JP2001261573A - 腫瘍転移抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍の軟部臓器への転移を抑制する。 【解決手段】 カルシトニン類を有効成分とする腫瘍転
移抑制剤を処方する。カルシトニン類は、天然型でもよ
く、またアナログペプチドでもよい。 【効果】 生命維持に関わる軟部臓器への腫瘍転移を抑
制することによって、延命効果が期待できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カルシトニン類を
有効成分とする腫瘍の軟部臓器転移抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍の原発巣での増殖に伴い、他の軟部
臓器、及び骨への転移を起こすことが知られており、抗
癌剤によりこの増殖及び転移を抑制する事で患者の助命
およびＱＯＬの改善がもたらされる。癌の増殖、転移抑
制に関しては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、免疫腑活
剤、抗癌性抗生物質等の抗癌剤が用いられており、治療
効果を奏するものの、血液毒性、心臓毒性、肝臓毒性
等、多くの重篤な副作用が懸念されている（日本医事新
報；Ｖｏｌ．３７４０,３（１９９５））。また骨への
転移に関してはビスフォスフォネート系製剤での治療効
果が報告されているものの確証は得られていない。

【０００３】カルシトニン類の腫瘍転移抑制作用に関し
ては、前立腺癌による骨転移をＰＴＨ拮抗作用により防
止した報告（ｉｎ Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ １９８０；
２９５（１９８０））があり、骨転移に伴う骨破壊に対
する適応も考えられてきた（Ｔｈｅ Ｂｏｎｅ；Ｖｏ
ｌ．１０，１２５（１９９６））。また骨転移後の骨転
移巣に対しては、甲状腺癌後、骨転移した症例で甲状腺
ホルモンとカルシトニン（エルカトニン）を投与して転
移巣の腫瘤の消退と骨欠損部への石灰化による改善が認
められ（ホルモンと臨床；Ｖｏｌ．３４（増刊号），１
７４（１９８６））、また、尿管癌で血中カルシウム濃
度が上昇したため、エルカトニンとプレドニゾロンを投
与したが、結果的に血中カルシウム濃度は下がらなかっ
たが、骨転移もなかった（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ；Ｖｏｌ．３３，１０７（１９９４）ことが報
告されており、またこれらの症例では抗癌剤で懸念され
ている重篤な副作用は認められていない。

【０００４】カルシトニン類は、１９６２年Ｃｏｐｐら
により発見された血清カルシウム低下ホルモンであり
（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．７０，６３８
（１９６３））、骨ページェット病（日整形学誌；Ｖｏ
ｌ；５８，９３７（１９７９））、骨粗鬆症（綜合臨
床；Ｖｏｌ．３９，３６２３（１９９０））、高カルシ
ウム血症（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａ
ｂ．；Ｖｏｌ．６，９３（１９８８））などの治療剤と
して有効性が確立され、低毒性の薬剤として臨床的に使
用されている。また、腎臓に対してはナトリウム、リン
などの電解質排泄促進作用（Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．；Ｖｏｌ．２４６，９２７（１９８４））、胃に
対して胃液分泌抑制作用（Ａｃｕｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）；Ｖｏｌ．１５５，２１６（１
９７１））、膵臓に対して外分泌抑制作用（Ｇｕｔ；Ｖ
ｏｌ．１８，６１５（１９７７））、骨粗鬆症の疼痛に
対して鎮痛作用（Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ；Ｖｏ
ｌ．４１，１２１（１９９４））などが知られている。

【０００５】これらの作用は、各種標的細胞に存在する
カルシトニンレセプターを介してシグナルを与えること
によるものと考えられ、破骨細胞に対してはプロテイン
キナーゼＣを活性化するホスホリパーゼＣ経路を介して
細胞内に情報を伝えることが示され（Ｓｃｉｅｎｃｅ；
Ｖｏｌ．２５１，１０７８（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ；Ｖｏｌ．９
１，２１１５（１９９１））、この作用により破骨細胞
の運動性が調節を受け（Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．；Ｖｏｌ．１２６，４７３（１９９０））骨吸収を
抑制することが考えられている。また、腫瘍細胞におい
てもカルシトニンレセプターの存在が報告されており
（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．１３６，５３
７７（１９９５））、腫瘍細胞に対する調節機能が予想
される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、低毒性で重
篤な副作用を有しないカルシトニン類による腫瘍の軟部
臓器への転移抑制方法を提供し、肺、肝臓等の生命維持
のために必須な臓器での腫瘍の増殖を抑制することで延
命効果をもたらすことを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために研究を重ねた結果、全く意外にもカルシ
トニン類が、腫瘍の軟部臓器への転移抑制に対して有効
であることを見出した。すなわち培養腫瘍細胞を皮下に
接種したモデル系において、カルシトニン類は軟部臓器
への転移を抑制し、延命効果をもたらした。本物質の腫
瘍転移抑制効果は、腫瘍細胞４Ｔ１をＢａｌｂ／ｃマウ
スの皮下に接種し、これにカルシトニン１単位を毎日投
与すると肝臓、肺への転移が著明に抑制され、延命効果
がもたらされた。本発明は上記の知見に基づいてなされ
たものであり、カルシトニン類を有効成分とする腫瘍転
移抑制剤である。

