JP2001501930A

JP2001501930A - 神経酵素の調節

Info

Publication number: JP2001501930A
Application number: JP10516411A
Authority: JP
Inventors: ピーターデイヴィッドグルックマン; クリストファーエドワードウィリアムス; ジアングアン
Original assignee: オークランドユニサーヴィスィズリミテッド
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-06
Publication date: 2001-02-13
Also published as: US6365573B1; EP0929313A4; WO1998014202A1; CA2267523A1; AU743412B2; AU4639197A; EP0929313A1

Abstract

(57)【要約】本発明は神経酵素の効果の調整法に関する。特に、ＧＰＥ投与を介した、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）および一酸化窒素シンセターゼ（ＮＯＳ）の有効量の増加に関する。

Description

【発明の詳細な説明】神経酵素の調節本発明は神経酵素の効果の調整法に関する。特に、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）および一酸化窒素シンセターゼ（ＮＯＳ）の有効量の増加に関する。背景技術ＧＰＥはアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕから成るトリペプチドである。このトリペプチドおよびそのジペプチド類似体（Ｇｌｙ−ＰｒｏおよびＰｒｏ−Ｇｌｕ）は、セラ（sera）等によりＥＰ０３６６６３８に最初に開示された。セラ等による提案は、ＧＰＥが神経修飾特性（ニューロンの電気的性質に作用する能力）を有するということである。ＧＰＥはまた神経保護特性を有するものとして確立されており、従って神経細胞死の防止または阻害において有用性を有する（ＷＯ９５／１７２０４）ものとされている。しかしながら、これまでは、ＧＰＥおよびその類似体がＣＮＳに存在する神経酵素の有効量に直接的な影響を及ぼすことを教示または示唆するものは何もなかった。確かに、ＧＰＥがＣｈＡＴ、ＧＡＤ、およびＮＯＳ、および／またはそれらの受容体の発現をアップレギュレートする能力を有することを示唆するものはなかった。ＣｈＡＴは神経伝達物質であるアセチルコリンの合成に関与している。従ってＣｈＡＴ発現をアップレギュレートする能力は、神経細胞の生存が脅かされない場合を含めて、神経、筋肉、および神経筋の治療および予防と密接な関係がある。ＧＡＤは重要な抑制性の神経伝達物質であるガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成に係わっている。それゆえＧＡＤの発現をアップレギュレートする能力は、神経の治療および予防に密接に関係している。ＮＯＳは脳において、血液の流れ、細胞の代謝、および細胞の生存の調節を含む多様な機能を有する。それゆえＧＰＥを用いてＮＯＳの発現を調節する能力は、神経細胞の生存が脅かされない場合を含めて、神経の治療および予防と密接な関係がある。本発明の目的は、ＣＮＳに存在する神経酵素の発現を直接アップレギュレートすることを含むニューロンの治療または予防に対する新規なアプローチを提供すること、或いは少なくとも公衆に有用な選択を用意することである。発明の概要本発明の第一の態様においては、本発明はＣｈＡＴ、ＮＯＳ、およびＧＡＤから選択される神経酵素の量の増加が望ましい状況に苦しんでいるかまたは影響され易い患者の治療法を提供することであり、この方法は前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする。さらなる態様において本発明は、神経学的疾患または状況の治療または予防のために、患者の神経酵素ＣｈＡＴの量を増加させる方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法を提供する。さらにもう一つの態様において本発明は、神経学的疾患または状況の治療または予防のために、患者の神経酵素ＧＡＤの量を増加させる方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法を提供する。