JP2001506131A - ペニシリンｇ又はｖ、セファロスポリンｇ又はｖ、及びその誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ペニシリンＧ又はＶ、又はセファロスポリンＧ又はＶの誘導体の生産に対する発酵方法であって、フェニル酪酸の一定の誘導体が側鎖前駆体として使用されるものを開示する。該フェニル酪酸誘導体において、アシル鎖は、対の炭素原子により伸長され、かつ特定の置換基は、ω−及び／又はω-１の位置に存在する。対応するフェノキシ酪酸誘導体は、ペニシリンＶ又はセファロスポリンＶの誘導体の生産に使用される。任意に、ペニシリン又はセファロスポリンＧ又はＶ化合物は、脱アシル化した対応物を生産するために脱アシル化される。

Description

【発明の詳細な説明】 ペニシリンＧ又はＶ、セファロスポリンＧ又はＶ、及びその誘導体の製造方法 発明の技術分野 本発明は、発酵によるβ−ラクタム製造の分野に関する。 発明の背景 β−ラクタム抗生物質は、臨床用途の長い歴史において、抗生物質化合物の最 も重要なグループを構成する。このグループの中で、著名なものは、ペニシリン 及びセファロスポリンである。これらの化合物は、それぞれ糸状菌ペニシリウム ・クリソゲナム(penicillium chrysogenum)及びアクレモニウム・クリソゲナム( Acremoniumchrysogenum)によって、自然に産生される。 伝統的な株改良技術の結果として、ペニシリウム・クリソゲナム及びアクレモ ニウム・クリソゲナムにおける抗生物質の製造レベルは、過去１０年にわたって 劇的に上昇した。ペニシリン及びセファロスポリンを導く生合成経路についての 増加する知識と、組み換えＤＮＡ技術の出現により、生産株の改良及び化合物の in vivo誘導体化のための新しい手段が利用可能になった。 β−ラクタム生合成に関連する大部分の酵素が確認され、かつ、それらに対応 する遺伝子がクローン化されている。このことは、Ingolia及びQueener、Med．R es．Rev．９、245-264頁、1989年（生合成ルート及び酵素"biosynthesisroute a nd enzymers"）及びAharonowitz、Cohen及びMartin、Ann．Rev．Microbiol．46 、461-495頁、1992年（遺伝子クローニング"gene cloning"）に記載されている 。 Ｐ.クリソケナム中のペニシリンの生合成における最初の２段階は、３種のア ミノ酸、L-5-アミノ-5-カルボキシペンタン酸（L-α-アミノアジピン酸）(A)、 Ｌ−システイン（C）及びL−バリン（V）をトリペプチドLLD-ACV中に濃縮する段 階、次いでイソペニシリンＮ.を形成するためのトリペプチドの環化段階である 。この化合物は、典型的なβ−ラクタム構造を含む。 ペニシリンの生合成におけるこれら最初の２段階は、真菌及びバクテリアを生 成するペニシリン、セファマイシン及びセファロスポリンにおいて共通である。 第３段階は、L-5-アミノ-5-カルボキシペンタン酸の親水性D-α-アミノアジピ ン酸側鎖を、疎水性の側鎖により、酵素アシル基転移酵素（AT）の作用により交 換することを含む。ATにより媒介された酵素の交換反応は、細胞の細胞小器官、 つまり微小体の内部で起こり、このことはEP-A-0448180中に記載されている。 セファロスポリン生産生物において、第３段階は、エピメラーゼによるイソペ ニシリンＮからペニシリンＮへの異性化であり、ペニシリンに特有の五員環構造 は、酵素エキスパンダーゼ(expandase)によって、セファロスポリンに特有の六 員環に伸長される。 産業の関心である、唯一の直接発酵されたペニシリンは、ペニシリンＶ及びペ ニシリンＧであり、それぞれ疎水性の側鎖前駆体フェノキシ酢酸又はフェニル酢 酸を、Ｐ.クリソゲナムの発酵の間に加え、それによって、自然のβ−ラクタム の側鎖とフェノキシ酢酸又はフェニル酢酸とを交換することにより生産される。 フェニル酢酸に次いで、フエニル酪酸及び一定の誘導体がペニシリンＧの生産 を引き起こすが、当該フェニル酪酸は、フェニル酢酸より非常に低い効率でペニ シリンＧを生産する(Behrensら、J．Biol．Chem．175、793-809頁、1948年、Arn stein及びGrant、Bacteriol．Rev．20、133-147頁、1956年)。 フェニル酪酸の特定の誘導体が、フェニル酢酸よりさらに高い効率でペニシリ ンＧの生産を引き起こすことが本発明によって示されたことは、驚くべきことで ある。 本発明の説明 本発明は、フェニル酪酸の一定の誘導体、すなわちアシル鎖が、対の炭素原子 により伸長され、かつ特定の置換基がアシル鎖のω−及び／又はω-１の位置に 存在するフェニル酪酸誘導体が、Ｎ-フェニルアセチルペナム又はセフェム化合 物の発酵生産における側鎖前駆体として都合よく用いられることを開示する。 