JP2001503859A - Ｈｉｖ感染細胞の検出試薬系およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、血液収集および診断に関する。より具体的には、本発明は、磁気分離および光検出などの技術を利用する血液収集および診断に関する。本発明はまた、細胞表面に現れる抗原の存在を検出する方法および装置に関する。より好ましくは、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)に感染した細胞の検出に関する。本発明によれば、ＨＩＶ感染細胞を検出し、非感染細胞から分離できる。好ましい実施態様では、分離は磁場によって為される。感染細胞を磁場で被覆することにより、細胞の正確な位置までの移動を容易にする。本発明の新規態様は、１つのパッケージ中で血液の収集および試薬との混合を可能にするカートリッジ抗原試験であり、これは、蛍光顕微鏡で見ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ感染細胞の検出試薬系およびそのためのキット 発明の背景 本発明は血液の採取および診断に関する。より詳しくは、本発明は磁気分離お よび光学検出などの手法を利用する血液の採取および診断に関する。 本発明はさらに、細胞表面に提示された抗原の存在を検出するための方法およ び装置に関する。より詳細には、本発明はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およ び関連ウイルスに感染された細胞の検出に関する。本発明によれば、ＨＩＶ感染 細胞を検出でき、また非感染細胞と分離することができる。好ましい態様では、 磁場によって分離を行う。感染細胞に磁気粒子をコーティングすることにより、 細胞を正確な位置に移動させる。本発明の新規な局面は、血液を採取できかつそ れを１つのパッケージ内の試薬と混合することのできるカートリッジ抗原試験で あり、これは蛍光顕微鏡によって観察することができる。 本発明はＨＩＶ感染を初期診断するのに有用な方法およびそのための材料に関 する。さらに詳しくは、本発明は１つの態様として、全血中のＨＩＶ−１感染末 梢血リンパ球を単離し蛍光化することを目的とする、市販されている高親和性の 高度に特異的な磁気的にカップリングされた、ＨＩＶ−１のエンベロープ表面糖 タンパク質、例えばｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体を、エンベロープ糖 タンパク質、例えばｇｐ１２０に対する市販されているＦＩＴＣコンジュゲート 化ポリクローナル抗体とともに利用するための組成物およびその方法に関する。 本発明は、カートリッジ抗原試験をインキュベートしそれを判読する自動蛍光顕 微鏡システムであるMehica GP120検出器として知られている別の発明とともに使 用することができる。 背景技術 ヒトにおけるＡＩＤＳの原因物質の疫学および免疫に関する技術水準は次ぎの 文献に充分に要約されている：Laurence，"The Immune System and AIDS," Scientific American，12月，1985，pp84-93;Gallo，"The First Human Retrovi rus,"Scientific American，12月，1986，pp88-98;Gallo，"The AIDS Virus,"Sc ientific American，1月，1987，pp47-56;Levyら，Science，225,840-842(1984) ;"Mobilizing against AIDS,"Institute of Medicine，National Academy of Sc iences，ハーバード大学出版(Cambridge Mass.1986)；およびLaneら、Ann Rev． Immunol.，３，pp477-500(1985)。 ＨＩＶ感染におけるヒトＴリンパ球のＣＤ４表面糖タンパク質の役割は次ぎの 文献に示されているように充分に研究されている：Dalgeleishら、Science，312 ，pp.763-767(1984);Klatzmannら、Science，767-768(1984);Klatzmannら、Scie nce，225，pp.59-62(1984);McDoual，ら、J Immunol.，135，pp.3151-3162(1985 );およびMaddonら、Cell，47，pp.333-348(1986)。 ＨＩＶ−１によるＴ細胞への感染は、ＨＩＶ−１が担持するエピトープとＴ細 胞表面に位置するＣＤ４レセプターとの相互作用の結果として起こる。ＨＩＶ− １のエピトープはエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０（分子量１２０キロダル トン）によってもたらされる。糖タンパク質ＧＰ１２０は構造的にはＨＩＶ−１ エンベロープの外側に位置している。ｇｐ１２０はヘルパーＴ細胞などの細胞表 面に存在するＣＤ４抗原と結合し、またウイルスとＴヘルパー細胞との融合点を 提供するのみならず、ＨＩＶ−１が細胞間で感染する機序であるシンシチウムを 形成させる活性をもｇｐ１２０は有している［これは米国特許第４，７２５，６ ９９号にその詳細が記載されている］。 ＨＩＶおよびＡＩＤＳに関する上記の背景的情報に照らし、ウイルス感染の樹 立に重要な役割を果たしているウイルスのエンベロープに特異的な抗体を作製す れば、末梢血中の感染細胞表面上の最も重要な細胞結合抗原を同定するうえで、 非常に意義深いと推定できる。 多くの研究グループがｇｐ１２０に特異的なネズミモノクローナル抗体の開発 に成功したことを報告している。例えば、T.C.Canら（Eur.J.Immunol．16:1465, 1986）は、ｇｐ１２０のペプチド鎖の一部を化学的に合成し、その合成ペプチド に特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｓｓ）を調製したことを報告している。こ の研究者らは、間接蛍光抗体法にこのＭａｓｓを利用することで、このＭａｓｓ が、逆転写酵素測定法によって達成されるよりも高い感度でもってＨＩＶ感染を 検出できたと報告している。ネズミ抗ｇｐ１２０Ｍａｓｓに関する別の報告とし て、Gostlingら（J.Clin.Macrobiol.:25,845,1987）およびMatsushidaら（Medic al Immunol.14:307,1987）の報告がある。 ＨＩＶに関する抗体について血清を試験することは現在のところ、感染をスク リーニングし確認するための最も費用効率の高い正確な方法である。参考文献１ −５ＡＩＤ Knowledge Nase 2.1-9，Centers for Disese Control-Update:Serol ogic Testing for Antibody to Human Immunodeficiency Virus（ヒト免疫不全 ウイルスに対する抗体の血清学的試験）．MMWR 1988;36:833-40;Schwartz,J.S. ，Dans,P.E.Kinosian BP Human Immunodeficiency Virus Test Evaluation,Perf ormance and Use（ヒト免疫不全ウイルス試験の評価、実行および使用）．JAMA 1988;259;2574-9;Burke,D.S.，Brundage，J.F.，Redfield，R.R.，ら、Measurem ent of the False Positive Rate in a Screening Program for Human Immnmuno deficiency Virus Infections（ヒト免疫不全ウイルス感染のスクリーニングプ ログラムにおける擬陽性率の判定）．New England Journal of Medicine，1988; 319:961-4;Cohen，N.D.，Munoz,A.,Reitz,B.A.,et al．Transmission of Retrov iruses by Trnasfusion of Screened Blood in Patients Undergoing Cardiac S urgery（心臓手術を受けた患者における選別血液の輸血によるレトロウイルスの 伝播）．New England Journal of Medicine 1989;320:1172-6;MacDonald,K.L.， Jackson,J.B.Bowman，R.J.，et al．Performance Characteristics of Serologi c Tests for Human Immunodeficiency Virus Type 1(HIV-l)Antibody Among Min nesota Blood Donors（ミネソタ血液ドナーの１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ Ｖ−１）の血清学的試験の実行特性）．Public Health and Clinical Implicati ons．Ann Intern Med．1998;110;6617-21。 ＨＩＶ抗体試験は限定を受ける。通常、ＨＩＶに対する抗体は３−６月以内の ６−８週もの早期に現れるが、不顕性感染が報告されており、ここではウイルス 暴露から３年も経過して血清変換が起こる。従って、感染者は即座に抗体を発現 させず、陰性という試験結果であってもＨＩＶ感染を否定することはできない。 最初にＨＩＶ陽性と判定された患者の大多数（９０％）は１年以内にＡＩＤＳ を発症する。ＡＩＤＳ感染の平均間隔が９−１０年である事実を勘案すると、こ のことは、ＨＩＶ感染が同定された通常の患者は平均で８−９年陽性であったこ とを強く示唆するものである。 危険性の高い行動を行った者はこの行動を行った後の数日または２、３週以内 に試験を求めるという行動試験を考えると、このことは特に問題を内包する。次 いで、この者はＨＩＶについて忘れてしまい、血清変換が起こる前に行われた陰 性試験の偽の安堵に基づき、危険な行動を続けてしまう。 上記の観察事項の結果は、１．高い危険性のある行動を時折行う大多数のヒト はこのような行動をとった直後に再評価を求めがちである；２．この者たちは未 だ検出不可能な抗体レベルがゆえに偽の陰性である試験結果により、安堵を得、 偽の安心を得る；３．感染者の大多数は、感染した後８−９年の間、間欠的また は連続した危険性の高い行動を続ける；４．この者たちは従って、ＨＩＶを８− ９年伝播させつづける；５．可能な正確試験が危険な行動と血清交換の間の短期 間に行われれば、初期のＨＩＶの検出が顕著に増大するであろう；６．