JP2001286299A - 毛髪の成長抑制の鑑別法 - Google Patents
毛髪の成長抑制の鑑別法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 脱毛症、取り分け男性型脱毛症のメカニズム
を明らかにし、この様な脱毛症に有用な育毛料のスクリ
ーニング方法を提供する。 【解決手段】 ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）を
コードしたｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する
標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片からなる毛関係細
胞の鑑別剤を用いて、毛周期の休止期から移行期へのａ
ＦＧＦをコードしたｍＲＮＡの挙動を指標とし鑑別す
る。
を明らかにし、この様な脱毛症に有用な育毛料のスクリ
ーニング方法を提供する。 【解決手段】 ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）を
コードしたｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する
標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片からなる毛関係細
胞の鑑別剤を用いて、毛周期の休止期から移行期へのａ
ＦＧＦをコードしたｍＲＮＡの挙動を指標とし鑑別す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、脱毛症の鑑別に好
適な毛髪の成長抑制機構の鑑別法に関し、更に詳細に
は、休止期から成長期への移行時期におけるａＦＧＦ
（酸性線維芽細胞増殖因子）の発現を指標とする成長抑
制機構の鑑別法に関する。
適な毛髪の成長抑制機構の鑑別法に関し、更に詳細に
は、休止期から成長期への移行時期におけるａＦＧＦ
（酸性線維芽細胞増殖因子）の発現を指標とする成長抑
制機構の鑑別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】脱毛症や薄毛等の毛髪の異常障害におい
て、そのメカニズムには、男性ホルモンが関与する、所
謂、男性型脱毛症が存在することが知られている。この
様な男性型脱毛症に於いては、男性ホルモンにより毛髪
の増殖因子が阻害されることがそのメカニズムであろう
と言うことは推測されているが、増殖因子の種類とその
増殖因子が毛成長のどのステージで阻害されるかについ
ては知られておらず、従って、この様なメカニズムを明
らかにした育毛料は開発されていない。又、この様な増
殖因子を利用した男性型脱毛症か否かの鑑別法も開発さ
れておらず、適切な処置がされていない場合も少なくは
無いと言われている。即ち、男性型脱毛症において、男
性ホルモンが毛成長に影響を与えるメカニズムの解明が
望まれていたにもかかわらず明らかにされていないのが
現状であった。この理由としては、毛成長に多くの増殖
因子が関わっていることもその原因の一つに挙げられ
る。
て、そのメカニズムには、男性ホルモンが関与する、所
謂、男性型脱毛症が存在することが知られている。この
様な男性型脱毛症に於いては、男性ホルモンにより毛髪
の増殖因子が阻害されることがそのメカニズムであろう
と言うことは推測されているが、増殖因子の種類とその
増殖因子が毛成長のどのステージで阻害されるかについ
ては知られておらず、従って、この様なメカニズムを明
らかにした育毛料は開発されていない。又、この様な増
殖因子を利用した男性型脱毛症か否かの鑑別法も開発さ
れておらず、適切な処置がされていない場合も少なくは
無いと言われている。即ち、男性型脱毛症において、男
性ホルモンが毛成長に影響を与えるメカニズムの解明が
望まれていたにもかかわらず明らかにされていないのが
現状であった。この理由としては、毛成長に多くの増殖
因子が関わっていることもその原因の一つに挙げられ
る。
【０００３】一方、ａＦＧＦの毛成長の休止期から成長
期の移行時期に発現を指標に脱毛症などの毛髪異常の鑑
別を行うことも、このａＦＧＦの発現の程度を指標に育
毛剤のスクリーニングを行うことは全く為されていなか
った。
期の移行時期に発現を指標に脱毛症などの毛髪異常の鑑
別を行うことも、このａＦＧＦの発現の程度を指標に育
毛剤のスクリーニングを行うことは全く為されていなか
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、この様な状
況下為されたものであり、脱毛症、取り分け男性型脱毛
症のメカニズムを明らかにし、この様な脱毛症に有用な
育毛料のスクリーニング方法を提供することを課題とす
る。
況下為されたものであり、脱毛症、取り分け男性型脱毛
症のメカニズムを明らかにし、この様な脱毛症に有用な
育毛料のスクリーニング方法を提供することを課題とす
る。
【０００５】
【課題の解決手段】本発明者らは、この様な状況に鑑み
