JP2001500254A - 物質を粒子に付着させる手順 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ある物質、特に有機物質を１つまたは複数の極微粒子上に付着させる方法を提供する。この方法は、その極微粒子上に付着させるべきある物質のある量ならびにある量の極微粒子を提供することを含んでいる。次いで、その有機物質を第１の導管（１２、２０６）を通して導入し、そしてその極微粒子を第２の導管（１６、２１２）を通して送る。第１（１２、２０６）および第２（１６、２１２）の導管は合流点（２６、２１４、３０５）で一緒になり、上記物質が上記極微粒子に付着して被覆するように物質と極微粒子をそこで混合させる。好ましい実施形態では、さらに、上記物質と上記極微粒子を互いに混合するために、直列形の静的混合機（２２、２１６、２３８、３０７、３１７、３２３、３２９）などの混合手段が提供されている。被覆された極微粒子を、免疫検定法、核酸アッセイ法、細胞アッセイ法および治療用注射可能薬物用途の全ての方法に利用することができる。上記極微粒子を、第１の有機物質に接合または付着させるために別の有機物質で置き換えることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】 物質を粒子に付着させる手順 発明の背景 免疫検定法および他の診断手順で、磁性または非磁性の極微粒子を使用するこ とはよく知られている。そのような方法は全て、抗体、抗原、核酸または他の有 機化合物などの有機結合成分をその特殊な分析装置に利用される極微粒子に結合 させることが必要である。そして、その被覆された極微粒子を免疫検定法に利用 して、分析しようとする特定のサンプル中の重要な被検体を捕捉する。 一般的に、有機物質の極微粒子への結合は、反応容器内でのバッチ反応で達成 されている。例えば、米国特許４，５５４，０８８には、抗体または酵素を磁性 粒子に結合させる方法が記述されている。そのような結合は通常、粒子と試剤の 一定の混合を含めて、１６〜２４時間の反応時間を必要とする。結合成分の磁性 粒子への被覆の他の例が米国特許５，４１１，８６３に示されており、バッチ反 応での結合にやはり数時間必要としている。有機物質を極微粒子に被覆させるの に有用な各種の化学的方法 Seradyn（インディアナ州インディアナポリス）、Bangs Laboratories（インデ ィアナ州カーメル）またはPierce Chemical（イリノイ州ロックフォード）から の市販の文献で見ることができる。 有機物質の極微粒子、特に磁性の極微粒子へのバッチ反応での結合には、いく つかの問題が生じる可能性がある。第１に、磁性の極微粒子は密度が高いので、 反応容器の底にすぐ沈降してしまう。従って、均一な外観の混合物を維持するに は一定の撹拌が必要である。第２に、どんなに撹拌を行なっても、部分的に濃度 のばらつきが生じて、粒子へ結合する量が不均一になる。製造の設定で被覆のコ ンシステンシーを実証することが困難で、従って検定の信頼性を与ることが困難 な場合、この結合量の変動性は特に問題である。免疫検定の関係するものの中で バッチが変わったときの再現性もまた問題になる可能性がある。さらにまた、バ ッチ反応器での混合は、反応器の大きさ、形および容量、ならびに混合装置の大 きさおよび形とそれが回転または作動する速度に左右される。従って、結合方法 の１つの改良は、混合のパラメータを変えることなく、規模を大きくした りまたは小さくしたりできる方法であろう。 従って、磁性の極微粒子などの極微粒子の上に有機物質を付着または被覆する ためのより速くしかも不変の方法が必要である。 当該分野において、極微粒子を効率よく、均一に被覆する被覆方法も必要であ る。 さらに、この技術分野で現在利用できる方法よりも速く極微粒子に物質を付着 できる技術も必要である。 そのうえに、さらに免疫検定法などの各種の生物工学的用途に、ならびに例え ば、放射能標識したもしくは毒素標識した抗体またはタンパク質を使う注入療法 に使えるように、１つまたは複数の生物的または化学的材料を他の生物的または 化学的材料に付着させるより迅速な方法が必要である。生物的および化学的材料 の互いの結合または付着には、物質を極微粒子に結合させるのと関連して付随す る問題もまた非常にたくさんある。 発明の概要 ある物質を１つまたは複数の極微粒子に付着または接合させる方法には、その 極微粒子の上に付着させられるある物質のある量を供給することが含まれている 。ある量の極微粒子も供給 される。その物質は、第１の導管を通して導入され、極微粒子は第２の導管を通 して給送される。第１と第２の導管は合流点で一緒になり、そこでその物質とそ の極微粒子は混合して、その物質がその極微粒子に付着して被覆する。本発明の 方法は、下記に記述されるさまざまな実施形態により、補助生体高分子への結合 の程度が測定される免疫検定法に使用するための、高分子および磁性の極微粒子 を調製するために設計されている。 １つまたは複数の他の物質の上に１つの物質を付着させるまたは接合させる方 法も本発明の一部として提供されており、そのような物質が免疫検定法または他 の用途に利用される。この方法では、ある量の第１の物質が第１の導管を通して 導入され、ある量の第２の物質が第２の導管を通して導入される。その第１の物 質と第２の物質は合流点で一緒になり、第１の物質が第２の物質に付着する。