JP2001504235A

JP2001504235A - ポリヌクレオチド分離のバンド列の表示

Info

Publication number: JP2001504235A
Application number: JP53980398A
Authority: JP
Inventors: グジエルド，ダグラス・テイ; テイラー，ポール・デイ
Original assignee: トランスジエノミツク・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2001-03-27
Also published as: AU746851B2; EP0984978A1; WO1998040395A1; AU6461098A; EP0984978A4; CA2284164A1; US6355417B2; US20010008761A1

Abstract

(57)【要約】クロマトグラフィーの方法により分離された二本鎖核酸断片を、正確に定量化、至適化および記憶され得る１個のバンドの列として表わすための方法および装置。例えばマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）方法を使用して、ＵＶ検出器からのアナログ出力がディジタル化されかつコンピュータに入力される。ディジタル化された信号が１個の直線状のバンドの列に変換され、これがビデオディスプレイ端末上で表示されうる。バンドの強度および／もしくは色は、ディジタル化された信号中の対応する一点でユーザーに選択される閾値レベルより上のそれぞれの画分もしくはそれぞれの二本鎖核酸断片中の二本鎖核酸の量と相互に関係しうる。バンドの列中の各バンドの算出された塩基対長さ、濃度および保持時間がアルファニューメリック形式で表示されうる。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド分離のバンド列の表示本発明は二本鎖核酸の分離の改良されたバンド列の表示(band arraydisplays) のための方法およびシステムに関する。より具体的には、本発明は、分離された二本鎖核酸断片を表わすバンドの直線状の列の表示を生じせしめることに向けられる。二本鎖核酸断片の混合物は、法医学的調査から遺伝子マッピングまでの範囲にわたる多種多様な理由で分離される。ＤＮＡおよび他の二本鎖核酸断片の混合物を分離するための伝統的かつ最も広く使用される方法はスラブゲル電気泳動（ＧＥＰ）である。この古典的方法による二本鎖核酸断片混合物の分離は１個の直線状のバンドの列を生じ、ここで列中の各バンドはその混合物の分離された二本鎖核酸成分を表わす。多くの混合物は、典型的には同一のゲルスラブ上の別個のレーンで同時に分離かつ分析されるため、平行した一連のこうした直線状のバンド列が生じせしめる。原則として、これは高度に望ましい表示形式である。なぜならそれは観察者が多くの分離された混合物を同時に容易に比較することを可能にするからである。別のものと比較して１個の直線状の列中でのいずれかのバンドの存在もしくは非存在が、その分離が表示上で見える場合は容易に識別できる。しかしながら、実務において、ＧＥＰ表示の方法論はこの方法に内在する重大な欠点を被る。バンドはしばしばまっすぐよりむしろ湾曲し、それらの移動度および形状はゲルおよびレーンの幅の全域で変化し得、また、バンドが相互に混合し得る。こうした不正確性のもとは、ゲル床、電気浸透現象、熱勾配および拡散効果、ならびに多数の他の因子の均一性(uniformity)および等質性 (homogeneity)の欠如から生ずる。この種の不正確性はＧＥＰ技術で公知であり、そして分離結果の表示物中の重大なゆがみおよび不正確につながり得る。加えて、ＧＥＰ分離から得られるバンド表示データは、バンドの形状および完全性に関する不確実性のため定量的もしくは正確でない。ＧＥＰ分離により生じられる直線状のバンド列の表示の真の定量化は、直線状のバンド列が検出器で走査されそして生じるデータが積分される(integrated)場合でさえ達成され得ない。なぜなら直線状のバンド列はバンドの中央を横切ってのみ走査されるからである。検出器はいずれかの与えられたバンドの小部分を調べるのみであり、そしてバンドは均一でないため、走査法により生じられる結果は正確でなくかつ誤解さえさせ得る。ＧＥＰにより分離された二本鎖核酸混合物の成分を表わす直線状のバンド列は、蛍光、化学的染色の使用、ゲルに色素を添加すること（これはバンドを見えるようにする）、もしくはＧＥＰ分離前に放射活性Ｐ−32によるＤＮＡの標識化(t agging)、次いでオートラジオグラフィーによる直接可視化を包含する多様な方法により可視化されている。これらの可視化法は、平行した直線状のバンドの列から成る表示を生じ、それはゲルスラブそれ自身の直接ハードコピー表示である。この様式で生じる分離の表示は、そのように表示されるバンドの縁ははっきりと規定されているよりはむしろしばしば不鮮明かつ散漫であるため、ゆがめられかつ不正確であり得る。例えばオートラジオグラフィー技術では、各バンド中の分離されたヌクレオチド成分から放射される放射線は全方向性である。