従って、 可能な初期検出が、偽の自信を持ち忘れやすい者たちによるＨＩＶ伝播の高い流 行を有意に減少させるであろう。 初期ＨＩＶ感染におけるＲＮＡ、抗原および抗体の一貫した連続検出の試験に おいて、ＨＩＶ ＲＮＡ、ＨＩＶａｇおよびＨＩＶ抗体が血中に連続して現れる ことが見出された。血清交換パネルを試験して得られたデータは、初期ＨＩＶ感 染においてＨＩＶ ＲＮＡ、次いでＨＩＶ抗原（ｐ２４）、次いで抗ＨＩＶの凝 縮が一貫して連続的に起こることを示している。ＲＮＡおよび抗原出現のタイミ ングに基づき、ＨＩＶ ＲＮＡおよびＨＩＶａｇは初期感染の確認に使用できる ことが結論された。ＲＮＡおよび／またはＨＩＶａｇ試験はＨＩＶ感染の初期検 出に有用である可能性があると結論された（例えば血液スクリーニング）。 Busch,M.,Schumacher,Richard T.，Stramer,S.,et.al"Consistent Sequential D etection of RNA，Antigen and Antibody in Early HIV Infection（初期ＨＩＶ 感染におけるＲＮＡ、抗原および抗体の一貫した連続検出）：Assessment of Wi ndow Period"Irwin Memorial BloodCenter，サンフランシスコ、ＣＡ，Boston B iomedical，Inc.，Bridgewater，WA Poster Presented at XI International AIDS Conference，バンクーバー，BC 7月1966。 露出と抗体検出能との間の、この「窓」を閉じるための努力がなされてきた。 この方法により「窓」が部分的に閉じられたために、すでにｐ２４抗原試験は、 すべての登録された血液および血漿センターにより利用されるように命令されて いる。しかしながら、最良のシナリオにおいて、現実的には、ｐ２４抗原の検出 は６〜７日までに窓を閉じるのみである。有意な速度のウイルス複製が感染の最 初の１週間に起こり、エンベロープ糖蛋白ＧＰ１２０保有リンパ球が末梢血中に 生じるので、血液に結合したＧＰ１２０の検出は、ｐ２４試験よりもずっと効果 的な「窓」を閉じるための手段である。 磁気的に応答する、透過性の、固形の、水不溶性の微粒子を用いる、生物学的 液体中の物質（例えば、薬剤、ホルモン、ビタミンおよび酵素）の濃度を決定す る方法が米国特許第４１１５５３４号に開示されている。塩化鉄（ＩＩ）および 塩化鉄（ＩＩＩ）混合物を含有する酸性水溶液にキトサンのごときムコ多糖を溶 解することにより形成される機能的な磁性粒子が米国特許第４２８５８１９号に 開示されている。微小球を用いて、キレート形成により排水から溶解イオンを除 去してもよい。米国特許第３９３３９９７号には、抗ダイオキシン抗体が磁気的 に応答する粒子に結合されている、ダイオキシンのための固相放射イムノアッセ イが記載されている。 集団から生物および細胞を仕分けし、分離するための広く分散した表面積を提 供するために、抗体層をコーティングされた小型磁性粒子が米国特許第３９７０ ５１８号において用いられている。米国特許第４０１８８８６号には、溶液から 蛋白を分離選択してその検出を可能にするための広く分散した表面積を提供する ために用いられる小型磁性粒子が開示されている。粒子は、選択蛋白と特異的に 相互作用する蛋白でコーティングされる。 米国特許第４０７０２４６号には、生物学的に活性な蛋白を共有結合しうる基 材上の安定な水不溶性コーティングを含む組成物が記載されており、得られた生 成物は蛋白の生物学的特性および基材の機械的特性、例えば金属支持体の磁気的 特性を有している。 通常に分離可能な蛋白によりコーティングされた粒子の混合物を用いる診断方 法が米国特許第４１１５５３５号に開示されている。アクロレインホモポリマー ならびにメタクリル酸および／またはヒドロキシエチルメタクリレートのごとき 酸親水性コモノマーとのコポリマーからなる微小球が米国特許第４４１３０７０ 号において議論されている。米国特許第４４５２７７４号には、抗体、酵素およ び他の生物学的分子に共有結合でき、磁場の手段によって細胞ならびに生物学的 粒子および分子を標識し分離するのに使用される、磁性鉄−デキストラン微小球 が開示されている。コーティングされた帯磁可能な微粒子、その可逆的懸濁物、 およびそれに関するプロセスが米国特許第４４５４２３４号に開示されている。 イオン性ビーズに複雑に取り込まれた鉄磁性材料を用いる、混合樹脂ビーズ中の アニオン性ビーズからカチオン性ビーズを分離する方法が米国特許第４５２３９ ９６号に開示されている。磁性粒子のコロイドを用いる磁気的な分離方法が米国 特許第４５２６６８１号において議論されている。英国特許出願ＧＢ第２１５２ ６６４Ａ号には、磁気的アッセイ試薬が開示されている。 鉄−デキストラン粒子を抗体分子に共有結合させることにより製造される電子 が密である抗体抱合体がDutton，et al．（1979）Proc．Natl．Acad．Sci．76:3 392-3396に報告されている。Ithakissios，et al．Clin．Chem．23:2072-2079(1 977)には、ラジオアッセイにおける磁性微粒子含有蛋白の使用が記載されている 。高グラジエント磁気クロマトグラフィーを用いる免疫特異的鉄デキストラン微 小球で標識された細胞の分離がMolday et al．（1984）FEBS，17:232-238に開示 されている。Molday，et al．J．Immunol．Meth．52:353-367(1982)には、細胞 の標識および磁気的分離のためのフェロー磁性鉄−デキストラン試薬が記載され ている。細胞の標識および分離における磁性微小球の適用もまた、Molday,et al ．Nature 268．437-437(1977)に開示されている。ヒトのアルブミンおよび生物 学的液体の固相蛍光イムノアッセイがMargessi，et al．（1978）Clin．Chim．A cta．89:455-460において議論されている。Nye，et al．（1976）Clin．Chim．A cta．69:387-396には、固相磁性粒子ラジオイムノアッセイが開示されている。 磁性液体がRosenweig（1983）Scien．Amer．10:136-194により記載されている。 磁性蛋白Ａ微小球および細胞分離方法におけるそれらの使用がWidder,et al．（ 1979）Clin．Immunol．and Immunopath．14:395-400により開示されて いる。 米国特許第５２７９９３６号は、磁性粒子に対する目的成分の結合を引き起こ すことによる、混合物の他の成分からの目的成分の分離を目的とした方法である 。 他の成分を含有する混合物から細胞を分離する方法である当該発明の具体例に おいて、該方法は細胞および他の成分を含有する第１液体培地を、第１液体培地 と異なる比重および／または異なる粘度の第２培地と積層させることからなる。 細胞は常磁性粒子に結合する。積層した第１液体培地および第２液体培地を磁場 グラジエントに付し、細胞粒子が第２培地に移るようにする。第２液体培地中の 細胞を分離する目的は、第２液体培地から細胞を分離するさらなる具体例により 達成される。当該発明において、ＨＩＶ−１感染細胞の磁性分離は、感染細胞を 反応容器中の所定の場所に持っていくことにより、ＰＢＳ希釈血液の培地中で達 成されるため、第２液体培地を必要としない。分離後に必要な操作は最高の磁場 密度の点を照明し、高磁性特異的蛍光の有無を確認するだけであり、存在するな らば、蛍光標識したＨＩＶ感染末梢血液白血球（ｐｂｌ）の存在を示す。 米国特許第４９３５１４７号は、有機および無機生化学分析物、特に体液の分 析にて目的とする分析物のアッセイにて、特に、磁性分離の適用を目的とする方 法である。当該特許の方法は、非磁性粒子の磁性粒子への化学的に調節された非 特異的可逆的結合により該非磁性粒子を培地から分離するものである。磁性粒子 は粒径が小さいため、分離されるべき物質は極めて迅速に結合することとなる。 ついでその粒子を凝集させることで、従来の方法よりもさらにずっと迅速かつ完 全な磁性分離がなされる。当該発明において、磁性分離の方法は適用できない。 というのも、目的とする抗原が細胞に結合し、したがって溶液中になく、あるい は分離するために凝集させる必要がないからである。当該発明は、観察のために 、目的とする完全な細胞を反応容器の所定の場所に磁性的に引き寄せるのに、多 くの磁性物質を感染細胞表面に吸着させることが必要となるだけである。 キットに関して、従来技術は多段階にて試験するための血液を収集した。第１ 段階は、指の皮膚の刺し傷から、または静脈せん刺により適当な容器に血液を集 めることであった。ついで、血液を輸送または試験試薬と混合するのに適する容 器に入れなければならなかった。次に、洗浄工程で分断された多段階方法にて試 薬を加えなければならなかった。この方法の問題は多段階工程ということであり 、時間を要し、かつ熟練を必要とする。血液の収集においては、従来技術ではな おもランセットおよび試験管方法で取り扱われている。 例えば、前記した米国特許第４７７７９６４号（David Briggsら）（１０／１ ８／８８）は、ＡＩＤＳウイルスを保菌しているかどうかを確認し、血液をサン プリングし、その試料をさらなる試験のために試験所に持っていきたいと思って いる人のためのシステムを提供する。そのキットはランセットおよび試料を収集 するための試験管を含み、使用者がその末端をパテで密封することを必要とする 。この装置およびキットは単なる血液を収集するための手段であり、さらなる試 験のために試料を無傷で試験所に郵送するための手段にすぎない。アプライアン スを用いる試験はなされない。加えて、試料を試験管に移さなければならず、適 当な試験培地と混合しなければならない。試料を収集し、調製するのに別の多数 の試験キットおよび方法がある。以下の特許はこの分野における興味のあるもの である：米国特許第４３６５９７０号（Lawrenceら）；米国特許第４１２２９４ ７号（Falla）；米国特許第３２７２３１９号（Brewer）；米国特許第３２０３ ５４０号（Kalt）。上記した特許はいずれも同じ容器中で試料を収集し、調製し 、免疫化学を観察するものではない。 幾つかのテスト媒体が磁性分離を行なうために用意されたが、採集装置中で起 こる反応用でも、多段工程を行なうべく制御された研究室環境の外で完全なテス トを行なうためのものでもない。Pail A．Liberti、Brian P．Feeley、Dhanesh Ｉ．Gohelに与えられた米国特許第５１８６８２７号（０２／１６／９３）は、 非磁性テスト媒体から磁性粒子を分離するための精巧な磁気セパレーターを記載 している。