さ らにまた、結合した第１と第２の物質の複合体の上に追加の物質を付着させるた めにもっと多くの導管を利用することも可能である。 図面の簡単な説明 第１図は、第１の実施形態により本発明を実施するのに有用な器械の概略図で ある。 第２図は、いろいろな実施形態により本発明を実施するのに有用な器械の構成 部分の平面図の図解である。 第３図は、第２図に説明されている装置の側面図の図解である。 第４図は、第２の実施形態により本発明を実施するのに有用な器械の概略図で ある。 第５図は、第３の実施形態により本発明を実施するのに有用な器械の概略図で ある。 第６Ａ図、第６Ｂ図、第６Ｃ図および第６Ｄ図は、本発明の１つの実施形態に よる被覆方法の結果をもっと普通の方法と比較して、さらに例示しているグラフ である。 第７図は、本発明のもう１つの実施形態による被覆方法の結果をさらに例示し ているグラフである。 好ましい実施形態の詳細な説明 本発明は、ここに記述するいろいろな実施形態により、物質、特に有機物質を 、磁性の極微粒子および非磁性の極微小粒子の両方を含む極微粒子に付着または 接合させる方法を提供する。より詳細には、当該技術で現在知られているバッチ 式被覆方法に対立するものとしての、有機物質の極微粒子への連続式被覆 方法を提供する。その方法は、一般に、１つはその有機物質を含み、そして１つ はその極微粒子を含んでいる少なくとも２つの試剤の流れを、その試剤の流れが 混合する合流点に導くことから成っている。有機物質の極微粒子への付着は、合 流点で、および任意のその後の導管ならびに合流点の下流にある導管中に組み込 まれている混合装置で、その流れを混合することによって実行される。 さまざまの実施形態を通して同じ数字は同じ成分を表している図面を参照して 、本発明の方法の一例を先ず第１図を参照して説明する。装置１０は、第１の試 剤源１４に接続されている第１の導管１２と第２の試剤源１８に接続されている 第２の導管１６を含んでいる。第１の導管１２と第２の導管１６は、合流点２６ で一緒になり、第３の導管２０に流入する。第３の導管２０は、流出導管２４が 後に続いている混合装置２２を含んでいる。 この方法の一般的な例において、第１の試剤源１４は極微粒子に結合されるは ずの物質、例えば、抗体を含んでいる。その物質は、任意の適当な容器中の適当 な懸濁流体中に含まれているまたは懸濁していてよい。その懸濁流体は、一般的 には、試 剤を保存するのに利用される緩衝液などの当業者には既知の任意の種類の流体で あってよい。第２の試剤源１８は、やはり懸濁流体中に極微粒子を含んでいる。 その容器は、第１の試剤および第２の試剤、例えば、それぞれ有機物質および極 微粒子を保持するのに適した、例えば、びん、ビーカー、バケツなどのどんな種 類の器具であってもよい。 導管１２、１６、２０および２４は、当該技術者が容易に利用できる普通の管 であってよい。その管はどんな材料であってもよく、プラスチックポリマーが好 ましい。それは実質的に堅くまたは柔軟で、透明または不透明であってもよい。 その管の内径は、その中を試剤の流れが容易に動けるようなものでなければなら ない。本発明の方法に使用するのに好ましい管にはマスターフレックス（Master flex）シリコン管（イリノイ州ニルスのCole-Parmer Instrument Company製）と いうものがある。 合流点２６は第１と第２の試剤源が一点に集まる接合点であり、それによって ２つの試剤の流れを混合させる。その合流点は前述の混合および極微粒子上に有 機物質の被覆を容易にするように形作られなければならない。好ましいのは、普 通の「Ｔ字型」接合であり、より望ましいのは、Value Plastics，Inc.， Fort Collins，CO．から入手できる内径が３／１６インチのモデルＴＳＯ−６で ある。 再度第１図を、かつ第２図および第３図をも参照すると、そこには本発明の一 部として混合手段２２が任意選択で提供されている。この混合手段２２は一般的 には、第３の導管２０を経由して合流点２６の下流部に位置している。その混合 手段２２は、導管２０から下流に直列に、そして導管２４の土流に直列に取り付 けることができる。あるいは、混合手段２２は合流点２６の下流部に直接直列に 取り付けてもよい。さらにその混合手段はそれぞれの試剤の流れ中の有機物質と 極微粒子の混合を容易にし、それによって極微粒子土への有機物質の被覆を容易 にする。その混合手段２２は、本発明の方法に使用するために適合できる当該技 術で現在利用できるどんな手段であってもよい。望ましくは、その混合手段２２ は、Conprotec，Inc.，Salem，NHのカタログ番号FH-06-09-36として挙げられて いる、第２図および第３図に示されているような１つまたは複数の直列形の混合 機などの混合装置である。該装置を運転すると、２つの試剤が一点に集まり、合 流点２６で少なくとも部分的に混合し、そして第３の導管２０に流れ込む。それ から、その２つ の試剤は混合装置２２によって完全に混合される。２つの試剤が混合されると、 その有機物質はその極微粒子に付着または接合するようになる。理論的には、そ の方法の一部として含まれ得る混合手段すなわち混合装置２２の数は特に限定さ れない。混合装置の最適の数は、有機物質と極微粒子の間の結合親和力によって 変わるので、実験的に決めてよい。