これは、ゲルスラブと接触したフィルムの露光領域が実際のバンドの寸法により表わされるものより大きくなることを引き起こして広げられたかつ不鮮明な表示をもたらす。こうした表示中の隣接するバンドを分析することは、とりわけ各バンド中に存在する二本鎖核酸の相対的濃度に大きな差異が存在する場合に重大な問題となり得る。こうした場合には、より強いバンドがより弱いバンドをわかりにくくし得、そして後者は見えないかも知れない。表示されたデータは固定されるため、それは強められ、至適化されもしくは操作され得ず、そして重要な情報がしばしば気づかれないようになり得る。不完全なもしくは不十分な分離の表示を改良する唯一の方法は、より希薄なサンプルもしくはより弱い染色を使用して分離を再実施する(re-run)ことである。これは極めて時間がかかる。なぜならゲル電気泳動分離は５時間もしくはそれ以上までかかり得るからである。従って、明瞭な必要性が、一般に二本鎖核酸の分離、そしてとりわけＤＮＡおよびＲＮＡの分離のための改良されかつ融通のきくバンド列の表示形式について存在し、これは電子的に至適化、定量化かつ記憶され得る。第一の局面において、本発明は、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)により分離された二本鎖核酸断片を１個のバンドの列として表わす方法を提供し、当該方法は、画分中の二本鎖核酸断片に対応するディジタル化された信号を提供すること；そしてそのディジタル化された信号を１個のバンドの列に変換することを含んで成る。第二の局面において、本発明は、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)により分離された二本鎖核酸断片を１個のバンドの列として表わすための装置を提供し、当該装置はディジタル化された信号を捕捉するための捕捉手段（当該ディジタル化された信号は画分中の二本鎖核酸断片に対応し）、ディジタル化されたシグナルを画分中の二本鎖核酸断片に対応する１個のバンドの列に変換するための変換手段、およびそのバンドの列を表示するための表示手段を含んで成る。本発明の好ましい一態様において、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)分離方法からのアナログ信号出力が、アナログからディジタルに(analog-to-digital)（Ａ／Ｄ）変換され、そしてディジタル化された信号がコンピュータに入力される。コンピュータでは、ディジタル化された信号が１個の直線状のバンドの列に変換され、これがビデオディスプレイ端末（ＶＤＴ）、プリンタもしくは他の出力装置上で表示されうる。バンドは線もしくは固定された幅の長方形として表示されうる。バンドの強度および／もしくは色は、ディジタル化された信号中の対応する一点でユーザーに選択された閾値レベルより上のそれぞれの画分もしくはそれぞれの二本鎖核酸断片中の二本鎖核酸の量と相互に関係しうる。図１は本発明のバンド列表示を生じさせるためのシステムの一態様の図解表示である。図２は本発明のバンド列表示を生じさせるためのシステムの一態様中の検出器からのアナログ出力のサンプル信号の代表的なものを具体的に説明する。図３は、サンプル信号中のピークの本発明のバンド表示への変換の具体的説明である。図４は本発明のグレースケールのバンドの具体的説明である。図５はサンプル信号中のピークのバンド表示への変換の一態様を描くフローチャートであり、ここでバンドは長方形として表わされる。図６はサンプル信号中のピークのバンド表示への変換の一態様を描くフローチャートであり、ここでバンドは線として表わされる。図７、８および９は本発明のサンプル表示の具体的説明である。本発明は二本鎖核酸混合物の分離を表わすバンドの改良された直線状の列表示を生じ、ここで１個の列中の各バンドは混合物の成分の断片を表わす。当該バンド列表示はディジタル化されたデータの図形(graphical)表示から生じられる。直線状のバンド列は二本鎖核酸およびとりわけＤＮＡの分離結果を表示しかつ見るのに好ましい形式である。なぜならこれはＧＥＰすなわちもっとも広く使用される二本鎖核酸の分離方法の表示形式であるからである。正確に定量化、至適化かつ記憶され得る、クロマトグラフィー分離から得られるディジタル化されたデータから生じられた直線状のバンド列の表示はこれまで開示されていない。最近、二本鎖核酸断片の混合物が、ボン(G．Bonn)らへの米国特許第５，５８５，２６３号（引用によりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）で詳細に記述されたような非極性ポリマー固定相上で分離された。マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matched Ion Polynucleotide Chromatography) （ＭＩＰＣ）と呼ばれる前述の分離の方法論の範囲および利用性の大きな改良が、同時係属出願（代理人摘要書(docket)番号ＴＲＡＮ１−０７６およびＴＲＡＮ１−０７７）に開示され、これらは引用によりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。