【０００８】本発明におけるカルシトニン類とは、少な
くともカルシトニンレセプターに対する結合能を有する
ペプチドホルモンであればいずれでもよく、その一部は
臨床的に高カルシウム血症、骨ページェット病や骨粗鬆
症に対する治療薬として使用されており、天然型カルシ
トニンまたはそのアナログペプチドが挙げられる。天然
型カルシトニンの例としては、ウナギカルシトニン、サ
ケカルシトニン、ブタカルシトニン、ニワトリカルシト
ニン、ヒトカルシトニン等が挙げられる。またそのアナ
ログペプチドの例としては、カルシトニン類の構造に基
づいてその１，７位のジスルフィド結合をアミノスベリ
ン酸にてエチレン結合に置換した合成誘導体が挙げら
れ、例えばエルカトニン（〔Ａｓｕ^1.7〕ウナギカルシ
トニン、）、〔Ａｓｕ^1.7〕ヒトカルシトニン、〔Ａｓ
ｕ^1.7〕サケカルシトニン、〔Ａｓｕ^1.7〕ニワトリカル
シトニン、〔Ａｓｕ^1.7〕ブタカルシトニンなどが知ら
れており、これらの物質や合成法については、英国特許
第１５１６９４７号明細書などに記載されている。上記
以外のカルシトニン類についても少なくともカルシトニ
ンレセプターに対する結合能を有するペプチドホルモン
であれば、本発明の範囲に含まれる。

【０００９】カルシトニン類が、ラットの血清カルシウ
ム値低下作用を指標とした生物学的測定法（第十三改正
日本薬局方第二追補,２７（１９９９））で定量された
０．５〜５０００単位のカルシトニン活性を有していれ
ば、本発明の範囲に含まれる。これらのカルシトニン類
は、極めて低毒性であり、例えばエルカトニンをマウ
ス、及びラットに静脈内、筋肉内、皮下、経口の各経路
で１３００または７４００単位／ｋｇ（体重）投与して
も致死的毒性は全く観察されなかった。本発明における
薬剤の形態としては、例えば注射剤、直腸吸収剤、膣吸
収剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸
収剤、経口投与剤などが挙げられ、これらの投与形態は
何ら限定されるものではない。

【００１０】注射剤としては好ましくは筋肉内投与また
は、静脈内投与のために使用されるもので、直腸吸収剤
・膣吸収剤は一般に坐剤の形態で使用され、経鼻吸収剤
・経皮吸収剤は適当な吸収促進剤を添加した製剤の形態
で使用され、経肺吸収剤は適当な分散剤もしくは水、及
び噴射剤を含有するエアゾール組成物の形態で使用され
る。口腔内吸収剤は適当な吸収促進剤を添加して例えば
舌下錠などの形態で使用され、また経口投与剤はリポゾ
ーム製剤、マイクロカプセル製剤などの経口用としての
形態で使用される。

【００１１】これらの薬剤は通常のそれぞれの薬剤形態
に適した剤型に調整される。注射剤は、例えばエルカト
ニンを緩衝剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適量溶解した注
射用蒸留水に溶解し、除菌フィルターを通して滅菌した
ものをアンプルに分注することによって調整され得る。
直腸吸収剤、膣吸収剤は、例えばエルカトニンをベクチ
ン酸ナトリウムやアルギン酸ナトリウムなどのキレート
能を有する吸収促進剤、塩化ナトリウムやグルコースな
どの高張化剤を適宜選択使用して、蒸留水または油性ビ
ヒクルに溶解または分散して直腸・膣注入坐剤又は坐剤
として調整される（英国特許第２０９２００２号明細
書、同第２０９５９９４号明細書参照）。