本発明は、更に、特定のフェニル酪酸誘導体のフェノキシ誘導体を使用して、 Ｎ-フェノキシアセチルペナム又はセフェム化合物を生産することを開示する。 特に、本発明は、Ｎ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナム又は セフェム化合物の発酵生産方法を開示し、ここで、発酵は、側鎖前駆体としての ω-及び／又は（ω-１）置換フェニルアルカン酸の存在下で起こり、前記ω-及 び／又は（ω-１）置換フェニルアルカン酸は、式１の構造を有する。 式中 −Ｒ₁及び−Ｒ₃は、−ＯＨ、＝Ｏ又は−Ｈからなる群より選ばれ、ここで−Ｒ₁ 及び−Ｒ₃は、同じでも異なってもよいが、−Ｒ₁及び−Ｒ₃が双方とも−Ｈ又は ＝Ｏではなく、 −Ｒ₁又は−Ｒ₃がそれぞれ−ＯＨ又は−Ｈである場合、−Ｒ₂又は−Ｒ₄はそれぞ れ−Ｈであり、 −Ｒ₁又は−Ｒ₃がそれぞれ＝Ｏである場合、−Ｒ₂又は−Ｒ₄はそれぞれ存在せず 、 −Ｒ₅は、−ＯＲ₆又は−ＮＨ₂であり、ここでＲ₆は、−Ｈ、−ＣＨ₃又は−ＣＨ₂ ＣＨ₃からなる群より選ばれ、 ｍは、０又は１であり、 ｎは、１から１５までの奇数であり、炭素鎖は任意に二重以上の結合を含む。 フェニルアルカン酸の炭素鎖長の上限は、主に脂肪族アシル基がβ-酸化によ り攻撃される効率により決定されることが理解される。好適には、約１８の炭素 原子までの鎖長を用いてもよく、これは、ｎは１から１５までの奇数であること に関連している。好ましくは、ｎは１から９、好ましくは、１から５までの奇数 である。最も好ましくは、ｎは１である。 好ましくは、−Ｒ₂又は−Ｒ₄が存在しない又は−Ｈであることに関連して、− Ｒ₁又は−Ｒ₃は＝Ｏ又は−ＯＨのいずれかであり、−Ｒ₃及び−Ｒ₄は、−Ｈであ り、−Ｒ₅は、−ＯＨであり、ｍは０又は１であり及び、ｎは１である。好まし くは、−Ｒ₂が存在しない又は−Ｈであることに関連して、−Ｒ₁は＝Ｏ又 は−ＯＨのいずれかであり、−Ｒ₃及び−Ｒ₄は、−Ｈであり、−Ｒ₅は、−ＯＲ₆ であり、ここでＲ₆は−Ｈであり、ｍは０又は１であり及び、ｎは１である。最 も好ましくは、３-ベンゾイルプロピオン酸が、側鎖前駆体として用いられる。 すなわち、Ｒ₁は＝Ｏであり、Ｒ₂は存在せず、Ｒ₃及びＲ₄は−Ｈであり、Ｒ₅は −ＯＨであり、ｍは０であり及び、ｎは１である。 ３-ベンゾイルプロピオン酸は、本発明の方法における好ましい側鎖前駆体で あり、これは、この化合物が比較的安価な成分から都合よく合成されるからであ る(Sommerville及びAllen、Org．Synth．Coll．Vol.11、81-83頁、1943年）。 本発明の方法において、Ｐ.クリソゲナム株を使用すると、ペニシリンＧ又は Ｖが生産される。 フェニル酪酸誘導体３-ベンゾイルプロピオン酸は、フェニル酪酸より非常に 高い効率と、より重要なことに、フェニル酢酸よりさらに高い効率とを有するペ ニシリンＧの生産を引き起こすことがわかる。 加えて、本発明は、組換え型ペナム又はセフェム生産株、即ち組換え型Ｐ.ク リソゲナム又はアクレモニウム・クリソゲナム株を使用することによって、本発 明の前駆体を適用している発酵方法においてセファロスポリンＧ又はＶの誘導体 を生成することを認識する。本発明の発酵方法において使用される特定の組換株 に依存して、異なるセファロスポリンＧ又はＶ化合物が生産される。 脱アセトキシ・セファロスポリンＧ又はＶの誘導体は、例えば、組換え型エキ スパンダーゼ発現Ｐ.クリソゲナム株、即ち、エキスパンダーゼ遺伝子を含む発 現カセットに提供されるＰ.クリソゲナム株により生産される(EP 0532341又はWO 95/04149の「エキスパンダーゼ発現Ｐ.クリソケナム株」を参照のこと)。この点 において、WO96/38580は、ペニシリンＧが、in vivoでエキスパンダーゼ発現Ｐ. クリソゲナム株中に伸長され得ることを開示するので、W096/38580は関連がある 。 組換え型エキスパンダーゼ発現Ｐ.クリソゲナム株が、付加的な関連するセフ ァロスポリン生合成遺伝子、例えば、ヒドロキシラーゼをコード化している遺伝 子及び／又はアセチル転移酵素をコード化している遺伝子を含む１以上の発現カ セットに提供される場合、脱アセトキシ化合物以外のセファロスポリンＧ又はＶ の誘導体が生産される。あるいは、脱アセトキシ化合物以外のセファロスポリン Ｇ又はＶの誘導体は、アシル基転移酵素遺伝子を組換え的に発現するＡ.クリソ ゲナム株を用いて生産される。 本発明の方法は、好適なペナム又はセフェム生産株、即ち前記菌類株の発酵に よって、好適な発酵培地中で行われる。使用される発酵条件は、本発明にとって 重大ではないが、発酵が、側鎖前駆体としての式１のフェニル又はフェノキシ酪 酸誘導体の存在下で起こるものを提供した。例えば、発酵条件は、EP 0532341に 開示されたものを適用してもよい。 