JP2001258572A - 融合化されたエストロジェンレセプター蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】安定性に優れ、取扱いの容易なエストロジェン
レセプター蛋白質を提供する。 【解決手段】エストロジェンレセプター蛋白質と糖結合
性蛋白質とが融合されてなることを特徴とする融合化さ
れたエストロジェンレセプター蛋白質、および該融合化
されたエストロジェンレセプター蛋白質を用いたリガン
ドとの相互作用の有無を検出するための試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脊椎生物に広く存
在するエストロジェンレセプターが融合化された蛋白
質、該蛋白質をコードする遺伝子、融合化蛋白質の製造
方法、融合化蛋白質を用いた化学物質の相互作用解析の
ための試薬に関する。また本発明はエストロジェンレセ
プターを介した薬理作用を有するリガンドの探索、ある
いは既知の化学物質がいわゆる外因性内分泌撹乱化学物
質としての性質を有するか否かの判断（スクリーニング
試験）に使用しうる生体材料に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】エストロジェンレセプターα（以下、Ｅ
Ｒαとも示す）はいわゆる核内レセプタースーパーファ
ミリーの一員として知られており、その生体内での内在
性リガンドは、エストラジオール等である。ここでリガ
ンドとは低分子の化学物質をいい、一般的には分子量数
百〜数千の化合物である。ＥＲαは内在性リガンドの一
定濃度の存在下、ＥＲＥ（エストロジェン応答要素）と
呼ばれる、遺伝子上の領域にリガンド−ＥＲα複合体と
して結合し、その下流域にある遺伝子を発現させること
でエストロジェン作用を発揮する。エストロジェンレセ
プターは発生、性の分化、生殖器の発達、増殖、生殖行
動などの生体内で重要なプロセスにおいてトリガー的な
役割を果たすため、そのレセプター反応の異常は発生異
常、分化異常、発達異常、生殖行動異常、生殖器異常、
腫瘍生成など、生体に深刻な結果をもたらす可能性が高
い。

【０００３】ＥＲαと反応する内在性リガンドは主にエ
ストラジオールであるが、クメストール、ゲニステイン
など天然の植物エストロゲン、医薬品としての合成エス
トロジェン、環境汚染物質としての環境エストロゲンに
分類されることがある。医薬品の合成アゴニストとし
て、meso-Hexestrol、Ｐ１４９６、エチニルエストラジ
オール、部分アゴニスト・アンタゴニスとしてtrans-Hy
droxytamoxifen、完全アンタゴニストとしてＩＣＩ１６
４、３８４などが作製されている（Journal of Biochem
istry,272(8),pp5069-5075(1997)）。

【０００４】工業的に多量使用されている化学物質のい
くつかが、ＥＲαと相互作用をするいわゆる環境エスト
ロゲンの報告が近年数多くなされている。これらはアン
ドロジェン様物質、甲状腺ホルモン様物質・アロマター
ゼ阻害剤として報告されている化学物質も含め、広く外
因性内分泌撹乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）とし
て呼ばれ、現在使用されている化学物質の再点検が急務
とされている。エストロジェン関連化学物質の中で、エ
ストロジェン作用を有する物質としてメトキシクロル、
ジエチルスチベロール（ＤＥＳ）、ビスフェノールＡ、
o,p'-ＤＤＴ（o，p'-1,1,1-トリクロロ-2,2-ビス(p-ク
ロロフェニル）エタン）、一部のＰＣＢなどがあり、エ
ストロジェン阻害作用化学物質として、ＤＤＥ（p,p-1,
1-ジクロロ-2,2-ビス(p-クロロフェニル）エチレン）、
p,p-ＤＤＴ、ダイオキシン、エンドサルファンなどが既
に報告されている。外因性内分泌撹乱化学物質として可
能性がある物質は、今後スクリーニングが進むにつれ、
ますます多数のものが見出されていくものと危惧されて
いる（ホルモンと臨床；第４６巻、第７号、５１７−５
４３頁（１９９８））。

【０００５】さらに１９９６年にはこれまで１種類の存
在として知られていたＥＲの別種のタイプが新たに見出
され、旧来のものはαタイプ、新規なものはβとして特
性が研究されている（FEBS Lett 392,pp49-53(1996)及
びProc. Natl. Acad. Sci. USA 93,pp5925-5930(199
6））。配列的に極めて類似性の高いα、βのＥＲは特
性的にも互いに似通っているが、反応性などで相違点も
種々報告されつつあり、α，βタイプの存在意義などを
含めて研究されている。

【０００６】ＥＲの薬理的なリガンドの探索、内分泌撹
乱化学物質としてのポテンシャルの測定には現在、化学
物質投与後のラットあるいはマウスの子宮重量変化を測
定するなどのイン・ビボ（in vivo）の方法の他に、種
々のイン・ビトロ（in vitro）の方法が提案されてい
る。ラットＥＲαバインデイングアッセイ、乳がん細胞
由来のＭＣＦ７培養細胞ライセートを用いたヒトＥＲα
バインデイングアッセイ、ヒト組換えＥＲα及びＥＲβ
と蛍光を有するアゴニスト化合物を用いる競合アッセイ
法（蛍光偏光法）、ＭＣＦ７細胞増殖アッセイ（ＥＳＣ
ＲＥＥＮ）、ヒト組換えＥＲαを発現するベクターとレ
ポーター遺伝子を有する組換え酵母用いた、ＹＥＳ−酵
母エストロゲンスクリーン法、ＭＣＦ７に安定にｈＥＲ
α遺伝子を組み入れたレポーターアッセイ法、ＥＲα遺
伝子とレポーター遺伝子を組み入れたＣＶ−１及びＣＯ
Ｓ細胞を使用したレポータ−アッセイ法）などがインビ
トロアッセイの代表的なものである（米国環境保護庁
（EPA）発行のEDSTAC Final Report, Chapter Five App
endices, August,(1998)参照）。これらの方法はいずれ
も一長一短があるが、ＥＲαあるいはβ蛋白分子そのも
のをの用いたレセプター結合アッセイ法として区分され
るのは、ラットＥＲαバインデイングアッセイ、ＭＣＦ
７培養細胞ライセートを用いたヒトＥＲαバインデイン
グアッセイ、ヒト組換えＥＲα（β）と蛍光を有するア
ゴニスト化合物を用いる競合アッセイ法（蛍光偏光法）
である。この３種のバインデイングアッセイ法の利点と
しては、リガンドとレセプターの直接的な相互作用を見
ることができ、他のアッセイ法と相互に補完することで
対象とする化学物質の本質をより明瞭にすることができ
る点にある。