さらにもう一つの態様において本発明は、治療または予防のために、患者の神経酵素ＮＯＳの量を増加させる方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を調節する段階を含むことを特徴とする方法を提供する。神経酵素の「量を増加させること」は、神経酵素の発現のアップレギュレーションを介する。「類似体」の意味するものは、ジペプチドＧｌｙ−ＰｒｏおよびＰｒｏ−Ｇｌｕならびに、ＧＰＥが結合するＣＮＳ内の受容体と有効に結合することができ、さらにＣｈＡＴ、ＧＡＤ、またはＮＯＳおよび／またはそれらの各々の受容体の発現に対して同等のアップレギュレーション効果を誘導することが可能な他の小さいペプチドを意味する。最も好ましくは、患者のＣＮＳ内で増加するものが有効量のＧＰＥそれ自体であることである。これはＧＰＥの直接投与により効果的に達成されることが可能であり、実際これが好ましい。しかしながら、ＧＰＥの有効量を間接的に増加させる化合物（例えば患者の体内で分解されてＧＰＥを放出するプロドラッグ）の投与が決して除外されるわけではない。活性のある化合物（ＧＰＥまたはその類似体）は、単独で、或いは好ましくは薬剤組成物の一部として投与することができる。この組成物は末梢から（例えば末梢の循環内への注射のような非経口経路により）患者に投与することが可能であり、或いはＣＮＳに直接投与することもできる。後者の投与経路は、例えば患者の脳の側脳室への注射によるか、または外科的に挿入された側脳室内へのシャントを含むことが可能である。都合のよいことに、以下の一つまたはそれ以上についての予防および治療において、ＣｈＡＴおよび／またはその受容体の発現は、ＧＰＥまたはその類似体の投与を通してアップレギュレートされる：運動ニューロン疾患；アルツハイマー病；筋ジストロフイー；末梢神経疾患；自律神経障害；記憶喪失；および加齢による神経退行変性。都合のよいことに、以下の一つまたはそれ以上についての予防および治療において、ＧＡＤおよび／またはその受容体の発現は、ＧＰＥまたはその類似体の投与を通してアップレギュレートされる：窒息後の発作；てんかんのような痙攣性疾患；およびハンチントン病のような神経退行変性疾患。都合のよいことに、以下の一つまたはそれ以上についての予防および治療において、ＮＯＳおよび／またはその受容体の発現は、ＧＰＥまたはその類似体の投与を通してアップレギュレートされる：クモ膜下出血；一過性脳虚血発作；脳卒中；多発梗塞性痴呆；脳脈管炎；および外傷性脳障害。さらなる態様において、本発明はまたＣＮＳに存在するＣｈＡＴ、ＧＡＤ、またはＮＯＳの量の増加に用いるための医薬品の製造に、ＧＰＥまたはその類似体を使用することにある。図面の簡単な説明本発明は、概括的には前文に定義したごとくである。しかしながらこの技術の当業者には、それが前文にのみ限定されるものではなく、以下の説明がその実施例を提供している態様をも含めたものであることが了解されるであろう。第１図は、低酸素症誘導の２時間後に、対照の賦形剤または３μｇのＧＰＥで処理した後のＣｈＡＴ陽性ニューロンの数を示しており；第２図は、低酸素症誘導の２時間後に、対照の賦形剤または３μｇのＧＰＥで処理した後のＧＡＤ陽性ニューロンの数を示しており；第３図は、低酸素症誘導の２時間後に、対照の賦形剤または３μｇのＧＰＥで処理した後のＮＯＳ陽性ニューロンの数を示しており；第４図は、キノリン酸で脳に損傷を誘導した後のＧＡＤ陽性ニューロンの数に及ぼすＧＰＥの影響を示しており；第５図は、キノリン酸で脳に損傷を誘導した後のＮＯＳ陽性ニューロンの数に及ぼすＧＰＥの影響を示しており；第６図は、キノリン酸で脳に損傷を誘導した後のＣｈＡＴ陽性ニューロンの数に及ぼすＧＰＥの影響を示している。発明の説明前文に示したように、本発明は概して、ＧＰＥおよびその類似体がＣＮＳ内のある神経酵素の量を増加させることができるという本出願人等の驚くべき発見に基づくものである。この増加は、酵素活性をアップレギュレートすることを介したものであり、患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効濃度または量を増加させることによって遂行される。効果が特異的にアップレギュレートされる神経酵素は、ＣｈＡＴ、ＧＡＤ、およびＮＯＳである。神経酵素の量を増加させるためにＧＰＥ自身を用いることは、現在本出願人等により好ましいとされている。