該磁気セパレーターは、テスト媒体を受ける内部表面域を伴う周囲壁 を有する非磁性容器と、テストされた物質が試験管のような反応容器に収納され ている該磁性容器内で磁場グラディエントを発生させる磁性手段を包含する。 磁性分離を利用し、光源を用いて粒子を同定する方法もある。Koichi Fujiwar a、Juichi Noda、Hiroko Misutani、Hiromichi Mizutaniに与えられた米国特許 第５２３８８１０号（０８／２３／９３）はそのような方法を提供するものであ るが、他の磁性分離方法と同様、この方法はテストする血液試料の採集、 調製に多段の装置および工程を含む。この方法も、そのテストについて二重試薬 混合物よりも１試薬に焦点を当てている。反応を行なうための種々の容器形態(c onfiguration)を提供しているが、１つで試薬貯蔵、血液採集、混合、インキュ バーションおよび観察(viewing)装置として供することのできる容器を包含また は意図するものではない。 発明の概要 本発明は、磁性分離技術を利用する、例えば、ｐｂｌｓ、Ｔ−細胞、細胞系、 マクロファージ、人工リポソーム等の検出および／または分離用の種々の分析に 関する。１つの態様において、本発明は、１つの使い捨て容器内で、１工程で血 液試料を得、テスト試薬と混合することに関する。この容器は、インキュベート することができ、さらなるプロセッシングなしに、蛍光顕微鏡により、容器内で 試薬と血液試料間の反応の関連結果を見て、読み取り、迅速に正確にテストでき る。 本発明は、血液採取および磁性分離の装置および方法に向けられており、ここ において、抗体結合(coupled)磁性粒子および抗体複合（conjugated）フルオロ クロムを用いて、集めた光を適用して高グラディエント磁性分離および同定手段 により非磁性テスト媒体から目的とする物質を単離する。 本発明の１つの態様は、上記のような複数の目的に供する独特の反応容器に基 づくものである。磁気分離の従来の方法は、例えば、反応容器の形態と血液試料 採取および１工程テストとが両立しないことにより種々の点で異なる。加えて、 大部分の磁性分離装置は、容器内のいずれのさらなる反応を観察するように供さ れていない。 本発明は、試料を採取するのと同時に穿刺し、血液の試料と混合し得る、試薬 の自己−含有微細−バッギーを提供する。さらに、その中で血液を採取し、かつ 、その中で該血液と試薬とを混合するチャンバーは、反応混合物をインキュベー トするために用いる同一チャンバーまたは容器であり、さらに、存在する場合に は感染細胞の磁性分離を行うチャンバーでもある。最後に、それは、存在する場 合にはその中で感染細胞を観察するチャンバーとしても供する。血液採取試薬貯 蔵、 試薬／血液混合、反応物インキュベーション、磁性分離、および最後に存在する いずれかの感染細胞の観察のために供される本発明のごとき等価の多目的チャン バーは存在しない。 カートリッジ・アンタイジェン・テスト(ＣＡＴ)は、血液採取、血液との試薬 混合、該混合物のインキュベーション、磁性分離、および試験結果の観察が行い 得る装置である。該装置は、微細レンズを有するウェル・スライド、試薬を満た す微細−バッギー(baggy)、マイラー(mylar)カバー・ストリップ、および同定目 的用のバーコードよりなる。 本発明は、また、ｇｐ１２０のごとき表面抗原に対する一対の作製非−競合性 抗体を利用する蛍光測定イムノアッセイにも関する。１の抗体(Mab)を準磁性粒 子にカップリングさせ、一方、二次抗体をＦＩＴＣとコンジュゲートさせる。本 発明は、その特定の免疫マーカーに基いて細胞の混合物、特定の細胞コンポーネ ントを豊富化または分離するために過去１５年にわたって開発された免疫磁性分 離の技術の利点を採用している。例えば、米国特許第４，７７７，１４５号；第 ４，７３１，３３７号；第５，１８６，８２７号；第５，２３８，８１０号；第 ５，２７９，９３６号；第５，４１１，８６３号；および第４，９３５，１４７ 号を参照されたし。 これらの発明においては、磁性粒子を用いて液体培地から物質を分離するため の特定の方法が開示されている。しかしながら、これらの発明はいずれも、全血 液中のＨＩＶを診断するための免疫磁性粒子を用いるプロセスに特異的ではない 。本発明は、磁性粒子にカップリングさせた市販の高アフィニティー抗−ｇｐ１ ２０ Ｍａｂ、およびＦＩＴＣとコンジュゲートさせてＨＩＶ感染細胞を蛍光的 に“標識(ｔａｇ)”し、ついで全血液中の非感染細胞からそれを磁気的に分離す る二次非−競合性抗−ｇｐ１２０ Ｐａｂに依存する。 本発明の背景に対して特に重要なことは、前記したＨＩＶ感染の分子生物学の 利点となる診断システムを創生することの重要性を実証する要素を考慮すること である。また、抗体産生によってＨＩＶ感染に対する宿主の免疫応答に未だに主 として依存する現在のスクリーニングおよび確認試験プロトコールによって課さ れる制限に基づく本発明に対する要望を理解することも重要である。 したがって、本発明者らの発明の幾つかの目的および利点は、移動、添加また は複雑なプロセスなしに、指に刺し、血液を採取し、該血液を試験試薬を用いて 処理し、該試験混合物を混合し、ついで結果形態を判読する全体のプロセスを設 定することを目的とする。当該装置を使用するために操作者を特別に訓練する必 要はない。これにより、離れた部位で結果がより迅速に、自動的に試験し、患者 の試験を簡便に標識し、および試料の簡便に廃棄することができる。 なおさらなる目的および利点は、確実とする説明および添付する図面を考慮す ることにより明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に係る採取／加工用カートリッジの正面図である。 図２は、ウェル、微細−レンズ、微細−バッギーおよびマイラー・カバーを図 示する採取／加工用カートリッジの側面図である。 図３は、図２に示す微細−レンズのうちの１つの拡大図である。 図４は、試験対象からの血液試料の採取を図示する側面図である。 図５Ａ−５Ｅは、インキュベーション、磁性勾配の適用、および試薬および血 液混合物上の焦点化光源の適用を含む血液と２つの試薬系との間の免疫化学反応 を説明するウェルの側面図である。 図６Ａ−６Ｃは、各々、インキュベーション、磁性勾配および焦点化光源の適 用、およびレンズを通した反応の観察を説明するカートリッジおよびウェルの上 面および側面図である。 発明の詳細な説明 本発明のいくつかの目的および利益は、全血液における早期の（曝露４日以内 ）ＨＩＶ−１感染検出の費用効果的な、正確な方法であって、免疫化学的に／磁 性的に単離する能力および蛍光標識ＨＩＶ−１感染末梢血リンパ球に基づいた方 法を提供することにある。本発明の利益は、例えば、１．細胞結合抗原に基づく 試験は、宿主免疫系に依存しなければならないことによって生じるウィンドー期 間（window period）を封鎖して、約４日までにＨＩＶ−１抗原に対する抗体 を生産する；２．多目的カートリッジおよび完全な自動化インキュベーター、磁 気分離機および結像系は、非医学的に養成された人員によって操作可能である； ３．細胞結合ｇｐ１２０の出現は、ウイルス遺伝物質の出現と平行し、ほんの少 しの費用で「金標準（Gold Standard）」ＰＣＲと同じ時間単位においてＨＩＶ の存在を検出できる；４．血液収集／免疫化学／磁気分離／結像カートリッジの 機能的設計が、ウイルス遺伝物質のための「金標準」ＰＣＲ試験よりも取り扱い が非常に容易である完全な、自蔵式の、使い捨てユニットを可能にする；５．全 試験手順は、ＰＣＲの場合の週単位と比べて分単位の所要時間を要する；６．試 験当たりの費用は、数百ドルよりもむしろ数十ドルであることを包含する。また さらなる目的および利益は、以下の記載および添付の図面の考察から明らかにな ろう。 本発明の一実施態様においては（例えば第５図参照）、数滴の全血サンプルを 約0.5ｃｃのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の常磁性ミクロスフィアと結合さ せたネズミの坑−ｇｐ１２０モノクローナル抗体群で希釈する。この希釈サンプ ルに常磁性ミクロスフィアと結合させたネズミの坑−ｇｐ１２０モノクローナル 抗体群、および坑−ｇｐ１２０ポリクローナル抗体ＩｇＧとコンジュゲートさせ たフルオレッセインを加える。希釈全血サンプル中に、ＣＤ−４を帯有する、さ らに多数の露出ｇｐ１２０抗原をも帯有する、少数のＨＩＶ感染末梢血リンパ球 が存在する。血液と抗体群との混合物は、５分間培養した後、両抗体を非競合的 に各ｇｐ１２０抗原およびそれらのすべてと結合させる。このことにより、各Ｈ ＩＶ感染末梢血リンパ球は、常磁性ミクロスフィアと結合させたネズミの坑−ｇ ｐ１２０モノクローナル抗体群、および坑−ｇｐ１２０ポリクローナル抗体Ｉｇ Ｇとコンジュゲートさせたフルオレッセインの両方により被覆される。未感染末 梢血リンパ球は両抗体のいずれによっても被覆されずにそのまま残っている。培 養した血液と試薬類の混合物を含む容器は、この反応容器の外側表面上の予め定 めた箇所で強い磁性勾配に露出させることができる。磁界はすべてのＨＩＶ感染 末梢血リンパ球を、この反応容器の内側表面の磁性勾配の最高濃度の箇所へ移動 させ、かくして、希釈全血サンプル中のＨＩＶ感染末梢血リンパ球を未感染末梢 血リンパ球から分離する。磁性分離には約２０秒を要する。磁性分離を起こさ せる指定時間後、予め定めた磁性勾配の最高濃度の箇所を、適切にフォーカスし た４８８ｎｍ波長の光源で照射し、予め定めた箇所に凝集したすべてのＨＩＶ感 染末梢血リンパ球の、５２０−５４０ｎｍ間の蛍光を発生させる。希釈血液サン プル中には、ＨＩＶ感染末梢血リンパ球に結合していない坑−ｇｐ１２０ポリク ローナル抗体ＩｇＧとコンジュゲートさせたフルオレッセインの過剰量が存在す るであろうが、その量は十分であり、低強度を提供するのにのみ適量である坑− ｇｐ１２０ポリクローナル抗体ＩｇＧとコンジュゲートさせたフルオレッセイン の希釈により、反応容器の内壁面に付着した感染細胞上に、坑−ｇｐ１２０ポリ クローナル抗体ＩｇＧとコンジュゲートさせたフルオレッセインに結合させた細 胞の高強度と対比して、蛍光顕微鏡検査で視認できるバックグラウンド蛍光を散 乱させる。同様にして、細胞の表面に免疫学的に結合していない磁性粒子の過剰 量は、容器の内壁面へより早い速度で移動し、磁性粒子で被覆した全ての細胞が 容器内壁に到達する前に、常磁性ミクロスフィアと結合させたネズミの坑−ｇｐ １２０モノクローナル抗体群が結合していない暗色の被覆を確実に形成させ、そ れに対して感染細胞を付着させ、ＨＩＶ感染末梢血リンパ球の高強度発光と鋭い コントラストを生じる。 