【０００７】品質が一定であること、量的に容易に確保
できるということから組換え体としてのＥＲの発現方法
の報告が数多くなされている。昆虫細胞Ｓｆ９で発現さ
せたヒト組換え体ＥＲ（Biochemistry,32,p6229-6236(1
993)）、酵母で発現させたプロテインＡ融合ヒトＥＲ
（J. Steroid Biochem.Molec.Biol. 44, p1-11(199
3)）、大腸菌で発現させたヒト組換え体ＥＲ（Recepto
r, 2, p77-92(1992)）、大腸菌で発現させたグルタチオ
ン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ）融合ニジマスＥＲ
（Molecular and Cellular Endocrinology,104,p81-93
(1994)）、大腸菌で発現させたマルトース結合蛋白質融
合ヒトＥＲ（J. Biological Chemistry, 272,p4843-484
9(1997)）などが報告されている。

【０００８】組換え融合蛋白質として発現させた例は、
いずれも融合する蛋白と目的蛋白の連結部分に凝固第Ｘ
因子、トロンビン等の特異的プロテアーゼ認識配列を有
し、蛋白発現後特異的プロテアーゼで切断されるか、切
断せずに精製して使用することになる。これらの特異的
プロテアーゼ特異的配列は、発現宿主内・外の比較的非
特異的なプロテアーゼの標的となることが極めて多く、
発現時のＥＲは融合蛋白質と連結された形態のものと連
結されていない形態のものが混合した形となりやすい。

【０００９】またバインデイングアッセイを化学物質に
対して実施する場合、化学物質そのものとの反応性を検
討するだけでなく、臓器抽出物（いわゆるＳ９ミックス
と称されるものなど）、あるいは薬物代謝酵素（チトク
ロームＰ４５０など）と反応させ、生体内部で代謝され
た状態の化学物質の反応性を検討することで、化学物質
の総合的な反応性が評価される場合が極めて多い。

【００１０】これらの臓器抽出物・薬物代謝酵素調製物
中には、種々の非特異的・特異的プロテアーゼが含有さ
れることが多く、次工程でのＥＲとの反応時にＥＲを分
解するため妨害因子となる。特異的プロテアーゼとして
はトリプシン、ペプシン、トロンビン、カリクレイン、
ウロキナーゼなどがあり、臓器によって分布、存在量は
異なるが、これらの特異的プロテアーゼは非特異的プロ
テアーゼと共にＥＲとの反応に大きな影響を与え、リガ
ンドあるいは化学物質の評価の判定に困難を生じさせ
る。したがって、これらのプロテアーゼの影響の回避は
重要である。

【００１１】特異的プロテアーゼは、リジン、アルギニ
ンなどの塩基性アミノ酸、あるいは芳香族アミノ酸、疎
水性アミノ酸を認識することが多い。例えば、トリプシ
ンはアルギニン、リジンのカルボキシル基側を選択的に
切断し、ペプシンはより広い特異性を有するが、より好
適には、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファ
ン、システイン、シスチン、ロイシン残基のカルボキシ
ル基を切断する。カリクレインＢは配列Ｘ−フェニルア
ラニン−アルギニン−Ｙ、キモシンはＸ−プロリン−ヒ
スチジン−ロイシン−セリン−フェニルアラニン−メチ
オニン−アラニン−イソロイシン−Ｙを、ウロキナーゼ
はＸ−アルギニン−バリン−Ｙを、トロンビンは特定配
列のアルギニンを認識する。

【００１２】特異的プロテアーゼが認識する配列は上述
の融合蛋白質などで利用されているが、それらの配列と
しては血液凝固因子Ｘａ、トロンビン、エンテロキナー
ゼの認識する配列である。具体的には、血液凝固因子Ｘ
ａはＸ−イソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アル
ギニン−Ｙ、トロンビンは、Ｘ−ロイシン−バリン−プ
ロリン−アルギニン−グリシン−セリン−Ｙ、エンテロ
キナーゼはＸ−アスパラギン酸−アスパラギン酸−アス
パラギン酸−アスパラギン酸−リジン（またはアルギニ
ン）−Ｙを認識する。 これらの配列はアルギニン、リ
ジンなどの塩基性アミノ酸を含み、したがって、これら
の配列を有する蛋白質は、所定の特異的プロテアーゼに
て切断されるだけでなく、臓器抽出物などに存在する比
較的特異性の低いプロテアーゼの標的ともなる。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】種々の妨害環境の影響
を受けず、調製が容易であるという観点から、遺伝子組
換え技術による各種ＥＲの使用が望ましいが、上記いず
れの方法で調製された組換えＥＲも保存安定性が非常に
悪く、長期保存は困難な面が多い。また、ＥＲの配列を
コードする蛋白質はインクルージョンボデイを形成しや
すく、微生物、昆虫細胞で発現させたＥＲのほとんどは
不溶性であり、ウレア、グアニジン塩酸塩などの変性剤
による処理と蛋白質の巻き戻し処理を必要する。インク
ルージョンボデイからのＥＲの精製は、多くの労力を要
すると共に巻き戻して活性ある蛋白質の取得する効率は
一般に非常に悪く不利である。さらには、活性のある蛋
白質と活性の無い蛋白質の分離は困難である。また融合
蛋白質として可溶性の状態でＥＲを発現させようとする
試みは、それらの連結部は先述した比較的特異性の低い
プロテアーゼの攻撃も受けるため、代謝後の化学物質の
性質を調べる際に不都合な結果をもたらす。