最も好ましくは、このことは患者へのＧＰＥの直接投与を通して遂行される。しかし、現段階ではこのことが好ましいとはいえ、本出願人等の側には他の形でのＧＰＥの投与を排除する意向はない。例としては、ＣＮＳ内のＧＰＥの有効量は、ＧＰＥと担体とを含むプロドラッグ形のＧＰＥを投与することによって増加させることができる。ＧＰＥと担体とは、患者の体内での切断または消化に感受性のある結合により結合されている。投与後に切断または消化されてＧＰＥを放出することになるいかなる適切な結合も用いることができる。ＧＰＥが薬物または製剤の一部として投与されることはさらに好ましい。これには、ＧＰＥと製剤上適切な担体、アジュバント、または医薬品添加物との組み合わせが含まれる。この担体、アジュバント、または医薬品添加物の選択が一般的には使用される投与の経路に依存することはいうまでもないであろう。この投与経路は広範囲に変えることが可能である。ＧＰＥの利点は、末梢に投与することができることである。このことは、ＣＮＳ内で効果をもたせるために患者のＣＮＳに直接投与する必要がないことを意味する。この技術において周知のいかなる末梢経路の投与も用いることが可能である。これらには、適切な例として、末梢循環内への非経口投与を含むことができる。しかしながら、経口、直腸、鼻、皮下、吸入、腹腔内、または筋肉内から選択される代りの投与経路を用いてもよい。最も便利な二つの投与経路は、静脈内（例えば０．９％の塩化ナトリウムに溶解して）または経口によるもの（カプセルにて）であろう。時には、患者のＣＮＳにＧＰＥを直接投与することが望ましいことがあることもまた了解されよう。さらにまた、このことは何らかの直接的な投与経路によって遂行することができる。例としては、患者の脳の側脳室への注射によるか、または外科的に挿入された側脳室内へのシャントが含まれる。投与されるべきＧＰＥまたはその類似体の有効量の算出は、この技術の当業者には日常的なものであろう。いうまでもなく、投与されるべき最終的な量は、投与の経路に依存し、かつ治療されるべき神経障害または状況の性質に依存することとなる。適切な用量の範囲は、例えば、この用量が中枢に投与される場合、体重１００ｇ当り約０．０４μｇから１０００μｇの間のＧＰＥおよび／または類似体でよい。ＧＰＥおよびその類似体は適切な市販の源から入手可能である。別法として、ＧＰＥおよびその類似体は、Merryfield等(J．Amer．Chem．Soc．85，2149‐215 6(1963))の段階的固相合成法のような通常の方法により、直接的に合成することができる。別法として、合成にはApplied Biosystems model 430Aのような市販のペプチド合成機の使用が含まれる。ここに以下の制限しない実施例を参照して、本発明を説明する。実施例１これらの研究の目的は、ＣｈＡＴの発現に及ぼすＧＰＥ投与の効果を、ＣＮＳの損傷の有無において測定することであった。実験には、限局性のＣＮＳ損傷の２時間後に、対照の賦形剤またはＧＰＥを用いてラットを処理することが含まれた。これらのラットは、大脳半球に標準的な方法（頚動脈の結紮）で誘導された低酸素虚血性損傷を有していた。低酸素の程度および期間、周囲の温度および湿度は損傷の程度を標準化するべく定められた。神経死は頚動脈結紮の側に限定されており、主として結紮された大脳半球の海馬、歯状回、線条、および側方皮質においてである。反対側の半球にはニューロンの損失が全くない。明確には、９対の成体ウィスターラット（２８０〜３２０ｇ）をハロタン／Ｏ₂ 麻酔下に用意した。右側の頚動脈を結紮した。ガイドカニューレを、定位的ゼロより７．５ｍｍ前方かつ正中線から右１．５ｍｍの硬膜上に置いた。このラットを１時間覚醒させ、次いで低酸素処理に先立ち、９０＋／−５％の湿度ならびに３１＋／−０．５℃の温度のインキュベーター中に１時間静置した。酸素濃度を減じ、６＋／−０．２０２％にて１０分間維持した。低酸素処理の後、このラットをインキュベーターにて２時間保持し、次いで３μｇのＧＰＥまたは賦形剤のいずれか（０．１Ｍクエン酸緩衝液[ｐＨ６]、０．１Ｍリン酸緩衝液［ＰＢＳ］[ｐＨ７．３]中の０．１％ウシ血清アルブミンに１０倍希釈した）を用いて処理した。さらに６匹のラットを正常な対照として用いた。低酸素虚血性損傷の３日後に、このラットをペントバルビタールを用いて犠牲にした。