実際問題として、この分野に恒常的に従事し ている人は多分、約２５未満の混合手段、そしてより望ましくは３から１５の混 合手段で十分であるということを知るだろう。 第４図を参照して本発明の方法の特に好ましい実施形態を説明する。この実施 形態では、さらに、合流点へ向かう試剤の流れの動きを促進するための手段が提 供されている。好ましくは、これらの手段はポンプ輸送手段であり、より好まし くは関連のある導管に放出するポンプである。そのポンプ輸送手段、そして好ま しくはそのポンプは第４図及び本明細書の他の所に説明されているシステムに当 該技術でよく知られた方法によってつながれている。蠕動性ポンプを使用すると 、特定の被覆操作の終了後、導管の交換が容易になる。第１のポンプ２０２は、 抗体などの有機物質を好ましくは懸濁流体に含んでいる第１の試 剤を、容器すなわち貯槽２０４から第１の導管２０６へ流す。第２のポンプ２０ ８は、極微粒子を好ましくは懸濁流体に含んでいる第２の試剤を、容器すなわち 貯槽２１０から第２の導管２１２へ流す。第１および第２の導管２０６および２ １２は合流点２１４に集まり、１つまたは複数の直列形の混合機要素２１６中に 流入する。その２つの試剤は混合機２１６を通って流れるにつれて、１つまたは 複数の化学的または物理的反応が起こり、抗体を極微粒子に結合させる。これら の化学的および／または物理的反応は当該技術で説明されており、例えば、共有 結合を含んでいる可能性がある。 第４図に示した実施形態では、第３のポンプ輸送手段、好ましくは、例えば、 ＥＤＡＣ（ミズーリ州セントルイスのSigma Chemicalの１−エチル−３（−３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を含んでいる第３の試剤を貯槽２２ ２から導管２２４へ流す第３のポンプ２２０も任意で提供されている。第３の導 管からの試剤の第３の流れは、第２の合流点２１８で第１および第２の試剤の混 合物と混合して、導管２２６中にそしてそれを通って流れる。第１、第２および 第３の試剤の混合物が導管２２６を通って、さらに下流へ流れるにつれて、 ＥＤＡＣは極微粒子に結合した抗体ならびに過剰のＥＤＡＣと架橋結合する。 第４図に示すように、第４のポンプ輸送手段、すなわちポンプ２３０がある。 ポンプ２３０は第４の試剤、例えば、緩衝溶液を貯槽２３４から導管２２８へ流 れさせるように形作られている。この方法では、第４のポンプ２３０は通常、そ の運転の終わりに（例えば、試剤のうちの１つの貯蔵量が使い尽くされてしまっ た時）、装置２００を洗い流す働きをする。第１、第２および第３の試剤の混合 物は、別の一組の１つまたは複数の直列形混合機２３８へ流れ込み、次いで放出 導管２４０に流れる。その結果生じた放出導管２４０から出てくる物質は、抗体 で被覆され、しかもＥＤＡＣで架橋結合された極微粒子の懸濁物である。 第４図の典型的な方法では、ポンプ２０２、２０８、２２０および２３０とし ては、Watson-Marlow 504u/RL蠕動ポンプなどの蠕動ポンプが最も好ましい。導 管は内径が約１．６ｍｍ（導管２０６、２１２、２２４および２２８）または４ ．８ｍｍ（導管２２６および２４０）の円筒形のシリコン管である。混合機２１ ６および２３８は、カタログ番号FH-06-09-36のConprotec直 列形混合機である。 この方法では、このシステムを通して最適な流れを維持するように、ポンプ２ ０２、２０８、２２０および２３０を運転する。例えば、全てのポンプを、短時 間（約６０秒）で泡を取り除くのに、または導管から空気の泡を除き、入口およ び出口の導管に試剤を入れるのに十分な高速度で同時に運転してもよい。定常運 転中は、各ポンプを、試剤（特に第１の試剤）を保持するために時間設定したポ ンプ操作で、その関連試剤を望ましい速度で供給するために安定した速度で運転 する。例えば、第１の物質を含んでいる第１の試剤の供給が他のどの試剤、例え ば、極微粒子に先立って使い尽くされるだろうという前提で、次の操作手順を使 うことができる。 １）空気の泡を洗い流し、関連した入口および出口の導管に試剤を入れるために 必要な時間全てのポンプを高速で運転する。 ２）試剤１および２の混合物の前端が第２の合流点２１８に達するまで、ポンプ １および２をその通常の流速（約１０ｍｌ／分）で運転する。 ３）試剤１がなくなるまで、ポンプ１、２および３を通常の流速（約１０ｍｌ／ 分）で運転する。試剤１、２および３の反応 混合物を放出導管２４０で集める。 ４）試剤１がなくなったら、緩衝溶液に置き換える。試剤１、２および３の混合 物の後端を表すために泡を導入してもよい。 ５）試剤１、２および３の混合物の後端が第２の合流点２１８に達するまで、ポ ンプ１、２および３を通常の流速で運転する。 ６）試剤１、２および３の混合物の後端が放出導管２４０に出るまで、ポンプ４ を通常の流速の約３倍（すなわち３０ｍｌ／分）で運転する。 運転が終ったら、システムを同じ方法で繰り返し運転することが出きる。ある いは、特に、もし他の異なる試剤が望ましければ、導管および直列形混合機の組 立品を前部取り外し捨てて、新しい管および混合機と交換してもよい。 当業者ならすぐ分かるだろうが、極微粒子上に生物的および化学的材料を付着 、結合または被覆させるための本発明の方法には、潜在的に何の制限もない。