【００１４】またマルトース結合蛋白質がＥＲαと融合
された例においては、菌体にて発現させた後、アミロー
ス固定化樹脂・イオン交換樹脂にて精製後、血液凝固因
子Ｘａにてダイジェスト後、さらにゲルろ過による精製
を実施している。この高度精製された最終ＥＲは−８０
〜４℃で安定性が良好であるが、融合蛋白質自体の保存
時の活性変動については不明である。まして菌体破砕液
の状態での４℃における安定性については検討されてい
ない。融合蛋白質状態のこれらのＥＲは、Ｓ９ミックス
と反応させたときにＳ９の含有するプロテアーゼの標的
として連結部の領域中のアルギニン残基は切断され、比
活性の変化を来たす恐れが高く、結果の判定に重大な影
響を及ぼす可能性が高い。つまり、ここで提示された蛋
白質は安定性が他のＥＲと比して向上している可能性は
否定できないが、実際の化学物質の毒性、影響評価にお
いて欠くことのできない代謝試験での適用を考慮されて
おらず不十分である。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは以上の課題
の解決を図るべく、鋭意検討の結果、糖結合性蛋白質を
ＥＲのアミノ基末端に融合化させることで、ＧＳＴ融合
化蛋白質等には見られない、顕著な安定化が可能であ
り、かつ融合化するための連結部において、特異的プロ
テアーゼに対する耐性を付与させることで、臓器抽出物
等と反応させた化学物質を共存するプロテアーゼの影響
を極めて低減化した状態で測定できることが可能である
ことを見出した。またこの耐性を付与したＥＲはプロテ
アーゼを多く含む菌体破砕液においても良好な安定性を
示し、必ずしも高度精製することなく正確なＲＩバイン
デイングアッセイ等が可能であることを見出し、本発明
を完成させるに至った。

【００１６】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）エストロジェンレセプター蛋白質が糖結合性蛋白
質とプロテアーゼ耐性配列を介して融合されたことを特
徴とする融合化されたエストロジェンレセプター蛋白
質。 （２）エストロジェンレセプター蛋白質が少なくともリ
ガンド結合領域を含む（１）の融合化されたエストロジ
ェンレセプター蛋白質。 （３）エストロジェンレセプター蛋白質が魚類、両生
類、爬虫類、鳥類及び哺乳類よりなる群から選ばれたい
ずれかに由来する（１）又は（２）の融合化されたエス
トロジェンレセプター蛋白質。 （４）エストロジェンレセプター蛋白質が完全にヒト由
来である（１）又は（２）の融合化されたエストロジェ
ンレセプター蛋白質。 （５） エストロジェンレセプター蛋白質が、一部アミ
ノ酸の配列の置換、欠失若しくは付加を有する（１）〜
（４）のいずれかの融合化されたエストロジェンレセプ
ター蛋白質。 （６）エストロジェンレセプター蛋白質が、以下の
（ａ）又は（ｂ）のエストロジェンレセプター蛋白質で
ある（５）の融合化されたエストロジェンレセプター蛋
白質。 （ａ）配列表・配列番号９に記載されるアミノ酸配列か
らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつエストロジェンレセプター活性を有する蛋
白質 （７）エストロジェンレセプター蛋白質が、内在性のエ
ストロジェン、合成されたアゴニスト、アンタゴニス
ト、エストロジェン様作用あるいは抗エストロジェン様
作用を有する化学物質と反応する（１）〜（６）のいず
れかのエストロジェンレセプター蛋白質。 （８）糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質である
（１）〜（７）のいずれかのエストロジェンレセプター
蛋白質。 （９） （１）〜（８）のいずれかの融合化されたエス
トロジェンレセプター蛋白質をコードする遺伝子。 （１０）以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子を含んでなる
（９）の融合化されたエストロジェンレセプター蛋白質
をコードする遺伝子。 （ｃ）配列表・配列番号８に記載される塩基配列からな
る遺伝子 （ｄ）塩基配列（ｃ）において１若しくは数個の塩基が
欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
エストロジェンレセプター活性を有する蛋白質をコード
する遺伝子。 （１１）（９）又は（１０）の遺伝子を担持してなるベ
クター。 （１２）（１１）のベクターが微生物に導入されてな
り、融合化されたエストロジェンレセプター蛋白質をコ
ードする遺伝子が発現された形質転換体。 （１３）微生物が大腸菌である（１２）の形質転換体。 （１４）大腸菌がエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）JM109であることを特徴とする（１３）の形質転換
体。 （１５）（１２）〜（１４）のいずれかの形質転換体を
培養することにより、得られる培養液から融合化された
エストロジェンレセプター蛋白質を採取することを特徴
とする融合化されたエストロジェンレセプター蛋白質の
製造方法。 （１６）（１）〜（８）のいずれかの融合化されたエス
トロジェンレセプター蛋白質、化学物質を溶解させるた
めの溶媒、溶解した化学物質の希釈液を含んでなること
を特徴とするリガンドとの相互作用の有無を検出するた
めの試薬。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明に使用する糖結合性蛋白質
としては、大腸菌由来のマルトース結合性蛋白質（以
下、ＭＢＰとも示す）の他に、セルロース結合性蛋白
質、マンノース結合性蛋白質、グルコサミン・シアル酸
結合性蛋白質など、種々の糖結合性蛋白質を使用するこ
とができる。発現させる宿主と同一起源の糖結合性蛋白
質の使用が好ましく、大腸菌を宿主とする場合、大腸菌
由来のＭＢＰの組み合せが好ましい。しかしながら、本
発明は大腸菌を宿主に限定されるわけではなく、糖結合
性蛋白質は他の宿主、例えば、バチルス（Bacillus）
属、シュードモナス属（Pseudomonas）などの原核微生
物、酵母などの真核微生物、昆虫細胞、動物細胞、植物
細胞等とそれに応じた発現ベクターによる発現系の使用
が可能である。