生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドを用いて脳を灌流し、さらに灌流固定法により一晩固定した。脳は、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５％ショ糖にこの組織が沈むまで貯蔵した。線条、淡蒼球、および黒質の凍結した冠状面の切片（３０μｍ）をマイクロトームを用いて切りだし、０．１ＭＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウムに４℃にて貯蔵した。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の免疫反応性は、浮動切片法を用いて染色することにより証明した。手短にいえば、抗体を１％ヤギ血清にて希釈した。切片は免疫組織化学法に先立ち、０．１ＭＰＢＳ／トリトン中の０．２％トリトンにおいて、４℃にて一晩インキュベートした。この切片を、５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂を用いて２０分間前処理した。次にこの切片を４D のウサギ（Ｒｂ）抗ＣｈＡＴ（１：５０００）抗体（一次抗体）と共に２日間振盪機にてインキュベートした。この切片をＰＢＳ／トリトンを用いて洗浄し（１５分間x３d）、次いでビオチニル化したヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１０００）と共に室温にて一晩インキュベートした。この切片を洗浄し、（ExtrAvidin TM Sigma、１：１０００）中で３時間インキュベートし、その後３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ，０．０５％）中のＨ₂Ｏ₂（０．０１％）による反応を行なった。これらの切片をクロムミョウバンで被覆したスライド上にマウントし、乾燥し、脱水し、カバーをつけた。ＣｈＡＴに対応する特異的な免疫反応性を示した両半球の線条体ニューロンを、光学顕微鏡および１ｍｍが２×１０００の格子を用いてカウントした。カウントに用いた線条体領域の寸法は、画像分析器を用いて測定した。ニューロン／ｍｍ²の全カウントをＧＰＥおよび賦形剤で処理した群の間で比較した。データは組み合わせt検定により分析し、平均＋／−ｓｅｍで表した。結果を第１図に示す。この図は、ＣｈＡＴ免疫陽性ニューロンの数が右および左（未損傷）の両側において増加していることを示す。このことは、ＧＰＥの投与がＣｈＡＴのアップレギュレーションに有効であることを明らかに示している。実施例２これらの研究の目的は、ＧＡＤの発現に及ぼすＧＰＥ投与の効果を、ＣＮＳの損傷の有無において測定することであった。実験には、限局性のＣＮＳ損傷の２時間後に、対照の賦形剤またはＧＰＥを用いてラットを処理することが含まれた。これらのラットは、大脳半球に標準的な方法（頚動脈の結紮）で誘導された低酸素虚血性損傷を有していた。低酸素の程度および期間、周囲の温度および湿度は損傷の程度を標準化するべく定められた。神経死は頚動脈結紮の側に限定されており、主として結紮された大脳半球の海馬、歯状回、線条、および側方皮質においてである。反対側の半球にはニューロンの損失が全くない。明確には、９対の成体ウィスターラット（２８０〜３２０ｇ）をハロタン／Ｏ₂ 麻酔下に用意した。右側の頚動脈を結紮した。ガイドカニューレを、定位的ゼロより７．５ｍｍ前方かつ正中線から右１．５ｍｍの硬膜上に置いた。このラットを１時間覚醒させ、次いで定酸素処理に先立ち、９０＋／−５％の湿度ならびに３１＋／−０．５℃の温度のインキュベーター中に１時間静置した。酸素濃度を減じ、６＋／−０．２０２％にて１０分間維持した。低酸素処理の後、このラットをインキュベーターにて２時間保持し、次いで３μｇのＧＰＥまたは賦形剤のいずれか（０．１Ｍクエン酸緩衝液[ｐＨ６]、０．１Ｍリン酸緩衝液［ＰＢＳ］[ｐＨ７．３]中の０．１％ウシ血清アルブミンに１０倍希釈した）を用いて処理した。さらに６匹のラットを正常な対照として用いた。低酸素虚血性損傷の３日後に、このラットをペントバルビタールを用いて犠牲にした。生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドを用いて脳を灌流し、さらに灌流固定法により一晩固定した。脳は、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５％ショ糖にこの組織が沈むまで貯蔵した。