試薬は、例えば、Immunodiagnostics，Inc.から、常磁性ミクロスフェア結合 ネズミ抗-ｇｐ１２０ ＨＩＶ−１ ｍＡｂが市販されている。マウス起源のモノ クローナル抗体は、ｇｐ１２０ ＨＩＶ-１糖タンパク質に対して高い親和性を持 つ高度に特異的なものが市販されている。これらは、交差反応性の交差中和性抗 体であり、常磁性ミクロスフェアに共有結合するものである。これらの結合比は 、常磁性ミクロスフェア１mg当りタンパク質およそ２.５マイクログラムである 。特異性試験は、ＥＬＩＳＡで測定したところ、磁性ネズミ抗-ｇｐ１２０ ｍＡ ｂが組換えｇｐ１２０(ＭＮ、IIIＢ)ペルオキシダーゼコンジュゲートに結合す ることを示す。生物活性は、これらの抗体のＣＤ４担持ＨＩＶ−１感染細胞およ びＨＩＶ−１感染ヒト末梢血リンパ球に対する結合として定義する。フロオレセ イン ウサギ抗-ｇｐ１２０ ＨＩＶ-１ IIIＢ ｐＡｂ ＩｇＧ(例えば、Immunodia gnostics，Inc.)。これらのフロオレセイン コンジュゲート化抗−１２０(ＨＩ Ｖ−１ IIIＢ)ｐＡｇ ＩｇＧは、ＦＩＴＣコンジュゲーション用に使 用前に高度に精製した(純度９５％)ポリクローナルＩｇＧであり得る。このフル オレセイン コンジュゲート化ｐＡｂ ＩｇＧの特異性は、ドットブロットアッセ イにおける天然および組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１２０への結合、および直接免疫 蛍光アッセイにおける細胞表面の染色により定義できる。この試薬は、直接免疫 蛍光アッセイに使用できる。この試薬は、１：５０希釈範囲での細胞の直接免疫 蛍光染色に使用できるが、精製ｇｐ１２０でのドット ブロットアッセイは、１ ：１００の最小希釈で実施してもよい。 モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を得ることができ(上記 参照)、これらはＦＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ に結合するが、競合的ではない、即ち、ｇｐ１２０のＶ３ループの別の領域に結 合している。この要因により、これらを特定の異なる目的に同時に使用すること が可能になる。 上記発明のさらに他の利点は、例えば、，それは、HIV−１抗原に対する抗体 の製造を約４日間行う宿主免疫システムに依存しているにちがいない創造される ｗウインドウ期間に密接している細胞ー結合抗原に基ずいたテスト；わずかな費 用で”ゴールド標準”PCRと同じ期間にてHIVの存在の検出を可能にする、ウイル ス遺伝子物質の外観と相似の細胞結合ｇｐ１２０の外観；全テスト処理がPCRの 数週間に比べて数時間を要するに過ぎない；より正確でかつ低コストにてスクリ ーニングと確認テストの両方を行い得る；このテストを、多目的カートリッジお よび完全自動インキュベーターマグネチックセパレーターオヨビ画像システムを 用いて、医療のトレーニングを受けていない個人でも操作し得る自動フォーマッ トにて利用し得る；このテストが、ウイルス遺伝子物質のために”ゴールド標準 ”PCRよりもより取り扱い易い完全自給式使い捨てユニットにて行える採血カー トリッジを含み得ることなどが挙げられる。 上記の説明は多くの具体例を含んでいるが、これらは本発明を限定するもので はなく単に本発明の好ましい態様を例示するに過ぎない。その範囲には他の多く の態様や変形が含まれる。例えば、その方法は、抗体の組み合わせを変え、他の ふっ化クロムを用いることにより他のウイルス感染のテストに使える。この方法 は、水の混入も試験でき、また癌細胞の分離および同定にも使える。 本発明の他の目的は、テストサンプル中に目的とする抗体または他の結合パー トナーの存在を検査するアッセイを提供する。好ましい態様では、所望の抗体は ウイルス,例えばHIV-1、HIV-2、HTLV、HTLVEBV、CMV、SIVなどによりコードされ る抗原に対して発生する抗体である。この好ましい態様では、抗体は、中和抗体 またはウイルスによる感染を妨害し得る抗体である。本発明のこの目的には、テ ストサンプル中の抗体の存在をウイルスによる標的細胞の感染を阻害する能力に よって決定する。 この目的を達成するには、標的細胞を細胞に感染し得るウイルスと接触させる 。その接触の工程は、例えば、試験管、スライドウェル、組織培養フラスコなど の容器中で標的細胞とウイルスとを組み合わせることによって達成される。典型 的には、その接触の工程は液相で行われるが、固相でも行いえる。 本発明で用いうる標的細胞は、所望のウイルス、例えばHIV-1で感染され得る または感染され易いものである。各種の細胞が用いられ、CD4(+)T細胞や脾臓細 胞、Tセルライン、リンパ芽球セルライン、H9、C8166、モルト（Molt）、モルト -4、CEM、ジュルカット(Jurkat)、好ましくは、CEM74（Virology、２２６：２０ ８−２１２、１９９７を参照卯）が含まれる。 標的細胞は、細胞をウイルスと感染させ得る条件下にウイルスと接触させるこ とができる。ここでは、ウイルスの細胞への感染に用い得るいかなるファクター （例えば、コファクター、たんぱく質、サイトカイン、イオン、など）、環境、 試薬、等、例えば、細胞にくっつけたり、細胞を加えたり、自分の都合に合わせ て細胞組織に侵入するなど、を意味する。これらの条件は、慣例的に決定でき、 例えば、至適pH温度、塩、バッファー、ウイルス濃度、細胞数、等を含む。それ らの効果的条件は、また、ウイルスの細胞内への侵入が行なわれる培地や他の液 体、環境を意味する。培地は、ウイルスの細胞内への侵入を容易にする成長因子 や他の化合物を含む。好ましいバッファー系は、例えば、PBS、トリス、クエン 酸ナトリウム等、ホウ酸等が挙げられる。 標的細胞およびウイルスの組換えは、混合物として現すことができる。この方 法は、例えば、標的細胞およびウイルスが、例えば、感染が起こり得るようにし て同じ容器中で共に存在することを意味する。そのため、標的細胞をウイルスと 接触させると混合物が生成する。言及すると、この接触は、ウイルス感染と関連 する抗原、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１等の感染および発現に適切な環境で達 成される。 本発明の特徴は、セル表面のビールス抗原の検出、およびその発現を邪魔する 試薬の検出である。抗原の検出は、直接または間接的に行っても良い。一つの態 様では、ビールス抗原の１以上のレセプター、例えばＣＤ４、ＣＫＲ５、ＣＣ− ＣＫＲ５、ＣＣＲ５、ＣＫＲ２、ＣＫＲ２Ｂ、ＣＫＲ３、ＣＫＲ４、ＣＸＣＲ４ 、ＣＣＲ２、フシン等（例えば、ジェイ・ヴィロル・７１：１６５７−１６６１ 、１９９７；Ｄｅａｎ等、サイエンス、２７３：１８５６−１８６２，１９９６ ）が表面(例えば、磁性粒子、ビーズまたはマイクロ球)とカップルし、次いでビ ールス抗原を発現するセルを補足するのに用いうる。別の態様では、間接補足手 段を用いる。例えば、第一の結合パートナー、ビールス感染時のセルに存在する ビールスによってコードされた抗原に特異的なパートナーが混合物に加えられる 。「特異的」の用語は、通常当業者に認識される意味、即ち混合物中に存在する 他の抗原よりビールス抗原により高い親和性を有することを意味する。結合パー トナーは、ビールスと同時に、またはビールスが混合物に加えられた後に、加え ても良い。使用される条件は、セル表面上に存在する、またはセルにより発現さ れているビールス抗原に結合パートナーを付着させる(効果的)である条件である 。 結合パートナーは、ビールス抗原を認識する試薬、例えば、アプタマーズ(ａ ｐｔａｍｅｒｓ)、PNA構造体、ペプチド、小分子、抗体(モノクローナル、ポリ クローナル、シメリック、単鎖、二価、ジスルフィド安定化Fvフラグメントなど )、ビールス抗原用のレセプター(例えば、CKR5、CD4)等であって良い。抗体を形 成する方法は、公知である。抗体はまた市販物、例えばイムノジアグノスチック 、マサチューセッツ州、ワルタムから得てもよい。 一旦結合パートナーがセル表面上でビールス抗原に結合したら、セルが直接補 足されうる。もし結合パートナーが基材、例えば、磁性粒子に結合したならば、 また第二の結合パートナー、即ち第一の結合パートナーを特異的に認識しうる（ 分子、抗原、試薬、抗体などの混合物から特異的に認識しうる）結合パートナー を用いて補足しても良い。第二の結合−パートナーは、好ましくは基材、例え ばラテックスビーズ、ガラススライド、マイクロウェル、磁性ビーズまたは粒子 などに結合する。結合パートナーの基材への付着は、常套の方法により行うこと ができる（米国特許５，５４３，２８９；ルク・アンド・リンドバーグ（Ｌｕｋ ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）、ジェイ・イムノル・メソッズ(Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１３７：１−８，１９９１参照） 本発明の別の観点は、目的物質を捕獲するのに用いられた基礎結合パートナー 、たとえばビールス感染セルとしてのビールスレセプターの使用に関する。例え ば、ＨＩＶ、ＣＤ４の場合、ＨＩＶレセプターがいくつかの理由から好ましい試 薬である。これは、ＨＩＶウイルスのほとんどのサブタイプ、ストレイン、及び クレード（clades）のためのユニバーサルな主要な結合サイトであり、ほとんど のＨＩＶ受容性セルの上にもある。その理由は、既にＨＩＶ感染したセルはその 全体のメンブラン表面にわたり拡散的に分配されたｇｐ１２０エンベローププロ テインを発現し（expresses）、また精製された（組み替え体又は天然原料由来 ）ＣＤ４はｇｐ１２０について高い特異性（specificity）及び親和性（affinit y）を有し、ｇｐ１２０を含む材料を捕捉（capture）するのに有用だからである 。精製のために、例えば、ＵＳＰ５，６０３，９３３；Ｄｅｅｎら、Ｎａｔｕｒ ｅ、３３１：８２−８４，８４−８６、１９８８；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ ｕｒｅ、３３５：２６７−２７０、１９８９を参照のこと。かかる態様において 、例えば、ＣＤ４は上記又は下記の方法に従って、標的材料を捕捉するために間 接的に用い得る。例えば、ＣＤ４は部分（moiety）、例えば、ＦＩＴＣと接合（ conjugate）され得、例えば、感染及び非感染セルの両方を含む混合物中からＨ ＩＶ感染セルを捕捉するのに用いうる。