【００１８】本発明で対象とするエストロジェンレセプ
ター（ＥＲ）の起源としては、ヒト、ラット、マウスな
どの哺乳類由来のもの、ニワトリなど鳥類由来のもの、
ワニなどの爬虫類由来のもの、カエルなどの両性類由来
のもの、マス、メダカなど魚類由来のものを使用するこ
とができる。化学物質の環境への影響という観点からは
いずれの給源由来のＥＲを用いた評価でも重要性は変わ
らないが、薬理効果としてのリガンドの探索においては
ヒト由来のもの、特に完全にヒト由来のものがより重要
である。

【００１９】ＥＲは転写活性化領域及びエストロジェン
応答ＤＮＡ配列（ＥＲＥ）との結合部分（ＤＮＡ結合領
域）、ヒンジ領域、転写調節領域、リガンド結合領域を
有していることが知られている。 本発明の主目的は、
化学物質のＥＲとの反応性におけるポテンシャル、ＥＲ
を介した薬理効果のあるリガンドの探索にあり、この目
的においては、ＥＲとしては少なくともリガンド結合部
分（リガンド結合ドメイン；ＬＢＤとも呼ばれる）が含
まれておれば良い。ＥＲＥのＤＮＡ部分との結合性をみ
る場合は、ＤＮＡ結合領域から下流の蛋白質を発現させ
るなど目的に応じて適宜選択できる。

【００２０】また本発明のＥＲとして、前述の変異研究
におけるリガンド結合能が変化したＥＲをも対象として
いる。生体での異常を反映したリガンド結合能の変化し
た種々の変異体が使用できる。ここで変異とは１もしく
は数個のアミノ酸の置換、付加、欠失をいう。いわゆる
一塩基変異多型（ＳＮＰＳ）に対応した、ＥＲの変異体
のタンパク質レベルでの研究に、本発明は威力を発揮す
ることができる。

【００２１】また、本発明でいう内在性エストロジェン
とはエストラジオール（正確には１７βエストラジオー
ル）及びエストロンなどをいい、合成アゴニストとはme
so-Hexestrol、Ｐ１４９６、エチニルエストラジオール
あるいは、trans-Hydroxytamoxifen、ＩＣＩ１６４、３
８４などをいう。エストロジェンあるいは抗エストロジ
ェンとしての外来性内分泌撹乱物質とはメトキシクロ
ル、ジエチルスチベロール（ＤＥＳ）、ビスフェノール
Ａ、o,p'-ＤＤＴ（o,p'-1,1,1-トリクロロ-2,2-ビス(p-
クロロフェニル）エタン）、一部のＰＣＢ、ＤＤＥ（p,
p-1,1-ジクロロ-2,2-ビス(p-クロロフェニル）エチレ
ン）、p,p-ＤＤＴ、ダイオキシン、エンドサルファンな
ど、現時点で既にエストロジェンレセプターとの相互作
用が報告されているものをいう。今後外因性内分泌撹乱
化学物質として報告される物質についてもエストロジェ
ンレセプターと相互作用する場合が多いものと予想され
る。

【００２２】本発明でいう特異的プロテアーゼ耐性配列
とは、上述したような血液凝固因子Ｘａ、トロンビン、
エンテロキナーゼ、あるいは臓器抽出物などに存在する
比較的特異性の低いプロテアーゼの影響を受けないよう
な配列をいう。特異的プロテアーゼの認識配列を考慮
し、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸、フェニ
ルアラニン、ロイシン、バリン、プロリンなどを一般的
なアミノ酸配列と比較して減じたものであればよい。し
たがって、連結部に例えばグリシン−セリンの繰り返し
配列、あるいはグルタミン酸とアスパラギン酸の組み合
せ配列などを使用することができる。これらの配列は糖
結合性蛋白質とＡＲ蛋白質が立体障害的に配置しないよ
うまた十分な発現量が確保できるよう留意されておれ
ば、他に制限は無い。

【００２３】本発明で使用するＡＲ蛋白質に対応する遺
伝子配列としては天然のものをそのまま使用することが
できる他に、アミノ酸変異を伴わない塩基配列の変更が
可能であり、使用する宿主のコドンの選択傾向（Codon
Usage）に合わせることも可能である。

【００２４】本発明を原核微生物として大腸菌を使用す
る場合、菌株としては、通常分子生物学、有用生理活性
物質生産で使用されているエシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）JM109、BL21などを使用することができる
が、工業生産に適した安全性の確保、安定な生産性を示
す菌株であれば制限なく使用することができる。