【００１２】経鼻吸収剤は、例えばエルカトニンに水溶
性有機酸であるグルクロン酸、コハク酸、酒石酸などの
吸収促進剤を添加した液剤あるいは粉末剤として調整さ
れる（特開昭６３−２４３０３３号公報、特開昭６３−
３１６７３７号公報、特開平１−２３０５３０号公報、
特開平２−１１１号公報、特開平２−１０４５３１号公
報）。更に、エルカトニンに適宜乳剤を加えて経鼻吸収
剤を得ることもできる（特開平４−９９７２９号公
報）。

【００１３】経皮吸収剤は、例えばサケカルシトニンに
エーゾン（Ａｚｏｎｅ）などの吸収促進剤を添加して皮
膚からの吸収を促進させる方法が報告されている（日本
薬剤学会第２年会、講演要旨集ｐ５７−５８）し、また
イオントフォレーシスによる方法（Ａｎｎ． Ｎ．
Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．；Ｖｏｌ．５０７，３２
（１９８８））でカルシトニン類の経皮吸収剤を得ても
よい。経肺吸収剤は、カルシトニン類を例えばアルラセ
ル、スパン８０などの分散剤と共に粉砕研和して均質な
ペーストとし、次いでこのペーストを冷却したフレオン
１１、フレオン１２などの噴射剤中に分散させた後、弁
を備えた容器に充填して得る方法がある（特開昭６０−
１６１９２４号公報）。

【００１４】口腔内吸収剤は、カルシトニン類に例えば
アスコルビン酸類、酸性アミノ酸類、クエン酸類、不飽
和脂肪酸類、サリチル酸類などを単独、あるいは２種類
以上を組合せ、グルコースなどの賦形剤、メントールな
どの矯味矯臭剤などを添加してトローチ剤、舌下錠、粉
末剤などとして得ることができる（特開昭５６−１４０
９２４号公報）。経口投与剤は、例えばＷ／Ｏ／Ｗエマ
ルジョンを用いた方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｊａ
ｐａｎ；Ｖｏｌ．２３，４９３（１９７６））でカルシ
トニン類を調剤してもよいし、またリポゾーム製剤の方
法（Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．；Ｖｏｌ．１６，２４９
（１９８２））でカルシトニン類を調剤してもよい。

【００１５】このような薬剤は、例えばエルカトニンの
注射剤の場合、エルカトニンの１回投与量としては０．
５〜５０００単位投与され、好ましくは１〜４００単位
である。その他の製剤、その他のカルシトニン類の場合
も、エルカトニンの力価単位に準じて投与すればよい。
なお投与回数は１日、１〜２回でもよく、また毎日また
は週１〜３回であってもよい。更に、ソリタＴ−３など
の適当な輸液にカルシトニン類を適量溶解して、例えば
１〜数時間かけて静脈内に点滴投与してもよい。薬剤中
におけるカルシトニン類の量は適宜決められるが、要は
１回投与当たりカルシトニン活性において注射剤の０．
５〜５０００単位の相当量に定めれば充分である。この
ようにして製造・調整されたカルシトニン類は以下の実
施例に示す通り、極めて良好に腫瘍の転移を抑制せし
め、腫瘍転移抑制剤として有用なものである。

【００１６】

【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。尚、図および表中における略語は次の用語を意味
する。 ｅＣＴ；Ｅｌｃａｔｏｎｉｎ

【実施例１】マウス乳癌細胞、４Ｔ１細胞を１０ｃｍ細
胞培養ディッシュに播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ
ｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ；以下、ＦＣＳという）
を添加したダルベッコ変法最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；
以下、ＤＭＥＭという）中においてサブコンフルエント
の状態になるまで培養した。培養後リン酸緩衝生理食塩
水にて２回洗浄し、細胞溶解液（４Ｍ グアニジンチオ
シアン酸、０．５％ ラウロイルサルコシン酸ナトリウ
ム、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））
０．８ｍｌにて溶解、回収後、１／１０量の１．６６Ｍ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）、等量のＰＣＩ液
（水飽和フェノール５０：クロロホルム４９：イソアミ
ルアルコール１）を加え、攪拌後、遠心分離した。上清
の水層を回収し、０．８ｍｌのイソプロピルアルコール
を加え、攪拌後、−３０℃に保存した。生じた沈殿を遠
心沈降させ、０．８ｍｌの細胞溶解液にて再び溶解し、
等量のイソプロピルアルコールを加え、攪拌後、−３０
℃に保存した。