て、脱毛症、取り分け男性型脱毛症のメカニズムを明ら
かにすべく鋭意研究努力を重ねた結果、この様な男性型
の脱毛症に於いてはａＦＧＦの発現抑制が大きく関与し
ていることを見いだし、解決の糸口を見いだした。更
に、研究を重ねた結果、男性ホルモンを投与してａＦＧ
Ｆ発現を抑制した動物脱毛モデルにおいて、検体投与に
よるａＦＧＦ発現への影響を見ることにより、有効な育
毛剤が開発しうることを見いだし、発明を完成させるに
至った。即ち、本発明は、以下に示す技術に関するもの
である。 （１）ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）をコードし
たｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する標識ＲＮ
Ａ及び／又は標識ＲＮＡ断片からなる毛関係細胞の鑑別
剤。 （２）ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）をコードし
たｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する標識ＲＮ
Ａ及び／又は標識ＲＮＡ断片が、 １）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞又は細菌にトランスフェ
クトし培養した後、前記動物細胞又は細菌より前記プラ
スミドを取り出し、 ６）前記プラスミドのＤＮＡを制限酵素で直線化し、 ７）ラベル化塩基とともにＲＮＡポリメラーゼの存在下
インキュベートし、ラベル化ｃＲＮＡを作成して取り出
したものであることを特徴とする、（１）に記載の毛関
係細胞の鑑別剤。 （３）配列式１又は２に表される塩基配列を有する、
（１）又は（２）に記載の毛関連細胞の鑑別剤作成用の
プライマー （４）１）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートしたこ
とを特徴とする、（１）又は（２）に記載の毛関連細胞
の鑑別剤作成用のプラスミド。 （５）１）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞又は細胞にトランスフェ
クトして得られることを特徴とする、（１）又は（２）
に記載の毛関連細胞の鑑別剤作成用の培養細胞又は細
菌。 （６）休止期から成長期への移行時期に於ける、ａＦＧ
Ｆ（酸性線維芽細胞増殖因子）の発現を指標とする、毛
髪の成長度合いの鑑別法。 （７）毛髪の成長抑制が男性型の脱毛症に起因するもの
であることを特徴とする、（６）に記載の毛髪の成長抑
制機構の鑑別法。 （８）請求項１又は２に記載の毛関連細胞の鑑別剤を使
用することを特徴とする、（６）又は（７）に記載の毛
髪の成長抑制機構の鑑別法。 （９）毛髪の休止期から成長期への移行時期に於いて、
ａＦＧＦの発現の程度を指標とする、男性型の脱毛症の
鑑別法。 （１０）ａＦＧＦの発現の程度が（１）又は（２）に記
載の毛関連細胞の鑑別剤により為されることを特徴とす
る、（９）に記載の男性型の脱毛症の鑑別法。 （１１）休止期の動物の毛髪に男性ホルモンを投与し、
ａＦＧＦの発現を抑制した動物モデルにおいて、検体を
投与し、ａＦＧＦの発現への影響を指標とすることを特
徴とする、育毛剤の鑑別法。 （１２）育毛剤が、男性型脱毛症用であることを特徴と
する、（１１）に記載の育毛剤の鑑別法。 （１３）ａＦＧＦの発現が請求項１又は２に記載の毛関
連細胞の鑑別剤によって為されることを特徴とする、
（１１）又は（１２）に記載の育毛剤の鑑別法。 以下、本発明について、実施の形態を中心に詳細に説明
を加える。
て、脱毛症、取り分け男性型脱毛症のメカニズムを明ら
かにすべく鋭意研究努力を重ねた結果、この様な男性型
の脱毛症に於いてはａＦＧＦの発現抑制が大きく関与し
ていることを見いだし、解決の糸口を見いだした。更
に、研究を重ねた結果、男性ホルモンを投与してａＦＧ
Ｆ発現を抑制した動物脱毛モデルにおいて、検体投与に
よるａＦＧＦ発現への影響を見ることにより、有効な育
毛剤が開発しうることを見いだし、発明を完成させるに
至った。即ち、本発明は、以下に示す技術に関するもの
である。 （１）ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）をコードし
たｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する標識ＲＮ
Ａ及び／又は標識ＲＮＡ断片からなる毛関係細胞の鑑別
剤。 （２）ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）をコードし
たｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する標識ＲＮ
Ａ及び／又は標識ＲＮＡ断片が、 １）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞又は細菌にトランスフェ
クトし培養した後、前記動物細胞又は細菌より前記プラ