線条、淡蒼球、および黒質の凍結した冠状面の切片（３０μ ｍ）をマイクロトームを用いて切りだし、０．１ＭＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウムに４℃にて貯蔵した。ＧＡＤの免疫反応性は、浮動切片法を用いて染色することにより証明した。手短にいえば、抗体を１％ヤギ血清にて希釈した。切片は免疫組織化学法に先立ち、０．１ＭＰＢＳ／トリトン中の０．２％トリトンにおいて、４℃にて一晩インキュベートした。この切片を、５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂を用いて２０分間前処理した。次にこの切片を４Dのウサギ（Ｒｂ）抗ＧＡＤ（１：５０００）抗体（一次抗体）と共に２日間振盪機にてインキュベートした。この切片をＰＢＳ／トリトンを用いて洗浄し（１５分間x３d）、次いでビオチニル化したヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１０００）と共に室温にて一晩インキュベートした。この切片を洗浄し、（ExtrAv idin TM Sigma、１：１０００）中で３時間インキュベートし、その後３，３− ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ，０．０５％）中のＨ₂Ｏ₂（０．０１％）による反応を行なった。これらの切片をクロムミョウバンで被覆したスライド上にマウントし、乾燥し、脱水し、カバーをつけた。ＧＡＤに対応する特異的な免疫反応性を示した両半球の線条体ニューロンを、光学顕微鏡および１ｍｍが２×１０００の格子を用いてカウントした。カウントに用いた線条体領域の寸法は、画像分析器を用いて測定した。ニューロン／ｍｍ² の全カウントをＧＰＥおよび賦形剤で処理した群の間で比較した。データは組み合わせt検定により分析し、平均＋／−ｓｅｍで表した。結果を第２図に示す。この図は、ＧＡＤ免疫陽性ニューロンの数が右側では増加したが、一方パルブアルブミン（同一の細胞型のマーカー）は増加せず、ＧＡＤの発現が生きた細胞においてアップレギュレートされたことを示している（＊ｐ＜０．０５）。実施例３これらの研究の目的は、ＮＯＳの発現に及ぼすＧＰＥ投与の効果を、ＣＮＳの損傷の有無において測定することであった。実験には、限局性のＣＮＳ損傷の２時間後に、対照の賦形剤またはＧＰＥを用いてラットを処理することをが含まれた。これらのラットは、大脳半球に標準的な方法（頚動脈の結紮）で誘導された低酸素虚血性損傷を有していた。低酸素の程度および期間、周囲の温度および湿度は損傷の程度を標準化するべく定められた。神経死は頚動脈結紮の側に限定されており、主として結紮された大脳半球の海馬、歯状回、線条、および側方皮質においてである。反対側の半球にはニューロンの損失が全くない。明確には、９対の成体ウィスターラット（２８０〜３２０ｇ）をハロタン／Ｏ₂ 麻酔下に用意した。右側の頚動脈を結紮した。ガイドカニューレを、定位的ゼロより７．５ｍｍ前方かつ正中線から右１．５ｍｍの硬膜上に置いた。このラットを１時間覚醒させ、次いで定酸素に先立ち、９０＋／−５％の湿度ならびに３１＋／−０．５℃の温度のインキュベーター中に１時間静置した。酸素濃度を減じ、６＋／−０．２０２％にて１０分間維持した。低酸素処理の後、このラットをインキュベーターにて２時間保持し、次いで３μｇのＧＰＥまたは賦形剤のいずれか（０．１Ｍクエン酸緩衝液[ｐＨ６]、０．１Ｍリン酸緩衝液［ＰＢＳ］[ ｐＨ７．３]中の０．１％ウシ血清アルブミンに１０倍希釈した）を用いて処理した。さらに６匹のラットを正常な対照として用いた。低酸素虚血性損傷の３日後に、このラットをペントバルビタールを用いて犠牲にした。生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドを用いて脳を灌流し、さらに灌流固定法により一晩固定した。脳は、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５％ショ糖にこの組織が沈むまで貯蔵した。線条、淡蒼球、および黒質の凍結した冠状面の切片（３０μｍ）をマイクロトームを用いて切りだし、０．１ＭＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウムに４℃にて貯蔵した。