ＭＩＰＣによる二本鎖核酸断片の混合物の分離は、同時係属出願（代理人摘要書番号ＴＲＡＮ１−０３１）に記述されるような金属および金属イオン汚染物質の除去によりさらに高められうる。本明細書で使用されるところのＭＩＰＣは、分離されている最小の二本鎖核酸を排除するのに有効である孔径を有する非極性ビーズを使用する一本鎖および二本鎖核酸の分離方法と定義され、ここで当該方法は対イオン剤および有機溶媒を使用してビーズから二本鎖核酸を脱着させる。ＭＩＰＣは、塩基対長さを基礎としかつ核酸配列を基礎とせずに二本鎖核酸断片、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を分離する。ＭＩＰＣは大きさを基礎とする分離である。ＭＩＰＣは自動化され得かつコンピュータ制御され得る。５〜1500塩基対を有するＤＮＡ断片の分離は５分未満で効果的に達成され得る。こうした分離は鮮明かつ再現可能な結果を生じる。従って、ＭＩＰＣが、本発明を伴う使用に好ましい二本鎖核酸分離方法として選択された。なぜなら、それは、電子的に至適化かつ定量化され得るディジタル化されたデータから生じられる正確な直線状のバンド列の表示形式を生じさせるのに理想的な技術を提供するからである。二本鎖核酸断片を分離することが可能な他の適するクロマトグラフィーの方法もまた使用されてよい。図１は本発明の第一の局面のバンド列の表示を生じさせるためのシステム２の一態様の図解表示である。当該システムは検出器６に接続された分離カラム４を包含する。この検出器はＡ／Ｄ変換器８に接続されるアナログ出力を有する。Ａ／Ｄ変換器出力はＣＰＵ１０、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）に接続される。ＣＰＵは、分離された二本鎖核酸断片を表わすディジタル化されたデータを変換しそして１個の直線状のバンドの列（ここで各バンドは元の混合物の分離された１個の断片に対応する）の図形表示を出力するためのソフトウェア（図１で具体的に説明されない）を包含する。接近して動く(close-running)断片は若干の分離では完全に分離されなくてもよいことが理解される。ＣＰＵ１０はデータを記憶するための記憶装置（例えばハードディスク、フロッピーディスクなど）１６に接続される。ＣＰＵ１０は、ビデオディスプレイ端末（ＶＤＴ）１８、プリンタ２０、または分離されたヌクレオチド断片の図形表示を表示もしくは別の方法で出力するための他の出力装置（具体的に説明されない）に接続されてよい。ＣＰＵ１０はまた、キーボード１２および位置入力装置１４、例えばマウス、トラックボール、タッチパッドなどにも接続される。好ましい分離カラム４は、米国特許出願（代理人摘要書番号ＴＲＡＮ１−０７６）および（代理人摘要諸番号ＴＲＡＮ１−０７７）に記述されたようなＭＩＰＣに適するビーズで充填される。好ましい検出器６は260nmすなわちＤＮＡの吸収極大で稼働する紫外（ＵＶ）検出器である。検出されるべき断片が蛍光もしくは放射活性マーカーで標識される場合には、それぞれ蛍光検出器もしくは放射能検出器が使用されてよい。分離されている断片を検出することが可能であるいかなる検出器もシステム２で使用されてよい。システム２は所望の形状を有するバンドを生じさせ、これらは二本鎖核酸混合物の分離された成分についての質的および量的双方の情報を提供する。例えば、好ましい形状は線もしくは固定された幅の細長い長方形の形態のバンドである。バンドの長さおよび場合によっては強度は、線であれ長方形であれそのバンドにより表わされる混合物成分の吸光度に比例する。バンドの長さおよび場合によっては強度は成分の相対的および絶対的濃度の真のかつ正確な量である。なぜなら１個のバンドにより表わされるサンプル全体が検出器により調べられるからである。これはゲルスラブを走査することと対照的であり、そこでは検出器は通常バンドの中央を調べるのみである。ＧＥＰ分離により生じられるバンドは一般に均一でないため、そのように得られたデータは定量的でも正確でもない。二本鎖核酸の分離結果を表わす１個のバンドの列を生じさせるためのシステム２の操作は以下のとおりである。二本鎖核酸断片の混合物の溶液が、米国特許出願（代理人摘要書番号ＴＲＡＮ１−０７６およびＴＲＡＮ１−０７７）に記述されたような分離カラム４中でその成分の断片に分離され、ここで二本鎖核酸断片が大きさすなわち塩基対の数を基礎として分離される。二本鎖核酸混合物は、分離の性質を変えることなく検出の感度を高めるように蛍光もしくは放射活性マーカーで標識されうる。二本鎖核酸混合物を分離するのに有能な移動相溶媒がカラム４を通って流される。移動相の正確な組成は分離されている二本鎖核酸混合物の性質および分子量範囲とともに変動するとは言え、最も効果的な移動相は、水、水と完全に混和できる有機溶媒および対イオン剤を含有する。好ましい有機溶媒はアセトニトリル、テトラヒドロフランおよびＣ−１ないしＣ−３アルカノールを包含する。二本鎖ＤＮＡの分離を包含する二本鎖核酸の分離を遂げるのに使用されている特定の移動相の例は、米国特許出願（代理人摘要書番号ＴＲＡＮ１−０７６およびＴＲＡＮ１− ０７７）に記述される。