スミドを取り出し、 ６）前記プラスミドのＤＮＡを制限酵素で直線化し、 ７）ラベル化塩基とともにＲＮＡポリメラーゼの存在下
インキュベートし、ラベル化ｃＲＮＡを作成して取り出
したものであることを特徴とする、（１）に記載の毛関
係細胞の鑑別剤。 （３）配列式１又は２に表される塩基配列を有する、
（１）又は（２）に記載の毛関連細胞の鑑別剤作成用の
プライマー （４）１）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートしたこ
とを特徴とする、（１）又は（２）に記載の毛関連細胞
の鑑別剤作成用のプラスミド。 （５）１）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞又は細胞にトランスフェ
クトして得られることを特徴とする、（１）又は（２）
に記載の毛関連細胞の鑑別剤作成用の培養細胞又は細
菌。 （６）休止期から成長期への移行時期に於ける、ａＦＧ
Ｆ（酸性線維芽細胞増殖因子）の発現を指標とする、毛
髪の成長度合いの鑑別法。 （７）毛髪の成長抑制が男性型の脱毛症に起因するもの
であることを特徴とする、（６）に記載の毛髪の成長抑
制機構の鑑別法。 （８）請求項１又は２に記載の毛関連細胞の鑑別剤を使
用することを特徴とする、（６）又は（７）に記載の毛
髪の成長抑制機構の鑑別法。 （９）毛髪の休止期から成長期への移行時期に於いて、
ａＦＧＦの発現の程度を指標とする、男性型の脱毛症の
鑑別法。 （１０）ａＦＧＦの発現の程度が（１）又は（２）に記
載の毛関連細胞の鑑別剤により為されることを特徴とす
る、（９）に記載の男性型の脱毛症の鑑別法。 （１１）休止期の動物の毛髪に男性ホルモンを投与し、
ａＦＧＦの発現を抑制した動物モデルにおいて、検体を
投与し、ａＦＧＦの発現への影響を指標とすることを特
徴とする、育毛剤の鑑別法。 （１２）育毛剤が、男性型脱毛症用であることを特徴と
する、（１１）に記載の育毛剤の鑑別法。 （１３）ａＦＧＦの発現が請求項１又は２に記載の毛関
連細胞の鑑別剤によって為されることを特徴とする、
（１１）又は（１２）に記載の育毛剤の鑑別法。 以下、本発明について、実施の形態を中心に詳細に説明
を加える。
【０００６】
【発明の実施の形態】（１）本発明の毛関連細胞の鑑別
剤 本発明の毛関連細胞の鑑別剤は、ａＦＧＦ（酸性線維芽
細胞増殖因子）をコードしたｍＲＮＡにアンチセンスの
塩基配列を有する標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片
からなることを特徴とする。これは本発明者らが検討を
重ねた結果、男性ホルモンに起因する男性型脱毛症にお
いて、男性ホルモンが存在しない場合には休止期から成
長期に発現されるａＦＧＦのｍＲＮＡが、男性ホルモン
に発現を抑制され、ａＦＧＦの産生が抑制され、これが
毛成長の抑制になっていることが明らかになり、この様
なａＦＧＦのｍＲＮＡの発現抑制が男性型脱毛症の原因
であり、休止期から成長期への移行期の毛関連細胞にお
ける、この発現の度合いを指標とすることにより、男性
型脱毛症の鑑別が出来、更には、この様なａＦＧＦ発現
抑制モデルにおいて、男性ホルモンと拮抗しａＦＧＦの
発現・産生の抑制を抑える物質を探索することにより、
男性型脱毛症の治療、改善、予防剤の開発が可能である
ことが明らかになったからである。本発明の毛関連細胞
の鑑別剤は、この様なａＦＧＦのｍＲＮＡの発現を鑑別
するものであり、かかるａＦＧＦのｍＲＮＡとアンチセ
ンスの塩基配列を有し、このものとハイブリダイズする
作用とその存在位置をマークしうる標識作用とを有する
ことを特徴とする。
剤 本発明の毛関連細胞の鑑別剤は、ａＦＧＦ（酸性線維芽
細胞増殖因子）をコードしたｍＲＮＡにアンチセンスの
塩基配列を有する標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片
からなることを特徴とする。これは本発明者らが検討を
重ねた結果、男性ホルモンに起因する男性型脱毛症にお
いて、男性ホルモンが存在しない場合には休止期から成
長期に発現されるａＦＧＦのｍＲＮＡが、男性ホルモン
に発現を抑制され、ａＦＧＦの産生が抑制され、これが
毛成長の抑制になっていることが明らかになり、この様
なａＦＧＦのｍＲＮＡの発現抑制が男性型脱毛症の原因
であり、休止期から成長期への移行期の毛関連細胞にお
ける、この発現の度合いを指標とすることにより、男性
型脱毛症の鑑別が出来、更には、この様なａＦＧＦ発現
抑制モデルにおいて、男性ホルモンと拮抗しａＦＧＦの
発現・産生の抑制を抑える物質を探索することにより、
男性型脱毛症の治療、改善、予防剤の開発が可能である
ことが明らかになったからである。本発明の毛関連細胞
の鑑別剤は、この様なａＦＧＦのｍＲＮＡの発現を鑑別
するものであり、かかるａＦＧＦのｍＲＮＡとアンチセ
ンスの塩基配列を有し、このものとハイブリダイズする
作用とその存在位置をマークしうる標識作用とを有する
ことを特徴とする。