神経の一酸化窒素シンセターゼ（ＮＯＳ）の免疫反応性は、浮動切片法を用いて染色することにより証明した。手短にいえば、抗体を１％ヤギ血清にて希釈した。切片は免疫組織化学法に先立ち、０．１ＭＰＢＳ／トリトン中の０．２％トリトンにおいて、４℃にて一晩インキュベートした。この切片を、５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂を用いて２０分間前処理した。次にこの切片を４Dのウサギ（Ｒｂ）抗ＮＯＳ（１：３０００）抗体（一次抗体）と共に２日間振盪機にてインキュベートした。切片をＰＢＳ／トリトンを用いて洗浄し（１５分間x３d）、次いでビオチニル化したヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１０００）と共に室温にて一晩インキュベートした。この切片を洗浄し、（ExtrAvidin TM Sigma、１：１０００）中で３時間インキュベートし、その後３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ，０．０５％）中のＨ₂Ｏ₂（０．０１％）による反応を行なった。これらの切片をクロムミョウバンで被覆したスライド上にマウントし、乾燥し、脱水し、カバーをつけた。ＮＯＳに対応する特異的な免疫反応性を示した両半球の線条体ニューロンを、光学顕微鏡および１ｍｍが２×１０００の格子を用いてカウントした。カウントに用いた線条体領域の寸法は、画像分析器を用いて測定した。ニューロン／ｍｍ² の全カウントをＧＰＥおよび賦形剤で処理した群の間で比較した。データは組み合わせt検定により分析し、平均＋／−ｓｅｍで表した。結果を第３図に示す。この図は、ＮＯＳ免疫陽性ニューロンの数が右および左（未損傷）の両側において増加していることを示す（＃ｐ＝０．０７２、＊ｐ＝０．００８）。このことは、ＧＰＥの投与がＮＯＳのアップレギュレーションに有効であることを明らかに示している。実施例４この研究の目的は、キノリン酸により線条に誘導された損傷の有無において、ＧＡＤ、ＮＯＳ、およびＣｈＡＴの発現に及ぼすＧＰＥ投与の効果を測定することであった。実験動物の線条に注射された場合、キノリン酸は線条体淡蒼球および線条体黒質のＧＡＢＡ作動性突起ニューロンの損失から生じる障害をもたらすが、線条の軸索には危害を与えない(Science，219，316-318(1983))。キノリン酸投与の２時間後に、対照の賦形剤またはＧＰＥを用いてラットを処理した。材料および方法全１４匹の雄性のウィスターラット（２８０〜３１０ｇ）をこの研究に用いた。８匹のラットをハロタン／Ｏ₂麻酔を用いて麻酔した。キノリン酸の注射（７８単位、Sigma、４MのＮａＯＨに希釈した）は、右線条の背側領域の、ブレグマに０．８ｍｍ前方、正中線に２．５ｍｍ側方、および軟膜表面に４．０ｍｍ腹側に定位的に位置させた。２時間後、３μｇのＧＰＥまたは賦形剤のみ（０．１Ｍクエン酸緩衝液[ｐＨ６]、０．１Ｍリン酸緩衝液［ＰＢＳ］[ｐＨ７．３]中の０．１％ウシ血清アルブミンに１０倍希釈された）を、定位ゼロから７．５ｍｍ前方、正中線より右１．５ｍｍ、および垂直に３ｍｍのガイドカニューレを通して右側脳室内へ投与した。６匹のラットを正常な対照として用いた。キノリン酸で誘導した線条体損傷の３日後に、このラットをペントバルビタールを用いて犠牲にした。１０％緩衝ホルマリン（ｐＨ７）を用いて脳を灌流し、ＧＡＤについて、線条におけるＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに見られるＮＯＳについて、およびアセチルコリンを合成しかつ線条のコリン作動性ニューロンに見られるＣｈＡＴについての免疫反応性のための処理を行なった。脳は、０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５％ショ糖にこの組織が沈むまで貯蔵した。線条、淡蒼球、および黒質の凍結した冠状面の切片（３０μｍ）をマイクロトームを用いて切りだし、０．１ＭＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウムに４℃にて貯蔵した。ＧＡＤ、ＮＯＳ、およびＣｈＡＴの免疫反応性は、浮動切片法を用いて染色することにより証明した。簡単にいえば、抗体を１％ヤギ血清にて希釈した。切片は免疫組織化学法に先立ち、０．１ＭＰＢＳ／トリトン中の０．２％トリトンにおいて、４℃にて一晩インキュベートした。