳動物で配 列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷分布を有し 、配列番号１と識別された親配列との配列相同が最高約８３％である化合物を含 む。本発明は、哺乳動物で骨刺激活性を有し、哺乳動物で配列番号９と識別され たアミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷分布を有し、配列番号９の２ 番目、 ３番目、６番目、または９番目に少なくとも１個の非保存性置換を含んでいるポ リペプチドも含む。 本発明は、（ａ）配列番号１のＮ末端から、１個から約４個のアミノ酸を欠失 したか、（ｂ）配列番号１のＣ末端から、１個から約２２個のアミノ酸を欠失し たか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１に対応するアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体を含む。対応して 、本発明は、（ａ）配列番号３のＮ末端から、１個から約４個のアミノ酸を欠失 したか、（ｂ）配列番号３のＣ末端から、１個から約２２個のアミノ酸を欠失し たか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号３に対応するアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体を含む。ポリペプ チドおよびタンパク質における配列の相同性については、例えばＭｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈ．Ｌｏｄｉｓｈ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ，Ａ．Ｂｅｒｋ，Ｓ．Ｌ．Ｚｉｐｕｒｓｋｙ，Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａおよび Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、 ニューヨーク市，第３版，１９９５年）で論じられている通りであり、当業者な らば理解するであろう。同様に、本発明は、（ａ）配列番号４のＮ末端から最高 約４個のアミノ酸を欠失したか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から最高約１６個の アミノ酸を欠失したか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号 ４に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体 を含む。本発明は、（ａ）配列番号５のＮ末端から最高約４個のアミノ酸を欠失 したか、（ｂ）配列番号５のＣ末端から最高約１１個のアミノ酸を欠失したか、 もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号５に対応するアミノ酸配 列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体を含む。本発明は、（ａ ）配列番号６のＮ末端から最高約４個のアミノ酸を欠失したか、（ｂ）配列番号 ６のＣ末端から最高約５個のアミノ酸を欠失したか、もしくは（ａ）と（ｂ）両 方をかね合わせた、配列番号６に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、 または機能的に同等な同族体を含む。本発明は、（ａ）配列番号７のＮ末端から 最高約４個のアミノ酸を欠失したか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から最高約１個 のアミノ酸を欠失したか、 もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号７に対応するアミノ酸配 列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体を含む。本発明はまた、 Ｎ末端から最高約４個のアミノ酸を欠失した配列番号８に対応するアミノ酸配列 を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族体を含む。本発明は、配列番 号９に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、または機能的に同等な同族 体を含む。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９に対応するアミノ酸配列 を含む最高で約３０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同等 なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または保 護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端保 護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基( このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している)に 変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９に対応するアミノ酸配列 を含む最高で約２５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同等 なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または保 護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端保 護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基( このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している)に 変換することによって保護することができる。 別例として、本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９に対応する アミノ酸配列を含む最高で約２０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または 機能的に同等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ 基、または保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができ る。Ｎ末端保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基 をアミド基（このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合 している）に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９に対応するアミノ酸配列 を含む最高で約１５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同等 なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または保 護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端保 護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基( このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している)に 変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９に対応するアミノ酸配列 を含む最高で約１０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同等 なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または保 護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端保 護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基( このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している)に 変換することによって保護することができる。本発明は、配列番号２４に対応す るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２８に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約３０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２８に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約２５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 別例として、本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２８に対応す るアミノ酸配列を含む最高で約２０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、また は機能的に同等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミ ノ基、または保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することがで きる。Ｎ末端保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル 基をアミド基（このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結 合している）に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２８に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２８に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。本発明は、配列番号２５に対応 するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２９に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約３０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２９に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約２５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 あるいは、本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２９に対応する アミノ酸配列を含む最高で約２０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または 機能的にその等しい同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ 基、または保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができ る。Ｎ末端保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基 をアミド基（このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合 している）に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２９に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号２９に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。本発明には、配列番号２６に対 応するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号３０に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約３０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号３０に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約２５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 別例として、本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号３０に対応す るアミノ酸配列を含む最高で約２０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、また は機能的に同等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミ ノ基、または保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することがで きる。Ｎ末端保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル 基をアミド基（このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結 合している）に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号３０に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１５個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。 本発明は、哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号３０に対応するアミノ酸配 列を含む最高で約１０個のアミノ酸長を有するポリペプチド、または機能的に同 等なその同族体を含む。このポリペプチドは、保護された末端アミノ基、または 保護された末端カルボキシル基、またはその両方を有することができる。Ｎ末端 保護基はアセチル基とすることができる。Ｃ末端は、カルボキシル基をアミド基 （このとき、例えば、アミド基のアミノ窒素は２個の水素原子と結合している） に変換することによって保護することができる。本発明は、配列番号２７に対応 するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。 本発明のポリペプチドは、単一分子において活性配列が反復しているより大き いポリペプチド配列中に組み込むことが可能である。 本発明のポリペプチドは合成することができ、そのアミノ酸配列の分子量は約 １０００から４０００の範囲にある。 本発明は、別のポリペプチドを、すなわち（ａ）配列番号１（または配列番号 ３）のＮ末端から１個から約４個のアミノ酸残基が欠失したか、（ｂ）配列番号 １（または配列番号３）のＣ末端から１個から約２２個のアミノ酸残基が欠失し たか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１（または配列番 号３）に対応するアミノ酸配列を有するもう一つのポリペプチドを充分に複製し たアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのもう一つのポリペプチドをコ ードするＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリッド形成するＤＮＡによっ てコードされるような、機能的に同等なそのペプチドの同族体を含む。このポリ ペプチドは、例えば最高で約３０個のアミノ酸長とすることができ、そしてその ペプチドの配列は、より大きいポリペプチド内で反復が可能であり、または、そ れ自体は骨成長を刺激しない他のポリペプチド配列を含むこともできる。このよ うなポリペプチドは、最高で２５個、２０個、１５個または約１０個のアミノ酸 長とすることもできる。 「ストリンジェントハイブリッド形成条件」の意味は、当業者の常識の範囲の 意味である。核酸のハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェント条件、 例えば約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）などは 、当業者ならば知っているであろう。下記の例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク市、１９８９年、６．３．１〜６．３．６に載っ ているものである。第１の好適なハイブリッド形成溶液５０ｍｌは、ホルムアミ ド２４ｍｌ、２０×ＳＳＣ１２ｍｌ、２ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）０．５ｍ ｌ、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液０．５ｍｌ、脱イオン水２．５ｍｌ、５０％ デキストラン硫酸１０ｍｌおよび１０％ＳＤＳ０．５ｍｌを混合する。第２の好 適なハイブリッド形成溶液は、１％結晶性ＢＳＡ(第Ｖ画分)、１ｍＭのＥＤＴＡ 、０．５ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）および７％ＳＤＳとすることができる 。洗浄段階における塩濃度は、低ストリンジェント条件の５０℃約２×ＳＳＣか ら、高ストリンジェント条件の５０℃約０．２×ＳＳＣまでの範囲から選択され る。これら両洗浄液とも０．１％ＳＤＳを含有することができる。さらに、洗浄 段階における温度は、ストリンジェント条件が低い室温約２２℃から、ストリン ジェント条件が高い約６５℃まで上げることが可能である。より詳しくは引用文 献を見れば分かるが、適切なストリンジェント条件は相同性の程度およびプロー ブの長さによって決まる。仮に相同性が１００％であるとすれば、高温（６５℃ から７５℃）を使用することができよう。相同性が低い場合は、低い洗浄温度を 使用しなければならない。しかし、プローブが非常に短い（＜１００ｂｐ）場合 、相同性が１００％であっても低温を使用しなければならない。