【０００７】ａＦＧＦの遺伝子類について、その塩基配
列は多くの動物について既に知られており、従って、そ
のＲＮＡに対してアンチセンスの塩基配列を有するリボ
核酸乃至はその断片を作成することは、常法により行う
ことが出来る。この様な作成方法としては、ＲＮＡシン
セサイザーなどを利用して、ａＦＧＦの遺伝子に固有の
塩基配列部分を、ヌクレオチドをホスホロアミダイト結
合或いはホスホロチオエート結合により伸長して合成す
る方法や、固有のプライマーを前記合成法により作成し
て、ａＦＧＦのｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分をリバースト
ランスクリプターゼを使用することによりｃＤＮＡへ逆
転写し、前記プライマーを用いてＰＣＲによって必要な
ｃＤＮＡのみを増幅し、かかるｃＤＮＡをプラスミドに
ライゲートし、更に、培養動物細胞又は細菌にトランス
フェクトし、前記プラスミドを産生させ、これを制限酵
素などで開いて、これを鋳型にリボヌクレアーゼを用い
てヌクレオチドを結合、伸長させることにより得ること
が出来る。この様な伸長反応の時、標識化ヌクレオチド
を存在させることにより、標識化ＲＮＡを得ることが出
来る。この時使用できる標識としては、ペルオキシダー
ゼなどの酵素類、ジゴキシゲニン等の抗原基、135Ｉ等
の放射性標識類などが例示でき、これらの中では抗原基
を用いることが好ましく、中でもジゴキシゲニンは市販
のキットにより導入できるので特に好ましい。又、ライ
ゲートするプラスミドは通常市販されているものを使用
することが出来る。この様なプラスミドをトランスフェ
クトする動物細胞や細菌としては、ミエローマなどの確
立された培養細胞や大腸菌、放線菌と言った細菌類が好
ましく例示できる。これらの内、特に好ましいものは細
菌類である。これはこの様な遺伝子組込手法が既に確立
されて、その目的で市販されている株が存在するからで
ある。
列は多くの動物について既に知られており、従って、そ
のＲＮＡに対してアンチセンスの塩基配列を有するリボ
核酸乃至はその断片を作成することは、常法により行う
ことが出来る。この様な作成方法としては、ＲＮＡシン
セサイザーなどを利用して、ａＦＧＦの遺伝子に固有の
塩基配列部分を、ヌクレオチドをホスホロアミダイト結
合或いはホスホロチオエート結合により伸長して合成す
る方法や、固有のプライマーを前記合成法により作成し
て、ａＦＧＦのｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分をリバースト
ランスクリプターゼを使用することによりｃＤＮＡへ逆
転写し、前記プライマーを用いてＰＣＲによって必要な
ｃＤＮＡのみを増幅し、かかるｃＤＮＡをプラスミドに
ライゲートし、更に、培養動物細胞又は細菌にトランス
フェクトし、前記プラスミドを産生させ、これを制限酵
素などで開いて、これを鋳型にリボヌクレアーゼを用い
てヌクレオチドを結合、伸長させることにより得ること
が出来る。この様な伸長反応の時、標識化ヌクレオチド
を存在させることにより、標識化ＲＮＡを得ることが出
来る。この時使用できる標識としては、ペルオキシダー
ゼなどの酵素類、ジゴキシゲニン等の抗原基、135Ｉ等
の放射性標識類などが例示でき、これらの中では抗原基
を用いることが好ましく、中でもジゴキシゲニンは市販
のキットにより導入できるので特に好ましい。又、ライ
ゲートするプラスミドは通常市販されているものを使用
することが出来る。この様なプラスミドをトランスフェ
クトする動物細胞や細菌としては、ミエローマなどの確
立された培養細胞や大腸菌、放線菌と言った細菌類が好
ましく例示できる。これらの内、特に好ましいものは細
菌類である。これはこの様な遺伝子組込手法が既に確立
されて、その目的で市販されている株が存在するからで
ある。
【０００８】（２）本発明の毛成長抑制機構の鑑別法 本発明の毛成長抑制機構の鑑別法は、上記の毛関連細胞
の鑑別剤を用いて、毛関連細胞における、ａＦＧＦのｍ
ＲＮＡの発現を鑑別し、これによりａＦＧＦの産生の程
度を知り、男性ホルモンなどによりａＦＧＦの産生が抑
制されて起こる男性型脱毛症の反応機構がどの程度寄与
しているかを鑑別するものである。この様な鑑別に於い
ては、組織標本などを作り、しかる後に上記毛関連細胞
の鑑別剤をイン・サイチュウ・ハイブリダイゼーション
する事が好ましい方法として例示できる。又、ａＦＧＦ
に対して、由来の動物と異なる動物を用いて抗体を作成
し、この抗体を標識する事により、ａＦＧＦの存在位置
を知るような手段も本発明の技術的範囲に属する。この
様な鑑別をすることにより、脱毛の動物モデルを作成し
た場合に於いて、その動物モデルがどの程度、男性型脱
毛症のモデルとして適切であるかを知ることが出来る。
この様なモデルとしての妥当性を知ることにより、適切
なスクリーニングが行え、優れた男性型脱毛症用の育毛
剤を開発することが出来る。
の鑑別剤を用いて、毛関連細胞における、ａＦＧＦのｍ
ＲＮＡの発現を鑑別し、これによりａＦＧＦの産生の程
度を知り、男性ホルモンなどによりａＦＧＦの産生が抑