従 って、ここに説明されている本発明のいろいろな実施形態による方法を、第１図 〜第４図に示されている構成部分について技術者に利用可能な無数の組立によっ て、さらに変更することもできる。例えば、例示されているように、その方法は ３つ以上の試剤の流れを混合させる こともできる。それはまた、２つ以上の混合手段の利用を含むことも可能である 。 どんなに多数の種類の極微粒子（例えば、Polymer Labs，Nippon Paint，Sphe rotech，SeradynまたはBangs Laboratoriesによって製造された）であっても、 それを被覆するために、いくつかの実施形態による方法を使うことも可能である 。これらの粒子は、ポリマー、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、セルロース 、または他の固体材料ならびにそれらの任意の組合せとし得る。磁気反応性粒子 は、磁鉄鉱または他の磁気反応性材料を、粒子内に中心部としてまたは粒子内に 分散して、或いは粒子の非磁性部分全体にわたってまたはそのうえに複合物とし て層をなして含み得る。 当該微粒子に結合させる物質、好ましくは有機物質、およびより望ましくは生 物的材料、のリストに本質的に制限はない。これらの物質には、例えば、抗体、 抗原、ハプテン、架橋剤、タンパク質、一本鎖および二本鎖核酸および酵素なら びにそれらの成分、フラグメント又は誘導体、任意の免疫試験または免疫アッセ イに利用できる或いは今後開発または誘導される他の有機分子および有機物質が 含まれる。これらの物質は、分析し ようとする各種流体のサンプル中の各種の被検体を捕捉および／または検出なら びに測定するために利用される。個々の物質の多くは、サイズが微小または極微 小であり得る。極微粒子に付着される物質は標識付けをしなくてもよいし、視覚 的または器械的手段により信号を出すことができる化学的または生物学的物質で 標識付けをしてもよい。蛍光偏極免疫検定法ならびに放射性免疫検定法に使用さ れるトレーサも、本発明のいろいろな実施形態によって使用し得る。したがって 、これまでのトレーサおよび標識には、全ての既知の物質または当業者によって 今後開発される物質が含まれている。免疫検定法で分析される流体には、血液、 血清、血漿、尿、唾液、汗などの生物的流体ならびに水、特に廃水などの他の流 体も含まれる。 当業者なら、本発明の方法を使って、非常に高程度の被覆のコンシステンシー を得ることができるということが分かるはずである。被覆のコンシステンシーを 直接測定するのは少し難しいけれど、含まれている極微粒子の小さなサイズと数 を考慮して、被覆された極微粒子の各種の免疫検定法への使用によって評価でき る。被覆効率も、従来のバッチ被覆方法を使用して同じ物質で被覆された同数の または似た数の極微粒子を比較する ことによって評価することができる。今まで記述された実施形態による本発明の 方法では、極微粒子上に物質の一定の化学量論的付着という結果になるのが好ま しい。言い換えれば、物質と極微粒子の測定比を得ることは本発明の一部である 。例えば、当業者なら各極微粒子上に被覆されたＸ数の物質の比を達成するだろ う。次にこの比は、被覆された極微粒子のバッチ全体については実質的に一定で あろう。 いくつかの記述された実施形態による方法が、既知のバッチ被覆方法と比較し て、極微粒子の被覆がより速くなるということも、本発明の一部である。当業者 なら、本発明の方法では、同じような量または体積の極微粒子を被覆するのに必 要な時間を少なくとも三分の一短縮するという結果になるということ、そして好 ましくは少なくとも５０％までの時間短縮が期待できることがわかるだろう。従 来のバッチ被覆方法と比較して、一組の量の極微粒子を被覆するのに必要な時間 の７５％の短縮が本発明の方法で達成されることが特に望ましい。ここで記述さ れている代表的な直列形の被覆、付着または結合操作の時間は、約３０分から２ ４時間であり、被覆される極微粒子の数に左右される。 ここで記述されている実施形態による本発明のもう１つの長所は、従来のバッ チ被覆方法と違って、ここでの方法は連続操作として調節され、混合設備の大き さ、形または他のパラメータによって制限されないということである。バッチ被 覆では、例えば、被覆できる極微粒子の数は、被覆用「バット」に見合う数によ って決まる。本発明の方法では、試剤と極微粒子の安定した供給が必要な全てで あり、その方法そのものは無限に続くことができる。 いったん有機物質が極微粒子に付着してしまうと、次にその被覆された極微粒 子は、当業者にすでに知られ利用されている任意の数および方法の免疫検定用途 ならびに他の用途で利用できる。 さらに、その有機物質がその極微粒子に付着または結合した後に、その方法の 一部として利用できるかもしれないある追加の試剤が本発明の一部として提供さ れている。その結合した有機物質にある任意のカルボキシル基をも活性化して、 その物質内および物質間に架橋結合を効果的に生成させるのにＥＤＡＣを使用す ることができる。次にこれは被覆された極微粒子の長期にわたる安定性を増加さ せる。そして、反応性のあるエプシ ロン−アミノ基があるという理由で選ばれた、ＤＬ−リシンまたはオルニチンな どのアミン求核試薬、或いは当該技術分野で既知の他の試薬を、残っているＥＤ ＡＣ活性化カルボキシル基と反応させて不活性化するために添加することができ る。