一般に、低温（ ３７℃から４０℃）からスタートし、オートラジオグラフィーにおいてバックグ ラウンドが主なファクターとならない程度に充分低い温度まで３〜５℃空間的配 置で温度を上げていく。 別の態様においては、本発明は、哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏ骨刺激活性を有し て、哺乳動物の骨におけるミネラル含量（すなわちカルシウム）を増加させ、配 列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して少なくとも約１９％が保存されるア ミノ酸配列を有し、さらにその配列から少なくとも１個のアミノ酸が欠失してい る合成ポリペプチド、または機能的に同等な同族体である。 本発明は、哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏ骨刺激活性を有して哺乳動物の骨におけ るミネラル含量を増加させ、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して少な くとも約２２％が保存されるアミノ酸配列を有し、さらにその配列から少なくと も１個のアミノ酸が欠失している合成ポリペプチドを含む。 本発明は、哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏ骨刺激活性を有して哺乳動物の骨におけ るミネラル含量を増加させ、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して少な くとも約２５％が保存されるアミノ酸配列を有し、さらにその配列から少なくと も１個のアミノ酸が欠失している合成ポリペプチドを含む。 本発明は、哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏ骨刺激活性を有して哺乳動物の骨におけ るミネラル含量を増加させ、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して少な くとも約２８％が保存されるアミノ酸配列を有し、さらにその配列から少なくと も１個のアミノ酸が欠失している合成ポリペプチドを含む。 本発明は、ポリペプチド配列から少なくとも６個のアミノ酸が欠失している前 記ポリペプチド、その配列から少なくとも１１個のアミノ酸が欠失している前記 ポリペプチド、その配列から少なくとも１６個のアミノ酸が欠失している前記ポ リペプチド、その配列から少なくとも２１個のアミノ酸が欠失している前記ポリ ペプチド、またはその配列から少なくとも２６個のアミノ酸が欠失している前記 ポリペプチドのいずれをも含む。 本発明は、これら合成ポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェント条 件下でハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされるような、上記合成ポリ ペプチドの１つを充分に複製したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。 また別の態様においては、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、 配列番号５、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、 配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配 列番号２９、配列番号３０と識別された配列を有する、哺乳動物で骨刺激活性を 呈するポリペプチド；そのポリペプチドのアナログであって、配列の３次元構造 に由来する哺乳動物における骨刺激活性が保存される限り、配列内のアミノ酸を 置換することも、欠失することも、または付加することもできるようなアナログ ；および上記ポリペプチドまたはそのポリペプチドアナログのそれぞれの結合体 であり、この結合体において、ポリペプチド配列が配列番号１と識別されたポリ ペプチド配列である場合には、そのポリペプチド配列から少なくとも１個のアミ ノ酸が欠失している結合体である。本発明は、骨刺激性ポリペプチドをコードす るＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリッド形成するＤＮＡによってコー ドされるような骨刺激性ポリペプチドを充分に複製したアミノ酸配列を有するポ リペプチド（または機能的に同等なその同族体）を含む。 別の態様において、本発明は、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して １９％〜９０％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列 に関して１９％〜８６％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミ ノ酸配列に関して１９％〜６９％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別さ れたアミノ酸配列に関して１９％〜５６％保存されるアミノ酸配列、配列番号１ と識別されたアミノ酸配列に関して１９％〜４２％保存されるアミノ酸配列、配 列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して１９％〜３９％保存されるアミノ酸 配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して１９％〜２８％保存される アミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して２８％〜９０％保 存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して２８％〜 ８６％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列に関して ２８％〜６９％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミノ酸配列 に関して２８％〜５６％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別されたアミ ノ酸配列に関して２８％〜４２％保存されるアミノ酸配列、配列番号１と識別さ れたアミノ酸配列に関して２８％〜３９％保存されるアミノ酸配列、または哺乳 動物で骨刺激活性を有する機能的に同等なその同族体を含むポリペプチドである 。 ポリペプチドは、本発明の一部として上述したアミノ酸配列のいずれかを含む キメラ骨刺激因子とすることができる。 本発明は、活性成分として、キメラポリペプチドをもちろん含め、本発明の一 部として上述したいずれかのポリペプチドを含む骨減少関連疾患の予防および治 療に用いる薬剤を含む。 したがって、本発明は、本発明の一部として上述したいずれかのポリペプチド を治療上有効な量有する骨成長を促進する薬剤組成物でもある。 本発明は、本発明の一部として上述したポリペプチド（またはそのポリペプチ ドを含む薬剤組成物）を治療上有効な量投与することにより哺乳動物における骨 成長を増大させる方法を含む。 本発明は、骨粗鬆症の治療、哺乳動物における骨成長の促進、または骨減少関 連疾患のヒトの治療を含む。 本発明は、骨成長の促進または骨粗鬆症の治療などにおいて用いられる薬剤の 調製における、本発明のいずれかのポリペプチドによる配列を有するポリペプチ ドの使用を含む。 本発明は、本発明のポリペプチドの存在を判定するための診断キットであって 、所定量のポリペプチド（または複数のポリペプチド）と抗体とが結合したとき に検出可能な反応を生じるレポーター系に連結されたポリペプチド（または複数 のポリペプチド）に対する抗体を含む診断キットを含む。 本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を含む。詳しくは、本発明は 、ポリペプチドを用いて抗体を合成するときに、このようなポリペプチドに結合 する抗体を含む。 本発明は、本発明のポリペプチドに関連した単離ヌクレオチド配列などの分子 を含む。例えば、本発明は、本発明のいずれかのポリペプチドの発現をコード化 する単離ＤＮＡフラグメントを含む。このようなフラグメントは、遺伝子コード の縮重ゆえに互いに異なることが可能であることはもちろん言うまでもない。さ らに、本発明は、このようなＤＮＡ配列のいずれかを組み込んだベクターを含む 。 本発明は、本発明のいずれかのアミノ酸配列またはそのアナログをコードする 単離ＤＮＡ配列であって、そのアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいてその 配列の三次元立体配座に由来する哺乳動物での骨刺激活性が保存されるかぎり、 配列中のアミノ酸は置換、欠失、または付加されることが可能である単離ＤＮＡ 配列；このＤＮＡとハイブリッド形成しかつ哺乳動物において骨刺激活性を示す ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列；および遺伝子コードの縮重ゆえ にその配列とは異なるＤＮＡを含む。 したがって、本発明は、ａ）このようなポリペプチドをコードするヌクレオチ ド配列を含むＤＮＡフラグメントを調製すること、ｂ）発現ベクターにこのＤＮ Ａフラグメントを組み込んで、このＤＮＡフラグメントを含みかつ複製可能であ る組換えＤＮＡフラグメントを得ること、ｃ）宿主細胞を組換えＤＮＡフラグメ ントで形質転換して、ポリペプチドを発現できる形質転換体を単離すること、ｄ ）形質転換体を培養することによって、形質転換体がポリペプチドを産生するこ とを可能にすると共に、得られた培養混合物からポリペプチドを回収することを 含む方法を含む、本発明のいずれのポリペプチドを生成する方法を含む。 図面の簡単な説明 以下の説明において、添付した図面を参照する。 図１は、上皮小体摘除術を施されたラットに体内移植することにより、化学的 に合成したヒトＮ−アセチル（Ｎ末端）ポリペプチド（配列番号２）を投与した ラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している。誤差バ ーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）をグラフで示している。ｐ値は０．００１未満 であった。 図２は、４週間にわたり処置したラットの右大腿骨のカルシウム密度をグラフ で示している。Ａ群のラットには、卵巣摘除術を施し、化学的に合成した通常の ペプチド（配列番号１）を毎日注射した。Ｂ群のラットには、卵巣摘除術を施し 、対照溶液を毎日注射した。Ｃ群のラットには、疑似(sham)卵巣摘除術を施し、 対照溶液を毎日注射した。Ｄ群は手術を施さないラットであり、対照溶液を毎日 注射した。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）をグラフで示している。 図３は、図２に関連して記載した処置の後に、テトラサイクリン標識によって 測定したラットの骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している。誤差 バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）をグラフで示している。 図４は、８週間にわたり処置したラットの大腿骨カルシウム濃度をグラフで示 している。Ａ群のラットには卵巣摘除術を施し、手術８週間後から化学的に合成 した通常のペプチド（配列番号１）を毎日注射した。Ｂ群のラットには同様に卵 巣摘除術を施し、対照溶液を毎日注射した。Ｃ群のラットには疑似卵巣摘除術を 施し、対照溶液を毎日注射した。Ｄ群には手術を施さず、対照溶液を毎日注射し た。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）をグラフで示している。 図５は、テトラサイクリン標識によって測定した、手術を施さなかったラット の骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している。Ａ群のラットは、化 学的に合成した通常のペプチド（配列番号１）に対するウサギ抗体で処置した。 Ｂ群のラットは、同じ抗体およびポリペプチド自体で処置した。Ｃ群は対照群で ある。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）をグラフで示している。 図６は、ヒトの化学的に合成したポリペプチド（配列番号１）およびＣｙｓ− Ａｌａ置換を含む同じポリペプチド（配列番号３）のトリシンＳＤＳ電気泳動ゲ ルをグラフで示している。 図７は、化学的に合成したヒトのポリペプチド（配列番号１）(Ａ群)、化学的 に合成したヒトのポリペプチド（配列番号３）(Ｂ群)、および対照（Ｃ群）を注 射したラットにおける骨ミネラル付加速度(μｍ／日)をグラフで示している(す べての群で数＝８)。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）を示している。 図８は、Ｎ末端化学的合成ポリペプチド配列番号１(Ａ群)、配列番号７(Ｂ群) 、配列番号６(Ｃ群)、配列番号５(Ｄ群)、および配列番号４（Ｅ群）を注射した ラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している(すべて の群で数＝６)。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）を示している。 図９は、化学的に合成したポリペプチドである配列番号８（Ｆ群）および配列 番号９（Ｇ群）を注射したラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグ ラフで示している。 図１０は、走査領域である近位端Ａ、骨幹部Ｂおよび遠位端Ｃを示すラット右 大腿骨のＤＥＸＡ画像である。 図１１は、走査した頚部を示すラット右大腿骨のＤＥＸＡ画像である。 図１２は、非Ｎ末端化学的合成ポリペプチドフラグメントである配列番号１( Ｈ 群)、配列番号１６(Ｉ群)、配列番号１５(Ｊ群)、配列番号１４(Ｋ群)、ならび に配列番号１０、１１、１２および１３（Ｌ群）を注射したラットにおける骨ミ ネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している(すべての群で数＝６)。誤差 バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）を示している。 図１３は、化学的に合成したポリペプチドフラグメントである配列番号１(Ｎ 群)、配列番号７(Ｏ群)、配列番号９(Ｐ群)、および配列番号２４(Ｑ群)、なら びに対照群（Ｍ群）を注射したラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／日） をグラフで示している。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）を示している。 図１４は、化学的に合成したポリペプチドフラグメントである配列番号２５( Ｓ群)、配列番号２６(Ｔ群)、配列番号２７(Ｕ群)、および配列番号２４(Ｖ群) 、ならびに対照群（Ｒ群）を注射したラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ ／日）をグラフで示している。誤差バーは、±１標準偏差（Ｓ．Ｄ.）を示して いる。 図１５は、化学的に合成したポリペプチドである配列番号２４(Ａ群Ａ)、配列 番号３４(ＢＢ群)、配列番号３５(ＣＣ群)、配列番号３６(ＤＤ群)、配列番号３ ７(ＥＥ群)、および配列番号３８（ＦＦ群）を注射したラットにおける骨ミネラ ル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している。グラフの第１のバーは対照群で ある。誤差バーは、±１Ｓ．Ｅ．を示している。 図１６は、化学的に合成したポリペプチド配列番号３４(Ｂ群Ｂ、(■))、配列 番号３５(ＣＣ群、(▲))、配列番号３６(ＤＤ群、(▼))、配列番号３７(ＥＥ群 、(◆))および配列番号３８（ＦＦ群、(六角)）を注射したラットにおける骨ミ ネラル付加速度（μｍ／日）の用量依存性をグラフで示している。誤差バーは、 ±１Ｓ．Ｅ．を示している。 図１７は、化学的に合成したポリペプチドである配列番号３９(ＧＧ群)、配列 番号４０(ＨＨ群)、配列番号４１（ＩＩ群）および配列番号４２（ＪＪ群）を注 射したラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／日）をグラフで示している。 誤差バーは、±１Ｓ．Ｅ．を示している。 図１８は、配列番号４３（ＫＫ群）と識別されたアミノ酸配列を有する化学的 に合成したポリペプチドを注射したラットにおける骨ミネラル付加速度（μｍ／ 日）をグラフで示している。誤差バーは、±１Ｓ．Ｅ．を示している。 図１９は、試験した種々のポリペプチドのアミノ酸配列を示し、中央線の上方 には活性ポリペプチドを示し、中央線の下方には骨成長の刺激が認められなかっ た配列を示している。 方法 国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ９４／００１４４の一般的な方法の項に記載さ れた適用できる方法に従った。 Ｎ末端にアセチルを有する化学的に合成したポリペプチド（配列番号２）に関す る毒性実験 ０．１％酢酸中のＮ末端アセチル基を有する化学的に合成したペプチド（配列 番号２）約１．５ｍｌを小型浸透ポンプ（アルゼット(Ａｌｚｅｔ)）に入れて、 約２５μｇ／日の算定日量を投与した。７日前に上皮小体摘除術を施した５匹の ラットの左側胸部の背側部皮下筋膜の下にポンプを埋め込んだ。同様に上皮小体 摘除術を施した５匹のラットに、０．１％酢酸のみを含む類似の挿入管を埋め込 んだ。上皮小体摘除術を施さなかった５匹のラットも対照として用いた。 ２８日後、前述した通りに埋め込んだ各ラットの右大臀筋に塩酸テトラサイク リン水溶液０．５ｍｌを筋肉内注射した。更に４８時間後、塩酸テトラサイクリ ン溶液の第２回目の注射を行った。更に２４時間後にラットを屠殺した。 埋め込みを施された１０匹の各ラットの右大腿骨の下部骨幹端の断面の検査に よって、骨ミネラル付加速度（μｍ／日）を測定した。結果を表１にまとめてあ り、それを図１にグラフで示す。 表１に示した各群の５匹のラットの選択した組織の組織学的評価を顕微鏡で行 った。毒性障害の証拠はみとめられなかった。 卵巣摘除術を施したラットと化学的に合成した通常のポリペプチド(配列番号１) に関する実験、４週間にわたる投与 １ｍｇのバルビツール酸ナトリウムを腹腔内投与（Ｉ．Ｐ.）して鎮静させた ６匹の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに卵巣摘除術を施した。６匹の 第２のラット群に疑似手術を施した。手術から快復させるために２週間だけ間を おいた。 卵巣摘除術を施した６匹のラットに、２８日間にわたり２４時間ごとに１００ μｇの化学的に合成したペプチド（配列番号１）を含有する０．１％酢酸溶液１ ００μｌを皮下注射した。