発酵工程に続き、発酵して生産したペニシリンＧ又はＶ、又はセファロスポリ ンＧ又はＶの誘導体は、当業者に公知の好適な技術を使用して、発酵培養液から 回収される。 任意に、ペニシリンＧ又はＶ、又はセファロスポリンＧ又はＶの誘導体は、対 応する脱アシル化したペニシリン、即ち６-アミノペニシラン酸(6-APA)、又はセ ファロスポリン、例えば、７-アミノデアセトキシセファロスポラン酸(7-ADCA) 、７-アミノデアセチルセファロスポラン酸（7-ADAC）又は7-アミノセファロス ポラン酸（7-ACA）を生成するために脱アシル化されてもよい。脱アシルは、い かなる好適な手段によっても行われる。好ましくは、脱アシルは、１段階の酵素 的な方法によって、好適な酵素を使用して行われる。ペニシリンＧ又はセファロ スポリンＧ誘導体の脱アシル化のための好適な酵素は、大腸菌又はＡ.ファエカ イス(A.faecalis)由来のアシラーゼであり、及びペニシリンＶ又はセファロスポ リンＶ化合物の脱アシル化のための好適な酵素は、菌類源由来のアシラーゼ、例 えばフラリウム(Fusarium)である。繰り返し酵素を使用できるように、好ましく は、固定化酵素が使用される。 本発明の好適な実施例として、Ｐ.クリソゲナムは、好適な培養液中、側鎖前 駆体としての３-ベンゾイルプロピオネートの存在下で発酵される。バイオマス を分けた後に、得られた発酵培養液を、ペニシリンの存在に対し、HPLC及び／又 はプロトンNMRを使用して分析する。ペニシリンＧは、発酵培養液に存在する唯 一のペニシリンであることがわかる。加えて、３-ベンゾイルプロピオネートは 、フェニルアセテートより効率的にペニシリンＧを生産することが示されたこ とは驚くべきである。 実施例１ 側鎖前駆体として３-ベンゾイルプロピオン酸を使用するペニシリンＧの生産 使用される株 ペニシリウム・クリソゲナム・ウィスコンシン54-1255（ATCC 28089） 溶液 前駆体-溶液：1M ＫＯＨでｐＨ6.5に調整した10%（w/v）前駆体を、使用前に フィルター殺菌した。 成長条件 振りフラスコ中におけるＰ.クリソゲナム・ウィスコンシン54-1255株の２段階 発酵を、ペニシリンの生産に使用した。種段階は、２×１０⁸胞子を50ml/500ml の培地フラスコに加えることによって開始した。当該培地は、（g/l）単位で、 グルコースを３０g/l、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を１０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄を１０g/l、微量 元素溶液Ｉ（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏが２５g/l,、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏが１０g/l、 ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏが０．５g/l、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏが２g/l、Ｎａ₂ＳＯ₄が５ ０g/l、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏが２g/l、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏが５g/l）を１０（ml/l ）（殺菌前のｐＨは６．５）で構成される。 種培養を48-72時間25-30℃でインキュベートし、次いで、10〜20体積の生産培 地を播種するために使用した。当該生産培地は、(g/l)で：ラクトースを８０g/l 、マルトースを２０g/l、ＣａＳＯ₄を４g/l、尿素を３g/l、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ を２g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄を７g/l、ＮａＣｌを０．５g/l、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を６g/l、 ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０．１g/l、微量元素溶液II(ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏを０．５ g/l、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを２g/l、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏを２g/l、Ｎａ₂ＳＯ₄を５ ０g/l）、（殺菌前のｐＨは５．