制されて起こる男性型脱毛症の反応機構がどの程度寄与
しているかを鑑別するものである。この様な鑑別に於い
ては、組織標本などを作り、しかる後に上記毛関連細胞
の鑑別剤をイン・サイチュウ・ハイブリダイゼーション
する事が好ましい方法として例示できる。又、ａＦＧＦ
に対して、由来の動物と異なる動物を用いて抗体を作成
し、この抗体を標識する事により、ａＦＧＦの存在位置
を知るような手段も本発明の技術的範囲に属する。この
様な鑑別をすることにより、脱毛の動物モデルを作成し
た場合に於いて、その動物モデルがどの程度、男性型脱
毛症のモデルとして適切であるかを知ることが出来る。
この様なモデルとしての妥当性を知ることにより、適切
なスクリーニングが行え、優れた男性型脱毛症用の育毛
剤を開発することが出来る。
【０００９】（３）本発明の育毛剤の鑑別法 本発明の育毛剤の鑑別法は、ａＦＧＦの産生乃至はａＦ
ＧＦのｍＲＮＡの発現を指標とすることを特徴とする。
即ち、毛成長の休止期から成長期への移行期において、
ａＦＧＦの産生乃至はａＦＧＦのｍＲＮＡの発現が抑制
されているモデルにおいて、育毛剤の投与によりこの様
な抑制が改善され、ａＦＧＦの産生が高まれば、この様
な育毛剤に於いては男性型脱毛症の改善或いは予防作用
があると鑑別される。この様な鑑別を行うことにより、
従来の動物の毛成長の促進のみを指標としていたスクリ
ーニング法では、実際は効果がないにも関わらず、有効
と鑑別されていた、いわば、ゴーストの育毛剤を、無効
なものとして鑑別してはじくことが可能である。この
為、本発明の鑑別法によれば、育毛剤のスクリーニング
をより的確なものとし、その効率を著しく向上すること
が出来る。
ＧＦのｍＲＮＡの発現を指標とすることを特徴とする。
即ち、毛成長の休止期から成長期への移行期において、
ａＦＧＦの産生乃至はａＦＧＦのｍＲＮＡの発現が抑制
されているモデルにおいて、育毛剤の投与によりこの様
な抑制が改善され、ａＦＧＦの産生が高まれば、この様
な育毛剤に於いては男性型脱毛症の改善或いは予防作用
があると鑑別される。この様な鑑別を行うことにより、
従来の動物の毛成長の促進のみを指標としていたスクリ
ーニング法では、実際は効果がないにも関わらず、有効
と鑑別されていた、いわば、ゴーストの育毛剤を、無効
なものとして鑑別してはじくことが可能である。この
為、本発明の鑑別法によれば、育毛剤のスクリーニング
をより的確なものとし、その効率を著しく向上すること
が出来る。
【００１０】
【実施例】以下に、実施例を示して、本発明について更
に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にの
み限定を受けないことは言うまでもない。
に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にの
み限定を受けないことは言うまでもない。
【００１１】＜実施例１＞以下に示す手順に従って、ジ
ゴキシゲニンで標識したａＦＧＦのｃＲＮＡを作成し、
イン・サイチュウ・ハイブリダイゼーションにより毛周
辺組織におけるａＦＧＦをコードするｍＲＮＡの発現の
状況を毛周期に従って検討を加えた。この時、マウスの
背部をジヒドロテストステロンで処理した男性型脱毛症
動物モデルについてもこの様な検討を行った。これらの
結果を図１〜６（図面代用写真）にしめす。これより、
ａＦＧＦは休止期の早い時期においても僅かながらその
発現が認められること、これはジヒドロテストステロン
を投与した場合に於いても同様であること。休止期から
成長期への移行時期に於いてａＦＧＦのｍＲＮＡの発現
がジヒドロテストステロンの投与により阻害されること
等から、ａＦＧＦがこの様な毛髪の成長の早い時期に出
現し、成長の大きな因子となっていることが推定され、
男性ホルモンなどにより、このものが阻害されることに
より男性型脱毛症が発症すると考えられる。
ゴキシゲニンで標識したａＦＧＦのｃＲＮＡを作成し、
イン・サイチュウ・ハイブリダイゼーションにより毛周
辺組織におけるａＦＧＦをコードするｍＲＮＡの発現の
状況を毛周期に従って検討を加えた。この時、マウスの
背部をジヒドロテストステロンで処理した男性型脱毛症
動物モデルについてもこの様な検討を行った。これらの
結果を図１〜６（図面代用写真）にしめす。これより、
ａＦＧＦは休止期の早い時期においても僅かながらその
発現が認められること、これはジヒドロテストステロン
を投与した場合に於いても同様であること。休止期から
成長期への移行時期に於いてａＦＧＦのｍＲＮＡの発現
がジヒドロテストステロンの投与により阻害されること
等から、ａＦＧＦがこの様な毛髪の成長の早い時期に出
現し、成長の大きな因子となっていることが推定され、
男性ホルモンなどにより、このものが阻害されることに
より男性型脱毛症が発症すると考えられる。
【００１２】（１）組織からのＲＮＡの抽出 ７００ｍｇのマウスの肝臓に１０ｍｌのＴＲＩ試薬（シ
グマ社製）を加えてホモジナイズし、１．５ｍｌマイク
ロチューブに１ｍｌずつ分注しストックとする。このも