２５日目に、塩酸テトラサイクリン溶液を各ラットに 筋肉内注射して、前述した通り体重Ｋｇあたり２４ｍｇを投与した。２７日目に 、塩酸テトラサイクリンの２回目の注射を行い、２８日目にラットを屠殺した。 卵巣摘除術を施した第２の群の６匹のラットを、同じ２８日間にわたりペプチ ドを含まない０．１％酢酸溶液で同様に処置した。それぞれ疑似手術した第３の 群の６匹のラットを、同じ２８日間にわたりペプチドを含まない０．１％酢酸溶 液で同様に処置した。卵巣摘除術を施さなかった第４の群の６匹のラットを、同 じ２８日間にわたりペプチドを含まない０．１％酢酸溶液で同様に処置した。 心臓穿刺によって死後血を採取し、分析するまで血清を凍結させた。各ラット で全身解剖を実施した。ポリペプチドで処置したラットで病的作用は認められな かった。 軟組織から各右大腿骨を切断し、２日間固定し、７０ｋｖで１分間、２分間、 および３分間、Ｘ線に曝露した。３分間曝露すると、最も満足な結果が得られた 。 ペプチドで処置せず、卵巣摘除術を施した第２の群のラットの大腿骨の骨密度は 、明らかに低かった。 別に、各ラットの右大腿骨から石灰質を除いた。石灰質除去液は、１０％ギ酸 （Ｖ／Ｖ）と５％クエン酸ナトリウム（Ｗ／Ｖ）を含み、ｐＨ３であった。各骨 を６ｍｌの石灰質除去液に入れた。液を４日後に取り替え、更に４日後に再び、 更に２日後に再び、更に３日後に再び取り替えた。更に２日後、石灰質除去液を 除去し、脱イオン水に取り替え、試料を２日間攪拌した。水を２日後に変え、更 に１日後に再び変えた。更に１日後に、各ラットのすべての液体試料を混合して 、それぞれの最終体積を脱イオン水で５０ｍｌに調節した。 骨を水に浸漬したときに変位した水の体積を測定することにより、各右大腿骨 の体積を測定した。各試料のカルシウム濃度を標準法に準拠して測定し、各骨の カルシウム濃度を計算した。結果を表２に示し、図２にグラフで示した。表２お よび図２から分かるように、ペプチド（配列番号１）で処置し、卵巣摘除術を施 したラットで測定した骨カルシウム濃度は、正常であるように思われる一方、処 置をしない、卵巣摘除術を施したラットでは骨のカルシウム濃度が低下していた 。 左大腿骨の下部骨幹端の測定によって、骨ミネラル付加速度を前述のように測 定した。結果を表３に示し、図３にグラフで示した。 卵巣摘除術を施したラットと化学的に合成した通常のポリペプチドに関する実験 、８週間にわたる投与 卵巣摘除術８週間後に、卵巣摘除術を施した５匹のラットにＮ末端アミノ基を アセチル基で修飾した化学的に合成したペプチド（配列番号２）１００μｇを含 有する０．１％酢酸溶液を１００μｌ皮下注射した。これは、８週間にわたり２ ４時間ごとに行った。５４日目に、塩酸テトラサイクリン溶液を各ラットの右大 臀筋に筋肉内注射して、前述した通り体重Ｋｇあたり２４ｍｇを投与した。５６ 日目に、塩酸テトラサイクリンの２回目の注射を行い、ラットを５７日目に屠殺 した。 卵巣摘除術を施された第２の群の７匹のラットを、同じ期間にわたりペプチド を含まない０．１％酢酸溶液で同様に処置した。それぞれ疑似手術した第３の群 の５匹のラットを、同じ期間にわたりペプチドを含まない０．１％酢酸溶液で同 様に処置した。卵巣摘除術を施さなかった第４の群の５匹のラットを、同じ８週 間にわたりペプチドを含まない０．１％酢酸溶液で同様に処置した。第２の群の ２匹のラットは８週間の間に病気になり、それらを早期に屠殺した。 心臓穿刺によって死後血を採取し、分析するまで血清を凍結させた。各ラット で解剖を実施した。ラットでは、卵巣摘除術を施したラットの子宮および膣の外 科的瘢痕および萎縮以外に、明らかな病理所見は認められなかった。 右大腿骨から石灰質を除き、前の通りカルシウム濃度を測定した。結果を表４ に示し、図４においてグラフで示した。 化学的に合成したタンパク質（配列番号１）に対する抗体の合成 化学的に合成したタンパク質（配列番号１）を、以下に示す３種の異なった架 橋剤でＫＬＨ（キーホールカサガイヘモシアニン）に結合させた。 グルタルアルデヒド結合 ２．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１３８ｍＭのＮａＣｌ、８． １ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄からなる２．５ｍｌのＰＢＳ溶液中に、５ｍｇのペプチド （配列番号１）を希釈して、２ｍｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度を得た。１０ｍｇ のＫＬＨを５．０ｍｌのＰＢＳ中に希釈して、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。 １．２５ｍｌのペプチド溶液を１．２５ｍｌのＫＬＨ溶液に添加した。グルタル アルデヒドを添加して、０．２５％の最終濃度とした。得られた溶液を室温で１ 時間攪拌した。攪拌後、１リットルのＰＢＳに対して溶液を透析した。ＰＢＳを ３回取り替えた。 カルボジイミド（ＥＤＣ）結合 ペプチドおよびＫＬＨ溶液を前項に記載した通り調製した。１．２５ｍｌのペ プチド溶液を１．２５ｍｌのＫＬＨ溶液に添加した。得られた溶液に２．５ｍｇ のＥＤＣを添加した。溶液を室温で４時間絶えず攪拌し、次いで１リットルのＰ ＢＳに対して透析した。ＰＢＳを３回取り替えた。 Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ） 結合 ５ｍｇのペプチドを５００μｌのＨ₂Ｏに添加し、ＮａＯＨでｐＨを８．５に 調節し、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。無水シトラコン酸をＨ₂Ｏ中に希釈 して、１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。５００μｌの無水物溶液を、各添加間にお いてｐＨを８．５に調節するときに１００μｌのペプチド溶液に添加した。次い で、溶液を室温で１時間絶えず攪拌した後、１００μｌの１Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液(ｐＨ７．２)、その後、９００μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．２）を添加した。スルホ−ＭＢＳをＨ₂Ｏ中に希釈して２５ｍｇ／ｍ ｌの濃度とし、この溶液４００μｌをペプチド溶液に添加して、約５ｍｇ／ｍｌ のＭＢＳ濃度を得た。この溶液を室温で３０分間絶えず攪拌した。６μｌのβ− メルカプトエタノールを添加して、３５ｍＭの最終β−メルカプトエタノール濃 度とした。この溶液を室温で１時間絶えず攪拌した。ＫＬＨを３ｍｇ／ｍｌでＰ ＢＳに溶解し、２．５ｍｌをペプチド溶液に添加した。この溶液を室温で３時間 絶えず攪拌し、次いで１リットルのＰＢＳに対してこの溶液を透析した。ＰＢＳ を３回取り替えた。最終ペプチド濃度は約１ｍｇ／ｍｌであり、最終ＫＬＨ濃度 は約１．５ｍｇ／ｍｌであった。 抗体の産生 以下のように、ウサギに合成ペプチド溶液を注射した。各２５０μｌのグルタ ルアルデヒド結合ペプチド溶液およびＥＤＣ結合ペプチド溶液を一緒に５００μ ｌのフロイントアジュバントと混合した。この溶液をウサギの後脚に脚当たり５ ００μｌ筋肉内注射した。注射したペプチドの総量は０．５ｍｇであった。ＭＢ ＳでＫＬＨに結合された５００μｌの合成ペプチドを５００μｌのフロイントア ジュバントと混合した。この溶液をもう１匹のウサギの後脚に脚当たり５００μ ｌ筋肉内注射した。注射したペプチドの総量は０．５ｍｇであった。 合成ペプチドを１．５μｇと４μｇで２レーンのゲル（１８％流動、５％堆積 ）上に載せた。ゲルを３０Ｖで一晩ブロットし、ＰＢＳ中３％ミルクでブロック した。ゲルを１％ミルク／ＰＢＳ中で１：２５０に希釈したウサギ血清とともに 一晩インキュベートし、続いて１：１０００に希釈したヤギ抗ウサギアルカリ性 ホスファターゼとともに１時間インキュベートした。次いで、ゲルを基質で展開 させた。合成ペプチドは、クーマシーブルー染色により認められた。ペプチドは 、各ウサギの２回目の出血で検出されたが、いずれのウサギの免疫する前の血清 では検出されなかった。 固定化ペプチドと血清抗体との間の相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を 用いる表面プラズモン共鳴で更に検討した。合成ペプチドは、アミンの結合によ ってデキストランマトリックス上に共有結合で固定化された。異なった希釈度の ウサギ血清を５分間表面に注入し、固定化ペプチドに結合した抗体の量を測定し た。タイターは、陽性反応、すなわち、５０共鳴単位より大きい反応が得られる 血清の最終希釈と定義する。この方法を用いて、両方のウサギからの血清中に抗 体が存在することが判明し、そしてペプチドとともに血清をプレインキュベート することにより相互作用を阻止することができる。ウサギの血清中の抗体は、固 定化された無関係のペプチドと相互作用しないことが判明した。 ラットと化学的に合成したペプチドに対する抗体に関する実験 ｐＨ７．４の１０ｍＭのトリスＣｌ中に抗体血清を調製した。５匹の各ラット に、左大臀筋に注射することにより１００μｌの溶液を投与した。第２の群の５ 匹の各ラットを同様に処置したが、４５μｇのポリペプチド（配列番号１）を含 有する溶液を右大臀筋にさらに注射する処理をした。第３の群の５匹の各ラット に、ｐＨ７．０の１０ｍＭのトリスＣ１１０μｌを注射した。 次いで、１５匹の各ラットに、体重Ｋｇあたり２４ｍｇの量で塩酸テトラサイ クリンを前述のように注射した。約４８時間後に塩酸テトラサイクリンの２回目 の注射を行った。約２４時間後にラットを屠殺した。 下方の右大腿骨幹端を前述のように測定して、骨ミネラル付加速度を測定した 。結果を表５および図５に示した。 したがって、抗体が結合するポリペプチドの検出に使用するために、ポリペプ チドに対する抗体を用いた方法および製品を開発することができる。例えば、抗 体に対するポリペプチドの明確な結合を示すために設けた既知のいくつかのレポ ーター系のいずれかに抗体を連結または共役結合させることができる。既知のレ ポーター系には、放射性免疫測定法（ＲＩＡｓ）または免疫放射定量測定法（Ｉ ＲＭＡｓ）が含まれる。あるいは、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）は、 ＲＩＡｓおよびＩＲＭＡｓと共通して相対的に高い感度を有するであろうが、一 般に、放射性同位元素の使用に依存しないであろう。可視的に検出可能な物質は 、製造することができるか、または分光光度計で検出可能な少なくとも１つのも のでありうる。アッセイされる酵素が結合する物質の蛍光に依存するアッセイを 用いることができた。本発明では、特定のポリペプチドの存在を検出するために 用いることができる多くのレポーター系があることが理解されるであろう。標準 化された試料収集および処理により、血清中の閾量を超える量のポリペプチドの 存在を充分に測定することができた。 化学的に合成したヒトポリペプチド（配列番号１）に対する抗原反応に基づく このような方法を開発することができ、次いで前述のようなアミノ酸の置換、欠 失および付加（および結合）で得られたポリペプチド変化体を潜在的な骨刺激因 子としてプレスクリーニングすることができた。既知のペプチドに対する抗体と 陽性反応するペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの骨刺激効果を、例えば、本明細書に 記載したシステムをラットに用いて試験することができた。 対象者の血清が不足量のポリペプチドしか含んでいないか否かを判定する方法 において、このような抗体結合レポーター系を用いることができた。したがって 、所定タイプの対象者血清中のこのようなポリペプチドの通常の閾濃度を考慮に 入れて、試験用キットを開発することができた。 システイン−アラニン置換を含む化学的に合成したヒトポリペプチドに関する実 験 アラニンが１３位のシステイン残基と置換することによって得られる、化学的 に合成したペプチド（配列番号１）の修飾配列（配列番号３）を標準的な化学的 手順によって調製した。アラニン残基は、ポリペプチドの自発的な二量体化を不 可能する、還元されたシステイン残基に立体的に類似している。修飾および未修 飾（通常の）ペプチドのトリシンＳＤＳ電気泳動ゲルを図６に示した。 体重が２９５ｇと３２０ｇ間の６匹のラットの３群で実験を行った。０．１％ 酢酸中で修飾ペプチド（配列番号３）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。０．１％ 酢酸中で通常のペプチド（配列番号１）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。第１の 群の各ラットの右大腿に０．１ｍｌの修飾ペプチド溶液を皮下注射した。同様に 、第２の群の各ラットに０．１ｍｌの通常のペプチド溶液を皮下注射した。対照 群である第３の群の各ラットに０．１ｍｌの０．１％酢酸溶液を注射した。これ らの注射後直ちに、０．５ｍｌの水に溶解した２４ｍｇ／Ｋｇ体重の塩酸テトラ サイクリンを各ラットに筋肉内注射した。４８時間後に塩酸テトラサイクリンの ２回目の投与を行った。２回目の投与から２４時間後にＣＯ₂麻酔により動物を 屠殺した。右大腿骨の下部骨幹端を切断し、酢酸塩緩衝液でｐＨ７．２に緩衝し たホルムアルデヒドの１０％水溶液中で固定した。骨切片を上述のような測定の ために作成した。 結果を表６に示し、図７にグラフで示した。それらから分かるように、修飾ポ リペプチドを注射したラットでの骨付着率は、対照群より非常に高いが、通常の ペプチドを注射したラットの骨付着率より低かった。 ３６個のアミノ酸のヒトポリペプチド活性フラグメントに関する実験 配列番号４、５、６、７、８および９と識別されたアミノ酸配列を有するポリ ペプチドを既知の化学的手順によって合成した。 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを試験動物として用いて、上述のように 骨ミネラル付加速度を測定した。体重が２８０〜３８０ｇの間の雄ラットに、１ 週間馴化させた後に皮下注射した。動物当たり約２５ｎｍｏｌのポリペプチドの 投与量を得るための濃度で調製した２００μｌの０．１％酢酸試験溶液を各動物 に注射した。各試験投与後直ちに、２４ｍｇ／体重Ｋｇの塩酸テトラサイクリン を筋肉内注射した。４８時間後にテトラサイクリンの２回目の注射を行った。 対照群：０．１％酢酸溶液 同様であるがもう１組の実験において、以下の化学的に合成したポリペプチド を用いて骨ミネラル付加速度を試験した。 骨ミネラル付加速度を、前述のように、右大腿骨の下部骨幹端の測定によって 測定した。２組の実験において得た結果を表７および表８にまとめ、図８および 図９にグラフで示した。それらから分かるように、試験したすべてのポリペプチ ドは骨付着率に陽性の効果を奏した。すなわち、骨刺激活性を示した。 配列番号７に関する骨カルシウム含量実験 配列番号７と識別されたポリペプチドを用いて更に一組の実験を実施して、ラ ットに投与したときの骨カルシウム含量に及ぼすポリペプチドの効果を測定した 。 卵巣摘除術を上述のようにラットに施した。２５ｎｍｏｌのポリペプチドを含 有する０．１％酢酸溶液を実験期間中に毎日各ラットに皮下投与した。１群のラ ットでは、卵巣摘除術１００日後から１２週間処置した。別のラット群では、卵 巣摘除術８週間後から８週間処置した。処置期間の終わりにラットを屠殺し、切 断し、骨無機質含量の死後評価を実施した。 腰椎Ｌ１−Ｌ４をパワーナイロンブラシで洗浄して、付着していた筋を除去し た。これらの腰椎を腹側を下にしてポリプロピレン容器内の蒸留水の３ｃｍ下に 置き、二重エネルギーＸ線吸光光度計(ＤＥＸＡ)、Ｈｏｌｏｇｉｃ１００によっ て走査し、グラム単位でカルシウム含量を測定した。各ラットの右大腿骨も無傷 で切断し、パワーナイロンブラシで付着していた筋を除去した。背面を下にして 蒸留水の３ｃｍ下に置いてＤＥＸＡによってそれを走査した。図１０および１１ に示したように、大腿骨の４領域、近位端Ａ、骨幹部Ｂ、遠位端Ｃ、および頸部 Ｄを走査した。吸収に基づくとともに機械の内部標準を用いて、大腿骨の４領域 において、グラム単位での骨無機質（すなわち、カルシウム）含量を評価した。 結果を表９〜１８に示した。 表に示したデータから分かるように、ｉｎ ｖｉｖｏでのカルシウム骨含量の増 加は大腿骨頚部および大腿骨幹部において最も明らかであり、このことは投与さ れたペプチドの効果が部位特異性であり得ることを示唆しており、この効果は機 械的応力下にある骨格部位においてより大きいものである可能性があることを示 唆している。 ３５個のアミノ酸のヒトポリペプチドの他のフラグメントに関する実験 通常のポリペプチド（配列番号１）のポリペプチドフラグメントも合成し、Ｃ 末端フラグメントと同様にその骨刺激活性を試験した。 対照群：０．１％酢酸 右大腿骨の下部骨幹端の測定によって骨ミネラル付加速度を再度測定した。得 られた結果を表１９にまとめ、図１２にグラフで示した。図１２から分かるよう に、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６と識別された非Ｎ 末端変化体は、対照に比べて骨付着率の増加が見られなかった。 配列番号９の１０個のアミノ酸配列を有するが、両末端が保護されているポリ ペプチドを合成し、配列番号１、７および９と識別されたポリペプチドと比較し て、その骨刺激活性を試験した。保護されたポリペプチドは、アミノ末端がアセ チル化され、かつカルボキシ末端がアミド化されており、本明細書では配列番号 ２４と識別された。動物の体重Ｋｇ当たり約１２５ｎｍｏｌのポリペプチドを用 い、上述の実験手順にしたがって得られた結果を表２０および図１３に示した。 ポリペプチド中にヒスチジンおよびシステイン残基が存在することにより、触 媒酵素がない状態で、アスパラギニル含有ポリペプチドおよびアスパルチル含有 ポリペプチドの分解をもたらすことが可能であるという文献報告がある(Ｉｎｔ ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５，１９９５，５４７，５ ５３)。配列番号９と識別されたポリペプチドの類似化合物を以下のように合成 した。 配列番号７および２４と識別された配列を有する各ポリペプチドを５ｍＭの酢 酸に溶解して最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、３７℃においてインキュベートした 。ペプチド組成物は、長さ５７ｃｍ、内径７５μｍのキャピラリーでランニング バッファーとしてｐＨ２．５のリン酸ナトリウム５０ｍＭを用いるＰ／ＡＣＥ６ ０００システム（ベックマン(Ｂｅｃｋｍａｎ)）での毛細管電気泳動により、毎 週分析した。インキュベーションしたペプチド（２０μｌ）を８０μｌのランニ ングバッファーで希釈し、Ｐ／ＡＣＥ上に注入する前に、２０秒間圧力を利用し て５００μｌのバイアルに入れた。インキュベートしたペプチドを３０ｋＶで１ ５分間の電気泳動した後、２回目の運転は、対照として新たに溶解したペプチド を用いて２回目の泳動を行った。 分析結果によれば、供試した各ポリペプチドは修飾された。