これに続いて、タンパク質または他の生物的物質のその極微粒子表面への非 特異的な吸着を防ぐために、牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼイ ンまたは当業者には既知の他の非反応性物質などの別の物質をさらに添加して、 極微粒子の被覆されないで残っている所を被覆することができる。 本発明の一部として、今まで説明した方法を、第２の物質上に第１の物質を付 着させるために利用することもできる。一般的には、その結果生じる付着した物 質は免疫検定法に利用される。しかし、核酸分析、細胞分析、および治療上の注 射可能薬物の用途もまた制限なく含まれる。互いに結合される物質、好ましくは 有機物質、より望ましくは化学および生物的材料、のリストには本質的に制限が ない。これらの物質には、例えば、抗体、抗原、ハプテン、架橋剤、タンパク質 、一本鎖および二本鎖核酸、毒素および酵素ならびにそれらの成分、フラグメン ト又は誘導体、ならびに現在利用できる或いは今後開発または 誘導される他の有機分子および有機物質が含まれる。個々の物質の多くは、サイ ズが微小または極微小であり得る。互いに付着される物質は標識付けをしなくて もよいし、視覚または器械的手段により信号を出すことができる化学的または生 物的物質で標識付けをしてもよい。結合した第１物質と第２物質の複合体への標 識の取り付けは、本発明の方法を使って行うことができる。蛍光偏極免疫検定法 ならびに放射性免疫検定法に使用されるトレーサを、本発明の１つまたは複数の いろいろな実施形態によって付着することもできる。したがって、これまでのト レーサおよび標識には、全ての既知の物質または当業者によって今後開発される 物質が含まれている。例えば、本発明の方法の他の適応には、酵素の接合、２つ 以上のタンパク質の結合、免疫原の調製、薬剤の生物的物質への結合、タンパク 質のフルオレセイン化、タンパク質のビオチニル化、タンパク質の結合、核酸の タンパク質への結合、タンパク質の細胞への結合、固着剤の細胞への付着、赤血 球の増感等が含まれる。標識したタンパク質を結像などの生体内診断法に使用す るのに適応させることもできる。 ある物質を１つまたは複数の他の物質に付着させる方法には、 上記で概略を述べた極微粒子用の詳細な方法のいずれか１つにおいて、当該極微 粒子を上述の物質種の１つで置き換えることが含まれていることは、当業者なら わかるであろう。こうして、１つの実施形態では、ある量の第１の物質が第１の 導管を通して導入され、そしてある量の第２の物質が第２の導管を通して導入さ れる。その第１および第２の物質が、その第１の物質がその第２の物質に付着す るように合流点に集まる。さらにまた、結合した第１と第２の物質の複合体の上 に追加の物質を付着させるために、極微粒子のために上述したいろいろな実施形 態に従ってもっと多くの導管を利用することもできる。以下の実施例も参照し得 る。本発明の方法で利用される物質の量の割合は、一般的に、従来のバッチ混合 で利用されている割合に近似し得るか、または当業者が容易に確認し得る。さら に、極微粒子の被覆に関連したおよび述べた長所は、１つの物質種をここに述べ た別の種類の物質に接合または付着させるのに完全に適用できる、ということも 本発明の一部である。 実施例 以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を説明するのに役立つ。これら はただ例示として提供されるものであり、本 発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。 実施例１−磁性粒子の抗体被覆 常磁性極微粒子（Polymer LabsのモデルSP1147）を、前立腺特異的抗原（ＰＳ Ａ）に対するマウスモノクローナル抗体で被覆するために、第４図に示したもの と類似の装置を使用した。その極微粒子を、５０ｍＭの４−モルホリンエタンス ルホン酸溶液（ＭＥＳ）にｐＨ６．２で固形物が１％になるまで希釈し、Microg en中空糸カートリッジを使用してディアフィルトレーションシステム中で、ＰＢ Ｓ／Tweenの混合物によりｐＨ７．４で洗浄、そして５０ｍＭのＭＥＳ５０ｍｌ に懸濁させた。ＰＳＡ抗体をリン酸緩衝の塩類溶液（ＰＢＳ）５０ｍｌに７．４ ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、６Ｎの塩酸を添加してｐＨを２．１にした。５０ｍ ＭのＭＥＳの溶液５０ｍｌ中に、ＥＤＡＣを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した 。 容器２０４に試剤１としての抗体溶液、容器２１０に試剤２としての極微粒子 懸濁液、そして容器２２２に試剤３としてのＥＤＡＣ溶液と一緒に、第４図のも のと類似の装置２００を組み立てた。そのシステムを次の方法で運転した。 １）空気の泡を洗い流し、関連した入口および出口の導管に試 剤を入れるために必要な時間全てのポンプを高速で運転した。 ２）試剤１および２の混合物の前端が第２の合流点２１８に達するまで、ポンプ １および２をその通常の流速（約１０ｍｌ／分）で運転した。 ３）試剤１がなくなるまで、ポンプ１、２および３を通常の流速（約１０ｍｌ／ 分）で運転した。試剤１、２および３の反応混合物を放出導管２４０で集めた。 ４）試剤１がなくなった時、ＭＥＳの緩衝溶液５０ｍｌで置き換えた。試剤１、 ２および３の混合物の後端を表すために泡を導入した。 ５）試剤１、２および３の混合物の後端が第３の合流点２３６に達するまで、ポ ンプ１、２および３を通常の流速で運転した。 ６）試剤１、２および３の混合物の後端が放出導管２４０に出るまで、ポンプ４ を通常の流速の約３倍（すなわち３０ｍｌ／分）で運転した。 この手順で被覆された極微粒子を、フルオレセイン結合抗マウス抗ＩｇＧ抗体 と混合し、Becton Dickenson製のＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメータ中の平均粒 子の蛍光を測定することによって、その極微粒子が抗体で被覆されていることを 確認した。従 来通り調製された２つのサンプル（第６Ｃ図および第６Ｄ図に示すバッチ調製に よる）と本発明の実施形態を使用して調製された２つのサンプルとのヒストグラ ムの比較を第６Ａ図および第６Ｂ図に示す。本発明の実施形態を使って調製され たサンプルは、蛍光が少し低い（ほとんど有意ではない、特に対数目盛からみて ）が、蛍光の読みの変動係数が低いことによって示されているように蛍光がより 均一である（約４９％対従来法サンプルの約５３％）。 実施例２−磁性粒子の抗体被覆 磁性粒子を、ヒトのホルモントリヨードチロニン（Ｔ３）に対する抗体で被覆 するために本発明方法の実施形態をさらに使用した。第５図に示したものと類似 の装置３００を組み立てた。第１のポンプ３０１および第２のポンプ３０３が第 １および第２の試剤を第１の合流点３０５に供給した。その後には、５つの直列 形混合機の構成要素３０７で構成されている直列形混合機が続いており、総混合 距離は約１３２．５ｃｍになる。第３のポンプ３０９および第４のポンプ３１１ は第３および第４の試剤を、第２および第３の合流点３１３および３１５にそれ ぞれ供給した。第２および第３の合流点はきわめて接近しており、 約３ｃｍ離れていた。それから、その混合物は、１５の直列形混合機の構成要素 で構成されている別の直列形混合機３１７（約３９７．５ｃｍ）を通って、第４ の合流点３１９に流れた。第４の合流点３１９で、第５のポンプ３２１が第５の 試剤を放出した。その後には、８つの混合機セグメントを備えたもう１つの直列 形混合機３２３（約２１２ｃｍ）があった。第６のポンプ３２５が第６の試剤を 第５の合流点３２７に放出した。その後には、６つのセグメントの混合機３２９ （約１５９ｃｍ）と放出管３３１があった。ポンプと合流点の間の導管はすべて 内径が１．６ｍｍのシリコン管から成っていた。直列形混合機は、Conprotec直 列形混合機の２６．５ｃｍのセグメントを組み合わせたものであった。合流点は 全てValue Plastics，Inc．製のポリプロピレンの「Ｔ」型接合点であった。ポ ンプは全てWatson-Marlowの蠕動性ポンプであった。 第１の試剤は、ＰＢＳまたはＭＥＳのいずれかに懸濁した濃度が約２．０ｍｇ ／ｍｌでｐＨが約２．１のヒトＴ３に対するヒツジのモノクローナル抗体から成 っていた。第２の試剤は、緩衝液に約０．１％の固形分濃度で懸濁したPolymer Labsの常磁性粒子（SP1178）から成っていた。第３の試剤はＭＥＳ緩 衝液であり、第４の試剤はＭＥＳ緩衝液にＥＤＡＣが約０．１ｍｇ／ｍｌの溶液 であった。第５の試剤は、ＤＬ−リジン−ＨＣｌから成り、ｐＨは６．０で、Ｅ ＤＡＣ濃度に対して約４モル過剰の濃度であった。第６の試剤は、ＰＢＳ中１％ のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。 第５図に示されている装置を次の方法で運転した。 １）全てのポンプを、空気の泡を除き、関連した導管に試剤を入れるために高速 で運転した。 ２）第１および第２のポンプ３０１および３０３を約１０ｍｌ／分で運転して、 抗体と極微粒子を混合させた。 ３）粒子と抗体の混合物の先端が第３の合流点３１５に達した時、第４のポンプ ３１１を約１０ｍｌ／分で運転した。第１および第２のポンプ３０１および３０ ３を約１０ｍｌ／分で運転し続けた。 ４）粒子、抗体およびＥＤＡＣの混合物の先端が第４および第５の合流点３１９ および３２７に達すると、関連したポンプ（それぞれ第５ポンプ３２１および第 ６ポンプ３２５）を約１０ｍｌ／分で運転した。この段階では、第３のポンプ３ ０９を除く全てのポンプを運転して、放出導管３３１から被覆した極微 粒子を集めた。 ５）抗体の供給が終わると、第１試剤の代わりに緩衝溶液を用いた。試剤１およ び２（抗体および極微粒子）の混合物の後端を表すために泡を導入した。 ６）粒子と抗体の混合物の後端が第２の合流点３１３に達した時、第１、第２お よび第４のポンプ３０１、３０３および３１１の電気を切り、第３のポンプ３０ ９を約３０ｍｌ／分で運転した。第５および第６のポンプ３２１および３２５の 運転を続け、被覆された極微粒子を放出導管３３１から集め続けた。 ７）粒子、抗体、ＥＤＡＣ、ＤＬ−リジンおよびＢＳＡの混合物の後端が放出導 管３３１から放出されると、ポンプを全て停止した。 極微粒子の被覆における本方法の有用性を、蛍光で標識したヤギ抗ヒツジＩｇ Ｇで着色して、ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメータで蛍光を測定することによっ て実証した。