アンチ−ＦＩＴＣ抗体を含む磁性粒子は 交互に（in turn）ＣＤ４−ＦＩＴＣでコートされたセルを標識するために用い うる。次いで、この混合物は分離カラムを通過せられて混合物中の全てのＨＩＶ 感染セルの陽性選択（positive selection）を行い、他方、非感染セルをデプレ ートする。混合物から非感染セルをデプレートした後、分離カラムを磁場から除 去し、ＨＩＶ感染セルをＰＢＳ又は他の適当な緩衝液で溶出する。次いで、ＦＩ ＴＣ接合ＣＤ４標識セルは固定され、標準フローサイトメトリーによりカウント され得る。他のウイルスに感染したセルは同様に選択され得る。 好ましい態様では、例えば、ＵＳＰ５，４１１，８６３；ＵＳＰ５，５４３， ２８９に記載のように、第２の結合パートナーが磁性粒子（ビーズ、微小球等） に付与される。磁性粒子はいずれかの有効なタイプ、例えば、フェロ磁性、超磁 性、パラ磁性、及び超パラ磁性で構成され得る。好ましい粒子は酸化鉄及びポリ サッカライドから構成される。好ましい磁性ビーズは捕捉されるセルの直径より も小さい直径、例えば、約１〜３００ｎｍ、約５〜２００ｎｍ、約１０〜１５０ ｎｍ、好ましくは約２０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約５０〜１２０ｎｍを有 する。好ましくは、磁性ビーズはセルの回りの被覆を形成しうる、例えば、セル に１個以上のビーズ、例えば、約１０ビーズ、約１００ビーズ、約１０００、又 は約１００〜１０００等が付加するのに十分なサイズである。このようなビーズ は製造することができ、又は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅ ｒｍａｎｙ社より市販されている。 第２結合パートナーを、特に第１結合パートナーと結合する能力、即ち、第１ 結合パートナーを認知し、細胞混合物中の他の成分より強い親和力で第１結合パ ートナーと結合する能力のために選択する。上記第２パートナーは、如何なる物 質、例えば第１結合パートナー用物質から成ってもよい。１つの態様では、第１ 結合パートナーは特に第２結合粒子と認識される部分(moiety)を含む。上記部分 は、常套の方法により上記結合パートナーに付着することができる。そのような 部分は、ハプテンまたは蛍光色素等の検出可能なラベル、例えばＦＩＴＣ、ＴＲ ＩＴＣ、Ｒ−フィコエリトリン、クワンタム・レッド(Quantum Red)、またはＣｙ ３、金、フェリチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、緑色蛍光プロ テインＧＦＰ(シャルフィー(Chalfie)等のサイエンス(Science),263:802,1994年 ；チェン(Cheng)等のネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology) ，14:606，1996年；レビー等のネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech nology)，14:606，1996年)、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ＨＲ Ｐ、ウレアーゼ、任意のハプテン等であってもよい。 １つの態様では、第１結合パートナーはＦＩＴＣに接合したアンチ-ｇｐ120抗 体であってもよく、第２結合パートナーはアンチ-ＦＴＩＣ抗体であってもよい 。他の態様では、第１結合パートナーはウイルス感染によって細胞表面に発現さ れ るウイルス性抗原用のレセプターであってもよい（例えばＣＤ４、ＣＫＲ５、フ ーシン(fusin)等）。第２結合パートナーは、特にウイルスレセプターー用とし て選択することができる。そのような結合パートナーは、上記レセプター上でエ ピトープを認識する抗体であってもよい。上記レセプターは、上記のように部分 を含んでいてもよく、第２結合パートナーは上記部分を認識する、例えば第１結 合パートナーがＦＩＴＣに接合したレセプターである病原体であってもよく、第 ２結合パートナーは、好ましくは１つ以上の常磁性ミクロスフェアと結合したア ンチ-ＦＩＴＣ抗体であってもよい。 第２結合パートナーは、ウイルスを細胞に接触させるのと同時に加えてもよく 、その後、例えば第１結合パートナーの添加後に加えてもよい。好ましくは、ウ イルスまたはウイルスの混合物を細胞に加え、次いでウイルスが細胞に感染する 、または細胞がそのような感染の証拠（例えば、ｇｐ120またはｇｐ41の表面発 現）を示すのに十分な時間、培養する。第１および第２結合パートナーは次いで 、２次ステップおよび逐次ステップで加えてもよい。それぞれの添加後、要すれ ば、上記結合バインダーがその基質に付着するのに適当な時間を提供する培養時 間を利用する。そのような時間は、機械的操作で決定され得る。上記の工程の結 果として、細胞−抗体−第一結合パートナー−第二結合パートナーの組み合わせ が形成される。抗体−第一結合パートナー−第二結合パートナーの組み合わせは 、少なくともこれら３成分を互いに結合させて、細胞に結合すると、複合体と呼 ばれることがある。好ましくは、複合体は、例えば、第二結合粒子を結合する際 に、磁性粒子を包み込んでいた。磁性粒子を複合体中に包み込むと、分離は、通 常、磁界によって達成され得る。例えば、実際上の選択により、米国特許第5,54 1,072号公報、同第5,543,289号公報、同第5,238,810号公報、同第5,196,827号公 報、同第4,731,337号公報を参照せよ。例えば、ある態様において、入口と出日 を有するチャンバーを、入口から試料で満たす。試料は、例えば、常磁性マイク ロスフェアで被覆された細胞（ＨＩＶ感染した細胞）を含有している。磁界を発 現し得る材料が、前記の満たされたチャンバーを包囲している。磁界をカラムに 加え、細胞を常磁性ビーズで被覆されたまま維持して、未被覆の細胞をチャンバ ーの出口を介して流出させる。感染しかつ被覆された細胞を、磁界を解除す ることにより、抽出できる。チャンバーは、磁界を発現し得る材料またはマトリ ックスを含む、材料またはマトリックスのいずれかを含有し得る。そのような方 法は、常法である。米国特許第5,411,863号公報には、本発明で使用され得る装 置、システムおよび粒子が開示されている。 本発明の関連した観点は、細胞のウイルス感染を干渉し、調整し、妨害しまた は促進する試薬の同定である。そのような試薬は、抗体、小分子、アプタマー、 リボザイム（ハンマーヘッド、イントロン、ヘアーピン等）、タンパク質（サイ トカイン、成長因子、サイトカイニン、拮抗薬等）、抗ウイルス性剤（プロテア ーゼ、ヌクレオチド等）、ケモカイン、ケモカイン拮抗薬（例えば、抗体を、Ｒ ＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂに包み込む拮抗薬）であり得る。本発 明のこの一面を達成するために、疑いのある試薬を、上述のようにして混合物に 添加して、試薬の存在または不存在下において捕集される細胞の数を試験または 測定することができる。例えば、ウイルスが細胞に入り込んだ後、ウイルス感染 を干渉する試薬を同定するために、細胞を試薬で予め処理することがある。細胞 とのウイルス結合を干渉するかまたは結合前にウイルスを無能にする試薬を同定 するためには、試薬を、ウイルスと同時に混合物に添加することもできる。 本発明で用いられる種々のサンプルには、ウイルス感染またはウイルス自体を 妨害する細胞または物質を含有すると思われるすべての物質が含まれる。例えば 、血液、リンパ球、組織、器官、インビトロ細胞培養物、尿、唾液、汗、水サン プル(例えば試験飲料水の質)、細胞培養基、ＦＢＳ、血液、便、食物、塩類溶液 などがある。このような物質は、無脊椎動物、脊椎動物、細菌、哺乳動物(ヒト 、サル類など)、軟体動物、昆虫類を含む源および種から由来する。 本発明に関する局面は、例えばウイルス由来のＨＩＶなどを血清から単離する ことを含む。例えば、ＨＩＶは、anti-gp4および／またはanti-gp120を有する２ mm磁気マイクロビトードに結合せしめることにより血清から単離できる。この技 法は、ウイルスの損失なしに免疫磁気分離法によって遠心分離を介してウイルス の濃度を高めることができ、ＰＣＲの血清阻害剤から効果的に単離することがで きる。細胞について上記したのと同じ方法がウイルスの単離に用いることができ る。しかし、磁気マイクロビードは、例えば約０．５−１nm、好ましくは１−５ nmのものが用いられる。 フロー細胞計数計が通常のように用いることができる。例えば、１つの実施態 様によって被覆細胞は磁気分離器から溶出される。参照、USP 5,411,863。この ような細胞いかなる技法によってもフロー細胞計数計にかけることができる。例 えば、下記参照：Hiebert，R.D.，"Electronics and Signal Processing",Flow Cytometry and Sorting，Second Ed.，Wiley-Liss Inc.，pp．127-155，1990;M. Loken et al.，“Two-Color Immunofluorescence using a Fluorescene-Activat ed Cell Sorter”、The Journal of Histochemistry and Cytochemistry，25(7) :899-907，1977;Sutherland et al.，“Sensitive detection and enumeration of CD34 cells in peripheral and cord blood by flow cytometry”，Exp．Hem atol.，Vol．22，pp．1003-1010，1994;V．Cacheux et al.，“Detection of 47 XYY Trophobladt Fetal Cells in Maternal Blood by Fluorescence in situ Hy bridization after Using Immunomagnetic Lymphocyte Depletion and Flow Cyt ometry Sorting”，Fetal Diagn．Ther.，Vol．7，pp．190-194,1992;P．N．Dea n，“Commercial Instruction”Flow Cytometry and Sorting，Second Ed.，Wil ey-Liss，Inc.，pp．171-186，1990;T．Lindmo et al.