５〜６．０）を含む。選択した前駆体(溶液1)を 、指示された濃度で加えた。その後、インキュベーションを、更に120時間続け た。 ペニシリン生産に対する異なる側鎖前駆体を利用するためのペニシリウム・ク リソゲナムの能力を試験した。フェニル酢酸、酪酸、フェニル酪酸及び３-ベン ゾイルプロピオン酸を、最終濃度０．０４％及び０．０８％（w/v）で試験した 。生産段階の最後に、培養濾液を集めてH-NMRによって検査した。 前駆体を添加しない場合、培地に蓄積した主なβ−ラクタムは、６-アミノペ ニシラン酸及びイソペニシリンＮであった。フェニル酢酸、フェニル酪酸又は３ -ベンゾイルプロピオン酸のいずれでも添加すると、ペニシリンＧを唯一生産し た（表１）。ペニシリンＧの最も高い生産量は、０．０８％（w/v）の３-ベンゾ イルプロピオン酸を使用して得られた。 表１異なる側鎖前駆体を有するペニシリン生産 1）H-NMRによって測定 2）初期のフェニル酢酸濃度０．０４％におけるペニシリンＧの生成量との比較 （w/v）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｐ 37/00 Ｃ１２Ｒ 1:82） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｎ−フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナム又はセフェム化合 物の生産方法であって、当該Ｎ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチル ペナム又はセフェム化合物の脱アシル化を任意に含み、以下の工程を含むこと を特徴とする方法。 （１）発酵培地中、次式１の側鎖前駆体の存在下で、好適なペナム又はセフェ ム生産株を発酵する工程、 （式中 −Ｒ₁及び−Ｒ₃は、−ＯＨ、＝Ｏ又は−Ｈからなる群より選ばれ、ここで −Ｒ₁及び−Ｒ₃は、同じでも異なってもよいが、−Ｒ₁及び−Ｒ₃が双方とも− Ｈ又は＝Ｏではなく、 −Ｒ₁又は−Ｒ₃がそれぞれ−ＯＨ又は−Ｈである場合、−Ｒ₂又は−Ｒ₄はそれ ぞれ−Ｈであり、 −Ｒ₁又は−Ｒ₃がそれぞれ＝Ｏである場合、−Ｒ₂又は−Ｒ₄はそれぞれ存在せ ず、 −Ｒ₅は、−ＯＲ₆又は−ＮＨ₂であり、ここでＲ₆は、−Ｈ、−ＣＨ₃又は−Ｃ Ｈ₂ＣＨ₃からなる群より選ばれ、 ｍは、０又は１であり、 ｎは、１から１５までの奇数であり、炭素鎖は任意に二重以上の結合を含む。 ） （２）Ｎ−フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナム又はセフェム 化合物を発酵培養液から回収する工程、及び （３）任意に、生産したＮ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナ ム又はセフェム化合物を脱アシル化し、及び対応する脱アシル化ペナム又はセ フェム化合物を回収する工程。 ２．Ｎ-フェニルアセチルペナム又はセフェム化合物を生産する方法であって、 発酵が、ｍが０である式１の側鎖前駆体を使用して行われる、請求項１に記載 の方法。 ３．Ｒ₁が＝Ｏであり、Ｒ₃及びＲ₄が、−Ｈであり、Ｒ₅が−ＯＨであり、ｍが０ であり、ｎが１である、式１の側鎖前駆体を使用して発酵が行われる、請求項 ２に記載の方法。 ４．Ｎ−フェノキシアセチルペナム又はセフェム化合物を生産する方法であって 、 発酵が、ｍが１である式１の側鎖前駆体を使用して行われる、請求項１に記載 の方法。 ５．Ｎ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナム化合物を生産する方 法であって、ペナム又はセフェム生産株が、ペニシリン・クリソゲナムであり 、 かつＮ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルペナム化合物がペニシリ ンＧ又はＶである、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。 ６．ペニシリンＧ又はＶが、６-アミノペニシラン酸を生産するために脱アシル 化される、請求項５に記載の方法。 ７．Ｎ-フェニルアセチル又はＮ-フェノキシアセチルセフェム化合物を生産する 方法であって、ペナム又はセフェム生産株が、エキスパンダーゼを発現する組 換え型ペニシリン・クリソゲナム株であり、かつＮ-フェニルアセチル又はＮ- フェノキシアセチルセフェム化合物がセファロスポリンＧ又はＶの誘導体であ る、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。 ８．セファロスポリンＧ又はＶの誘導体を脱アルキル化して、７-アミノデアセ トキシセファロスポラン酸、７-アミノデアセチルセファロスポラン酸又は７- アミノセファロスポラン酸を生産する、請求項７に記載の方法。