この方法によって被覆された極微粒子の２つの調製物は、４８０と ４１８の平均蛍光強度レベル（任意の蛍光単位）を生じた。それは、それぞれＰ ＢＳおよびＭＥＳに懸濁した抗体調製物に対する結合したＩｇＧの量を示してい る。同じ粒子および抗体についての 従来のバッチ被覆法は、２５６の平均蛍光強度レベルを生じた。上記の結果は、 本発明の方法が有意に効率がよいことを示している。 これらの粒子調製物の化学発光ベースの免疫検定法への利用もまた被覆効率が 高いことを示している。ここに記述された方法で被覆された粒子は、従来法で被 覆された粒子の１６２４８４相対光単位（ＲＬＵ）に対して、３２５９７０およ び３１９３８４ＲＬＵという平均光レベルを生じた。 実施例３−被覆均一性の実証 極微粒子の被覆の均一性を最大にする本発明の方法の有用性を、常磁性極微粒 子をヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対するマウスモノクローナル抗体で被 覆することによって実証した。第５図に示したものと類似の装置を、実施例２に 記載の方法と類似の方法で組み立てた。 第１試剤は、濃度が約２．０ｍｇ／ｍｌでｐＨが約２．１のヒトＴＳＨに対す るモノクローナル抗体から成っていた。第２試剤は、緩衝液に固形分約０．１％ の濃度で懸濁しているPolymer Labsの常磁性粒子（SP1147）から成っていた。第 ３の試剤はＭＥＳ緩衝液であり、第４の試剤は約１２ｍｇ／ｍｌ のＥＤＡＣ溶液であった。第５の試剤は、ＤＬ−リジン−ＨＣｌから成っており 、ｐＨは６．０で、濃度はＥＤＡＣ濃度に対して４モル過剰の濃度であった。第 ６の試剤は、ＰＢＳ中に１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。 第５図に示されている装置を、実施例２に記述した方法と類似の方法で運転し た。 蛍光で標識したヤギ抗マウスＩｇＧで着色して、フローサイトメータで蛍光を 測定することによって、上記手順で被覆した粒子の抗体活性を試験した。第７図 に示したその結果は、従来のバッチ装置で被覆した粒子と比較して、これらの粒 子の蛍光活性を示している。本発明の方法により処理した粒子は５％高い蛍光レ ベル、８３０対７８８任意単位を示しており、すなわちより大きい被覆レベルを 表している。より重要なことには、本発明の方法では蛍光の変動が２４％小さか ったことである。変動係数は本発明方法の３．３７％対従来方法の４．４４％で 、標準偏差は２８対３５であり、より均一な被覆であることを表している。最後 に、本発明の方法は５０ｍｌの極微粒子懸濁液の被覆を、同量の極微粒子を被覆 する従来法の約６０分とは対照的に、約１２分で達成した。 実施例４−第１物質の第２物質への接合 本発明の方法が当該技術にもたらすその改良をさらに実証するために、ここで 記述した直列形混合法を使って酵素免疫検定の接合体を調製し、それを従来のバ ッチ製造手段によって調製第４図で述べたものと類似の装置を組み立てて運転したが、第３および第４のポ ンプ輸送手段と第２の直列形混合要素は除いた。ｐＨ７．０のＰＢＳ中１０ｍｇ ／ｍｌの抗体（ヒト抗ＨＡＶＩｇＧ）と６ｍＭのＥＤＴＡを、最終濃度０．０２ Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）と一緒に室温で３０分間定温放置することに よって先ずチオール化した。次いで、Sephadex G-25ゲルろ過（スウェーデン、 ウプサラのPharmacia社製）で精製した。その抗体に接合されるはずの酵素、ア ルカリホスファターゼを、チオールと反応可能なマレイミド基とアミンに反応す るＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルを含んでいる３０炭素原子のヘテロ二 官能性リンカーを添加することによって修飾した。ｐＨ７．０のＰＢＳ中７ｍｇ ／ｍｌのアルカリホスファターゼ溶液、１ｍＭの塩化亜鉛および５ｍＭの塩化マ グネシウムを、室温で１５分間、ジメチルホルムアミド中のヘテロ二官能 性リンカーと一緒に定温放置した。次いで、修飾された酵素を直ちに同じ緩衝液 中でSephadex G-25ゲルろ過により精製し、４時間以内にチオール化した抗体に 接合させた。 第１の試剤は、ｐＨ７．０のＰＢＳ中０．９ｍｇ／ｍｌのチオール化した抗体 の溶液３ｍｌと６ｍＭのＥＤＴＡから成っていた。第２の試剤は、ｐＨ７．０の ＰＢＳ中１．２ｍｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼに付着した３ｍｌのヘテロ 二官能性リンカー、１ｍＭの塩化亜鉛および５ｍＭの塩化マグネシウムから成っ ていた。その装置を、前記実施例の場合のように流速４０ｍｌ／分で運転した。 総反応時間は５秒であった。 次いで、上記のように調製した酵素−抗体の接合体をAbbott 製した参考接合体と比較した。上記の方法で調製された接合体は、ネガティブコ ントロールシグナル：４９２．４カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）対参照接合体 の４９３．２ｃ／ｓ／ｓ、インデックスコントロールシグナル：４９４．４ｃ／ ｓ／ｓ対参照接合体の５０８．４ｃ／ｓ／ｓ、およびポジティブコントロールシ グナル：４３．２ｃ／ｓ／ｓ対参照接合体の３３．