【００２５】本発明の糖結合性蛋白融合ＥＲはタンパク
質レベルでの化学物質との反応性を検討することに使用
されるが、その反応性の評価方法としては、トリチウム
ラベルされた内在性ＥＲリガンドあるいは合成リガンド
を使用したラジオアイソトープによる方法、蛍光性のＥ
Ｒリガンドを合成して蛍光の状態を検出する方法、リガ
ンドとの結合時における微量な熱量を検出する方法、Ｅ
Ｒと反応したリガンドあるいは遊離のリガンドを抗体な
どの生体材料を用いて検出する方法など、様々な方法に
おいても評価することが可能である。

【００２６】本発明のＥＲを反応させる場合の組成物と
しては、既出の文献中に記載のものを適宜使用すること
ができる。例えば、ｐＨ６〜８に緩衝能力を有する緩衝
剤２０〜３００mM、ジチオスレイトールなどの温和な還
元剤１〜２０mM、グリセロール、ゼラチン、牛血清アル
ブミンあるいはグロブリンなどの安定化剤０．０１〜３
０重量％、モリブデン酸ナトリウム、バナジン酸ナトリ
ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化亜鉛、塩化
マグネシウムなどの金属塩０．５〜３００mMなどを含む
ことができる。

【００２７】本発明におけるリガンドとの相互作用の有
無を検出するための試薬は、上述したような本発明のエ
ストロジェンレセプター蛋白質、化学物質を溶解させる
ための溶媒、溶解した化学物質の希釈液を少なくとも含
んでなる。ここで、化学物質を溶解させるための溶媒と
は、水、緩衝液、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ、
ＤＭＦなどをいい、化学物質の性質に適した溶媒を選択
することができ、また適切な濃度を設定できる。水溶解
性の良好な化学物質については超純水を、そうでないも
のについては１００％ＤＭＳＯが多用される。また、溶
解した化学物質の希釈液とは、レセプターとの反応時
に、適切な濃度に化学物質を設定するために使用される
ものであり、緩衝液、溶媒、蛋白質などを含む。該希釈
液は、レセプターとの反応に影響しない組成であれば制
限はないが、レセプター蛋白質の反応組成物と共通であ
ることが好ましい。以上の他に、レセプターと結合した
リガンドと遊離リガンドを分離させるための補助試薬と
して、デキストランチャコール液あるいはヒドロキシア
パタイト樹脂を含む懸濁液などを適宜使用し、Ｂ／Ｆ分
離して反応を評価することができる。さらにこの際に、
分離手段として遠心分離、濾紙、フィルターによる分離
が好ましい。またレセプターと化学物質（リガンド）を
反応させた後、レセプター−リガンド複合体あるは遊離
リガンドをＨＰＬＣなどのクロマト手段、キャピラリー
電気泳動などで評価することが可能であり、抗体などを
用いて評価してもよい。

【００２８】

【実施例】以下、実施例により、本発明をより詳細に説
明する。

【００２９】実施例１ 配列番号１と配列番号２の合成オリゴヌクレオチド配列
をプライマー対とし、ヒトｃＤＮＡライブラリーとして
PCR-Ready Human cDNA（Placenta、Ovary、Spleen、Kid
ney及びLiver；マキシムバイオテック製）を鋳型とし
て、PFU turbo（ストラタジーン製）ＤＮＡポリメラー
ゼを用いてＰＣＲを実施した。実施したＰＣＲ試薬組成
（１００μL当たり）は、PFU turbo１０倍濃縮バッファ
ー１０μL、２５mM塩化マグネシウム溶液 ６μL、ｄＮ
ＴＰ溶液 １０μL、配列番号１のプライマー溶液(１０p
mol／μL）４μL、配列番号２のプライマー溶液（１０p
mol／μL）４μL、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー １μ
L、PFU turbo（２．５Ｕ／μL）１μL、滅菌済みMilli
Ｑ水６４μLである。ＰＣＲサイクルは９５℃、２分間
の予備加温の後、９５℃、３０秒−５７℃、３０秒−７
２℃、１分３０秒の２５回である。このＰＣＲの結果、
ＥＲαの２５３番目のアミノ酸から５９５番目のアミノ
酸に対応する約１０５０塩基対の遺伝子断片が確認でき
た。この遺伝子断片をMagExtractor PCR＆Gel Clean Up
キット（東洋紡績製）にてクリーンナップ後、配列番号
１及び配列番号２のプライマーに導入した、BamHI及びS
alIの制限酵素（東洋紡績製）にて３時間消化後、同じ
制限酵素にて消化した、ＭＢＰ融合ベクター（pMalc2
e；ニューイングランドバイオラボ製）にＴ４ライゲー
ス（東洋紡績製）を用いて連結し、コンピテントなエシ
ェリヒア・コリJM109株（東洋紡績製）に４２℃、４５
秒間で形質転換した。

【００３０】形質転換後、アンピシリンを含むＬＢ寒天
培地に撒き、３７℃にて終夜静置した。生じたコロニー
を２０種、ＬＢ培養液に接種し、３７℃で終夜培養し
た。終夜培養した各コロニーの培養液１００μLを、酵
母エキス（ギブコ製）１ｇ、トリプトン（ギブコ製）
１．５ｇ、塩化ナトリウム（ナカライテスク製）０．５
ｇを５０ｍｌ中に含む培養液（以下、ＳＢ培地という）
に、１Ｍグルコース（ナカライテスク製） １mL及び１
００mg／mLアンピシリン溶液（ナカライテスク製）６０
μLと共に植え継ぎ、約３時間、３７℃にて培養した。
ＯＤ660nmでの吸光度が０．８〜１．２の間にあること
を確認した後、１００mMのイソプロピルチオガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）１００μLを加え、
３０℃で４時間誘導培養した。誘導培養後、遠心分離に
より菌体を集め、破砕するまで−２０℃にて凍結保存し
た。