のを４℃で１２０００ｇ、１０分間の遠心分離操作を行
い、上清を回収した。ＴＲＩ試薬１ｍｌあたり０．２ｍ
ｌのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、少し放置した
後、更に４℃、１２０００ｇ、１５分間の遠心分離操作
を加え、上層の水相を回収した。ＴＲＩ試薬１ｍｌあた
り０．５ｍｌのイソプロパノールを加え混合した後少し
放置し、４℃で１２０００ｇ、１０分間の遠心分離操作
を行った。ペレットを取り、ＴＲＩ試薬１ｍｌあたり１
ｍｌの７５％エタノール水溶液を加えボルテックスし４
℃で１２０００ｇ、５分間の遠心分離操作を行い、ペレ
ットを取った。このペレットを水１００μｌに溶解して
用いた。
グマ社製）を加えてホモジナイズし、１．５ｍｌマイク
ロチューブに１ｍｌずつ分注しストックとする。このも
のを４℃で１２０００ｇ、１０分間の遠心分離操作を行
い、上清を回収した。ＴＲＩ試薬１ｍｌあたり０．２ｍ
ｌのクロロホルムを加え、激しく攪拌し、少し放置した
後、更に４℃、１２０００ｇ、１５分間の遠心分離操作
を加え、上層の水相を回収した。ＴＲＩ試薬１ｍｌあた
り０．５ｍｌのイソプロパノールを加え混合した後少し
放置し、４℃で１２０００ｇ、１０分間の遠心分離操作
を行った。ペレットを取り、ＴＲＩ試薬１ｍｌあたり１
ｍｌの７５％エタノール水溶液を加えボルテックスし４
℃で１２０００ｇ、５分間の遠心分離操作を行い、ペレ
ットを取った。このペレットを水１００μｌに溶解して
用いた。
【００１３】（２）上記ペレット液にリバーストランス
クリプターゼを作用させ、逆転写させ、できたｃＤＮＡ
を３０℃１０分―５５℃１５〜３０分―９９℃５分―５
℃５分のサイクルで１サイクル処理した後、「ＴａＫａ
Ｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ」（タカラ製）を用いて、
配列式１、２のプライマーを加え、９４℃２分処理し、
９４℃３０秒―５５℃３０秒―７２℃１分３０秒のサイ
クルで２８サイクルＰＣＲ処理した。
クリプターゼを作用させ、逆転写させ、できたｃＤＮＡ
を３０℃１０分―５５℃１５〜３０分―９９℃５分―５
℃５分のサイクルで１サイクル処理した後、「ＴａＫａ
Ｒａ ＲＮＡ ＬＡ ＰＣＲ」（タカラ製）を用いて、
配列式１、２のプライマーを加え、９４℃２分処理し、
９４℃３０秒―５５℃３０秒―７２℃１分３０秒のサイ
クルで２８サイクルＰＣＲ処理した。
【００１４】（３）上記のＰＣＲ生成物をアガロースゲ
ル電気泳動でチェックし、ＴＡクローニングキット（イ
ンビトロジェン製）を用い、ＴＡベクターにライゲート
した。
ル電気泳動でチェックし、ＴＡクローニングキット（イ
ンビトロジェン製）を用い、ＴＡベクターにライゲート
した。
【００１５】（４）市販の大腸菌であるＨＢ１０１細胞
を使用直前に氷中で融解し、穏やかに混和して１００μ
ｌのコンピテントセルをファルコン１５ｍｌチューブに
移した。ライゲートしたベクターＤＮＡに１／１０容の
５ＭＮａＣｌを加え、塩の終濃度を５００ｍＭに調整し
た。コンピテントセルにベクターＤＮＡを１０ｎｇ加
え、氷中に３０分間保存した。このものを４２℃で４５
秒間インキュベートし、氷中に２分間保存した。予め３
７℃に保温しておいたＬＢ培地を最終１ｍｌになるよう
に加え、３７℃で１時間振とうした。プレートに接種
し、３７℃で培養した。出来たコロニーよりプラスミド
を調整した。尚、このトランスフェクトされた大腸菌
は、受託番号Ｐ−１７８０９で工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。得られたプラスミドは、
使用前にインサートを確認した。
を使用直前に氷中で融解し、穏やかに混和して１００μ
ｌのコンピテントセルをファルコン１５ｍｌチューブに
移した。ライゲートしたベクターＤＮＡに１／１０容の
５ＭＮａＣｌを加え、塩の終濃度を５００ｍＭに調整し
た。コンピテントセルにベクターＤＮＡを１０ｎｇ加
え、氷中に３０分間保存した。このものを４２℃で４５
秒間インキュベートし、氷中に２分間保存した。予め３
７℃に保温しておいたＬＢ培地を最終１ｍｌになるよう
に加え、３７℃で１時間振とうした。プレートに接種
し、３７℃で培養した。出来たコロニーよりプラスミド
を調整した。尚、このトランスフェクトされた大腸菌
は、受託番号Ｐ−１７８０９で工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。得られたプラスミドは、
使用前にインサートを確認した。
【００１６】（５）細胞より調整し、インサートを確認
したプラスミドＤＮＡを制限酵素で直線化し、トランス
クリプションバッファー２μｌ、ジゴキシゲニン標識化
塩基であるＮＴＰラベリングミックス２μｌ、ＲＮＡポ
リメラーゼ１μｌとともに３７℃で２時間インキュベー
トし、更にデオキシリボヌクレアーゼ２μｌを加え３７
℃で１５分間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを
分解した。０．２ＭのＥＤＴＡを２μｌ加え反応を停止
し、４Ｍ塩化リチウム２．５μｌと冷エタノール７５μ
ｌを加え、−７０℃で２時間静置しラベル化されたＲＮ
Ａを沈殿させた。これを使用直前にアルカリ分解を行い
約１５０ベースの長さになるように調整した。（アンチ
センスＲＮＡ）
したプラスミドＤＮＡを制限酵素で直線化し、トランス
クリプションバッファー２μｌ、ジゴキシゲニン標識化
塩基であるＮＴＰラベリングミックス２μｌ、ＲＮＡポ
リメラーゼ１μｌとともに３７℃で２時間インキュベー
トし、更にデオキシリボヌクレアーゼ２μｌを加え３７
℃で１５分間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを
分解した。０．２ＭのＥＤＴＡを２μｌ加え反応を停止
し、４Ｍ塩化リチウム２．５μｌと冷エタノール７５μ
ｌを加え、−７０℃で２時間静置しラベル化されたＲＮ
Ａを沈殿させた。これを使用直前にアルカリ分解を行い
約１５０ベースの長さになるように調整した。（アンチ
センスＲＮＡ）
【００１７】（６）Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの背部皮膚を
採取し、パラホルムアルデヒドで固定後、エタノール系
列、トルエン系列次いでパラフィン系列で処理しパラフ
ィン埋包し、切片を切り出した。切片をトルエン系列次
いで含水エタノール系列で戻し、ＰＢＳで洗浄後パラホ
ルムアルデヒドで後固定した後、前記のアンチセンスＲ
ＮＡを用いてイン・サイチュウ・ハイブリダイゼーショ
ンを行った。これをアルカリホスファターゼ標識抗ジゴ
キシゲニン抗体で４℃、一晩の条件で処理し、ＢＣＩＰ
／ＮＢＴによって発色させ、エオジン染色して観察標本
とした。このものを顕微鏡下観察し、毛周期の異なる部
位の染色具合の比較を行った。
採取し、パラホルムアルデヒドで固定後、エタノール系
列、トルエン系列次いでパラフィン系列で処理しパラフ
ィン埋包し、切片を切り出した。切片をトルエン系列次
いで含水エタノール系列で戻し、ＰＢＳで洗浄後パラホ
ルムアルデヒドで後固定した後、前記のアンチセンスＲ
ＮＡを用いてイン・サイチュウ・ハイブリダイゼーショ
ンを行った。これをアルカリホスファターゼ標識抗ジゴ
キシゲニン抗体で４℃、一晩の条件で処理し、ＢＣＩＰ
／ＮＢＴによって発色させ、エオジン染色して観察標本
とした。このものを顕微鏡下観察し、毛周期の異なる部
位の染色具合の比較を行った。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、、脱毛症、取り分け男
性型脱毛症のメカニズムを明らかにし、この様な脱毛症
に有用な育毛料のスクリーニング方法を提供することが
できる。
性型脱毛症のメカニズムを明らかにし、この様な脱毛症
に有用な育毛料のスクリーニング方法を提供することが
できる。
【００１９】
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 エタノール処理３日後のハイブリダイゼーシ
ョンの図である。（図面代用写真）
ョンの図である。（図面代用写真）
【図２】 エタノール処理６日後のハイブリダイゼーシ
ョンの図である。（図面代用写真）
ョンの図である。（図面代用写真）
【図３】 エタノール処理９日後のハイブリダイゼーシ
ョンの図である。（図面代用写真）
ョンの図である。（図面代用写真）
【図４】 ジヒドロテストステロン処理３日後のハイブ
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
【図５】 ジヒドロテストステロン処理６日後のハイブ
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
【図６】 ジヒドロテストステロン処理９日後のハイブ
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
リダイゼーションの図である。（図面代用写真）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/58 Ａ 33/566 (Ｃ１２Ｎ 1/21 33/58 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:19） 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB24 BB46 CB09 CB16 DA14 FA16 FA34 FB01 FB02 FB03 4B024 AA11 BA80 CA09 CA11 CA12 DA06 EA04 HA11 4B063 QA01 QA08 QA19 QQ08 QQ53 QR35 QR48 QR51 QR58 QR66 QR77 QR84 QS10 QS36 QX01 4B065 AA26X AA91Y AB01 BA02 CA46 CA50
Claims (13)