９ｃ／ｓ／ｓによって示され るように、その検定で参照接合体に 匹敵する性能を与えた。 上記のように調製された酵素−抗体の接合体を、BaioRad SEC 400カラムを使 用してＨＰＬＣによって分析して、結果として生成した接合体の分子サイズの分 布を測定した。本発明方法で調製した接合体は、従来の方法で調製した接合体に 匹敵する分子量と分子分布を有し、同等量の未反応（遊離）タンパク質を含有し ていた。 これらのデータは、酵素−抗体の接合体を本明細書中で記述した方法で調製し て、その結果免疫検定法で使用し得る試剤を得ることができることを実証してい るとともに、当該方法により、従来の接合体調製の３０分から５秒へと反応時間 を３６０分の１に短縮し、及び１つのタンパク質溶液を別のタンパク質溶液と反 応させることに伴う規模拡大問題を減じている。 本発明を、そのいろいろな実施形態のそれぞれで説明してきたが、本明細書お よび添付の請求範囲に述べられている本発明の真の精神と範囲から逸脱すること なく、これに対してある種の修正を当業者なら行い得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エブル，キム・エス アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、メインセイル・ドライブ・ 151 (72)発明者 マネイ，ピーター・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、ジヤドソン・ストリー ト・730 (72)発明者 ステツケル，エリツク・ダブリユー アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、ウエスト・メドウ・サーク ル・12541 (72)発明者 ラビン，ブライアン・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、タマラツク・レイン・1082 (72)発明者 ウイツトマン，クレイグ・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・61037、グレ ン・エリン、スプリング・アベニユー・ 384 (72)発明者 ジヨンソン，ポール・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノー スブルツク、メープルウツド・ロード・ 1920

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１つまたは複数の極微粒子に少なくとも１つの物質を付着させる方法であっ て、 ａ）付着させるべき物質の第１の量および極微粒子の第２の量を供給する段階と 、 ｂ）前記第１の量と前記第２の量が互いに接触して前記物質が前記極微粒子に付 着するように、前記第１の量を第１の導管を通しておよび前記第２の量を第２の 導管を通して導入する段階、とを含む方法。 ２．さらに、前記の量の少なくとも１つを前記導管を通して移動させるためのポ ンプ輸送手段を備えている請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記ポンプ輸送手段が動力付きのポンプである請求の範囲第２項に記載の方 法。 ４．前記動力付きのポンプが蠕動ポンプである請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．さらに、前記量の物質と極微粒子とを互いに混合させるための少なくとも１ つの混合手段を備えている請求の範囲第１項 に記載の方法。 ６．前記混合手段が直列形混合機である請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．前記混合手段が少なくとも２つの直列形混合機である請求の範囲第５項に記 載の方法。 ８．前記第１および第２の導管が１つの合流点に集まる請求の範囲第１項に記載 の方法。 ９．前記合流点がＴ字型の接合点である請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．さらに、前記極微粒子または前記第１の物質の１つに付着させるために、 第３の物質を第３の導管を通して供給する段階を含む請求の範囲第１項に記載の 方法。 １１．さらに、前記極微粒子、前記第１の物質または前記第３の物質の１つに付 着させるために、第４の物質を第４の導管を通して供給する手段を備えている請 求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．前記物質が、生物的材料および化学的材料から成る群から選ばれる請求の 範囲第１項に記載の方法。 １３．１つまたは複数の物質に少なくとも１つの物質を付着さ せる方法であって、 ａ）第１および第２の物質を供給する段階と、 ｂ）前記第１および第２の物質が互いに接触して前記第１の物質が前記第２の物 質に付着するように、前記第１の物質を第１の導管を通しておよび前記第２の物 質を第２の導管を通して導入する段階 とを含み、前記第１および第２の物質が生物的材料および化学的材料から成る群 から選ばれる上記方法。 １４．前記生物的材料および化学的材料がさらに、免疫検定法、核酸アッセイ法 、細胞アッセイ法および治療用注射可能薬物に利用される材料を含有する請求の 範囲第１３項に記載の方法。