カラム流出物はカラムに接続される検出器６を過ぎて流れるよう指図される。検出器は二本鎖核酸もしくはそれらの標識された類似物を検出することが可能でなくてはならない。好ましい検出器はＵＶ光源およびＵＶ感知装置を使用して稼働し、そして流出物が検出器を過ぎて流れる際に流出物のＵＶ吸収の変化を測定することにより二本鎖核酸断片の存在を検出する。分離されるべき混合物中の二本鎖核酸断片が分離に先立ち蛍光もしくは放射活性マーカーで標識されている場合には、それぞれ蛍光もしくは放射能検出器が使用され得る。移動相がカラムを通って流れる際に、それは分離された二本鎖核酸断片を運搬し、これらはより少ないからより多い数の塩基対の順序でカラムを通りそして検出器を過ぎて溶出する。通常の状況下では、カラムに入るサンプルの全部がカラムを出、そして検出器セルを通って移動する。二本鎖核酸断片の存在はそれらが検出器を過ぎて流れる際に検出され、検出器は、典型的にはアナログ出力信号、典型的にはアナログ変動電圧を生じることにより応答する。出力信号の大きさは、いずれかの所定の時点で検出器を通過する移動相中に存在する二本鎖核酸の量および吸光度の関数である。検出器６のアナログ出力信号がＡ／Ｄ変換器８に入力され、ここで信号がディジタル化され、そしてディジタル化された信号がＣＰＵ１０に入力される。Ａ／Ｄ変換器８が検出器６のアナログ出力をサンプリングしかつディジタル化する速度は、カラム４および検出器６を通る混合物の流速に依存し、そして場合によっては変動されてよい。好ましい一態様において、Ａ／Ｄ変換器８は可変性のサンプリング速度を有し、これはデータ収集を至適化するよう調節され得る。一般に効果的なサンプリング速度は100ミリ秒間隔である。サンプリング速度が変動される場合には、これが、ディジタル化された信号が処理およびバンド表示への変換のためコンピュータで再構築される場合に考慮に入れられる。ディジタル化された信号がＣＰＵ１０により受領され、そして後の処理のため記憶装置１６に記憶されてよい。ディジタル化されたデータは表示／もしくは変換されることができ、そして実時間および／もしくはオフラインで（すなわち後の時間に）バンドの形態で表示されることができる。検出器からのデータの全部が、たとえデータが、ある関数が何らかの別個の特性を表示するのに使用されるように操作される場合であっても、バンドを表示するのに使用される。例えば、バンドは、予め決められた信号閾が達せられる場合にのみ示されうる。しかしながら、この閾値より上のデータの全部がバンドを表示するのに使用される。分離された断片の絶対的濃度は、断片に対応する信号を適切な標準品のものと比較することにより決定され得る。例えば、既知の塩基対長さおよび濃度の標準品が、分離された断片に対する検出器の応答を標準化するのに使用されうる。場合によっては、二本鎖核酸断片混合物が蛍光もしくは放射活性マーカーで標識される場合は、それぞれ蛍光もしくは放射活性の標準品が使用されうる。図２は検出器６からのアナログ出力を代表するサンプル信号１００を具体的に説明する。サンプル信号１００は３個のピーク１０２、１０４、１０６を包含し、これらは３種の異なる塩基対長さの二本鎖核酸断片を含有する混合物に応答した検出器６の出力を表わす。サンプル信号１００の高さは、検出器６を過ぎて流れる二本鎖核酸断片の瞬間的な量を時間の関数として表わす。３個のピーク１０２、１０４、１０６は、混合物中で検出される３種のそれぞれの異なる塩基対長さのそれぞれの二本鎖核酸断片の量を表わし、また、ピーク１０２、１０４、１０６の曲線のそれぞれの下の総面積は、混合物中で検出される３種のそれぞれの異なる塩基対長さの二本鎖核酸断片の総量を表わす。図２および後の図に具体的に説明される信号１００は具体的説明のみとしてであり、そして検出器６からの実際の信号出力を必ずしも表わさない。図３はサンプル信号１００のピーク１０２、１０４、１０６のバンド表示への変換を具体的に説明する。図３の再構築された信号１００’は元のサンプル信号１００（図２）のディジタル化された値から再構築された信号を表わす。ただ考察および表示の目的上、再構築された信号１００’は、サンプル信号１００が図２で具体的に説明される状態から90度回転されて示される。図３では、時間、そしてこれゆえに塩基対長さが上から下へと増大し、そして再構築された信号１００’の大きさが右へ増大する。二本鎖核酸断片の図形の、例えばバンドの表示はいくつかの形態をとりうる。例えば、第一の列１１０では、再構築されたピーク１０２’、１０４’、１０６ ’のそれぞれは対応する線１１２、１１４、１１６の形態のバンドにより表わされ、線１１２、１１４、１１６の垂直位置はそれぞれの再構築されたピーク１０２’、１０４’、１０６’の最大値に対応する。第二の列１２０では、再構築されたピーク１０２’、１０４’、１０６’のそれぞれが長方形１２２、１２４、１２６の形態のバンドにより表わされ、それぞれの長方形１２２、１２４、１２６の垂直位置および長さ（紙上での垂直高さ）は第一のユーザーに選択された閾値Ｔ₁に対応する。第三の列１３０では、再構築されたピーク１０２’、１０４ ’、１０６’のそれぞれが長方形１３２、１３４、１３６の形態のバンドにより表わされ、それぞれの長方形１３２、１３４、１３６の垂直位置および長さは第二のユーザーに選択された閾値Ｔ₂に対応する。