質量分光分析の結果 （図示せず）によれば、両方のペプチドがより小さなフラグメントに分解された 。すなわち、タンパク質加水分解を受けた。 各ポリペプチドを、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ３．０、２０ｍＭ酢酸アン モニウムｐＨ４．０、２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．０、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．５、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、２０ｍＭ酢酸アンモニウム ｐＨ８．５、または２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ９．５に溶解し、最終濃度を １ｍｇ／ｍｌとした。ペプチドは３７℃でインキュベートし、先に説明したＰ／ ＡＣＥ上での分離によって週に１度、検定した。何点かの試料をＲＰ−ＨＰＬＣ によって分離し、分離されたピークを質量分光分析にかけた。 分析結果によれば、配列番号２４と識別されたポリペプチドはｐＨ約４．５で 最も安定であった。ｐＨ６．０を超えるｐＨでインキュベートすると、このペプ チドは二量体化した。ｐＨ４．０未満でインキュベートするとこのペプチドは分 解した。配列番号７と識別されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも同様の安 定性プロファイルを有していた。 配列番号２４と識別された保護されたポリペプチドを、２０ｍＭまたは２５０ ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４．５に溶解し、最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。い くつかの実験ではこの緩衝液に、２０ｍＭ ＥＤＴＡを補った。次いでこのペプ チド溶液を、−７０℃、−２０℃、４℃、または室温（２２℃）でインキュベー トした。試料は、先に説明したＰ／ＡＣＥ上での電気泳動、および／またはＲＰ −ＨＰＬＣによって週に１度、検定した。 分析結果によれば、このペプチドは、粉末として、およびｐＨ４．５緩衝液に 溶解したときに非常に安定である。室温でインキュベートしたペプチドの修飾は ７日後に、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム上で元のままのペプチドの前に溶離す るピークとして観測された。ペプチドの修飾は、２０ｍＭ ＥＤＴＡの添加、ま たは２５０ｍＭ酢酸アンモニウム中でのインキュベーションによっては変更され なかった。４℃、−２０℃、または−７０℃でインキュベートした溶解ペプチド は、−７０℃で保存した乾燥ペプチドと比較して変化はなかった。室温インキュ ベーション１４日後、ＨＰＬＣのプロファイルは、７日目に観測された２つのピ ークに加えて、元のままのペプチドよりも大きな保持時間を有する追加のピーク を含んでいた。室温でインキュベートした溶解ペプチドは、時間の経過とともに 修飾され続けたが、明らかに、２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した低濃度の塩緩衝液 中で最も安定であった。その他の温度でのペプチドのインキュベーションでは、 −７０℃で最長２８日間保管した乾燥ペプチドと比較して、ＨＰＬＣプロフィー ルにあまり変化はなかった。 配列番号２５、２６および２７と識別されたアミノ酸配列を有するポリペプチ ドの安定性を先に説明した方法で試験した。 配列番号２７を有するポリペプチドは、３７℃で３日間インキュベートしたと き、試験した全てのｐＨで不安定であることが分かった。多数の追加ピークがそ の電気泳動図上に観察された。配列番号２５を有するポリペプチドは、ｐＨ２． ５〜３．０で２０日間、安定であった。３７℃でインキュベートしたとき、配列 番号２６を有するポリペプチドはｐＨ２．５〜３．０で安定であることが分かっ た。 一般に、配列番号７および２４と識別されたアミノ酸配列を有するポリペプチ ドは、希酸に溶解すると、時間の経過とともに分解した。これらのペプチドは、 ｐＨ４．５の緩衝液に溶解したときに最も安定であることが分かった。アナログ である配列番号２５および２６は、配列番号７または２４よりも安定であること が分かった。一方、配列番号２７はこれらよりもかなり不安定であることが分か った。 配列番号２５、２６および２７と識別されたアミノ酸配列を有するポリペプチ ドについて、配列番号２４と識別されたポリペプチドとの比較において骨刺激活 性を試験した。先に説明した実験手順に従って得られた結果を表２１および図１ ４に示す。 配列番号９、２４、２５、２６および２７と識別された１０個のアミノ酸配列 は、構成アミノ酸の側鎖に基づいた１つの一般的な電荷パターンを共有する。 アスタリスクによって示されたそれぞれの側鎖の場合、その側鎖は、生理学的条 件下で完全なイオン電荷を持たないと考えられる。トレオニン（２番目および６ 番目のアミノ酸）の側鎖が、極性を持つヒドロキシル基を含むことは当業者に周 知である。３番目のアミノ酸のアスパラギンも極性を持つ。７番目のアミノ酸の アラニンは相対的に非極性であると考えられる。９番目のアミノ酸のシステイン は極性を持つと考えられるが、このポリペプチドは、先に説明した分子間のジス ルフィド架橋によって自発的に二量体化すると考えられる。 一組の実験で、配列番号３４、３５、３６、３７および３８と識別されたアミ ノ酸配列を有する一連のポリペプチドを通常の手順に従って化学的に合成し、ラ ットでの骨ミネラル付加速度への影響を調べた。これらの各ポリペプチドは、配 列番号２４と識別されたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するが、電荷を持 つ側鎖を有するアミノ酸の１つがアミノ酸アラニンで置換されている。これらの 各試験では、それぞれの化合物について４匹のラット（約３００グラム）を試験 した。１００ｎｍｏｌの物質（２０ｍＭ酢酸溶液４００μｌ中）を、テトラサイ クリン（５ｍｇ／動物、水４００μｌ中）とともに、先に説明したとおり各動物 の皮下に注射した。４８時間後に、２回目のテトラサイクリン投与を実施し、投 与後２４時間して動物を屠殺した。骨ミネラル付加速度を決定するため、右大腿 骨の下部骨幹端を調べた。比較のため、酢酸溶液中に化合物を含まない対照を使 用し、配列番号２４と識別された配列を有するポリペプチドを使用した実験を実 施した。全ての場合で、試験化合物のＮ末端はアセチル化され、Ｃ末端はアミド 化されていた。得られた結果を図１５に示す。 もう一組の実験で、配列番号３４、３５、３６、３７および３８と識別された アミノ酸配列を有する一連の化合物を用いて観察された効果の用量依存性を検討 した。実験は、これらのそれぞれのポリペプチドについて３段階の投与量、すな わち１００、２００、および４００ｎｍｏｌ／動物で先に説明したとおりに実施 した。得られた結果を図１６に示す。 図１５、図１６、および図１７から分かるように、配列番号２４の１番目、４ 番目、５番目、８番目、または１０番目のアミノ酸のいずれかをアラニンで置き 換えると、骨刺激活性はかなり失われる。一方、配列番号２４の２番目、３番目 、６番目、または７番目のアミノ酸のいずれかを置き換えると、骨刺激活性はか な り保持される。 最後の実験群として、９番目のアミノ酸システインをアミノ酸チロシンで置換 したポリペプチド、配列番号４３を合成し、骨刺激活性を試験した。４匹のラッ ト（約３００グラム）に、物質１００ｎｍｏｌ（２０ｍＭ酢酸溶液４０μｌ中） を、テトラサイクリン（５ｍｇ／動物。水４００μｌ中）とともに、皮下注射で 先に説明したとおり投与した。４８時間後に、２回目のテトラサイクリン投与を 実施し、投与後２４時間して動物を屠殺した。骨ミネラル付加速度を測定するた め、右大腿骨の下部骨幹端を調べた。比較のため、酢酸溶液中に化合物を含まな い対照を使用した実験を実施した。得られた結果を図１８に示す。 図１８から分かるように、配列番号４３を有するポリペプチドを投与した動物 では、対照群に比べ、ある程度の骨刺激活性の増大が観察された。 配列番号９と識別されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから誘導される化 合物は、本発明の範囲に含まれる。この化合物群には、配列番号２４、２５、２ ６、２７、３９、４０、４２および４２を有するポリペプチドが含まれる。この ようなポリペプチドは、配列番号１と識別されるアミノ酸配列の３０、２５、２ ０、１５または１０個の連続したアミノ酸を最大で持つことができるか、または これらを基礎とすることができる。 特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドと同一であるか、あるいは実質的に 同族であるか、あるいは機能的にまたは構造上同等である分子的実体はいずれも 、そのポリペプチドから「誘導される」化合物である。したがって、特定のポリ ペプチドから誘導される分子は、そのポリペプチドのアミノ酸配列、そのポリペ プチドの任意の部分、または、骨成長を刺激するよう作用するその他の分子的実 体を含むことができる。このような結合ドメインから誘導される分子は誘導元の ポリペプチドを模倣する。このような分子的実体は、ペプチドミメティック（ｐ ｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）などを含むことができる。 「ペプチドミメティック」は、受容体分子と相互作用関係にあるペプチドの代 用として働く構造である（ペプチドミメティックの総説については、Ｍｏｒｇａ ｎ他(Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、２４巻、２４３〜２５２頁 、 １９８９年を参照されたい)。本明細書で使用するペプチドミメティックは、ア ミノ酸および／またはペプチド結合を含んでも、または含まなくともよい合成構 造を含むが、誘導元のペプチドの構造上および機能上の特徴を保持する。「ペプ チドミメティック」という用語には、Ｎ置換アミノ酸のペプチドまたはオリゴマ ーであるペプトイドおよびオリゴペプトイドも含まれる(Ｓｉｍｏｎ他、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、９３６７〜９３７１頁、１ ９７２年)。さらに、所与のアミノ酸長に設計され、それに対応する考えられる 全てのアミノ酸の配列を表すペプチドのコレクションであるペプチドライブラリ ーも、ペプチドミメティックとして含まれる。 定義されたポリペプチド長にわたって、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なく とも約８５％（好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、最も好ましくは少なく とも約９５％）が一致するとき、２つのポリペプチド配列は「実質的に同族」で ある。本明細書で使用するように、実質的に同族という表現は、指定のポリペプ チド配列に同一性を示す配列にも当てはまる。 本明細書で説明した骨刺激活性を有するポリペプチドを構造上および機能的に 模倣するペプチドミメティックの使用を本明細書に示す。このペプチドミメティ ックは、以下の方針および手順を使用して生成することができる。一般にミメテ ィックは、Ｄアミノ酸によるＬアミノ酸の系統的置換、異なる電子特性を有する メチル基または擬似等配電子基(ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｓｔｅｒｉｃ ｇｒｏｕｐ) による側鎖部分の置換(Ｈｒｕｂｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ.、２８８巻、２４９ 〜２６２頁、１９９０年を参照のこと)、アミド結合置換を用いた、先に説明し たペプチド阻害剤中のペプチド結合の系統的置換によって得られた情報に基づい て設計される。例えば、アミド結合代用物を含むアナログを使用して、主鎖の回 転自由度、分子内および分子間の水素結合パターン、局所および総ての極性、疎 水性の修飾、および経口でのバイオアベイラビリティーなどのペプチドの構造お よび機能面を調べることができる。 骨刺激活性を有する潜在的ペプチドミメティックの活性の立体配座の要件を求 めるために、局所的な立体配座の制約を導入することもできる。例えば、β，β −配置のアミノ酸を使用して、ペプチド活性に対する立体配座の制約の効果を調 べることができる(例えば、Ｍａｎｎｉｎｇ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.、２５巻 、４０８〜４１４頁、１９８２年；Ｍｏｓｂｅｒｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６巻、５０８〜５１２頁、１９８３年；Ｐｅｌｔ ｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、２３６〜２ ３９頁、１９８５年を参照されたい)。 ミメティックは、ψ〔ＣＨ₂Ｓ〕、ψ〔ＣＨ₂ＮＨ〕、ψ〔ＣＮＨ₂〕、ψ〔Ｎ ＨＣＯ〕、ψ〔ＣＯＣＨ₂〕、およびψ〔(Ｅ)または（Ｚ）ＣＨ＝＝ＣＨ〕など の等配電子アミド結合を含むことができる(総説については、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅ ｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＶＩＩ巻、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編 、ニューヨーク州Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、２６７〜３５７頁、１９８３年 のＳｐａｔｏｌａの論文を参照されたい)。これらの合成分子はさらに、逆向き の立体配座を安定化または促進し、酵素分解に対する分子の安定化を助けるため 、Ｄアミノ酸を含むこともできる(例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ他、「Ｐｅｐｔ ｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｄｅｂｅｒ他編 、，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ Ｃｏ.、イリノイ州ロックフォード、５４９〜５ ５２頁、１９８５年；Ｓａｗｙｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ、７７巻、５７５４〜５７５８頁、１９８０年；Ｔｏｒｃｈｉａｎａ他 、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ.、２３５巻、１７０〜１ ７６頁、１９７８を参照されたい)。環式アミノ酸アナログを使用して制約し、 アミノ酸残基を、特定の立体配座状態、例えば１−アミノシクロペンタンカルボ ン酸(シクロレウシン)、β，β−シクロペンタメチルイエン−β−メルカプトプ ロピオン酸などのαα’−置換およびββ−置換の環式アミノ酸とすることがで きる(前掲Ｈｒｕｂｙ他（１９９０）参照)。 ミメティックはさらに、フェノキサチン環構造などのβターン模倣、およびエ ピンドリジオン構造などのβシート模倣を含むポリペプチドの２次構造の模倣を 含むことができる。この構造は、アミノ酸残基の３次元配向をタンパク質の既知 の２次立体配座にモデル化することができる。αヘリックス誘導テンプレートの 設計合成および配座解析が記述されている(Ｋｅｍｐ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ Ｌｅｔｔ.、２９巻、４９３１頁、１９８８年；Ｋｅｍｐ他、Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９巻、４９３５頁、１９８８年)。 潜在的ミメティックの骨刺激化合物としての潜在的活性を、ミメティックの誘 導元のポリペプチドに対して生じた抗体に対するその化合物の親和性を測定する ことによって、試験またはプレスクリーニングすることができる。ポリペプチド について先に説明したように、既知のペプチドに対する抗体と陽性反応するそれ らのミメティックのｉｎ ｖｉｖｏでの骨刺激効果を、例えば、ラットについて 本明細書で説明したシステムを使用して試験することができる。配列番号９と識 別されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して生じた抗体はこのコンテク ストで特に有用であると考えられる。 ここでペプトイドの使用について述べる。ペプトイドは、Ｎ置換アミノ酸のオ リゴマーであり(前掲Ｓｉｍｏｎ他(１９７２))、結合および骨刺激活性を試験す ることができる新規な分子の化学的に多様なライブラリの生成のためのモチーフ として使用することができる。モノマーは、ｔ−ブチルベースの側鎖および９‐ フルオレニルメトキシ−カルボニルαアミン保護を組み込むことができる。ペプ トイドモノマーのオリゴマー化は、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキ シトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスファート、またはブロ モトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスファートによるｉｎ ｓｉｔｕでの活性化によって実施することができる。その他のステップは、α− （９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を使用する従来のペプチド合 成と同一である。対応するポリペプチドに匹敵する親和性を有するオリゴペプト イドを識別することができ、したがって、オリゴペプトイドは骨刺激薬として有 用であると言える。 特定のポリペプチドの「電荷パターン」を有する化合物またはポリペプチドは 、この特定のポリペプチドの配列のアミノ酸の側鎖の電荷の数および分布（すな わち同じ順序）を有する。それぞれの側鎖の電荷は、生理学的条件下で存在する 支 配的電荷に基づく。電荷の間隔も、このポリペプチドによって提供される間隔と 同様であると考えられる。好ましい例では、間隔が、その特定のポリペプチドの ポリアミド主鎖によって提供される間隔と実質的に同じであり、そのためこの場 合、この化合物は、ポリペプチドと実質的に同じ「電荷パターンおよび間隔」を 有すると言われる。 試験した特定のポリペプチド配列に関して得た結果の概要を図１９に示す。 見て分かるとおり、配列番号２４と識別されるポリペプチド（および対応する 非保護ポリペプチド、配列番号９）は、配列番号１と識別されるポリペプチドの ３６個のアミノ酸の配列に含まれる１０個のアミノ酸の配列を有する。したがっ て、ｉｎ ｖｉｖｏの骨刺激活性は、配列番号１のアミノ酸配列のわずか２８％ が保存されたポリペプチドで保持することができる。