，“Flow Sorters for Bi ological Cells”Flow Cytometry and Sorting，Second Ed.，Wiley-Liss，Inc. ，pp．145-169，1990;H．B．Steen，“Characteristics of Flow Cyometers”Fl ow Cytometry and Sorting，Wiley-Liss，Inc.，pp．11-25，1990;M．R．Melame d et al.，"An Historical Review of the Development of Flow Cytometers an d Sorters"，Flow Cytometry and Sorting，Second Ed.，Wiley-Liss，Inc．199 0，pp．1-9，1990;Gottlinger et al.，“Operation of a Flow Cytometer”，F low Cytometry and Cell Sorting”，A．Radbruch Ed.，pp．7-23，1992;Schols et al.，“Flow Cytometric Method to demonstrate Whether Anti-HIV-1 Agen t Inhibit Virion Binding to T4 Cells”，Vol．2，pp．10-15，1989;Sallusto et al.，Science，277:2005-2007，1997；U.S.P.Nos．5,602,349;5,675,517;5, 665,577;5,641,457;and 5,582,982. ポリペプチド、たんぱく質などについての他の点に関しては、分子生物学、た んぱく質科学、免疫学などの標準的教科書に記載されている。例えば、下記参照 ：Davis et al．(1986)，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevir Scien ces Publishing，Inc.，New york;Molecular Cloning，Sambrook et al.，Curre nt Protocols in Molecular Biology，Edited by F.M．Ausubel et al.，John W iley & Sons，Inc;Current Protocols in Human Genetics，Edited by Nicholas C．Dracopoli et a.，John Wiley & Sons，Inc．;Current protocols in Prote in Science;Edited by John E．Coligan et al.，John Wiley & Sons，Inc.;Cur rent Protocols in Immunology;Edited by John E．Coligan et al.，John Wile y & Sons，Inc. 試験キットの詳細な説明 図１は、カートリッジ抗体試験(ＣＡＴ)を表し、カートリッジ１６および厚さ ２／８"幅２、長さ３"の透明な四方形のプレクシガラスを含む。壁１４は、カー トリッジ１６の真中に１／４の深さにある中心部が半球のデプレッションで、試 剤１２および３個のミクロ−ランス１０の混合物を含有する小袋(ミクロバギー) を保持する。壁１４は透明なミラー長細片(mylar strip)１８と接着ファスナー でカバーされている。バーコード片２２はカートリッジ１６の底面近くにある。 図２は、壁１４の側面、上面、底部が透明ですけて見えており、試剤／血液混 合物を光が通過し得ることを示す。 図３は、デプレッションすなわち壁１４の中心底面から突き出た３個のミクロ ランス１０の１つを示す。ミクロ−ランスの真上に位置するのは試剤１２の混合 物を含有する小袋である。 図４Ａは、試験者がカートリッジ１６の壁１４上に手をどのように置くかを表 わす。 図４Ｂは、３個のミクローランス１０上に試剤１２の混合物を含有する小袋上 を親指で押すことにより、試験者が出血し、試剤と血液がどのように混合するか を表す。図４Ｃは接着片２０に接着するように透明のミラー長細片１８を下げる ことにより、どのように収集後にミラー長細片でカートリッジ１６の封をするか を表わす。 図５Ａは、試剤混合物を含有する小袋を開ける前の壁１４の側面図である。壁 １４は、磁気分離および蛍光同定に必要な２種の試剤を含有している。常磁性ミ クロ相に結合した抗体３０およびフルオロクロームに結合した抗体３２である。 図５Ｂは、透明のミラー長細片１８でカバーされた壁１４の側面図であり、イ ンキュベーション前の全血サンプルおよび試剤を含む。 図５Ｃは、透明のミラー長細片１８でカバーされた壁１４の側面図であり全血 と試剤を混合した後のものである。インキュベーション４０はカートリッジ１６ に行われ、非感染の末梢血リンパ球２４は試剤に影響されていない。インキュベ ーション４０は感染末梢血リンパ球に非競合的に結合した抗体３４を生産する。 図５Ｄは、強い磁気勾配４２にさらされた壁１４を示す。磁場が、磁器勾配４ ２の強度まで、感染末梢血のリンパ球に非競合的に結合した全抗体３４の壁１４ の内面への移動を起し、感染末梢血リンパ球に非競合的に結合した抗体３４を非 感染末梢血リンパ球２４と分離する。磁気分離は約２０秒を要する。 図５Ｅは磁気分離が生じた後の壁１４の側面を表す。最大磁気濃度のあらかじ め定めた点は、適当な焦点光源４４で現され、例えば４８８ｎｍ波長で、ＦＩＣ Ｔについて、感染末梢血リンパ球に非競合的に結合した全抗体が５２０−５４０ ｎｍの蛍光で輝き４８まであらかじめ定めた点で凝集する。反応は映像システム で顕微鏡またはレンズで見ることができる。 図６Ａは、カートリッヂ１６のストップ側面を表す。図６Ｂは、感染血リンパ 球に非競合的に結合した抗体３４が非感染末梢血リンパ球２４を磁場によって磁 気勾配２４の強度まで分離されることを示す。 図６Ｃは、カートリッヂ１６の側面図であって、焦点光源４４が壁１４の底面 および壁１４上に置かれたレンズを通して導かれ、反応の輝き４８を現すことを 示す。 本発明を使用するために、試験者はＣＡＴ上の試剤混合物を含有する小袋を親 指または他の指で押さえる。試剤混合物を含有する小袋は破れる。３個のミクロ ランス１０は指に穴を開けて出血せしめる。バブル中の試剤および血液を混合す る。透明のミラー長細片１８を引っ張り下し、接着ファスナーで固着し、血液と 試剤を含有する壁１４に封をする。 特殊な実施態様において、２種の試剤が壁中に存在しなければならない。標的 の微生物の磁気分離およびそれらの存在の蛍光的同定を完了する。第１試剤は、 常磁性のミクロ相に結合した抗体３０を含有し、第２試剤はフルオロクロームに 結合した抗体３２を含む。両試剤は自己を、インキュベーション４０中に感染ま たは標的抗原被覆細胞に結合せしめる。 封をしたカートリッジ１６中の混合物は、３７℃で３〜５分間インキュベート される。次いで、カートリッジ１６は、観察台に移される。強い磁気勾配４２を 壁１４の側面に適用する。磁場は標的抗体、感染末梢血リンパ球に非競合的に結 合した抗体３４を他の非標的細胞から、磁気勾配４２が集中する固定点まで、分 離する。４８８nmの強制光源４４は、壁１４および血液と試剤の混合物を通過す る。強制光源４４は、特殊放出周波数における輝き４８を生じ、感染末梢血リン パ球に非競合的に結合した抗体３４を特殊なフルオロクロームにより測定せしめ る。反応は、レンズ４６または、感染した末梢血リンパ球に非競合的に結合した 抗体３４が位置するであろうウェル１４の内側表面において最も密度が高い所定 の磁気勾配の組み合わせ４２を通じて観察され得る。そして、発光（もしくはグ ロー、または輝き）がなければ結果は陰性であり、発光４８があれば結果は陽性 である。 テストの種類は、カートリッジ１６に付けたバーコード・ストリップ２２によ って同定される。 従って、本発明は、すべてのステップを一つの機能的なユニットで統一するこ とによって、血液の収集、試薬の混合、患者の追跡、および試験の解釈の手順を 簡単にするものであることが認められる。３つの微小レーン１０上に試薬の混合 物を含む微小袋状物１２を位置させることは、血液の収集および試薬との混合を 一工程で行うことを可能にする。透明なマイラーのストリップ１８が露出したウ ェル１４を被覆するために使用され、カートリッジ１６は３７℃でインキュベー ト４０される。 本発明は２つの試薬で作用する。第１の試薬は、磁気勾配４２を適用すること によって、感染した末梢血リンパ球２６が感染していない末梢血リンパ球２４か ら分離されるように、常磁性のミクロスフェアに結合した抗体３０から成る。磁 気勾配４２によって形成される磁場は、感染した末梢血リンパ球２６に付着した 常磁性のミクロスフェアに結合した抗体３０を、ウェル１４の内壁の所定の場所 に引き寄せる。 第２の試薬は、焦点を合わせた光源４４をウェル１４に当てることにより、感 染した末梢血リンパ球２６を、それが存在する場合には、特定の蛍光色素によっ て決定される特定の放射周波数で発光させて、感染した末梢血リンパ球２６が同 定され得るように、蛍光色素と結合した抗体３２から成る。透明なマイラーのス トリップ１８で被覆されたウェル１４は、カートリッジ１６を移動させ、試験反 応がレンズ４６を通して観察されるようにする。 参照番号のリスト １０ ３つの微小レーン １２ 試薬の混合物を含む微小袋状物 １４ ウェル １６ カートリッジ １８ 透明なマイラーのストリップ ２０ 粘着性ファスナー ２２ バーコードのストリップ ２４ 感染していない末梢血リンパ球 ２６ 感染した末梢リンパ球 ３０ 常磁性のミクロスフェアに結合した抗体 ３２ 蛍光色素と結合した抗体 ３４ 感染した末梢血リンパ球に非競合的に結合した抗体 ４０ インキュベーション ４２ 磁気勾配 ４４ 焦点を合わせた光源 ４６ レンズ ４８ 発光 上述の説明は多くの特定の態様を含んでいるが、これらは、本発明の範囲を限 定するものとして解釈されるべきでなく、単に現時点において本発明の好ましい 態様の幾つかの説明を与えているにすぎない。種々のほかの実施態様および派生 したものが、本発明の範囲内において可能である。例えば、感染性の疾病を診断 する際に用いられる種々の免疫化学反応が、カートリッジ１６を使用して、試薬 の混合物を含む微小袋状物１２において試薬を替えることによって実施され得る 。自動化されたカートリッジプロセッサは、先端技術の研究室の環境外において テストを実施するために、ＣＡＴを使用することができ、また、訓練されていな い人によって操作され得る。磁気的な分離を必要としない試験は、本発明を使用 して実施され得る。 このように、本発明の範囲は、以下に示す実施例によってではなく、添付した 請求の範囲、およびそれらの合法的な均等物のみによって決定される。