Ｔ₁は、再構築された信号１００’上でＴ₂より大きな大きさに設定されるため、Ｔ₁に対応する第二のバンド列１２０のバンド１２２、１２４、１２６のそれぞれは、Ｔ₂に対応する第三のバンド列１３０の対応するバンド１３２、１３４、１３６より短い長さを有する。本発明のシステムは、所望のバンド表示形態、例えば線もしくは長方形を選択する能力をユーザーに提供し、そして、ユーザーが、ノイズもしくは再構築された信号１００’中の他の成分を濾過して除くように閾値を変えることもまた可能にする。加えて、線もしくは長方形のバンド表示が選ばれる場合は、ユーザーは、グレースケール、色、もしくは他の表示形態を表示することを選択することができ、ここでは例えばグレースケールの強度もしくは色が再構築された信号の大きさに対応する。代表的なグレースケールのバンド１０８が図４に具体的に説明される。図４にもまた具体的に説明されるように、利用可能な量子化レベルの数に依存して、グレースケールのバンド表示は別個の水平の下位バンドの連続として現われる傾向がありうる。本発明の好ましい一態様において、「混和された(blended )」グレースケールのバンド表示（バンド全域のアナログ変動を表わす）が、個々の画素を「点灯する(turn on)」もしくは「消す(turn off)」ことにより形成される。バンドを形成するそれぞれの画素の線において、各画素を「つける」もしくは「消す」ことの決定は、再構築された信号１００’の対応する大きさに無作為数倍をかけることにより得られる。生じる積がある閾値より大きい場合には、画素は点灯される、すなわち黒い（もしくは色の）点として表示される。さもなければ画素はそのように表示されない。かように、再構築された信号１００’の大きさが増大する際に、より多くの画素がそれぞれのバンドの対応する線に沿って表示されることができる。図５は、サンプル信号中のピークのバンド表示への変換の一態様を描くフローチャートであり、ここでバンドは長方形として表わされる。図６は、サンプル信号中のピークのバンド表示への変換の一態様を描くフローチャートであり、ここでバンドは線として表わされる。双方のフローチャートは、バンドが前に収集されかつ記憶されたデータから形成されているかのように記述されることができる。しかしながら、当業者は、基本的手順が、サンプル信号データをバンド表示に実時間で変換するのに使用され得ることを容易にわかるであろう。当業者はまた、これらのフローチャートが本発明の範囲から離れることなく多数の異なる形態で描かれ得ることも認識するであろう。いずれかのフローチャートに入るのに先立ち、ユーザーは、典型的には、メニュー選択から長方形もしくは線の表示を選択することができる。最初に図５を参照すれば、流れは初期化(INITIALIZE)処理ブロック２０１で始まり、ここで、カウンタ、所望の信号閾および他の変数が初期化される。サンプルカウンタがその後、インクリメントカウンタ(INCREMENT COUNTER)処理ブロック２０２で１だけ増される。サンプルカウンタにより示される現在のサンプルが、サンプルＧＥ閾値(SAMPLE．GE．THRESHOLD)決定ブロック２０３で信号閾と比較される。現在のサンプルがその閾値より上である場合には、そのサンプルが新バンド(NEW BAND)決定ブロック２０４により決定されるような新たなバンドの開始として確立される場合は新たなバンドがバンド開始(START BAND)処理ブロック２０５で開始される。バンド開始(START BAND)２０５処理ブロックで、そのバンドのグラフィック表示出力(g raphic display output)が開始され、また、変数が、サンプル濃度および他の関連する量を算出するため初期化される。流れはその後最終サンプル(LAST SAMPLE )決定ブロック２０９を通過する。使用される溶出溶媒の量は全核酸混合物をカラム４および検出器６（図１）を通過させるのに十分であるため、最終サンプル (LAST SAMPLE)決定ブロック２０９は、サンプル信号がその閾値より上である（その後検出器により検出されている断片を表わす）場合は常にそのＮＯ出口を通って流れることができる。流れがその後インクリメントカウンタ(INCREMENT COUNTER)処理ブロック２０２まで戻る。バンドが開始され、すなわちサンプル信号がユーザーに特定された閾値に達するもしくはこれを越え、そしてサンプル信号が閾値でもしくはそれより上で留まれば、新バンド(NEW BAND)２０４決定ブロックからの流れがそのＮＯ出口を通ってバンド拡張(EXTEND BAND)処理ブロック２０６に流れ、ここでそのバンドのグラフィック表示出力が継続し、かつ、濃度および他の量が累算される。この処理はサンプル信号がこの閾値より下に低下するまで継続し、それはサンプルＧＥ閾値(SAMPLE．GE．THRESHOLD)決定ブロック２０３をそのＮＯ出口を通ってバンド中(IN BAND)決定ブロック２０７に流れさせることができる。第一の閾値下サンプルがバンドが開始した後に遭遇される場合、バンド中(IN BAND)決定ブロック２０７はそのＹＥＳ路を通ってバンド終了(END BAND)２０８処理ブロックに流れることができる。