特に、この保護されている アミノ酸１０個のポリペプチド配列である配列番号２４は、配列番号１、または 保護されていないアミノ酸１０個の配列番号９の骨刺激効果を上まわる骨刺激効 果を有する。 さらに見て分かるとおり、配列番号２６と識別されるポリペプチド（および対 応する非保護ポリペプチド、配列番号２９）は、アミノ酸１０個の配列を有し、 そのうち、配列番号１と識別されるポリペプチドの３６個のアミノ酸の配列に含 まれるものと同一なのは８個のみである。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏの骨刺激 活性を、配列番号１のアミノ酸配列のわずか２２％が保存されているポリペプチ ドで保持することができることを示している。モルベースでは、保護された配列 （配列番号２６）が、少なくとも前述の実験の条件下で、配列番号２４の効果よ りもいっそう大きな効果を有することが分かった。 同様に、配列番号２５と識別されるポリペプチド（および対応する非保護ポリ ペプチド、配列番号２８）は、アミノ酸１０個の配列を有し、そのうち、配列番 号１と識別されるポリペプチドの３６個のアミノ酸の配列に含まれるものと同一 であるのは９個のみである。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏの骨刺激活性を、配列 番号１のアミノ酸配列のわずか２５％が保存されているポリペプチドで保持する ことができることを示している。モルベースでは、保護された配列（配列番号２ ５）が、前述の実験の条件下で、配列番号２４の効果に匹敵する骨刺激効果を有 することが分かった。 配列番号２７と識別されるポリペプチド(および対応する非保護ポリペプチド 、配列番号３０)は、アミノ酸１０個の配列を有し、そのうちの９個のみが、配 列番号１に含まれるものと同じである。このうちの保護されているポリペプチド も、骨刺激効果を有することが分かったが、配列番号２６の効果ほどは大きくな かった。 前述の実験で示したとおり、ポリペプチドは、ポリペプチドが曝露される条件 により互いに異なる。活性なポリペプチドが、保存時または投与中に、不活性な 部分または活性の弱い部分にまで分解されないことが一般に望ましい。活性なフ ラグメントの安定性に関する情報は、保存および投与用の調製物を処方する際に 役立つ。安定性の情報はさらに、個体に投与した後、より長期的活性なフラグメ ントを選択する際に役立つかもしれない。 同様の活性を与えるポリペプチドが一般に、ポリペプチドがある方法で結合す る受容体などの、他の物質と相互作用する同じまたは類似の３次元部分を有する ことによって関係していることは当業者なら当然知っていることである。相互に 関係したいくつかのポリペプチドが同様の骨刺激活性を示すのはそのためである 。 本発明は、哺乳動物についてｉｎ ｖｉｖｏでの骨刺激活性を有し、哺乳動物 の骨中のカルシウム密度または含量を高め、配列番号１と識別されるアミノ酸配 列に対して少なくとも約１９％のアミノ酸配列が保存されたアミノ酸配列を有し 、少なくとも１つのアミノ酸を欠失した合成ポリペプチドまたはその同族体を提 供する。本発明では、配列番号１のアミノ酸配列と位置をそろえると、その中に 、元の配列の個々のアミノ酸残基の少なくとも約３０％が存在するアミノ酸配列 を含むペプチドは、配列番号１と識別されるアミノ酸配列を約３０％保存してい るとされる。位置をそろえた配列間の同族置換および限られた数の挿入または欠 失は許される。位置をそろえた配列中に、配列番号１の３６個のアミノ酸残基の うちの７個を有するアミノ酸配列は１９％保存となる。配列番号２６および２９ の場合のように、位置をそろえた配列中に、配列番号１の３６個のアミノ酸残基 の うちの８個を有するアミノ酸配列は２２％保存となる。配列番号２５、２７、２ ８および３０のように、位置をそろえた配列中に、配列番号１の３６個のアミノ 酸残基のうちの９個を有するアミノ酸配列は２５％保存となる。配列番号９およ び２４のように、位置をそろえた配列中に、配列番号１の３６個のアミノ酸残基 のうちの１０個を有するアミノ酸配列は２８％保存となる。 少し異なる方法で説明すると、本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号１の Ｎ末端から、１個から約４個のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号１の Ｃ末端から、１個から約２２個のアミノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と （ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有するポリペ プチド、または機能的に同等なその同族体である。配列番号１のＮ末端から５個 または６個またはそれ以上のアミノ酸を欠失すること、あるいは、Ｃ末端から２ ３個以上のアミノ酸を欠失することが可能であることが判明する可能性がある。 別の見方では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号 ４、配列番号５、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列 番号９と識別される配列と、その配列の三次元構造に由来する哺乳動物での骨刺 激活性が保持される範囲で、配列内のアミノ酸が置換、欠失または付加されてい る可能性のあるその同族体と、ポリペプチド配列が配列番号１と識別されるポリ ペプチド配列を有している場合、少なくとも１つのアミノ酸を欠失したその各ポ リペプチドまたは、各同族体の結合体である哺乳動物で骨刺激活性を示すポリペ プチドとして記述することができる。 本発明のポリペプチドは、約１０００〜４０００の範囲の分子量を有する配列 を含む。ただし、この配列に、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ）またはその他 の手法によって、化合物全体の分子量を４０００以上に高める可能性のある付加 を行うことができることに留意されたい。 また、本明細書に開示したポリペプチドの骨刺激効果を担う３次元構造を「保 存」しつつ、アミノ酸をさまざまに置換できると理解されたい。ただしこれによ って本発明が限定されるわけではない。したがって、例えば、非極性の脂肪族中 性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリン、およびイソロイシン 間の相互交換が可能であることが予想される。同様に、極性の脂肪族中性アミノ 酸であるセリン、トレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギンおよびグ ルタミン間の置換も可能であろう。このことから、ジスルフィド架橋によるペプ チド同士の結合はある程度の重要性を持つようであり、先に示したとおり、ｃｙ ｓ−ａｌａ置換は成功した（配列番号３）が、おそらくは、孤立システイン残基 を元のままに保ち、また、ジスルフィド結合を形成することができるその他のア ミノ酸が配列中で置換されないようにすべきである。電荷を持つ酸性アミノ酸で あるアスパラギン酸とグルタミン酸の間の置換は先に示したように可能であり、 電荷を持つ塩基性アミノ酸であるリジンとアルギニンの間の置換も可能である可 能性が高い。置換は、単独でまたは組み合わせて実施することができる。これら の種類の置換および相互交換は当業者にとって周知のことである。例えば、米国 特許第５，４８７，９８３号および５，５１２，５４８号には、遺伝子によって コードされていないアミノ酸が関与する置換を含む、その他の可能な置換が記載 されている。その他の置換も十分に可能であろう。 配列のＮ末端部分の重要性は、本明細書に記載した結果から明らかである。配 列番号１のアミノ酸５から１４を有するポリペプチド（配列番号９、２４、２５ 、２６、２７、２８、２９および３０）は骨刺激活性を示し、一方、最初の９つ のＮ末端アミノ酸を欠き、アミノ酸１０から３２（配列番号１４）またはアミノ 酸２０から３５（配列番号１０）を有するポリペプチドは骨刺激活性を示さない 。骨刺激活性を担うポリペプチドの部分配列の３次元構成を保持しながら、配列 番号９と識別されるポリペプチドのいずれの端からもさらにアミノ酸を欠失する ことができる。内部欠失は、ある限定された範囲では可能かもしれないが、わず かなものでなければならない。配列番号９と識別されるアミノ酸配列とは１つの アミノ酸残基だけが異なる配列番号１６と識別される配列を有するポリペプチド には特に留意されたい。配列番号１６は骨刺激活性を示さないが、配列番号９は 活性を示す。本明細書に開示した実験法を使用して、骨成長を刺激する配列とし ない配列、および、骨カルシウム含量を上昇させる配列と上昇させない配列を区 別することが可能である。 それほど多くなければ、配列の末端でアミノ酸の付加を実施できるはずであり 、カルボキシ末端とアミノ末端への対称またはほぼ対称の付加が可能である可能 性は高い。内部付加は、ある限定された範囲では可能かもしれないが、わずかな ものでなければならない。 先に挙げた配列への修飾のうちで、末端での付加、欠失または置換は、例えば 、放射線免疫検定での使用に関する同定のための基、または結合のための基など 、さまざまな機能を果たすので、最も有用であると言える。 通常のペプチド（配列番号１）と同様に、システイン残基を含む活性の部分配 列（すなわち配列番号４、５、６、７、８または９）は、少なくともある条件下 で、自発的に二量体化し、二量体化した形態で存在することができる。 先に説明した実験によればさらに、一般に「非保存的」置換とみなされる限ら れたいくつかの置換を実施し、依然として骨刺激活性を保持することができる。 これは特に、例えば、電荷パターンを保持しつつ、配列に沿って３番目の位置を 占めるアスパラギン残基をアラニンで置換することができることが分かっている 配列番号９に対応するアミノ酸配列にも当てはまる。 当技術分野で知られているように、タンパク質のキメラ体を通してさらなる利 点を得ることができる。完全なタンパク質、またはそのタンパク質の一部をコー ドしているＤＮＡ配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ‐ガラクトシダーゼのＣ 末端部分をコードしているＤＮＡ配列に結合し、融合タンパク質を生成させるこ とができる。ヒト呼吸器系合胞体ウイルスの糖タンパク質ＦおよびＧの発現シス テムが、例えば、１９９４年２月２２日に発行された米国特許第５，２８８，８ ３０号およびその引用文献に記載されている。 本発明のポリペプチドは、従来の「化学」手法によって調製されたにせよ、ま たは組換え手法によって調製されたにせよ、通常は合成ポリペプチドである。こ こでは、このように生成されたポリペプチドが、例えば動物の血清中など、自然 界で直接に見い出される場合に、それとともに存在するであろうポリペプチドや タンパク質を一般に含まないとき、そのポリペプチドを、実質的に純粋なポリペ プチド、または生化学的に純粋なポリペプチドと呼ぶ。 標準ポリペプチドの活性部分をコードしている核酸（ＤＮＡ）配列を以下に示 す。 配列番号１を基礎とし、置換されたアミノ酸残基を有するポリペプチドの仮定 のコード配列を以下に示す。 これに従って、このようなＤＮＡ配列を組み込んだベクターを、ポリペプチド の合成に使用する目的で、以前の記載のとおりに、特に国際特許出願ＰＣＴ／Ｃ Ａ ９４／００１４４に記載のとおりに構成することができる。配列番号１と識 別されるポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列は、本明細書の配列リストの配列 番号２３に示されている。 本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む一切のフラグメン トを本発明のＤＮＡ配列またはフラグメントとすることができる。前記コード配 列の他に、このＤＮＡフラグメントは、適当なプロモーターおよびＳＤ配列（ま たは適当なリボソーム結合部位）をその５’末端に、必要であれば、翻訳開始コ ドンを含むヌクレオチド配列を５’末端に、終止コドンを含むヌクレオチド配列 を３’末端に有することができる。 当業者に知られているとおり、遺伝コードは「縮重」している。したがって、 遺伝子配列中のヌクレオチドは、遺伝子がコードしているポリペプチドのアミノ 酸配列を変えることなく、特定のコドン（暗号トリプレット）の縮重に従って他 のヌクレオチドに置き換えることが出来る。その結果、本発明のＤＮＡ断片は、 前述のいずれの配列（および置換されたポリペプチドや明瞭に説明されていない 他のアナログに相当するＤＮＡ配列）からも得ることが可能であり、このような 置換は、遺伝子工学の技術を応用した本発明のポリペプチドを産生する際に、結 果として得られるコドンが特定の宿主細胞で高い利用率を示すような方法で実施 できる可能性がある。 本明細書で使用される「保護された」末端アミノ基とは、ペプチド合成に利用 可能な様々なアミノ末端保護基のいずれかと結合した末端アミノ基（Ｎ末端）を 指す。適切なアミノ基の例としてはアシル保護基（例えばホルミル基、アセチル 基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル基、スクシニル基、メトキシサクシニ ル基）や芳香族ウレタン保護基(例えばベンジルオキシカルボニル基)、脂肪族ウ レタン保護基（例えばｔ−ブトキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニ ル基）などがある(Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ.、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、３巻、３〜８８頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニュ ーヨーク、１９８１年)。 本明細書で使用される「保護された」末端カルボキシル基とは、様々なカルボ キシル末端保護基のいずれかと結合した末端カルボキシル基（Ｃ末端）を指す。 当業者には容易に明らかなように、適切な基には、ｔ−ブチル基やベンジル基な ど、エステル結合またはエーテル結合によって末端カルボキシル基に結合する許 容し得る基である。 本発明の範囲内の化合物は、例えば固相ペプチド合成のようなよく知られた技 術によって化学的に合成することが可能である。この合成は、α−アミノ基で保 護されたアミノ基を利用してペプチドのカルボキシ末端から始める。ｔ−ブチル オキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基や他の適切な保護基が利用可能である(Ｓｔ ｅｗａｒｔ他「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ.、サンフランシスコ、１９６９年；Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５頁、２１４９−２１５４頁、 １９８３年；Ｖａｌｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１３巻、１３９４−１３９７頁、 １９８１年，ａｎｄ Ｍａｒｋｅ他Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１０３巻、３ １７８頁、１９８１年)。合成法はＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｅｄ．の「Ｐｒｉｎ ｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」(Ｓｐｒｉｎｇ− Ｖｅｒｌａｇ １９８４)にも記載されている。これらのペプチド合成法および 他のペプチド合成法は米国特許第３，８６２，９２５号、第３，８４２，０６７ 号、第 ３，９７２，８５９号、第４，１０５，６０２号、第４，６８３，２９１号、第 ４，２４４，９４６号、第４，３０５，８７２号にも例示されている。 化合物は手動または自動技術、例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍａ ４３０Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ(米国カリフォルニア州 フォスターシティ)やＢｉｏｓｅａｒｃｈ ＳＡＭ １１自動ペプチド合成装置( ＢｉｏＳｅａｒｃｈ社、米国カリフォルニア州サンラファエル)を利用して合成 してもよい。 本発明の化合物およびこれを含有する混合物は、骨量が減少する疾患の予防お よび治療において、多くの予防的／治療的用途に有用であることが明らかになっ ている。したがって、化合物を適切な投与経路で投与し、例えば骨粗鬆症の治療 で骨成長促進剤として利用することが可能である。投与経路は、患者の血流にポ リペプチド型の化合物を分布させるのに適している経路が望ましいが、本明細書 に記載されている化合物のようなポリペプチドには、適切な保存条件および取り 扱い条件が必要であることを覚えておかなければならない。 したがって、本発明は、前述の治療による恩恵を単独で提供する可能性のある 、非毒性付加塩、アミドおよびエステルを含めた本発明の化合物を有効量含有す る混合物も提供する。また、このような混合物は、生理学的に許容可能な液体、 ゲルまたは固形の希釈剤、佐剤および付加剤と共に提供され得る。 前述の実施例では、１回の投与に動物の体重１ｋｇ当たり約１２５ｎｍｏｌの ポリペプチド配列が利用された。実際には、特にヒトの場合、１日投与量は体重 １ｋｇ当たり０．０１〜３００ｍｇあるいはそれ以上が適当であろう。さらに、 １日量は体重１ｋｇ当たり約０．１〜３０ｍｇが望ましいであろう。投与回数は １日１回前後が望ましいが、投与経路、便宜、１回投与量や投与回数によって変 化する治療の有効性などによって異なる。また、投与量は投与対象および作用の 範囲によっても異なる。１個または複数の化合物の投与量は、利用される化合物 の組み合わせや特定の化合物、投与方法、治療の対象となる哺乳動物など多くの 要因によって異なる。特定の化合物または複数の化合物の組み合わせの投与量は 、通常考慮すべき事柄を基に、例えば、本発明化合物に特徴的な作用と既知の薬 剤 のそれとを比較することにより、つまり、例えば時間の経過と共に患者の骨密度 を測定する適切な薬理学的プロトコルを使って、決定することが可能である。 製剤には、骨の成長または骨粗鬆症の治療あるいはその両方を促進するための 注射溶液（使用直前に調製する注射溶液を含む）として調製された化合物が含ま れる。注射剤は液剤または懸濁剤のいずれかであるが、注射前に液剤または懸濁 剤に溶解するのに適した固形製剤も製造可能である。製剤は乳化してもよい。活 性ポリペプチドは、生理学的に許容可能でポリペプチドと配合可能な希釈剤や添 加剤としばしば混合される。適切な希釈剤および添加剤は、例えば水、食塩水、 Ｄ−グルコース、グリセロールおよびこれらの類似物やこれらの組み合わせであ る。もし必要であれば、混合物は湿潤剤や乳化剤、安定剤、ｐＨ緩衝剤およびこ れらの類似物などの補助物質を少量含有できる。 