この切片を、５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂を用いて２０分間前処理した。次にこの切片を４Dのウサギ抗ＧＡＤ（１：５０００）、ウサギ抗ＮＯＳ（１：３０００）、またはウサギ抗ＣｈＡＴ（１：５０００）抗体と共に２日間振盪機にてインキュベートした。この切片をＰＢＳ／トリトンを用いて洗浄し（１５分間x３d）、次いでビオチニル化したヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１０００、Amersham）と共に室温にて一晩インキュベートした。この切片を洗浄し、（ExtrAvidin^TM、１：１０００、Sigma）中で３時間インキュベートし、次いで０．０５％の３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドおよび０．０１％のＨ₂Ｏ₂と反応させ、褐色の反応生成物を産生した。これらの切片をクロムミョウバンで被覆したスライド上にマウントし、乾燥し、脱水し、カバーをつけた。ＧＡＤ、ＮＯＳ、およびＣｈＡＴに対応する特異的な免疫反応性を示した両半球の線条体ニューロンを、光学顕微鏡および１ｍｍが２×１０００の格子を用いてカウントした。カウントに用いた線条体領域の寸法は、画像分析器（Mocha im age analysis software）を用いて測定した。ニューロン／ｍｍ²の全カウントをＧＰＥおよび賦形剤で処理した群の間で比較した。データは統計上の有意性について分析されていない。ＧＰＥ処理した動物のうち１匹からの組織はカウント不能であった。これらの結果を第４ないし６図に示す。結果第４図は、損傷後の脳の左（未損傷）および右の両側の線条におけるＧＡＤの免疫反応性の損失を示す。ＧＰＥは、脳の両側におけるＧＡＤの発現のアップレギュレーションを誘導した。第５図は、損傷後の脳の左右両側の線条におけるＮＯＳ活性の損失を示す。ＧＰＥは、脳の左（未損傷）側での酵素レベルを正常に保持したままで、脳の両側における酵素発現のアップレギュレーションを誘導した。第６図は、損傷後の脳の両側におけるＣｈＡＴ免疫反応性の損失を示す。ＧＰＥ処理は、脳の右（損傷）側のＣｈＡＴのレベルを正常より高くアップレギュレートした。結論これらの結果は、ＣＮＳにおけるＧＡＤ、ＮＯＳ、およびＣｈＡＴの発現を調整するＧＰＥの能力を証明する。さらに、この結果はＧＡＤおよびＮＯＳが、キノリン酸に誘導された損傷があってもなくても調整されることを示している。このことは、ＧＡＤおよびＮＯＳの発現のアップレギュレーションにおけるＧＰＥの効果が、神経の損傷または神経細胞の生存に対する脅威の影響を受けないことを明らかに証明している。この結果はまた、キノリン酸で誘導された神経の損傷の存在下では、ＧＰＥによってＣｈＡＴをアップレギュレートすることが可能であることを示している。産業上の利用この実験結果は、ＧＰＥの、酵素発現の直接的な増加を通しての、ＣＮＳにおける神経酵素ＣｈＡＴ、ＧＡＤ、およびＮＯＳの量を増加させる能力を証明している。さらにこの結果は、神経の損傷があってもなくても、ＣｈＡＴおよびＮＯＳの発現がアップレギュレートされることを示している。このことは、これらの酵素の発現をアップレギュレートすることにおけるＧＰＥの効果が、神経の損傷または神経細胞の生存への脅威に対する反応とは無関係であることを明確に表している。これらの発見は、ＧＰＥまたはその類似体を、数多くの神経性の疾患または状況の治療において治療用または予防用として適用可能なものにする。実際、ＣＮＳ内のＣｈＡＴ、ＧＡＤ、またはＮＯＳの発現の増加から患者が利益を受けることになる場合にはいつでもＧＰＥおよびその類似体が使用できることが、この技術の当業者には明らかであろう。このことから利益を受けることとなる神経性の疾患または状況は、以下のものを含むがこれに制限されない：運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、末梢神経疾患、自律神経症、記憶喪失、加齢および他の形の神経退行変性（ＣｈＡＴ）；窒息後発作、てんかんおよび他の痙攣性疾患、ハンチントン病のような神経退行変性疾患、および頭部外傷、脳卒中、および他の形の低酸素虚血性の脳損傷に続く直後の急性期（ＧＡＤ）；およびクモ膜下出血、一過性脳虚血発作、脳卒中、多発脳梗塞性痴呆、脳脈管炎、および頭部外傷、および頭部外傷、脳卒中、および他の形の低酸素虚血性の脳損傷に続く直後の急性期。