実施例 ＨＩＶ−１ 分離システム 感染していない細胞の混合物からＨＩＶ−１感染した細胞を分離することが望 ましい場合の種々の場合において、インミュノマグネティック(imunomagnetic) 分離を利用するＨＩＶ−１感染細胞分離を用いることができる。感染細胞及び非 感染細胞の混合物を洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ中で再懸濁(resuspend)させる 。ポリクローン化した(polyclonal)アンチ−ＧＰ１２０−ＦＩＴＣを、再懸濁さ せた細胞の中に導入し、１０分間インキュベート(incubate)する。遠心分離によ って細胞を分離し、洗浄する。ポジティブ・セレクション・カラム(positive se lection column)を用いる蛍光ラベル化したＨＩＶ−１感染細胞(fluorescently labeled HIV-1-infected cells)を分離するのに、アンチ−ＦＩＴＣマイクロビ ーズを用いる。分離したＨＩＶ−１感染細胞を定量するのに、フローサイトメト リーを用いる。 これと同様の単離システム(isolation system)は、例えばＳＩＶ又はＨＴＬＶ 等の他のウイルス性の感染細胞に用いることもできる。 ＨＩＶ−１中和アッセイ(Neutralization Assay) ＨＩＶ感染細胞のインミュノマグネティック分離の原理を利用して、血清にお ける中和抗体活性(neutralizing antibody activity)の測定に、中和アッセイを 用いる。懸濁状態の受容性ＣＭ１７４細胞（又は他の受容性ウイルス性受容体） をＨＩＶ−１（ＭＮ及びIIIB株）の培養された実験室分離株(cultured Iaborato ry isolates)に接種することによって、ポジティブ・コントロールを決定する。 ７日間のインキュベート後、遠心分離によって細胞を分離し、洗浄し、ＰＢＳ中 で再懸濁させる。再懸濁した細胞の中にアンチ−ＧＰ１２０−ＦＩＴＣを導入し 、１０分間インキュベートする。遠心分離によって細胞を分離し、洗浄する。ボ ジティブ・セレクション・カラムを用いる蛍光ラベル化したＨＩＶ−１感染細胞 の分離に、アンチ−ＦＩＴＣマイクロビーズを用いる。その後、標準的フローサ イトメトリーを用いて、ＨＩＶ−１感染細胞を定量する。 逐次希釈した血清検体（specimen）をウイルス及びＣＭ１７４細胞の混合物へ 加え、ポジティブ・コントロールに用いたのと同じ時間でインキュベートするこ とによって、血清の中和活性を測定する処理を行う。ポジティブ・コントロール の場合と同様にアンチ−ＧＰ１２０−ＦＩＴＣ及びアンチ−ＦＩＴＣマイクロビ ーズを用いて、ＨＩＶ−１感染細胞を分離し、計量する。中和化血清による細胞 及びウイルスのインキュベート及び処理の後に単離されたＨＩＶ−１感染細胞の 量における、ポジティブ・コントロールとの差によって、各血清検体の中和活性 を測定する。 これと同様のアッセイを、例えばＳＩＶ又はＨＴＬＶ等の他のウイルス性の感 染細胞に用いることもできる。 ＨＩＶ−１薬物スクリーニング・アッセイ ＨＩＶ−１感染細胞のインミュノマグネティック分離の原理を利用して、in v itroでのＨＩＶ−１複製を防止する新しいアンチＨＩＶ薬物候補（drug can did ate）能を調べるためのＨＩＶ−１ドラッグ・スクリーニング・アッセイを行う 。懸濁状態の受容性ＣＭ１７４細胞を、ＨＩＶ−１（ＭＮ及びIIIB株）の培養さ れた実験室分離株(cultured laboratory isolates)に接種することによ って、ポジティブ・コントロールを決定する。７日間のインキュベート後、遠心 分離によって細胞を分離し、洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁させる。 再懸濁した細胞の中にアンチ−ＧＰ１２０−ＦＩＴＣを導入し、１０分間イン キュベートする。遠心分離によって細胞を分離し、洗浄する。ポジティブ・セレ クション・カラムを用いる蛍光ラベル化したＨＩＶ−１感染細胞の分離に、アン チ−ＦＩＴＣマイクロビーズを用いる。その後、標準的フローサイトメトリーを 用いて、ＨＩＶ−１感染細胞を定量する。 逐次希釈した候補の検体を、ウイルス及びＣＭ１７４細胞の混合物へ加え、ポ ジティブ・コントロールに用いたのと同じ時間でインキュベートすることによっ て、新しい薬物候補の抗ウイルス活性を測定する処理を行う。ポジティブ・コン トロールの場合と同様にアンチ−ＧＰ１２０−ＦＩＴＣ及びアンチ−ＦＩＴＣマ イクロビーズを用いて、ＨＩＶ−１感染細胞を分離し、計量する。薬物候補によ る細胞及びウイルスのインキュベート及び処理の後に単離されたＨＩＶ−１感染 細胞の量における、ポジティブ・コントロールとの差に関連する用量を記録する ことによって、各薬物候補の抗ウイルス活性を測定する。 これと同様のアッセイを、例えばＳＩＶ又はＨＴＬＶ等の他のウイルス性の感 染細胞に用いることもできる。 前述の実施例は、本発明の既に説明した実施例において用いたものと同様の、 属又は種として記載したリアクタント（reactant）及び／又は操作条件に換える ことによっても、同様の結果を繰り返すことができる。 上記および下記全ての出願、特許および刊行物、および特許出願番号０８/７ ３２,７８２および０８/７３２,７８４の開示全体は、出典明示により本明細書 の一部とする。 当業者ならば、本発明の実質的な特徴は上記の説明から容易に確認でき、かつ 本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途や条件に適合させる ため本発明の様々な変更や修飾を為すことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ０７Ｋ 16/08 // Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キング，チェスター・エフ アメリカ合衆国21702メリーランド州 フ レデリック、ショックスタウン・ロード 1641番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）細胞のウイルス感染を達成するのに有効な条件下で、標的細胞を細胞 感染能のあるウイルスと接触させて混合物を生成し、 ｂ）その混合物に、ウイルス感染時に細胞表面上で発現される、ウイルス によりコードされている抗原に対して特異的な第１結合パートナーを、その第１ 結合パートナーが細胞表面上でウイルス抗原に結合するのに有効な条件下で加え 、 ｃ）ｂ）から得られた混合物に、第１結合パートナーに特異的で磁気ビー ズに結合させた第２結合パートナーを、第１結合パートナーが細胞により発現さ れる抗原に結合するとき、第２結合パートナーが第１結合パートナーに結合する のに有効な条件下で加えて、複合体を生成し、 ｄ）磁場によって分離を達成することにより、その複合体を含有する標的 細胞を分離する、 ことを含んでなる、ウイルス抗原発現細胞の分離法。 ２．更に、標的細胞に、ウイルス抗原に特異的なサンプル抗体を添加する、請 求項１に記載の方法。 ３．更に、サンプル抗体の存在下および不在下で、ｄ）で分離した標的細胞の 数を計測することを含む、請求項２に記載の方法。 ４．更に、第２抗体の量が第１結合パートナーのウイルス抗原への結合と抵触 するのに有効であるようにして、標的細胞に、ウイルス抗原に特異的な抗体を含 有するサンプルを添加することを含む、請求項１に記載の方法。 ５．更に、標的細胞に、ウイルス抗原に特異的な抗体を含有する疑いのあるサ ンプルを添加することを含む、請求項１に記載の方法。 ６．更に、サンプル抗体の存在下および不在下で、ｄ）で分離した標的細胞の 数を計測することを含む、請求項５に記載の方法。 ７．第１結合パートナーがウイルス抗原に特異的な抗体である、請求項６に記 載の方法。 ８．第２結合パートナーが第１結合パートナーに特異的な抗体である、請求項 ６に記載の方法。 ９．第１結合パートナーがウイルス抗原に特異的な抗体であって、その抗体が 検出可能な標識で標識されている、請求項６に記載の方法。 １０．第２結合パートナーが検出可能な標識に特異的な抗体である、請求項９ に記載の方法。 １１．第１結合パートナーがウイルス抗原に特異的な抗体であって、その抗体 が検出可能な標識で標識されている、請求項６に記載の方法。 １２．ウイルスがＨＩＶである、請求項６に記載の方法。 １３．第１結合パートナーがウイルス抗原ｇｐ１２０に特異的な抗体であって 、その抗体が検出可能な標識で標識されており、かつ第２結合パートナーが検出 可能な標識に特異的な抗体である、請求項６に記載の方法。 １４．標的細胞がＴ−細胞系列である、請求項６に記載の方法。 １５．サンプル抗体の存在下および不在下でのｄ）で分離した標的細胞の数の 計測をフローサイトメトリーにて達成する、請求項６に記載の方法。 １６．第１結合パートナーがウイルス抗原に対する受容体である、請求項１２ に記載の方法。 １７．第１結合パートナーがウイルス抗原に対する受容体で、検出可能な標識 で標識されており、かつ第２結合パートナーが検出可能な標識に特異的な抗体で ある、請求項１６に記載の方法。 １８．ビーズの直径が約５０〜１２０nmである、請求項６に記載の方法。 １９．細胞を少なくとも約１００〜１０００のビーズによって接触させる、請 求項６に記載の方法。 ２０．ａ）細胞のウイルス感染を達成するのに有効な条件下で、標的細胞を細 胞感染能のあるウイルスと接触させて混合物を生成し、 ｂ）その混合物に、ウイルス感染時に試験細胞表面上で発現される、ウ イルスによりコードされている抗原に対して特異的な第１結合パートナーを、そ の第１結合パートナーが細胞表面上でウイルス抗原に結合するのに有効な条件下 で加え、 ｃ）ｂ）で生成した得られた混合物に、標的細胞のウイルス感染と抵触 する疑いのある薬剤を含有する試験サンプルを加え、 ｄ）ｃ）で生成した得られた混合物に、第１結合パートナーに特異的で磁 気ビーズに結合させた第２結合パートナーを、第２結合パートナーが試験細胞に より発現されるウイルス抗原に結合するとき、第２結合パートナーが第１結合パ ートナーに結合するのに有効な条件下で加えて、複合体を生成し、 ｅ）分離が磁場によって達成されるようにして、該複合体を含有する試験 細胞を分離し、 ｆ）試験サンプルが、工程ａ）、ｂ）およびｄ）と比較したときに、その 複合体を含有する試験細胞数を変えるかどうかを測定する、 ことを含んでなる、細胞のウイルス感染と抵触する薬剤の同定法。 ２１．ＨＩＶの細胞表面ウイルスレセプターでコートした表面を有する磁気ビ ーズ。 ２２．