【００３１】実施例２ 実施例１で取得した菌体を、菌体濃度としてＯＤ660が
１０となる様に、上述のJournal of Biological Chemis
try 272,p4843-4849 (1997)に記載の破砕液と方法によ
り破砕した。破砕後、ストレプトマイシン硫酸塩（ナカ
ライテスク製）を０．０２ｇ／mLとなるよう加え、除核
酸を実施後、トリチウムラベルしたエストラジオール
（第一化学薬品製）を終濃度１nMとなるよう加え、同文
献記載の方法同様にデキストランチャコール法により、
ＥＲの結合活性を評価した。反応は７℃で実施した。２
０種のコロニーのうち、約８割が明瞭なＥＲの結合活性
を示した。ここでコントロールとして、トリチウムラベ
ルしたエストラジオールと共に２００nMのラジオラベル
されていないエストラジオール（ナカライテスク製）を
共存させてとり、結合活性の指標としてこのラジオラベ
ルされていないエストラジオールの有無でのシグナル差
を活性値とした。その結果、極めて明瞭なＥＲ結合活性
を示すことが判明した。

【００３２】実施例３ ＥＲ結合活性の確認された実施例２のクローンを１つ選
択し、菌体よりプラスミドを常法にて精製した。このプ
ラスミドを鋳型として、配列番号３及び配列番号４の合
成オリゴヌクレオチド対とQuick Change Site-Directed
Mutagenesis Kit（ストラタジーン製）を用いて、ＭＢ
ＰとＥＲとの連結部分のリジン残基をグルタミン酸残基
に変更し、特異的プロテアーゼ（エンテロキナーゼだけ
でなく、トリプシンなどのプロテアーゼ）の標的となり
うる配列を消滅させた。反応条件などはキットのプロト
コール記載の方法に従って実施し、変異を導入した発現
ベクターを担持したシングルコロニーを取得した。取得
したシングルコロニーより常法にてプラスミドを調製
し、配列番号５〜７のプライマーとABI PRISM Big Dye
Terminator Cycle Sequencing Kitを用いて塩基配列の
決定を実施した。試薬組成、反応条件はキット添付のプ
ロトコールにしたがって実施し、測定及び解析はABI PR
ISM モデル３１０にて実施した得られた塩基配列及びア
ミノ酸配列の結果を配列番号８及び配列番号９に示す。

【００３３】さらに連結部の変更に関する別な態様のも
のを作製する方法を次に示す。pMalc2eベクターの連結
部内におけるAvaI及びBamHI間の配列をグリシン及びセ
リンを主体とするアミノ酸に変更するため、配列番号１
０及び配列番号１１に記載の合成オリゴヌクレオチドを
作製し、熱処理にて相補対を形成させた後、ベクター及
び相補対ＤＮＡをAvaI及びBamHIにて消化し、ライゲー
スにて連結することで変異ベクターを取得した。ライゲ
ーション後、実施例１と同様に、コンピテントなエシェ
リヒア・コリJM109を用いて形質転換を実施してシング
ルコロニーを選択した。熱処理としては各プライマーを
それぞれ５０pmol／μLとなるよう滅菌MilliQ水で調製
し、等量混合後、９５℃、１分−５０℃、１分の熱処理
を１０回繰り返すことで実施した。この操作にてAvaI−
BamHI間に−グリシン−セリン−グルタミン酸−セリン
−セリン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−が
導入できた。導入後、実施例１と同様の方法によりＥＲ
遺伝子断片を挿入し、形質転換体を取得した。

【００３４】実施例４ 実施例３にて得られた配列番号８を含むプラスミドを有
するエシェリヒア・コリJM109を実施例１,２同様に培養
後、誘導して活性測定を実施した。また活性の保存安定
性を検討するために、菌体破砕液の状態で７℃、−２０
℃で保存し、経時的な変化を確認したところ図１の様に
なり、検討した期間で−２０℃及び７℃でほとんど結合
活性の変動の無いことが判明した。これは従来のＥＲα
に比べて明確な優位性を示すものである。

【００３５】実施例５ 実施例４で調製したＥＲαサンプルを、７℃、１６時間
で、終濃度１nMのトリチウムラベルしたエストラジオー
ルと反応させた。この時トリチウムラベルされていない
エストラジオール、ビスフェノールＡ、ジエチルスチベ
ロール（ナカライテスク製）、ノニルフェノール（関東
化学製）を終濃度１nM〜１００μMまで変化させ、結合
活性に対する影響を検討した。その結果を図２〜５に示
す。これら代表的な内分泌撹乱物質の可能性が高いとさ
れている化学物質のいずれもが、濃度依存的にＥＲ反応
を競合阻害していることが、各図のドーズレスポンスよ
り確認された。

【００３６】

【発明の効果】上述したように、本発明により、Ｓ９ミ
ックスなど生体の代謝系で処理した化学物質をも、混在
するプロテアーゼの影響を受けることなく正確に測定す
ることができるエストロゲンレセプターを提供できるよ
うになり、さらに、薬物、内分泌撹乱物質のスクリーニ
ングにおいてより信頼性の高い評価手段を市場提供でき
る。

【００３７】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGCGGGAT CCATGGATCC AGGTGGGATA CGAAAAGACC GAAGA 45

【００３８】 配列番号：２ 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCCCGTCG ACTCAGACTG TGGCAGGGAA ACCCTCTGCC TCCCC 45