バンド終了(END BAND)処理ブロック２０８では、そのバンドのグラフィック表示出力が前のサンプル（閾値にもしくはそれより上にあった）で停止され、また、濃度および他の関連する量が表示もしくは他の使用のためユーザーにより選択されたとおり記憶される。この処理は、サンプルＧＥ閾値(SAMPLE．GE．THRESHOLD)決定ブロック２０３がそのＮＯ出口を通って流れ、バンド中(IN BAND)決定ブロック２０７がそのＮＯ出口を通って流れ、そして最終サンプル(LAST SAMPLE)決定ブロック２０９が、ラン(run)の最終サンプルを示す、そのＹＥＳ出口を通って流れるまで継続する。閉鎖(CLOSE)処理ブロック２１０で、全濃度および他の関連する量を要約するデータが算出され、記憶され、また、表示されることができる。図４に具体的に説明されかつ上述されたとおり、バンドは、ディジタル化された検出器信号の値を表わすように、色、強度、無作為画素を使用する混和されたグレースケールなどを使用して表示されうる。これは、例えばバンド開始(STARD BAND)２０５、バンド拡張(EXTEND BAND)２０６およびバンド終了(END BAND)２０８処理ブロックのそれぞれで企図されてよい。図６を参照すれば、流れは初期化(INITIALIZE)処理ブロック３０１で始まり、ここで変数、カウンタ、所望の信号閾などが初期化される。最大値は選択された閾値に等しく設定される。サンプルカウンタがその後インクリメントカウンタ(I NCREMENT COUNTER)処理ブロック３０２で１だけ増される。現在のサンプルが、サンプルＧＥ閾値(SAMPLE．GE．THRESHOLD)決定ブロック３０３で信号閾と比較される。現在のサンプルがこの閾値より大きいもしくはこれと等しい場合は、現在のサンプルがその後、サンプルＧＴ最大(SAMPLE．GT．MAX)決定ブロック３０４で最大値と比較される。現在のサンプルが最大値より大きい場合は、最大値がその後、最大＝サンプル(M AX=SAMPLE)処理ブロック３０５で現在のサンプルの値に設定される。最大＝サンプル(MAX=SAMPLE)３０５処理ブロックからの流れは最終サンプル(LAST SAMPLE) ３０８決定ブロックに進む。図５の配置と類似に、最終サンプル(LAST SAMPLE) ３０８決定ブロックへのＹＥＳ出口は、全部の核酸混合物がカラム４および検出器６を通過した後にのみ利用されることができる。流れはその後、インクリメント(INCREMENT)処理ブロック３０２まで戻り、そして、現在のサンプルが、信号がピークに達しそして減少することを始めていることを示す、最大値未満になるまで継続する。これが起こる場合、処理はＮＯ出口からサンプルＧＥ最大(SAMPL E．GE．MAX)決定ブロック３０４に流れる。バンド線引き(DRAW BAND LINE)処理ブロック３０６では、バンドの線がピーク信号値に対応する位置に表示される。流れは最大＝閾値(MAX=THRESHOLD)処理ブロック３０７に進み、ここで最大値がユーザーに選択された閾値に再設定される。この処理は、最終サンプルが達せられそして最終サンプル(LAST SAMPLE)決定ブロック３０８がそのＹＥＳ出口を通って流れるまで継続する。閉鎖(CLOSE)処理ブロック３０９で、全濃度および他の関連および他の関連する量を要約するデータが算出され、記憶され、また、表示されることができる。長方形としてのバンドの表示に類似の様式で、線が、ディジタル化された検出器信号のピーク値を表わすように、色、強度、無作為画素を使用する混和されたグレースケールなどを使用して表示されうる。これはバンド線引き(DRAW BAND LINE)処理ブロック３０６で企図されてよい。上の記述では、バンドは信号のピーク値に従って位置を定められる線として表示されうる。信号が１サンプル以上についてピーク値にある例では、線が、最初のサンプル、最後のサンプルに対応した位置、または、最初と最後のサンプルのとの間の予め決められたもしくはユーザーに選択された位置にピーク値で引かれうる。図７、８および９は、ＶＤＴ１８、プリンタ２０もしくは他の装置上に出力されうるサンプル表示を具体的に説明する。図７、８および９のサンプル表示はただ例として具体的に説明され、かつ、本発明により提供される表示の形式もしくは内容を制限しない。図７を参照すれば、第一サンプル表示ウィンドウ３０は、例えばピーク形式選択(Peak format selection)３１、ゲル形式選択(Gel format selection)３２およびＯＫ（もしくは実行）３３ボタンを包含する一連の制御である。包含されうる他の制御は、当業者に公知のグラフィックス表示機能(gra phics display functions)、例えばズーム、パン、移動（水平および／もしくは垂直）、回転、コピー、カット、ペーストなどを包含してよい。制御および／もしくは選択は、また当業者に公知であるようなメニュードリブンコマンドを使用してもまた可能にされうる。選択されているゲル形式選択(Gel format selectio n)３２制御に対応する一連のサンプルバンドの表示もまた図７に具体的に説明される。