ウイルスレセプターがＣＤ４である請求項２１の磁気ビーズ。 ２３．（ａ）磁気粒子に付着した第１抗ｇｐ１２０抗体、（ｂ）検出可能な標 識に付着した第２抗ｇｐ１２０抗体および（ｃ）ＨＩＶ感染末梢血リンパ球を含 む水性試料を合併して混合物を形成し、 該抗体が該ｇｐ１２０に結合する条件下に該混合物をインキュベートし、該磁 気粒子上でＨＩＶ感染細胞に該第１および第２抗体が結合した複合体を形成し、 該磁気粒子を、該混合物を含む反応器の決められた位置に移動させ、該移動は 該磁気粒子に作用する磁場によって行なわれ、 該ＨＩＶ感染細胞上のｇｐ１２０に結合した該第２抗体の標識を検出し、その 検出が該混合物から未結合の第１抗体および未結合の第２抗体を除去することな く行なわれる水性試料中のＨＩＶ感染細胞の検出方法。 ２４．該第１および第２抗体がｇｐ１２０の種々のエピトープを認識する請求 項２３の方法。 ２５．水性試料が全血である請求項２３の方法。 ２６．該決められた位置が、該標識を検出するのに有効な光で照射されている 請求項２３の方法。 ２７．該検出可能な標識がＦＩＴＣである請求項２３の方法。 ２８．該第１抗体がモノクローナル抗体または抗体である請求項２３の方法。 ２９．該第１抗体がモノクローナル抗体であり、該第２抗体がポリクローナル 抗体であって、ＦＩＴＣである検出可能な標識に結合している請求項２３の方法 。 ３０．ＨＩＶ感染細胞が末梢血リンパ球である請求項２３の方法。 ３１．（ａ）磁気粒子に付着した第１抗ｇｐ１２０抗体、（ｂ）検出可能な標 識に付着した第２抗ｇｐ１２０抗体および（ｃ）ＨＩＶ感染細胞を含む水性試料 を合併して混合物を形成し、 該抗体が該ｇｐ１２０に結合する条件下に該混合物をインキュベートし、該磁 気粒子上でＨＩＶ感染細胞に該第１および第２抗体が結合した複合体を形成し、 該磁気粒子を、該混合物を含む反応器の決められた位置に移動させ、該移動は 該磁気粒子に作用する磁場によって行なわれ、 該ＨＩＶ感染細胞上のｇｐ１２０に結合した該第２抗体の標識を検出し、その 検出が該混合物から未結合の第１抗体および未結合の第２抗体を除去することな く行なわれる水性試料中のＨＩＶ感染細胞の検出方法。 ３２．(ａ)当該細胞の表面のウイルス性抗原を認識し、磁性粒子に付着した一 次抗体；(ｂ)当該細胞の表面の当該ウイルス性抗原を認識し、検出ラベルに付着 した二次抗体；および(ｃ)ウイルス感染性細胞を含む試料を組み合わせて、混合 液を形成し、 当該抗体の当該ウイルス性抗原の結合を効果的にする条件下で当該混合液 をインキュベーションし複合体、すなわち当該ウイルス性感染性細胞に結合する 当該一次および二次抗体を含む当該複合体を形成し、そして 当該混合液をいれた反応混合容器の前決定点に当該磁性粒子を移動し、そ れによって当該移動は当該磁性粒子に作用する磁性領域により為され、非ウイル ス感染性細胞から当該ウイルス感染性細胞を分離し、当該移動は当該混合液から 非結合性抗体である一次および二次抗体を除去することなく為し得る ことを含む試料内の非ウイルス感染性細胞からウイルス感染性細胞を分離する方 法。 ３３．当該一次および二次抗体が当該ウイルス性抗原の異なるエピトープを認 識する、当該ウイルス感染性細胞の当該ウイルス抗原に結合した当該二次抗体の ラベルを検出することをさらに含む、請求項３２の方法。 ３４．(ａ)当該細胞表面を認識し、磁性粒子に付着した一次抗体；(ｂ)当該抗 原を認識し、検出性ラベルに付着した二次抗体；および(ｃ)当該微生物を含む試 料を組み合わせて混合液を形成すること、 当該抗体の当該抗原への結合を効果的にする条件下で当該混合液をインキ ュベーションし複合体、すなわち当該微生物に結合した当該一次および二次抗体 を含む当該複合体を形成し、そして 当該混合液をいれた反応混合容器の前決定点に当該磁性粒子を移動し、そ れによって当該移動は当該磁性粒子に作用する磁性領域により為され、当該微生 物を分離し、当該移動は当該混合液から非結合性の一次抗体および二次抗体を除 去することなく為し得る ことを含む細胞表面抗原を持つ微生物を分離する方法。 ３５．当該微生物に結合した当該二次抗体のラベルを検出することをさらに含 む請求項３４の方法。 ３６．(ａ)当該癌細胞の表面の癌抗原を認識し、磁性粒子に付着した一次抗体 ；(ｂ)当該細胞の表面の当該癌抗原を認識し、検出ラベルを付着した二次抗体； および(ｃ)当該癌細胞を含む試料を組み合わせ、 当該抗体の当該癌抗原の結合を効果的にする条件下で当該混合液をインキ ュベーションし複合体、すなわち当該磁性粒子において当該癌細胞に結合した当 該一次および二次抗体を含む当該複合体を形成し、および 当該抗体の当該癌抗原への結合を効果的にする条件下で当該混合液を移動 し複合体、すなわち当該癌細胞に結合した当該一次および二次抗体を含む当該複 合体を形成し、および 当該混合液をいれた反応混合容器の前決定点に当該磁性粒子を移動し、そ れによって当該移動は当該磁性粒子に作用する磁性領域により為され、当該哺乳 類細胞から当該癌細胞を分離し、そして当該移動は当該混合液から非結合性一次 抗体および二次抗体を除去することなく為し得る ことを含む、癌および通常細胞の混合液において癌細胞を分離する方法。 ３７．上記癌細胞に結合した上記第２の抗体の標識を検出ずることを更 に含む請求項３６の記載の方法。 ３８．以下のもの ａ）底の付いたウエルを備え、ウエルは上記血液試料を収集するための窪み(d epression)をカートリッジ中に含み、上記ウエルの底は光を通すことができるよ うに透明になっている、収集／処理用カートリッジ； ｂ）血液試料を収集するために対象に穴をあけるためにウエルの上記底に配置 された少なくともひとつのランセット(lance)； c)対象に上記少なくともひとつのランセットによって穴をあける時に、薬剤を 放出することができるように少なくともひとつのランセット上に配置された薬剤 または薬剤類を含むバギー(baggy)；および ｄ）上記ウエルに蓋をするための上記カートリッジの末端に取り付けられた透 明なカバー材料、 を含む、一段階で対象の血液試料の収集と試験のためのカートリッジ式抗原試験 システム。 ３９．カートリッジの、上記カバー材料が取り付けられている端部とは 反対側の端部のところに、血液試料を収集した後上記ウエル上の材料をシールし カバーするための粘着剤付き留め具を更に含む請求項３８に記載のカートリッジ 式抗原試験システム。 ４０．身元確認のためのバーコードを更に含む請求項３８に記載のカー トリッジ式抗原試験システム。 ４１．上記薬剤または薬剤類を検出するための光源を更に含む請求項３ ８に記載のカートリッジ式抗原試験システム。 ４２．上記薬剤または薬剤類が、ｉ）磁性粒子または常磁性粒子に結合 された抗体、およびii)フルオロクロムに結合した抗体を含み、上記抗体が問題 としている試験物質に結合されている請求項３８に記載のカートリッジ式抗原試 験システム。 ４３．上記磁性粒子または常磁性粒子を磁気的に分離するための磁場を 作るための手段を更に含む請求項４２に記載のカートリッジ式抗原試験システム 。 ４４．上記薬剤または薬剤類が、i)磁性粒子または常磁性粒子に結合 された抗体、およびii)フルオロクロムに結合した抗体の複数対を含み、上記複 数対の抗体の各々が複数の問題としている試験物質のひとつに結合する請求項３ ８に記載のカートリッジ式抗原試験システム。 ４５．上記磁性粒子または常磁性粒子を磁気的に分離するための磁場を 作るための手段を更に含む請求項４４に記載のカートリッジ式抗原試験システム 。 ４６．上記薬剤または薬剤類が、i)ラテックス粒子に結合した捕捉抗原 、およびii)フルオロクロムに結合した抗イムノグロブリンを含み、上記捕捉抗 原および上記抗イムノグロブリンの各々が問題としている抗体に結合する請求項 ３８に記載のカートリッジ式抗原試験システム。 ４７．上記薬剤または薬剤類が、i)ラテックス粒子に結合した捕捉抗原 、およびii)フルオロクロムに結合した抗イムノグロブリンの複数対を含み、上 記捕捉抗原および上記抗イムノグロブリンの上記複数対の各々が問題としている 複数抗体のひとつに結合する請求項３８に記載のカートリッジ式抗原試験システ ム。 ４８．請求項４２のカートリッジ抗原テスト系を用いて、単一のステップで、対 象のテスト物質のために、被検者由来の血液サンプルを捕集およびテストするた めの方法であって、 ａ）該被検者の親指または指を該バギーおよび該少なくとも１つのランス（la nce）に押し当て、該被検者から該ウェルに血液を出させ、該バギーから該ウェ ルに該試薬または試薬類を開放すること； ｂ）該ウェルを該透明被覆材料で被覆すること； ｃ）該サンプルおよび該試薬または試薬類をインキュベートし、該試薬類で該 サンプルを反応させ、対象の該テスト物質を示すシグナルを生じさせること； ｄ）該シグナルのために該ウェルを観察し、これによって対象の該テスト物質 を決定すること； を含む方法。 ４９．該試薬または試薬類がｉ）磁性または常磁性(パラマグネチック)粒子に結 合された抗体およびｉｉ）フルオロクロムに共役された抗体を含み、該抗体の それぞれが対象のテスト物質に結合する請求項４８の方法であって、磁界を生じ させ、該磁性または常磁性粒子を磁性的にわけること、および該フルオロクロム およびその結果として対象の該テスト物質の決定のために、光源を適用すること をさらに含む方法。 ５０．該試薬または試薬類がｉ）磁性または常磁性粒子に結合された抗体および ｉｉ）フルオロクロムに共役された抗体の多数の対を含み、該多数の対の抗体の それぞれが対象の多数のテスト物質の一つに結合する請求項４８の方法であって 、磁界を生じさせ、該磁性または常磁性粒子を磁性的にわけること、および該フ ルオロクロムおよびその結果として対象の該多数のテスト物質の決定のために、 光源を適用することをさらに含む方法。 ５１．該試薬または試薬類がｉ）ラテックス粒子（latex particles）に結合さ れたキャプチャー抗原（capture antigen）およびｉｉ）フルオロクロムに共役 された抗−イムノグロブリンを含み、該キャプチャー抗原および抗−イムノグロ ブリンのそれぞれが対象のテスト物質に結合する請求項４８の方法であって、該 フルオロクロムおよびその結果として対象の該テスト物質の決定のために、光源 を適用することをさらに含む方法。 ５２．該試薬または試薬類がｉ）ラテックス粒子に結合されたキャプチャー抗原 およびｉｉ）フルオロクロムに共役された抗−イムノグロブリンの多数の対を含 み、該多数の対の該キャプチャー抗原および該抗−イムノグロブリンのそれぞれ が対象の多数のテスト物質の一つに結合する請求項４８の方法であって、該フル オロクロムおよびその結果として対象の該多数のテスト物質の決定のために、光 源を適用することをさらに含む方法。