本発明を、ある特定の態様についての参照を以って前文に説明したが、この説明は代表的なものにすぎず、また添付の合法的な請求の範囲によってのみ本発明が制限されるものであることが了解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号２９９５１３ (32)優先日平成８年10月４日(1996．10．4) (33)優先権主張国ニュー・ジーランド（ＮＺ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グアンジアンニュー・ジーランド国オークランドエイヴォンデールアランストリート 29

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣｈＡＴ、ＮＯＳ、およびＧＡＤから選択される神経酵素の量の増加が望ましい状況に苦しんでいるかまたは影響され易い患者の治療法であって、前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法。２．請求項第１項記載の方法において、ＧＰＥまたはその類似体の濃度が、前記患者に対する有効量のＧＰＥまたは前記ＧＰＥの類似体あるいはそれらのプロドラッグの投与により増加することを特徴とする方法。３．請求項第２項記載の方法において、ＣＮＳにおけるＧＰＥの濃度が、ＧＰＥの直接投与により増加することを特徴とする方法。４．予防法であることを特徴とする請求項第１ないし３項のいずれか１項記載の方法。５．治療法であることを特徴とする請求項第１ないし３項のいずれか１項記載の方法。６．請求項第１ないし５項のいずれか１項記載の方法において、前記状況がＣｈＡＴの量の増加が望ましい状況であることを特徴とする方法。７．請求項第６項記載の方法において、前記状況が、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、末梢神経疾患、自律神経症、記憶喪失、および加齢による神経退行変性から選択されることを特徴とする方法。８．請求項第１ないし５項のいずれか１項記載の方法において、前記状況がＧＡＤの量の増加が望ましい状況であることを特徴とする方法。９．請求項第８項記載の方法において、前記状況が、窒息後発作、痙攣性疾患、神経退行変性疾患、および脳の低酸素虚血性損傷から選択されることを特徴とする方法。１０．請求項第１ないし５項のいずれか１項記載の方法において、前記状況がＮＯＳの量の増加が望ましい状況であることを特徴とする方法。１１．請求項第１０項記載の方法において、前記状況が、クモ膜下出血、一過性脳虚血発作、脳卒中、多発脳梗塞性痴呆、脳脈管炎、および外傷性の脳損傷から選択されることを特徴とする方法。１２．神経性の疾患または状況に対する治療または予防のための、患者の神経酵素ＣｈＡＴの発現をアップレギュレートする方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法。１３．神経性の疾患または状況に対する治療または予防のための、患者の神経酵素ＧＡＤの発現をアップレギュレートする方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法。１４．神経性の疾患または状況に対する治療または予防のための、患者の神経酵素ＮＯＳの発現をアップレギュレートする方法であって、前記方法が前記患者のＣＮＳ内のＧＰＥまたはその類似体の有効量を増加させる段階を含むことを特徴とする方法。１５．請求項第１１ないし１３項のいずれか１項記載の方法において、ＧＰＥ、その類似体、またはそのプロドラッグを前記患者のＣＮＳに直接投与することを含むことを特徴とする方法。１６．治療または予防の目的のための、患者のＣＮＳ内のＣｈＡＴ、ＧＡＤ、およびＮＯＳから選択される神経酵素の量の増加に用いるための医薬品の調製におけるＧＰＥまたはその類似体の使用。１７．請求項第１６項記載の使用において、前記医薬品が、患者のＣＮＳにおけるＣｈＡＴの発現の増加に使用するためのものであることを特徴とする使用。１８．請求項第１６項記載の使用において、前記医薬品が、患者のＣＮＳにおけるＧＡＤの発現の増加に使用するためのものであることを特徴とする使用。１９．請求項第１６項記載の使用において、前記医薬品が、患者のＣＮＳにおけるＮＯＳの発現の増加に使用するためのものであることを特徴とする使用。