【００１７】再び生じた沈殿を遠心にて沈降させ、８０
％エタノール溶液にてリンスし、風乾させた後、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ エチレンジアミン４酢酸
（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ Ｔｅｔｒａｇｌｕ
ｔａｍｉｃ ａｃｉｄ；以下ＥＤＴＡ、という）（ｐＨ
８．０）の緩衝溶液にて溶解し、これをＲＮＡ溶液と
して逆転写反応に用いた。逆転写反応溶液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．３)、７５ｍＭ 塩化カリウ
ム、１０ｍＭ ジチオトレイトール、３ｍＭ 塩化マグネ
シウム、および、１０ｎＭ デオキシアデノシン三リン
酸、１０ｎＭ デオキシチミジン三リン酸、１０ｎＭ デ
オキシシチジン三リン酸、１０ｎＭ デオキシグアノシ
ン三リン酸（以下、この四塩基の混合物をｄＮＴＰ ｍ
ｉｘという））に総ＲＮＡ，および，ランダムプライマ
ー（ギブコＵＲＬ）２００ｎｇを加え、７０℃１０分間
加温の後，氷中にて急冷し、ＲＮＡおよびランダムプラ
イマーを変成させた。ここにＭＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩ
ＢＣＯ）を２００ユニット加え、３７℃にて１時間イン
キュベートし、逆転写反応を行った。

【００１８】ＰＣＲ反応溶液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃl (ｐＨ９．１)、１８ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．
６ｍＭ 硫酸マグネシウム、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ｍｉ
ｘ）にマウスカルシトニン受容体特異的プライマー（セ
ンス；５’ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＴＴＧＴＧ ＣＣＣ ＡＡＴ
ＧＧＡ−３’アンチセンス；５’ＣＣＣ ＴＧＧ ＡＡ
ＡＴＧＡ ＡＴＣ ＡＧＡ ＧＡＧ−３’２０ｐｍｏｌ
ｓ、逆転写反応溶液（総ＲＮＡ ５０ｎｇ相当）、およ
びＥｌｏｎｇａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（ＧＩＢＣ
Ｏ）を１ユニット加え、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲ、という）反応を
行った。反応は、始めに９４℃で３分間の熱変性の後、
９４℃ １０秒、５７℃ ３０秒、６８℃ １分の反応を
３５サイクル行ない、その後６８℃１０分の伸長反応を
行った。反応の終了したＰＣＲ反応溶液の１／５量をエ
チジウムブロマイド含有の１％アガロースゲルに展開
し、増幅されたＤＮＡ断片を検索することでカルシトニ
ンレセプターの発現を確認した。

【００１９】その結果４Ｔ１細胞においては図１に示す
通り、コントロールとしておいたマウスの腎臓、脳およ
び成長板軟骨の組織と同様にＣ１ａタイプのカルシトニ
ンレセプター発現が確認され、カルシトニン類が腫瘍細
胞に対して直接作用をもたらす可能性が示唆された。

【００２０】

【実施例２】４Ｔ１細胞を２４穴プレートに、１万細胞
個／ｗｅｌｌの密度で播種し、１０％ ＦＣＳを含むＤ
ＭＥＭ培地に、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉ
ｎｅＳｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；以下ＢＳＡ、とい
う）を含むクエン酸緩衝液にて希釈した各濃度のエルカ
トニンを播種当日から添加し単層培養に及ぼす効果を確
認した。培地は毎日交換し、５日間培養後、細胞をリン
酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄、０．２５％トリプシ
ン、０．０２％ＥＤTＡにて回収し、その細胞数を血球
計算板上において計測した。その結果は図２に示す通り
に１０^-10モル濃度（０．０２単位／ｍｌ相当）以上で
細胞の増殖を抑制した。