ＣＰＵ１０は多数の分離からのデータを記憶し得る。図７に具体的に説明されるように、複数の記憶された分離が１サンプルの成分の断片の別のサンプルのものとの比較のために同時に表示され得る。多くの分離が同時に表示される場合、バンドの列は図７に示されるように相互に平行である。より分離されたサンプルが例えばＶＤＴ１８上で合うことができるより比較されることが必要である場合は、付加的分離が、慣習的技術、例えば位置入力装置１４またはキーボード１２上の矢印もしくはページアップ／ページダウンコマンドキーを使用してスクロールすることにより現われさせられ得る。図３、４および７を参照すれば、バンドは線もしくは長方形として表わされることができ、かつ、色および／もしくはグレースケールを包含しうる。色および／もしくはグレースケールで表示されるバンドでは、各バンドの色および／もしくは強度は、そのバンドが表わす画分中の二本鎖核酸の濃度に比例しうる。いかなるかつ全ての分離も、いずれかの選ばれた表示形式でＶＤＴ１８上に表示されることができ、そして／またはプリンタ２０もしくは他の出力装置により印刷されうる。図８を参照すれば、第二サンプル表示ウィンドウ３０’にピーク形式選択(Pea k format selection)３１制御が選択されて示され、そしてサンプリングされた信号がバンド形式で表示される。図９では、第三サンプル表示ウィンドウ３０” でピーク形式選択(Peak format selection)３１およびバンド形式選択(Band for mat selection)３２制御双方が選択され、そしてサンプリングされた信号がピークおよびバンド双方の形式で表示される。上で挙げられたズームの特徴を使用して、１個の特定のバンドの列もしくはその一区分が電子的に拡大されて隣接するバンド間の目に見える解像度を改良し得る。この特徴は、１個のバンドが隣接するバンドより大きな濃度で存在しかつより濃縮されたバンドがより小さく濃縮されたバンドをわかりにくくする場合にとりわけ重要である。ゲル電気泳動分離では、接近して泳動するより小さく濃縮されたバンドは完全に気づかれなくなるかも知れない。複数の分離が同時に見られる場合は、レーンのズームの特徴が全部のバンド列に適用され得る。類似の操作および表示は、それが表示のために選ばれる場合はピーク形式で実施されうる。分離カラムが既知の塩基対長さおよび濃度の二本鎖核酸標準品で較正される場合は、混合物の分離された断片の塩基対長さおよびそれらの絶対的濃度がソフトウェアにより算出され得る。この分離および表示の方法論は再現可能であるため、多くの混合物の成分の正確な塩基対長さが各分離についてシステムを再較正する必要なしに算出され得る。メニュードリブンコマンドが、分離されたバンドの積分(integration)、塩基対長さの表示、分離された混合物中の各成分画分の絶対的濃度および相対的パーセントを包含するがしかしこれらに制限されない多様な質的および量的情報をアルファニューメリック形式で生じさせるのに使用されうる。１個のサンプルから分離されたバンドはまた、別のサンプルのものから電子的に差し引かれていずれかの分離されたＤＮＡ混合物中の特定のＤＮＡ断片（１種もしくは複数）の存在もしくは非存在の視覚的決定を単純化もしうる。類似の操作が、ピーク形状が表示のため選ばれる場合に実施されうる。本発明の多様な態様および特徴が記述された一方、当業者は、それらの特徴および機能に対する変形および付加が本発明の範囲内でなされ得ることを認識するであろう。本発明は、従って、付属として付けられた請求の範囲の範囲によってのみ制限されることを意図される。

【手続補正書】【提出日】平成１２年４月１４日（２０００．４．１４）【補正内容】［請求の範囲］『１．ｂ）二本鎖核酸断片の混合物をマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）により塩基対長さ画分に分離し；ｃ）分離された塩基対長さ画分を、ＵＶ検出器、蛍光検出器もしくは放射能検出器で検出し；ｄ）検出された塩基対長さ画分に対応するディジタル化された信号を提供し；そしてｅ）ディジタル化された信号を各バンドが塩基対長さ画分に対応するバンドの列に変換する、段階を含んで成る、各バンドが算出された塩基対長さを有する二本鎖ＤＮＡの特定の画分を表わすバンドの列を生じさせる方法。２．画分のそれぞれの塩基対長さを算出すること、および、各画分の塩基対長さをそれぞれのバンドと関連して表示することを包含する、請求項１記載の方法。３．バンドの列中の１個のバンドの位置がそれぞれの画分中のＤＮＡの塩基対の数と相関する、請求項１記載の方法。４．バンドの列が線もしくは長方形の列として表示される、請求項１記載の方法。５．ａ）二本鎖核酸断片の混合物を塩基対長さ画分に分離するためのＭＩＰＣ分離手段；ｂ）それらの分離された塩基対長さ画分を検出するためのＵＶ検出器、蛍光検出器もしくは放射能検出手段；ｃ）検出された塩基対長さ画分に対応するディジタル化された信号を提供し、そしてディジタル化された信号を各バンドが塩基対長さ画分に対応するバンドの列に変換するためのコンピュータおよびソフトウェア手段、を含んで成る、１個のバンドの列を生じさせるための装置であって、各バンドが算出された塩基対長さを有する二本鎖ＤＮＡの特定の画分を表わす装置。