製剤には、従来の添加剤、つまりこの化合物と有害な反応を起こさず、化合物 の保存・取り扱い上の安定性を増強させると思われ、製剤学的に認められる有機 または無機担体物質と混合した化合物の利用が含まれる。製造工程には製剤の滅 菌が含まれる。化合物は、滑沢剤や保存剤、安定剤、浸透圧に影響を与える塩な どこの化合物と有害な反応を起こさない補助剤と混合してもよい。 混合組成物は通常非経口的に、例えば皮下または皮内注射で投与される。その 他の投与方法に適した剤形としては座剤、点鼻用エアロゾル、場合によっては経 口剤がある。座剤の場合、伝統的に使用されている結合剤および添加剤には、例 えばポリアルキレングリコールやトリグリセリドがある。座剤は０．５〜１０％ の範囲内（１〜２％が望ましい）で有効成分を含む混合物から製造してもよい。 経口剤には、例えば製剤学的等級のマンニトールやラクトース、デンプン、ステ アリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム およびこれらの類似物など、通常使用される添加剤が含まれる。これらの組成物 は液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性剤、散剤のいずれかの剤形で 、有効成分の１０〜９５％（２５〜７０％が望ましい）を含有する。経口剤には 、吸収されるまでペプチドを保護するように作られた剤形が含まれる。 ペプチド化合物は中性または塩の形で組成物に製剤化してもよい。製剤学的に 認められる非毒性の塩には酸付加塩（遊離アミノ基で形成）と、例えば塩酸やリ ン酸のような無機塩と共に、あるいは酢酸やシュウ酸、酒石酸、マンデル酸およ びこれらの類似物のような有機塩と共に生成されるものがある。遊離カルボキシ ル基と共に生成される塩は、例えばナトリウムやカリウム、アンモニウム、カル シウム、水酸化第２の鉄のような無機塩基や、例えばイソプロピルアミンやトリ メチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインおよびこ れらの類似物のような有機塩基から得てもよい。 本発明の化合物は自分自身すなわちペプチドに重合してホモポリマーを形成し たり、あるいは互いに重合してヘテロポリマーを形成したりすることが出来る。 また、ＢＩＯＰＯＬ（商標）(ＷＲ Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ.，Ｃｏｎｎ.)のよう な生体適合性の重合体化合物に結合することも可能である。 遺伝子組み換え技術を利用して調製する場合は、標準的な自動技術を用いて本 発明の希望するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を合成するか、あるいはそ の配列または一部をｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから回収する。このＤＮ Ａを適切な発現ベクターに連結させ、ベクターを適切な宿主に形質転換させる。 原核生物および真核生物の培養系を始め、様々な発現ベクター／宿主細胞系を利 用できる。 原核生物は、大腸菌の様々な菌株によって最も頻繁に代表される。しかし、バ チルス属（例えば枯草菌）やシュードモナス属の様々な種、その他の菌株など、 他の微生物株も利用されることがある。このような原核生物系では、複製源を持 ち、宿主に適合した種に由来する配列をコントロールするプラスミドベクターが 利用される。例えば、大腸菌は通常、大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２の 派生物を利用して形質転換される(Ｂｏｌｉｖａｒ他(１９７７)Ｇｅｎｅ ２： ９５)。一般的に使用される原核生物制御配列は、リボソーム結合部位配列と共 に（時にはオペレーターと共に）転写開始用プロモーターを含むと本明細書では 定義されるが、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）ラクトース（１ｎｃ）プロモ ーター系（Ｃｈａｎｇ他、、Ｎａｔｕｒｅ、１９８巻、１０５６頁、１９７７年 ）やトリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系(Ｇｏｅｄｄｅｌ他、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、８巻、４０５７頁、１９９０年)、λ由来Ｐ₆プロモーター／ Ｎ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ他、Ｎａｔｕｒｅ ２９２ 巻、１２８頁、１９８１年）など、一般的に用いられるプロモーターを含む。し かし、原核生物に適応したプロモーター系であれば、どれでも利用可能である。 本発明の真核生物系で有用な発現系は、適切な真核生物の遺伝子由来のプロモ ーターを含む。例えば酵母で有用なプロモーターのクラスには、アルコールデヒ ドロゲナーゼプロモーターやグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ プロモーター(Ｈｏｌｌａｎｄ ＆ Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ 、２５巻、２５９６頁、１９８０年)、α−因子プロモーター(Ｂｉｔｔｅｒ他、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、８１巻、５３３０頁、１９８４年)、 ｇａｌプロモーター(Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＆ Ｄａｖｉｄ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４巻、１４４０頁、１９８４年)、３−ホスホグリセレートキナーゼ のプロモーター(Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５６巻、１ ３８５頁、１９８０年)、ＹＥｐ１３から得たＬｅｕ２遺伝子（Ｂｒｏａｃｈ， Ｊ．他、Ｇｅｎｅ、８巻、１２１ｖ頁、１９７８年）など、解糖酵素の合成用の プロモーターがある。 適切な哺乳類プロモーターには、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター （Ｆｉｅｒｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻、１１３頁、１９７８年）や他のウイ ルスプロモーター、例えばポリオーマウイルスやアデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭 腫ウイルス、トリ肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターがある。適切なウイ ルスエンハンサーおよび哺乳類エンハンサーは前述のとおりである。植物細胞を 発現系として使用する場合は、ノパリン合成プロモーターが適している(Ｄｅｐ ｉｃｋｅｒ，Ａ．他、Ｊ Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎ １巻、５６頁、１９８２ 年)。 発現系は複製ベクター上に含まれるか、あるいは組み換え宿主の染色体に組み 込まれる。ベクターに複製系が含まれる系の場合、コピー数は少ないこともあれ ば、多いこともある。通常、コピー数は約１０００未満だが、特定の状況ではラ ンナウェイベクターを利用してもよい。組み込み用ベクター上に提供されるにせ よ、複製系内に提供されるにせよ、本発明のポリペプチドをコードする配列は、 ジヒドロ葉酸還元酵素やメタロチオネイン、チミジンキナーゼおよびこれらの類 似物などの増幅遺伝子と縦一列に結合させてもよい。原核生物系では、同一の転 写／翻訳制御領域の制御下に増幅遺伝子と標的遺伝子の両方を置くことが可能で ある。 通常、ベクターには、発現系を持つ宿主細胞の選択を考慮する標識が含まれる 。このような標識の性質は宿主によって異なり、当技術業界で理解されている。 プロモーターのような必要な調節因子に加え、エンハンサーのような補助配列を 転写レベルの向上に利用することも可能である。ポリペプチドを分泌させる場合 は、米国特許第４，３３６，３３８号、第４，３３８，３９７号、第４，５４６ ，０８２号に記載されているようなシグナルペプチドをコードする上流配列を使 用してもよい。ポリペプチド産物が分泌されると、シグナル配列は酵素で切断さ れる。 使用する宿主細胞に合った標準的方法で形質転換を行う。塩化カルシウムを利 用したカルシウム処理(Ｃｏｈｅｎ,Ｓ.Ｎ.、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓ ｃｉ ＵＳＡ、６９巻：２１２０頁、１９７２年)またはＲｂＣｌ法(Ｍａｎｉａ ｎｔｉｓ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２５４ 頁、１９８２年）を、原核生物または固い細胞壁バリアを有する他の細胞に使用 する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染（Ｓｈ ａｗ，Ｃ．Ｈ．他、Ｇｅｎｅ、２３巻、３１５頁、年）をある種の植物細胞に使 用する。固い細胞壁を持たない哺乳類細胞の場合は、リン酸カルシウム沈降法（ Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ.、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻、 ２号、５４６頁、１９７８年）が良い。酵母への形質転換は、例えばＶａｎ Ｓ ｏｌｉｎｇｅｎ他の方法（Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｐ．他、Ｊ Ｂａｃｔｅ ｒ、１３０巻、９４６頁、１９７７年）やＨｓｉａｏ他の方法（Ｈｓｉａｏ，Ｃ ．Ｌ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６巻、３８２９ 頁、１９７９年）に従って行う。 一般に、適切な発現系の作成後、その発現系を適切な宿主にトランスフェクシ ョンし、成功した形質転換体を発現ベクター上の標識で選択する。続いて、希望 するポリペプチドを産生するために、形質転換が成功したコロニーを培養する。 本発明の希望するポリペプチドをコードする遺伝子が発現されず、条件の適切な 操作によってそのポリペプチドの産生が誘発される条件下で細胞が増殖できるよ うに、環境の条件を制御することによってコントロール可能なプロモーターを使 用することが望ましい場合がある。例えば、大腸菌でｔｒｐプロモーターを使用 する場合、細胞はトリプトファンの存在下で増殖し、トリプトファン濃度の低下 またはインドリル酢酸のようなトリプトファン類似化合物の添加によって発現が 誘発される。遺伝子がＰＬプロモーターのコントロール下にある場合は、約３５ ℃という比較的低温で細胞は適切な細胞密度まで増殖し、温度が上昇してこのプ ロモーターを活性化させる。細胞内ポリペプチドのように細菌宿主内で産生され る場合、Ｎ−末端のメチオニンは切断されることもあれば、切断されないことも ある。哺乳類系では、例えばメタロチオネインプロモーターを利用することによ り、重金属またはグルココルチコイドの添加によって誘導が可能になる。このプ ロトコルは、細胞増殖に悪影響を及ぼす恐れのあるポリペプチドの早期蓄積を予 防するのに適している。 ポリペプチドは細胞内で産生したり、適切な宿主で作用可能なシグナルペプチ ドがペプチドに先行するベクターの作成によって分泌したりすることが可能であ る。 ポリペプチドは当技術業界で一般的に知られている適切な方法で細胞または培 地から回収され、例えばイオン交換クロマトグラフィーや硫酸アンモニウム沈降 反応、ゲル透過クロマトグラフィーなどの方法で精製される。 「通常の」ポリペプチド（配列番号１）と関連して記載されているとおり、本 明細書で開示されるポリペプチドのいずれに対しても抗体が生じる可能性がある ことは、当然理解されるだろう。抗体が結合しているポリペプチドを検出するの に用いられるポリペプチドに対する抗体を利用する方法および生成物の開発が可 能である。 例えば、抗体は、ポリペプチドと抗体との結合を示すようにセットアップされ たレポーター系と結合または抱合することが可能である。よく知られているレポ ーター系には放射性免疫測定法（ＲＩＡ）や免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）が ある。別法として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＲＩＡやＩＲＭ Ａと同様に比較的高い感受性を持つが、一般にラジオアイソトープの利用には頼 らない。視覚的に検出可能な物質、少なくとも分光光度計で検出可能な物質を生 成できる可能性がある。定量される酵素が結合した物質の蛍光による定量法が利 用できる。本発明によれば、特定のポリペプチドの存在を検出するのに使用でき るレポーター系が多数存在することが理解されよう。標準化された検体採取およ び治療により、血清中に閾値以上存在するポリペプチドの量を測定できるだろう 。 このような抗体結合レポーター系は、被検者の血清中のポリペプチド量が不足 しているか否かを調べる方法に利用できる。したがって、ある種の被検者の血清 中のポリペプチドの正常な閾値濃度が与えられれば、検査キットの開発が可能で ある。 発行された特許および係属中の特許出願も含め、前述のすべて参考文献は参照 して本明細書に組み込むものとする。また、本出願には、１９９３年３月１２日 出願の米国特許出願第０３１，３８６号、１９９３年９月１３日出願の第１２０ ，２１７号、１９９４年９月１２日出願の第３０２，４８５号、１９９５年６月 ７日出願の第４８７，０７４号の各明細書を参照して本明細書に組み込むものと する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年１月１８日（１９９９．１．１８） 【補正内容】 請求の範囲 １．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、配列番号９に対応するアミ ノ酸配列によって提供されるアミノ酸側鎖電荷の電荷パターンを有する化合物。 ２．配列番号９に対応するアミノ酸配列のペプチド主鎖によって提供される主鎖 と実質的に等配電子である主鎖を含む請求項１に記載の化合物。 ３．ポリペプチドである請求項１に記載の化合物。 ４．化合物の電荷パターンが本質的に、配列番号９に対応するアミノ酸配列によ って提供される電荷パターンからなる請求項１に記載の化合物。 ５．配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供される電荷パターンおよび 空間的配置を有する請求項４に記載の化合物。 ６．ポリペプチドである請求項５に記載の化合物。 ７．ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の一方または他方または両方が保護され ている請求項８に記載の化合物。 ８．哺乳動物で骨刺激活性を保持する化合物であって、配列番号９に対応する配 列の置換体を含む請求項１、請求項２または請求項３に記載の化合物。 ９．ポリペプチドである化合物であって、ポリペプチドが誘導される前記配列が 、配列番号１に対応する配列および１つまたは複数の選択した配列の結合体から 選択される２５個までの連続したアミノ酸からなる請求項８に記載の化合物。 １０．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される２０個までの連続したア ミノ酸からなる請求項９に記載の化合物。 １１．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される１５個までの連続したア ミノ酸からなる請求項１０に記載の化合物。 １２．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される１０個までの連続したア ミノ酸からなる請求項１１に記載の化合物。 １３．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、本質的に、配列番号９に 対応するアミノ酸配列によって提供される電荷パターンおよび空間的配置からな る電荷パターンを有する化合物。 １４．哺乳動物で骨刺激活性を保持する、配列番号９に対応するアミノ酸配列、 配列番号２５に対応するアミノ酸配列、配列番号２６に対応するアミノ酸配列、 配列番号２７に対応するアミノ酸配列、配列番号３９に対応するアミノ酸配列、 配列番号４０に対応するアミノ酸配列、配列番号４１に対応するアミノ酸配列、 配列番号４２に対応するアミノ酸配列および配列番号４３に対応するアミノ酸配 列から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその置換体を含む請 求項１３に記載の化合物。 １５．配列番号２５に対応するアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドからなる 請求項１４に記載の化合物。 １６．Ｎ末端およびＣ末端が保護されている請求項１５に記載の化合物。 １７．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、配列番号９に対応するア ミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷パターンおよび空間的配置を有し 、配列番号１と約８３％までの配列相同性を有する化合物。 １８．３０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である請 求項１７に記載の化合物。 １９．配列番号１と約６９％までの配列相同性を有する請求項１７に記載の化合 物。 ２０．２５個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である請 求項１９に記載の化合物。 ２１．配列番号１と約５５％までの配列相同性を有する請求項１９に記載の化合 物。 ２２．２０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である請 求項２１に記載の化合物。 ２３．配列番号１と約４２％までの配列相同を有する請求項２１に記載の化合物 。 ２４．１５個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である請 求項２３に記載の化合物。 ２５．配列番号１と約２８％までの配列相同を有する請求項２３に記載の化合物 。 ２６．１０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である請 求項２５に記載の化合物。 ２７．哺乳動物で骨刺激活性を有するポリペプチドであって、配列番号９と識別 されるアミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷パターンおよび空間的配 置を有し、２位、３位、６位、または９位に少なくとも１個の非保存性置換体を 含んでいるポリペプチド。 ２８．哺乳動物で骨刺激活性を保持する、配列番号３９、配列番号４０、配列番 号４１，配列番号４２、または配列番号４３と識別される配列を有するアミノ酸 配列、およびそれらの置換体を有する請求項２７に記載のポリペプチド。 ２９．本質的に、10個までのアミノ酸のアミノ酸配列からなる請求項２８に記載 のポリペプチド。 ３０．本質的に、10個のアミノ酸のアミノ酸配列からなる請求項２８に記載のポ リペプチド。 ３１．本質的に、配列番号３９と識別されるアミノ酸配列からなる請求項３０に 記載のポリペプチド。 ３２．本質的に、配列番号４０と識別されるアミノ酸配列からなる請求項３０に 記載のポリペプチド。 ３３．本質的に、配列番号４１と識別されるアミノ酸配列からなる請求項３０に 記載のポリペプチド。 ３４．本質的に、配列番号４２と識別されるアミノ酸配列からなる請求項３０に 記載のポリペプチド。 ３５．本質的に、配列番号４３と識別されるアミノ酸配列からなる請求項３０に 記載のポリペプチド。 ３６．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号１または配列番号３のＮ末 端から１個から４個のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号１または配列 番号３のＣ末端から１個から２２個のアミノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１もしくは配列番号３に対応するアミ ノ酸配列を含むポリペプチド、または機能的に同等な同族体。 ３７．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号４のＮ末端から４個までの アミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から１６個までのアミノ 酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号４ に対応するアミノ酸配列を含む請求項３６に記載のポリペプチド、または機能的 に同等な同族体。 ３８．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号５のＮ末端から４個までの アミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号５のＣ末端から１１個までのアミノ 酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号５ に対応するアミノ酸配列を含む請求項３７に記載のポリペプチド、または機能的 に同等な同族体。 ３９．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号６のＮ末端から４個までの アミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号６のＣ末端から３個までのアミノ酸 を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号６に 対応するアミノ酸配列を含む請求項３８に記載のポリペプチド、または機能的に 同等な同族体。 ４０．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号７のＮ末端から４個までの アミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から１個までのアミノ酸 を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号７に 対応するアミノ酸配列を含む請求項３９に記載のポリペプチド、または機能的に 同等な同族体。 ４１．哺乳動物で骨成長を促進する、Ｎ末端から４個までのアミノ酸を欠失して いる、配列番号８に対応するアミノ酸配列を含む請求項４０に記載のポリペプチ ド、または機能的に同等な同族体。 ４２．哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９、配列番号２８、配列番号２９ または配列番号３０に対応するアミノ酸配列を含む、２０個までのアミノ酸長の ポリペプチド、または機能的に同等な同族体。 ４３．配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供されるアミノ酸側鎖電荷 の電荷パターンおよび空間的配置を有する請求項３６から請求項４２のいずれか に記載のポリペプチド。 ４４．Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の一方、他方または両方が保護基で 保護されている請求項３６から請求項４３のいずれかに記載のポリペプチド。 ４５．Ｎ末端保護基がアセチル基である請求項４４に記載のポリペプチド。 ４６．Ｃ末端保護基がアミド基である請求項４４に記載のポリペプチド。 ４７．配列番号２９に対応するアミノ酸配列を含んでいる請求項４３に記載のポ リペプチド。 ４８．本質的に、配列番号２９に対応するアミノ酸配列からなり、その保護され た誘導体を含む請求項４７に記載のポリペプチド。 ４９．合成されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が約１０００から４００ ０、または約１０００から３０００、または約１０００から２０００、または約 １０００から約１５００の範囲に限定された分子量を有する、請求項２９から請 求項３８のいずれかに記載のポリペプチド。 ５０．３０個までのアミノ酸長の配列を有し、（ａ）配列番号１または配列番号 ３のＮ末端から１個から４個のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号１ま たは配列番号３のＣ末端から１個から２２個のアミノ酸を欠失しているか、もし くは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１または配列番号３に対応す るアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを充分に複製する第１のポリペプチド であって、ストリンジェント条件下で第２のペプチドをコードするＤＮＡとハイ ブリッド形成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド、または 機能的に同等な同族体。 ５１．請求項２７から請求項４８、請求項４９および請求項５０のいずれかに記 載のポリペプチドの保存的に置換された変化体であるポリペプチド。 ５２．哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無機質含 有量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくとも約１ ９％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したアミノ酸 配列を有する合成ポリペプチドまたは機能的に同等な同族体。 ５３．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含有量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくと も約２２％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したア ミノ酸配列を有する請求項５２に記載の合成ポリペプチド。 ５４．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含有量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくと も約２５％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したア ミノ酸配列を有する請求項５３に記載の合成ポリペプチド。 ５５．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含有量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくと も約２８％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したア ミノ酸配列を有する請求項５４に記載の合成ポリペプチド。 ５６．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項５２に記載のポリペプチド。 ５７．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項５３に記載のポリペプチド。 ５８．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項５４に記載のポリペプチド。 ５９．前記配列から少なくとも１１個のアミノ酸を欠失した、または前記配列か ら少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１ 個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠 失した請求項５５に記載のポリペプチド。 ６０．約１０００から４０００、約１０００から３０００、または約１０００か ら２０００、または約１０００から１５００の範囲の分子量を有する請求項５２ から５５のいずれかに記載のポリペプチド。 ６１．請求項５２から請求項６０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む第２の ポリペプチドを充分に複製するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって 、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリ ッド形成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド。 ６２．哺乳動物で骨刺激活性を示すポリペプチドであって、配列番号１、配列番 号３、配列番号４、配列番号５、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番 号８または配列番号９と識別される配列を有するポリペプチド；そのアナログで あって、配列の三次元構造に由来する哺乳動物での骨刺激活性が保持される限り 、配列内のアミノ酸が置換、欠失または付加することができるアナログ；および ポリペプチド配列が配列番号１と識別されるポリペプチド配列を有している場合 、そこから少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、各ポリペプチドの結合体 またはその同族体。 ６３．実質的に純粋なポリペプチドであって、アミノ酸配列が約１０００から４ ０００、約１０００から３０００、または約１０００から２０００、または約１ ０００から１５００の範囲の分子量を有する請求項６２のいずれかに記載のポリ ペプチド。 ６４．請求項６２または請求項６３に記載のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を 有する第２のポリペプチドを充分に複製するアミノ酸配列を含む第１のポリペプ チドであって、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェント条件 下でハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド 、または機能的に同等な同族体。 ６５．請求項３、請求項２６から請求項４６、および請求項４８から請求項６４ のいずれかに記載のポリペプチドを含むキメラ骨刺激因子。 ６６．請求項１、請求項２、および請求項４から請求項２５のいずれかに記載の 化合物を含むキメラ骨刺激因子。 ６７．請求項３、請求項２６から請求項４５、および請求項４９から請求項６４ のいずれかに記載のポリペプチドを治療上有効な量投与することにより哺乳動物 で骨成長を増加させる方法。 ６８．請求項１、請求項２、および請求項４から請求項２５のいずれかに記載の 化合物を治療上有効な量投与することにより哺乳動物で骨成長を増加させる方法 。 ６９．請求項５５または請求項６８に記載のキメラ骨刺激因子を治療上有効な量 投与することにより哺乳動物で骨成長を増加させる方法。 ７０．骨粗鬆症の治療のための請求項３、請求項２６から請求項４６、および請 求項４９から請求項６４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。 ７１．骨粗鬆症の治療のための請求項１、請求項２、および請求項４から請求項 ２５のいずれかに記載の化合物の使用。 ７２．骨粗鬆症の治療のための請求項６５または請求項６８に記載のキメラ骨刺 激因子の使用。 ７３．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項３、請求項２６から請求項４６ 、および請求項４９から請求項５７のいずれかに記載のポリペプチドの使用。 ７４．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項１、請求項２、および請求項４ から請求項２５のいずれかに記載の化合物の使用。 ７５．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項６５または請求項６６に記載の キメラ骨刺激因子の使用。 ７６．請求項３、請求項２５から請求項４８、および請求項４９から請求項６４ のいずれかに記載のポリペプチドの存在を測定するための診断キットであって、 レポーターシステムに結合する前記ポリペプチドに対する抗体を含み、所定量の ポリペプチドと抗体とが互いに結合したときにレポーターシステムが検出可能な 反応を生じる診断キット。 ７７．請求項１、請求項２、および請求項４から請求項２５のいずれかに記載の ポリペプチドの存在を測定するための診断キットであって、レポーターシステム に結合する前記ポリペプチドに対する抗体を含み、所定量のポリペプチドと抗体 とが互いに結合したときにレポーターシステムが検出可能な反応を生じる診断キ ット。 ７８．配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または 配列番号９と識別されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、前記ポリ ペプチドの１つを使用して合成される抗体。 ７９．請求項３、請求項２６から請求項４６、および請求項４９から請求項６４ に記載のポリペプチドのいずれかの発現をコードする単離ＤＮＡフラグメントお よび遺伝子コードの縮重に起因して前記フラグメントと異なっているＤＮＡ。 ８０．請求項３、請求項２６から請求項４５、および請求項４７から請求項６２ のいずれかに記載のポリペプチドのいずれかの発現をコードするＤＮＡ配列を含 むベクター。 ８１．請求項３、請求項２６から請求項４５、および請求項４９から請求項６４ のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含むＤＮＡフラグメントを調製 するステップと、 （ｂ）前記ＤＮＡフラグメントを発現ベクターに組み込んで、前記ＤＮＡフラグ メントを含み、かつ複製可能な組換えＤＮＡフラグメントを得るステップと、 （ｃ）宿主細胞を前記組換えＤＮＡフラグメントで形質転換して、前記ポリペプ チドを発現できる形質転換体を単離するステップと、 （ｄ）前記形質転換体を培養して、形質転換体に前記ポリペプチドを産生させ、 前記ポリペプチドを得られた培養混合物から回収するステップ を含む方法。 ８２．請求項２７に記載の前記アミノ酸配列をコードする単離ＤＮＡ配列または その同族体であって、配列の三次元立体配座に由来する哺乳動物での骨刺激活性 が前記アミノ酸配列を含むポリペプチドで保持される限り、配列のアミノ酸が置 換、欠失もしくは付加することができるもの；前記ＤＮＡとハイブリッド形成し 、哺乳動物で骨刺激活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列； および遺伝子コードの縮重に起因して前記配列と異なっているＤＮＡ。 ８３．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項３、請求項２６から請求項４５、および請求項４９から請求項５４のいず れかに記載のポリペプチドの使用。 ８４．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項１、請求項２、および請求項４から請求項２５のいずれかに記載の化合物 の使用。 ８５．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項６５または請求項６６に記載のキメラ骨刺激因子の使用。 ８６．配列番号９に対応するアミノ酸配列により提供されるアミノ酸側鎖電荷の 電荷パターンおよに空間的配置を有する請求項５０から請求項６２のいずれかに 記載のポリペプチド。 ８７．（ａ）配列番号９と識別されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、 （ｂ）（ａ）の非コード鎖と特異的にハイブリダイゼーションし、かつ、配列番 号９と識別されるポリペプチドも特異的に認識する抗体によって特異的に認識さ れるポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列、および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列によりコードされているポリペプチドと 同じポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 からなる群から選択される第１のＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、配列番号９に対応するアミ ノ酸配列によって提供されるアミノ酸側鎖電荷の電荷パターンを有するポリペプ チドから誘導される化合物。 ２．配列番号９に対応するアミノ酸配列のペプチド主鎖によって提供される主鎖 と実質的に等配電子である主鎖を含む請求項１に記載の化合物。 ３．ポリペプチドである請求項１に記載の化合物。 ４．化合物の電荷パターンが本質的に、配列番号９に対応するアミノ酸配列によ って提供される電荷パターンからなる請求項１に記載の化合物。 ５．配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供される電荷パターンおよび 空間的配置を有する請求項４に記載の化合物。 ６．ポリペプチドである請求項５に記載の化合物。 ７．ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の一方または他方または両方が保護され ている請求項８に記載の化合物。 ８．哺乳動物で骨刺激活性を保持する、配列番号９に対応する配列の置換を含む 請求項１、請求項２または請求項３に記載の化合物。 ９．ポリペプチドである化合物であって、ポリペプチドが誘導される前記配列が 、配列番号１に対応する配列および１つまたは複数の選択した配列の結合体から 選択される２５個までの連続したアミノ酸からなる請求項８に記載の化合物。 １０．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される２０個までの連続したア ミノ酸からなる請求項９に記載の化合物。 １１．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される１５個までの連続したア ミノ酸からなる請求項１０に記載の化合物。 １２．ポリペプチドが誘導される前記配列が、配列番号１に対応する配列および １つまたは複数の選択した配列の結合体から選択される１０個までの連続したア ミノ酸からなる請求項１１に記載の化合物。 １３．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、本質的に、配列番号９に 対応するアミノ酸配列によって提供される電荷パターンからなる電荷パターンを 有する化合物。 １４．配列番号９に対応するアミノ酸配列、配列番号２５に対応するアミノ酸配 列、配列番号２６に対応するアミノ酸配列、配列番号２７に対応するアミノ酸配 列、配列番号３９に対応するアミノ酸配列、配列番号４０に対応するアミノ酸配 列、配列番号４１に対応するアミノ酸配列、配列番号４２に対応するアミノ酸配 列および配列番号４３に対応するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有 し、哺乳動物で骨刺激活性を保持する置換を有するポリペプチドである請求項１ ３に記載の化合物。 １５．配列番号２６に対応するアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドからなる 請求項１４に記載の化合物。 １６．Ｎ末端およびＣ末端が保護されている請求項１５に記載の化合物。 １７．哺乳動物で骨刺激活性を有する化合物であって、配列番号９に対応するア ミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷分布を有し、配列番号１と約８３ ％までの配列相同性を有する化合物。 １８．約３０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である 請求項１７に記載の化合物。 １９．配列番号１と約６９％までの配列相同性を有する請求項１７に記載の化合 物。 ２０．約２５個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である 請求項１９に記載の化合物。 ２１．配列番号１と約５５％までの配列相同性を有する請求項１９に記載の化合 物。 ２２．約２０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である 請求項２１に記載の化合物。 ２３．配列番号１と約４２％までの配列相同を有する請求項２１に記載の化合物 。 ２４．約１５個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である 請求項２３に記載の化合物。 ２５．配列番号１と約２８％までの配列相同を有する請求項２３に記載の化合物 。 ２６．約１０個までのアミノ酸長を有するポリペプチドまたはその結合体である 請求項２５に記載の化合物。 ２７．哺乳動物で骨刺激活性を有するポリペプチドであって、配列番号９と識別 されるアミノ酸配列によって提供される側鎖電荷の電荷分布を有し、２位、３位 、６位、または９位に少なくとも１個の非保存性置換を含んでいるポリペプチド 。 ２８．哺乳動物で骨刺激活性を保持する、配列番号３９、配列番号４１．配列番 号４２、または配列番号４３から誘導されるアミノ酸配列、およびそれらの置換 を有する請求項２７に記載のポリペプチド。 ２９．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号１または配列番号３のＮ末 端から１個から約４個のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号１または配 列番号３のＣ末端から１個から約２２個のアミノ酸を欠失しているか、もしくは （ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１もしくは配列番号３に対応する アミノ酸配列を含むポリペプチド、または機能的に同等な同族体。 ３０．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号４のＮ末端から約４個まで のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から約１６個までのア ミノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番 号４に対応するアミノ酸配列を含む請求項２９に記載のポリペプチド、または機 能的に同等な同族体。 ３１．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号５のＮ末端から約４個まで のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号５のＣ末端から約１１個までのア ミノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番 号５に対応するアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のポリペプチド、または機 能的に同等な同族体。 ３２．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号６のＮ末端から約４個まで のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号６のＣ末端から約５個までのアミ ノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号 ６に対応するアミノ酸配列を含む請求項３１に記載のポリペプチド、または機能 的に同等な同族体。 ３３．哺乳動物で骨成長を促進する、（ａ）配列番号７のＮ末端から約４個まで のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号４のＣ末端から約１個までのアミ ノ酸を欠失しているか、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号 ７に対応するアミノ酸配列を含む請求項３２に記載のポリペプチド、または機能 的に同等な同族体。 ３４．哺乳動物で骨成長を促進する、Ｎ末端から約４個までのアミノ酸を欠失し ている、配列番号８に対応するアミノ酸配列を含む請求項３３に記載のポリペプ チド、または機能的に同等な同族体。 ３５．哺乳動物で骨成長を促進する、配列番号９、配列番号２８、配列番号２９ または配列番号３０に対応するアミノ酸配列を含む、約２０個までのアミノ酸長 のポリペプチド、または機能的に同等な同族体。 ３６．配列番号９に対応するアミノ酸配列によって提供されるアミノ酸側鎖電荷 の電荷パターンを有する請求項２９から３５のいずれかに記載のポリペプチド。 ３７．Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の一方、他方または両方が保護基で 保護されている請求項２９から請求項３６のいずれかに記載のポリペプチド。 ３８．Ｎ末端保護基がアセチル基である請求項３７に記載のポリペプチド。 ３９．Ｃ末端保護基がアミド基である請求項３７に記載のポリペプチド。 ４０．配列番号２９に対応するアミノ酸配列を含んでいる請求項３６に記載のポ リペプチド。 ４１．本質的に、配列番号２９に対応するアミノ酸配列からなり、その保護され た誘導体を含む請求項４０に記載のポリペプチド。 ４２．合成されたポリペプチドであって、アミノ酸配列が約１０００から４００ ０、または約１０００から３０００、または約１０００から２０００、または約 １０００から約１５００の範囲に限定された分子量を有する、請求項２９から３ ８のいずれかに記載のポリペプチド。 ４３．約３０個までのアミノ酸長の配列を有し、（ａ）配列番号１または配列番 号３のＮ末端から１個から約４個のアミノ酸を欠失しているか、（ｂ）配列番号 １または配列番号３のＣ末端から１個から約２２個のアミノ酸を欠失しているか 、もしくは（ａ）と（ｂ）両方をかね合わせた、配列番号１または配列番号３に 対応するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを充分に複製する第１のポリペ プチドであって、ストリンジェント条件下で第２のペプチドをコードするＤＮＡ とハイブリッド形成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド、 または機能的に同等な同族体。 ４４．請求項２７から請求項３９、請求項４２および請求項４３のいずれかに記 載のポリペプチドの保存的に置換された変化体であるポリペプチド。 ４５．哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無機質含 量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくとも約１ ９％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したアミノ酸 配列を有する合成ポリペプチドまたは機能的に同等な同族体。 ４６．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくとも 約２２％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したアミ ノ酸配列を有する請求項４５に記載の合成ポリペプチド。 ４７．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくとも 約２５％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したアミ ノ酸配列を有する請求項４６に記載の合成ポリペプチド。 ４８．哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏで骨刺激活性を有し、哺乳動物の骨の無 機質含量を増加させ、配列番号１と識別されるアミノ酸配列に関して少なくとも 約２８％が保存されており、そこから少なくとも１つのアミノ酸を欠失したアミ ノ酸配列を有する請求項４７に記載の合成ポリペプチド。 ４９．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項４５に記載のポリペプチド。 ５０．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項４６に記載のポリペプチド。 ５１．前記配列から少なくとも６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から 少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１個 のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠失 した請求項４７に記載のポリペプチド。 ５２．前記配列から少なくとも１１個のアミノ酸を欠失した、または前記配列か ら少なくとも１６個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２１ 個のアミノ酸を欠失した、または前記配列から少なくとも２６個のアミノ酸を欠 失した請求項４８に記載のポリペプチド。 ５３．約１０００から４０００、約１０００から３０００、または約１０００か ら２０００、または約１０００から１５００の範囲の分子量を有する請求項４５ から請求項４８のいずれかに記載のポリペプチド。 ５４．請求項４５から５３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む第２のポリペ プチドを充分に複製するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって、第２ のポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリッド形 成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド。 ５５．哺乳動物で骨刺激活性を示すポリペプチドであって、配列番号１、配列番 号３、配列番号４、配列番号５、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番 号８または配列番号９と識別される配列を有するポリペプチド；そのアナログで あって、配列の三次元構造に由来する哺乳動物での骨刺激活性が保持される限り 、配列内のアミノ酸が置換、欠失または付加することができるアナログ；および ポリペプチド配列が配列番号１と識別されるポリペプチド配列を有している場合 、そこから少なくとも１つのアミノ酸が欠失している、各ポリペプチドの結合体 またはその同族体。 ５６．実質的に純粋なポリペプチドであって、アミノ酸配列が約１０００から４ ０００、約１０００から３０００、または約１０００から２０００、または約１ ０００から１５００の範囲の分子量を有する請求項５５のいずれかに記載のポリ ペプチド。 ５７．請求項５５または５６に記載のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する 第２のポリペプチドを充分に複製するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドで あって、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡとストリンジェント条件下でハ イブリッド形成するＤＮＡによってコードされている第１のポリペプチド、また は機能的に同等な同族体。 ５８．請求項３、２６から３９、および４２から５７のいずれかに記載のポリペ プチドを含むキメラ骨刺激因子。 ５９．請求項１、２、および４から２５のいずれかに記載の化合物を含むキメラ 骨刺激因子。 ６０．請求項３、２６から３８、および４２から５７のいずれかに記載のポリペ プチドを治療上有効な量投与することにより哺乳動物で骨成長を増加させる方法 。 ６１．請求項１、２、および４から２５のいずれかに記載の化合物を治療上有効 な量投与することにより哺乳動物で骨成長を増加させる方法。 ６２．請求項５８または５９に記載のキメラ骨刺激因子を治療上有効な量投与す ることにより哺乳動物で骨成長を増加させる方法。 ６３．骨粗鬆症の治療のための請求項３、２６から３９、および４２から５７の いずれかに記載のポリペプチドの使用。 ６４．骨粗鬆症の治療のための請求項１、２、および４から２５のいずれかに記 載の化合物の使用。 ６５．骨粗鬆症の治療のための請求項５８または請求項５９に記載のキメラ骨刺 激因子の使用。 ６６．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項３、２５から３９、および４２ から５７のいずれかに記載のポリペプチドの使用。 ６７．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項１、２、および４から２５のい ずれかに記載の化合物の使用。 ６８．哺乳動物で骨成長を促進するための請求項５８または請求項５９に記載の キメラ骨刺激因子の使用。 ６９．請求項３、２６から３９、および４２から５７のいずれかに記載のポリペ プチドの存在を測定するための診断キットであって、レポーター系に結合する前 記ポリペプチドに対する抗体を含み、所定量のポリペプチドと抗体とが互いに結 合したときにレポーター系が検出可能な反応を生じる診断キット。 ７０．請求項１、２、および４から２５のいずれかに記載のポリペプチドの存在 を測定するための診断キットであって、レポーター系に結合する前記ポリペプチ ドに対する抗体を含み、所定量のポリペプチドと抗体とが互いに結合したときに レポーター系が検出可能な反応を生じる診断キット。 ７１．配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または 配列番号９と識別されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合し、前記ポリ ペプチドの１つを使用して合成される抗体。 ７２．請求項３、２６から３９、および４２から５７に記載のポリペプチドのい ずれかの発現をコードする単離ＤＮＡフラグメントおよび遺伝子コードの縮重に 起因して前記フラグメントと異なっているＤＮＡ。 ７３．請求項３、２６から３８、および４０から５５のいずれかに記載のポリペ プチドのいずれかの発現をコードするＤＮＡ配列を含むベクター。 ７４．請求項３、２６から３９、および４２から５７のいずれかに記載のポリペ プチドを製造する方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含むＤＮＡフラグメントを調製 するステップと、 （ｂ）前記ＤＮＡフラグメントを発現ベクターに組み込んで、前記ＤＮＡフラグ メントを含み、かつ複製可能な組換えＤＮＡフラグメントを得るステップと、 （ｃ）宿主細胞を前記組換えＤＮＡフラグメントで形質転換して、前記ポリペプ チドを発現できる形質転換体を単離するステップと、 （ｄ）前記形質転換体を培養して、形質転換体に前記ポリペプチドを産生させ、 前記ポリペプチドを得られた培養混合物から回収するステップ を含む方法。 ７５．請求項２７に記載の前記アミノ酸配列をコードする単離ＤＮＡ配列または その同族体であって、配列の三次元立体配座に由来する哺乳動物での骨刺激活性 が前記アミノ酸配列を含むポリペプチドで保持される限り、配列のアミノ酸が置 換、欠失もしくは付加することができるもの；前記ＤＮＡとハイブリッド形成し 、哺乳動物で骨刺激活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列； および遺伝子コードの縮重に起因して前記配列と異なっているＤＮＡ。 ７６．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項３、２６から３９、および４２から５７のいずれかに記載のポリペプチド の使用。 ７７．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項１、２、および４から２５のいずれかに記載の化合物の使用。 ７８．骨成長の促進または骨粗鬆症の治療に使用するための薬剤の調製における 請求項５８または請求項５９に記載のキメラ骨刺激因子の使用。 ７９．配列番号９に対応するアミノ酸配列により提供されるアミノ酸側鎖電荷の 電荷パターンを有する請求項４３から５５のいずれかに記載のポリペプチド。