【００３９】 配列番号：３ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGGATGACG ATGACGAGGT ACCGGAATTC GG 32

【００４０】 配列番号：４ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGAATTCCG GTACCTCGTC ATCGTCATCC CC 32

【００４１】 配列番号：５ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGGGTGCCG TAGCGCTGAA GTCT 24

【００４２】 配列番号：６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24

【００４３】 配列番号：７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGGGCTTA CTGACCAACC TGGC 24

【００４４】 配列番号：８ 配列の長さ：2220 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：両形態 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGAAAACTG AAGAAGGTAA ACTGGTAATC TGGATTAACG GCGATAAAGG CTATAACGGT 60 CTCGCTGAAG TCGGTAAGAA ATTCGAGAAA GATACCGGAA TTAAAGTCAC CGTTGAGCAT 120 CCGGATAAAC TGGAAGAGAA ATTCCCACAG GTTGCGGCAA CTGGCGATGG CCCTGACATT 180 ATCTTCTGGG CACACGACCG CTTTGGTGGC TACGCTCAAT CTGGCCTGTT GGCTGAAATC 240 ACCCCGGACA AAGCGTTCCA GGACAAGCTG TATCCGTTTA CCTGGGATGC CGTACGTTAC 300 AACGGCAAGC TGATTGCTTA CCCGATCGCT GTTGAAGCGT TATCGCTGAT TTATAACAAA 360 GATCTGCTGC CGAACCCGCC AAAAACCTGG GAAGAGATCC CGGCGCTGGA TAAAGAACTG 420 AAAGCGAAAG GTAAGAGCGC GCTGATGTTC AACCTGCAAG AACCGTACTT CACCTGGCCG 480 CTGATTGCTG CTGACGGGGG TTATGCGTTC AAGTATGAAA ACGGCAAGTA CGACATTAAA 540 GACGTGGGCG TGGATAACGC TGGCGCGAAA GCGGGTCTGA CCTTCCTGGT TGACCTGATT 600 AAAAACAAAC ACATGAATGC AGACACCGAT TACTCCATCG CAGAAGCTGC CTTTAATAAA 660 GGCGAAACAG CGATGACCAT CAACGGCCCG TGGGCATGGT CCAACATCGA CACCAGCAAA 720 GTGAATTATG GTGTAACGGT ACTGCCGACC TTCAAGGGTC AACCATCCAA ACCGTTCGTT 780 GGCGTGCTGA GCGCAGGTAT TAACGCCGCC AGTCCGAACA AAGAGCTGGC AAAAGAGTTC 840 CTCGAAAACT ATCTGCTGAC TGATGAAGGT CTGGAAGCGG TTAATAAAGA CAAACCGCTG 900 GGTGCCGTAG CGCTGAAGTC TTACGAGGAA GAGTTGGCGA AAGATCCACG TATTGCCGCC 960 ACTATGGAAA ACGCCCAGAA AGGTGAAATC ATGCCGAACA TCCCGCAGAT GTCCGCTTTC 1020 TGGTATGCCG TGCGTACTGC GGTGATCAAC GCCGCCAGCG GTCGTCAGAC TGTCGATGAA 1080 GCCCTGAAAG ACGCGCAGAC TAATTCGAGC TCGAACAACA ACAACAATAA CAATAACAAC 1140 AACCTCGGGG ATGACGATGA CGAGGTACCG GAATTCGGAT CCATGGATCC AGGTGGGATA 1200 CGAAAAGACC GAAGAGGAGG GAGAATGTTG AAACACAAGC GCCAGAGAGA TGATGGGGAG 1260 GGCAGGGGTG AAGTGGGGTC TGCTGGAGAC ATGAGAGCTG CCAACCTTTG GCCAAGCCCG 1320 CTCATGATCA AACGCTCTAA GAAGAACAGC CTGGCCTTGT CCCTGACGGC CGACCAGATG 1380 GTCAGTGCCT TGTTGGATGC TGAGCCCCCC ATACTCTATT CCGAGTATGA TCCTACCAGA 1440 CCCTTCAGTG AAGCTTCGAT GATGGGCTTA CTGACCAACC TGGCAGACAG GGAGCTGGTT 1500 CACATGATCA ACTGGGCGAA GAGGGTGCCA GGCTTTGTGG ATTTGACCCT CCATGATCAG 1560 GTCCACCTTC TAGAATGTGC CTGGCTAGAG ATCCTGATGA TTGGTCTCGT CTGGCGCTCC 1620 ATGGAGCACC CAGTGAAGCT ACTGTTTGCT CCTAACTTGC TCTTGGACAG GAACCAGGGA 1680 AAATGTGTAG AGGGCATGGT GGAGATCTTC GACATGCTGC TGGCTACATC ATCTCGGTTC 1740 CGCATGATGA ATCTGCAGGG AGAGGAGTTT GTGTGCCTCA AATCTATTAT TTTGCTTAAT 1800 TCTGGAGTGT ACACATTTCT GTCCAGCACC CTGAAGTCTC TGGAAGAGAA GGACCATATC 1860 CACCGAGTCC TGGACAAGAT CACAGACACT TTGATCCACC TGATGGCCAA GGCAGGCCTG 1920 ACCCTGCAGC AGCAGCACCA GCGGCTGGCC CAGCTCCTCC TCATCCTCTC CCACATCAGG 1980 CACATGAGTA ACAAAGGCAT GGAGCATCTG TACAGCATGA AGTGCAAGAA CGTGGTGCCC 2040 CTCTATGACC TGCTGCTGGA GATGCTGGAC GCCCACCGCC TACATGCGCC CACTAGCCGT 2100 GGAGGGGCAT CCGTGGAGGA GACGGACCAA AGCCACTTGG CCACTGCGGG CTCTACTTCA 2160 TCGCATTCCT TGCAAAAGTA TTACATCACG GGGGAGGCAG AGGGTTTCCC TGCCACAGTC 2220