６．コンピュータおよびソフトウェア手段が、画分のそれぞれの塩基対長さを算出するための手段、および各画分の塩基対長さをそれぞれのバンドと関連して表示するための手段を備える、請求項５記載の装置。７．コンピュータおよびソフトウェア手段がバンドの列を表示するための手段を包含し、ここでバンドの列中の１個のバンドの位置がそれぞれの画分の塩基対長さと相関する、請求項５記載の装置。８．コンピュータおよびソフトウェア手段が、バンドを１個の線もしくは長方形の列として表示するための手段を備える、請求項５記載の装置。９．コンピュータおよびソフトウェア手段が、バンドを色で表示する（そして各バンドの色が各バンドで表わされる断片の量と相関する）、もしくは、バンドをグレースケールで表示する（そして各バンドのグレースケールのレベルが各バンドで表わされる断片の量と相関する）ための手段を備える、請求項５記載の装置。１０．コンピュータおよびソフトウェア手段が、各画分中のＤＮＡの塩基対長さ、各画分中のＤＮＡの濃度、およびバンドの列中の各バンドについての各画分の分離時間を算出するための手段を備える、請求項５記載の装置。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）により分離された二本鎖核酸断片を１個のバンドの列として表わす方法であって、当該方法が、ａ）二本鎖核酸断片に対応するディジタル化された信号を提供すること；およびｂ）ディジタル化された信号を１個のバンドの列に変換することを含んで成る方法。２．ディジタル化された信号を提供する段階が、ｉ）ＭＩＰＣにより二本鎖核酸断片を分離すること； ii）分離された二本鎖核酸断片を検出すること；および iii）検出された二本鎖核酸断片に対応するディジタル化された信号を提供することを含んで成る、請求の範囲１の方法。３．ディジタル化された信号を提供する下位段階が、検出された二本鎖核酸断片に対応するアナログ信号を提供することおよび当該アナログ信号をディジタル化することを含んで成る、請求の範囲２の方法。４．クロマトグラフィーの方法が二本鎖核酸断片の塩基対の数を基礎とした分離を含んで成る、請求の範囲２の方法。５．分離された二本鎖核酸断片を検出する下位段階が紫外（ＵＶ）検出器を使用することを含んで成る、請求の範囲２の方法。６．分離された二本鎖核酸断片を検出する下位段階が蛍光検出器を使用することを含んで成る、請求の範囲２の方法。７．分離された二本鎖核酸断片を検出する下位段階が放射能検出器を使用することを含んで成る、請求の範囲２の方法。８．バンドの列中の１個のバンドの位置がそれぞれの断片中の二本鎖核酸の塩基対の数と相互に関係する、請求の範囲１の方法。９．バンドの列が線の列として表示されうる、請求の範囲１の方法。１０．バンドの列が長方形の列として表示されうる、請求の範囲１の方法。１１．バンドが色で表示され、また、バンドの色がそのバンドにより表わされる二本鎖核酸断片の量と相互に関係する、請求の範囲９の方法。１２．バンドがグレースケールで表示され、また、バンドの長さに沿った一点でのグレースケールのレベルが、ディジタル化された信号の対応する点での閾値レベルより上のそれぞれの二本鎖核酸断片の量と相互に関係する、請求の範囲９の方法。１３．長方形のバンドの長さが、ユーザーが選択可能な閾値レベルより上のそれぞれの二本鎖核酸断片のレベルの存在と相互に関係する、請求の範囲９の方法。１４．バンドの列がその対応するディジタル化された信号と同時に表示されうる、請求の範囲１の方法。１５．ＭＩＰＣにより分離された二本鎖核酸断片を１個のバンドの列として表わすための装置であって、当該装置がａ）ディジタル化された信号を捕捉するための捕捉手段であって、当該ディジタル化された信号は二本鎖核酸断片に対応し、ｂ）ディジタル化された信号を二本鎖核酸断片に対応する１個のバンドの列に変換するための変換手段、およびｃ）バンドの列を表示するための表示手段を含んで成る装置。１６．捕捉手段がＡ／Ｄ変換器を含んで成る、請求の範囲１５の装置。１７．捕捉手段が、それと連絡にある二本鎖核酸の検出器を有するＭＩＰＣ分離カラムを含んで成り、当該二本鎖核酸の検出器がＡ／Ｄ変換器に接続されたアナログ出力を有する、請求の範囲１６の装置。１８．二本鎖核酸の検出器がＵＶ検出器を含んで成る、請求の範囲１７の装置。１９．二本鎖核酸の検出器が蛍光検出器を含んで成る、請求の範囲１７の装置。２０．二本鎖核酸の検出器が放射能検出器を含んで成る、請求の範囲１７の装置。２１．変換手段が、ディジタル化された信号を１個の直線状のバンドの列に変換するためのＣＰＵを含んで成る、請求の範囲１５の装置。２２．表示手段が複数の直線状のバンドの列の表示のための手段を含んで成る、請求の範囲１５の装置。２３．それぞれの対応するバンドの列により表わされる各二本鎖核酸断片の塩基対の数、濃度および保持時間を算出するための算出手段を含んで成る、請求の範囲１５の装置。２４．バンドの列中の各バンドの算出された塩基対長さ、濃度および保持時間のアルファニューメリック表示のためのアルファニューメリック表示手段を含んで成る、請求の範囲１５の装置。