- 【請求項１】 ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）を
コードしたｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する
標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片からなる毛関係細
胞の鑑別剤。 - 【請求項２】 ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）を
コードしたｍＲＮＡにアンチセンスの塩基配列を有する
標識ＲＮＡ及び／又は標識ＲＮＡ断片が、 １）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞にトランスフェクトし培
養した後、前記動物細胞より前記プラスミドを取り出
し、 ６）前記プラスミドのＤＮＡを制限酵素で直線化し、 ７）ラベル化塩基とともにＲＮＡポリメラーゼの存在下
インキュベートし、ラベル化ｃＲＮＡを作成して取り出
したものであることを特徴とする、請求項１に記載の毛
関係細胞の鑑別剤。 - 【請求項３】 配列式１又は２に表される塩基配列を有
する、請求項１又は２に記載の毛関連細胞の鑑別剤作成
用のプライマー - 【請求項４】 １）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートしたこ
とを特徴とする、請求項１又は２に記載の毛関連細胞の
鑑別剤作成用のプラスミド。 - 【請求項５】 １）動物よりＲＮＡを取り出し、 ２）前記ＲＮＡをもとに逆転写酵素によりｃＤＮＡを作
成し ３）前記ｃＤＮＡを鋳型に、配列式１及び２に表される
塩基配列のプライマーとともにＰＣＲ反応を行い ４）得られたｃＤＮＡをプラスミドにライゲートし、 ５）前記プラスミドを動物細胞又は細菌にトランスフェ
クトして得られることを特徴とする、請求項１又は２に
記載の毛関連細胞の鑑別剤作成用の培養細胞又は細菌。 - 【請求項６】 休止期から成長期への移行時期に於け
る、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞増殖因子）の発現を指標
とする、毛髪の成長度合いの鑑別法。 - 【請求項７】 毛髪の成長抑制が男性型の脱毛症に起因
するものであることを特徴とする、請求項６に記載の毛
髪の成長抑制機構の鑑別法。 - 【請求項８】 請求項１又は２に記載の毛関連細胞の鑑
別剤を使用することを特徴とする、請求項６又は７に記
載の毛髪の成長抑制機構の鑑別法。 - 【請求項９】 毛髪の休止期から成長期への移行時期に
於いて、ａＦＧＦの発現の程度を指標とする、男性型の
脱毛症の鑑別法。 - 【請求項１０】 ａＦＧＦの発現の程度が請求項１又は
２に記載の毛関連細胞の鑑別剤により為されることを特
徴とする、請求項９に記載の男性型の脱毛症の鑑別法。 - 【請求項１１】 休止期の動物の毛髪に男性ホルモンを
投与し、ａＦＧＦの発現を抑制した動物モデルにおい
て、検体を投与し、ａＦＧＦの発現への影響を指標とす
ることを特徴とする、育毛剤の鑑別法。 - 【請求項１２】 育毛剤が、男性型脱毛症用であること
を特徴とする、請求項１１に記載の育毛剤の鑑別法。 - 【請求項１３】 ａＦＧＦの発現が請求項１又は２に記
載の毛関連細胞の鑑別剤によって為されることを特徴と
する、請求項１１又は１２に記載の育毛剤の鑑別法。
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|---|---|---|---|
| JP2000105771A JP2001286299A (ja) | 2000-04-07 | 2000-04-07 | 毛髪の成長抑制の鑑別法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2001286299A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004063750A1 (ja) * | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | 育毛活性評価方法 |
-
2000
- 2000-04-07 JP JP2000105771A patent/JP2001286299A/ja active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2004063750A1 (ja) * | 2003-01-08 | 2004-07-29 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | 育毛活性評価方法 |
| CN100381820C (zh) * | 2003-01-08 | 2008-04-16 | 住友电气工业株式会社 | 评价受试物质的毛发生长促进活性的方法和试剂盒 |
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