【００４５】 配列番号：９ 配列の長さ：740 配列の型： アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Asp 370 375 380 Asp Asp Asp Glu Val Pro Glu Phe Gly Ser Met Asp Pro Gly Gly Ile 385 390 395 400 Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg 405 410 415 Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg 420 425 430 Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys 435 440 445 Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu 450 455 460 Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg 465 470 475 480 Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp 485 490 495 Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe 500 505 510 Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp 515 520 525 Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro 530 535 540 Val Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly 545 550 555 560 Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr 565 570 575 Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys 580 585 590 Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser 595 600 605 Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu 610 615 620 Asp Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu 625 630 635 640 Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu 645 650 655 Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser 660 665 670 Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met 675 680 685 Leu Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser 690 695 700 Val Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser 705 710 715 720 Ser His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe 725 730 735 Pro Ala Thr Val 740

【００４６】 配列番号：１０ 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCATCTCG GGGGCAGTGA GAGCGGCAGC AGTGGGGGGG GATCCGCGCG C 51

【００４７】 配列番号：１１ 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGCGCGGAT CCCCCCCCAC TGCTACTGCT CTCACTGCCC CCCGAGATGC AT 52

【図面の簡単な説明】

【図１】各保存温度における菌体破砕液中のＥＲ結合活
性活性を経時的にプロットした図である。

【図２】エストラジオールの共存下での、ＥＲ結合活性
（％）を示す図である。

【図３】ジエチルスチベロールの共存下での、ＥＲ結合
活性（％）を示す図である。

【図４】ビスフェノールＡの共存下での、ＥＲ結合活性
（％）を示す図である。

【図５】ノニルフェノールの共存下での、ＥＲ結合活性
（％）を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ａ 33/53 33/566 33/566 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA40 BB20 CB17 CB19 CB21 DA36 DA54 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 AG20 CA02 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エストロジェンレセプター蛋白質が糖結
   合性蛋白質とプロテアーゼ耐性配列を介して融合された
   ことを特徴とする融合化されたエストロジェンレセプタ
   ー蛋白質。
2. 【請求項２】 エストロジェンレセプター蛋白質が少な
   くともリガンド結合領域を含む請求項１記載の融合化さ
   れたエストロジェンレセプター蛋白質。
3. 【請求項３】 エストロジェンレセプター蛋白質が魚
   類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類よりなる群から選
   ばれたいずれかに由来する請求項１又は２に記載の融合
   化されたエストロジェンレセプター蛋白質。
4. 【請求項４】 エストロジェンレセプター蛋白質が完全
   にヒト由来である請求項１又は２に記載の融合化された
   エストロジェンレセプター蛋白質。
5. 【請求項５】 エストロジェンレセプター蛋白質が、一
   部アミノ酸の配列の置換、欠失若しくは付加を有する請
   求項１〜４のいずれかに記載の融合化されたエストロジ
   ェンレセプター蛋白質。
6. 【請求項６】 エストロジェンレセプター蛋白質が、以
   下の（ａ）又は（ｂ）のエストロジェンレセプター蛋白
   質である請求項５記載の融合化されたエストロジェンレ
   セプター蛋白質。 （ａ）配列表・配列番号９に記載されるアミノ酸配列か
   らなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつエストロジェンレセプター活性を有する蛋
   白質
7. 【請求項７】 エストロジェンレセプター蛋白質が、内
   在性のエストロジェン、合成されたアゴニスト、アンタ
   ゴニスト、エストロジェン様作用あるいは抗エストロジ
   ェン様作用を有する化学物質と反応する請求項１〜６の
   いずれかに記載のエストロジェンレセプター蛋白質。
8. 【請求項８】 糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白
   質である請求項１〜７のいずれかに記載のエストロジェ
   ンレセプター蛋白質。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載の融合
   化されたエストロジェンレセプター蛋白質をコードする
   遺伝子。
10. 【請求項１０】 以下の（ｃ）又は（ｄ）の遺伝子を含
    んでなる請求項９記載の融合化されたエストロジェンレ
    セプター蛋白質をコードする遺伝子。 （ｃ）配列表・配列番号８に記載される塩基配列からな
    る遺伝子 （ｄ）塩基配列（ｃ）において１若しくは数個の塩基が
    欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
    エストロジェンレセプター活性を有する蛋白質をコード
    する遺伝子。
11. 【請求項１１】 請求項９又は１０に記載の遺伝子を担
    持してなるベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のベクターが微生物に
    導入されてなり、融合化されたエストロジェンレセプタ
    ー蛋白質をコードする遺伝子が発現された形質転換体。
13. 【請求項１３】 微生物が大腸菌である請求項１２記載
    の形質転換体。
14. 【請求項１４】 大腸菌がエシェリヒア・コリ（Escher
    ichia coli）JM109であることを特徴とする請求項１３
    記載の形質転換体。
15. 【請求項１５】 請求項１２〜１４のいずれかに記載の
    形質転換体を培養することにより、得られる培養液から
    融合化されたエストロジェンレセプター蛋白質を採取す
    ることを特徴とする融合化されたエストロジェンレセプ
    ター蛋白質の製造方法。
16. 【請求項１６】 請求項１〜８のいずれかに記載の融合
    化されたエストロジェンレセプター蛋白質、化学物質を
    溶解させるための溶媒、溶解した化学物質の希釈液を含
    んでなることを特徴とするリガンドとの相互作用の有無
    を検出するための試薬。