【００２１】また５％子牛血清および５％ FＣＳを含む
ＤＭＥＭで希釈した４Ｔ１細胞を、０．３％軟寒天中に
懸濁し、２４穴プレートに１０００細胞個／ｗｅｌｌに
なるように播種した。寒天がゲル化した後、各濃度のエ
ルカトニンを軟寒天上に添加し、培養７日目にも、同様
にエルカトニンを添加した。この際培養１４日目に、５
０個以上の細胞からなるコロニーの数を位相差顕微鏡下
にて計測した。その結果は図３に示す通り、エルカトニ
ン１０^-10モル濃度以上で細胞の増殖を抑制した。これ
らのことはエルカトニンが直接腫瘍細胞に対して増殖抑
制作用をもたらしていることを示し、このことが軟部臓
器への転移抑制剤として作用する少なくとも一つのメカ
ニズムであることを示唆している。

【００２２】

【実施例３】６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス（体重約２
０ｇ）の右乳房部の皮下に、ルシフェラーゼ遺伝子を導
入した４Ｔ１細胞を１００万細胞個／個体で移植した。
１週間後、原発腫瘍が形成されるのを確認した後、エル
カトニン１単位を、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝
液に溶解し腹腔内に毎日投与した。コントロール群に
は、０．１％ＢＳＡを含むクエン酸緩衝液のみを投与し
た。移植２０日目にマウスを屠殺し、肺および肝臓のル
シフェラーゼ活性を計測し、臓器湿重量当りのルシフェ
ラーゼ活性によって腫瘍の臓器への転移抑制効果を評価
した。なお、ルシフェラーゼ活性はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉ
ｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ケミルミノメーターに
て測定した。その結果は図４に示す通り、著明に臓器へ
の転移を抑制するものであった。

【００２３】

【実験例４】６週齢メスＢａｌｂ／ｃマウス（体重約２
０ｇ）の右乳房部の皮下に、４Ｔ１細胞を１００万細胞
個／個体で移植し、１週間後、原発腫瘍が形成されるの
を確認した後、エルカトニン１単位を、０．１％ＢＳＡ
を含むクエン酸緩衝液に溶解しマウスの腹腔内に毎日投
与した。コントロール群には、０．１％ＢＳＡを含むク
エン酸緩衝液のみを投与した。マウスの生存率は、Ｋａ
ｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存率曲線により評価したとこ
ろ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定において図５に示す如く、両
群に有意差が認められ、エルカトニンの延命効果が確認
された。

【００２４】

【発明の効果】以上のことから本発明は、カルシトニン
類が腫瘍の転移を抑制し、さらには延命に対して効果を
発揮しうることを示したものであり、かつカルシトニン
類が低毒性であることからも、予防の範囲を含む有用な
腫瘍転移抑制剤が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】４Ｔ１細胞のカルシトニンレセプターの発現を
示すものである。

【図２】４Ｔ１細胞の単層培養における増殖に及ぼすエ
ルカトニンの抑制効果を示すものである。

【図３】４Ｔ１細胞の軟寒天中における増殖に及ぼすエ
ルカトニンの抑制効果を示すものである。

【図４】４Ｔ１細胞の臓器転移に及ぼすエルカトニンの
抑制効果を示すものである。

【図５】エルカトニンの４Ｔ１細胞臓器転移抑制による
延命効果を示すものである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルシトニン類を有効成分とする腫瘍の
   軟部臓器転移抑制剤。
2. 【請求項２】 カルシトニン類が、天然型カルシトニン
   またはそのアナログペプチドである請求項１記載の腫瘍
   転移抑制剤。
3. 【請求項３】 腫瘍転移抑制剤が、注射剤、直腸座剤、
   膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内
   吸収剤または経口投与剤である請求項１記載の腫瘍転移
   抑制剤。
4. 【請求項４】 カルシトニン類が、血清カルシウム値低
   下作用を指標として生物学的測定法で定量された０．５
   〜５０００単位のカルシトニン活性を有する請求項１記
   載の腫瘍転移抑制剤。
5. 【請求項５】 天然型カルシトニンが、ウナギカルシト
   ニン、ヒトカルシトニン、サケカルシトニン、ニワトリ
   カルシトニンまたはブタカルシトニンである請求項２記
   載の腫瘍転移抑制剤。
6. 【請求項６】 天然型カルシトニンのアナログペプチド
   が、〔Ａｓｕ^1.7〕ウナギカルシトニン、〔Ａｓｕ^1.7〕
   ヒトカルシトニン、〔Ａｓｕ^1.7〕サケカルシトニン、
   〔Ａｓｕ^1.7〕ニワトリカルシトニンまたは〔Ａｓ
   ｕ^1.7〕ブタカルシトニンである請求項２記載の腫瘍転
   移抑制剤。