JP2001224902A

JP2001224902A - ホルモン様作用物質の測定方法及びそれに用いる前処理カラム用充填剤

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Publication number: JP2001224902A
Application number: JP2000038473A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石; Toshiki Kawabe; 俊樹川辺
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2000-02-16
Publication date: 2001-08-21

Abstract

(57)【要約】【課題】短時間に大量の試料を自動処理できる濃縮工
程を含む、ホルモン様作用物質の測定方法を提供する。【解決手段】少なくとも、送液ポンプ、試料導入装
置、前処理カラム、分離カラム及び検出器より構成され
る液体クロマトグラフィー装置を用いた、ホルモン様作
用物質の測定方法において、少なくとも、上記前処理カ
ラムに試料を１回以上注入し、試料中のホルモン様作用
物質を前処理カラムに吸着させる吸着工程、及び、該前
処理カラムに吸着されたホルモン様作用物質を脱着させ
て分離カラムに導入する工程を含むことを特徴とするホ
ルモン様作用物質の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホルモン様作用物
質の測定方法及びその方法に用いる前処理カラム用充填
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】環境中に排出された生物由来のステロイ
ドホルモン類や一部の化学物質は、生体内に取り込まれ
るとホルモン類似作用を示すものがある。これらの化学
物質は内分泌攪乱物質と呼ばれ、動物の生殖機能等に悪
影響を及ぼすことがわかってきた。従ってこれらの物質
の正確な測定は極めて重要である。

【０００３】ホルモン様作用物質は極めて微量であるた
め、ガスクロマトグラフィー法とマススペクトル分析法
を組み合わせた方法（ＧＣ−ＭＳ法）、液体クロマトグ
ラフィー（ＬＣ）法、ＬＣ−ＭＳ法、あるいは抗原抗体
反応に基づく免疫法などの高感度分析により測定されて
いる。これらの内、ＬＣ法は、設備の面やコストの面、
前処理の簡便さから最も有益な方法である。しかしなが
らＬＣ法は、感度の点で他法に比べて低い。

【０００４】ホルモン様作用物質のような微量物質の測
定を行う際には、固相抽出法を用いて試料の濃縮を行う
と感度の向上が期待できる。これは、固相抽出用カラム
に試料を添加することで、固相上に目的物質を濃縮する
方法である。

【０００５】一般に固相抽出に用いられる担体として
は、スチレン−ジビニルベンゼン系の担体や２−ビニル
ピロリドン−ジビニルベンゼン系の担体（ＬＣＧＣ、１
５（２）、１５２−１５８，１９９７）、あるいはジビ
ニルベンゼン−アクリル酸エステル共重合体（特開平６
−２５８２０３号公報）などが開示されている。しかし
これらの固相抽出担体は、ホルモン様作用物質の抽出に
特異的でなく、吸着能や脱着能が不十分で、定量性に問
題があった。また微量物質の測定時に妨害となる成分を
溶出してしまう問題があった。これは固相抽出担体の原
材料としてベンゼン環を有する化合物を使用しているこ
とにも由来しており、洗浄操作などによっても極めて除
去されにくい。

【０００６】さらにこれらの固相抽出法は用手法であ
り、操作が煩雑であった。また処理能力にも限界があっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、ＬＣ法
によるホルモン様作用物質の測定は、測定精度に問題が
あった。また感度を向上させるための濃縮工程は、ホル
モン様作用物質を特異的に吸着する固相担体が必要であ
るが、これまで適当な素材が開示されておらず、また操
作が用手法のため、作業が煩雑であった。

【０００８】本発明は、上記の欠点を解決し、短時間に
大量の試料を自動処理できる濃縮工程を含む、ホルモン
様作用物質の測定方法及びその方法に用いる前処理カラ
ム用充填剤を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明（以
下、本発明１という）は、少なくとも、送液ポンプ、試
料導入装置、前処理カラム、分離カラム及び検出器より
構成される液体クロマトグラフィー装置を用いた、ホル
モン様作用物質の測定方法において、少なくとも、上記
前処理カラムに試料を１回以上注入し、試料中のホルモ
ン様作用物質を前処理カラムに吸着させる吸着工程、及
び該前処理カラムに吸着されたホルモン様作用物質を脱
着させて分離カラムに導入する工程を含むことを特徴と
するホルモン様作用物質の測定方法である。

【００１０】請求項２記載の発明（以下、本発明２とい
う）は、請求項１記載の測定方法における前処理カラム
に用いられる充填剤であって、（メタ）アクリル酸エス
テルである架橋性単量体を重合して得られる架橋重合体
よりなる、前処理カラム用充填剤である。

【００１１】以下、本発明１について説明する。

【００１２】本発明１における液体クロマトグラフィー
装置は、例えば図１に示すように、少なくとも、送液ポ
ンプ２、試料導入装置３、前処理カラム４、分離カラム
５及び検出器６より構成される。

【００１３】上記前処理カラム４は、図１のように、常
時、試料導入装置３及び分離カラム５と接続されていて
もよいし、また、図２または図３に示すように、流路上
に設けられた切替バルブ７の切替により試料導入装置３
及び分離カラム５と接続できるように構成されていても
よい。

【００１４】上記送液ポンプ２、試料導入装置３、検出
器６は、公知の装置が使用され得る。また公知のＬＣに
用いられる付属装置；例えば制御用コントローラ、カラ
ム恒温槽、脱気装置、グラディエンタなどを備えていて
もよい。これらの装置は、例えば図１〜３のように接続
することにより、ホルモン様作用物質の測定を行うこと
ができる。

【００１５】本発明１のホルモン様作用物質の測定方法
では、少なくとも上記前処理カラム用充填剤に、試料を
１回以上注入することで、該充填剤表面にホルモン様作
用物質が吸着される工程が含まれる。注入は、公知の試
料注入装置を用いて行うことができる。注入後、ホルモ
ン様作用物質以外の物質は、試料溶液とともに溶離液に
よって前処理カラムより排出される。この排出液は、前
処理カラムに接続された分離カラムを通して排出されて
もよいし、図２または図３のように切り替えバルブ７に
より流路外へ排出されてもよい。これらの作業はプログ
ラムにより自動化することも可能である。

【００１６】上記吸着を行う工程に用いられる溶離液
は、ホルモン様作用物質を含む試料が溶解し、かつホル
モン様作用物質が前処理カラム用充填剤に吸着される性
質を有していれば特に制限はなく、公知の溶離液組成物
が使用できる。例えば、水；リン酸、硝酸、塩酸、過塩
素酸などの無機酸またはこれらの塩類；コハク酸、マレ
イン酸、クエン酸、酢酸などの有機酸またはこれらの塩
類を含む緩衝液；メタノール、エタノール、イソプロパ
ノールなどのアルコール類；アセトニトリル、アセト
ン、ジオキサン、ジクロロメタン、ヘキサンなどの有機
溶媒；あるいはこれらの混合液が用いられる。また通常
溶離液に添加される物質；例えば塩酸、硝酸などの酸
類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基類；
塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなどの
塩類；アジ化ナトリウムなどの防腐剤などを添加しても
よい。これらは混合されて用いられてもよいし、複数の
溶離液を用いてもよい。

【００１７】本発明１のホルモン様作用物質の測定方法
では、上記吸着工程のほか、前処理カラムに吸着された
ホルモン様作用物質を脱着し、ホルモン様作用物質を分
離カラムへ導入する工程が含まれる。この脱着工程は、
前処理カラム用充填剤と、ホルモン様作用物質の相互作
用を切断し、ホルモン様作用物質は溶離液により分離カ
ラムへ運ばれる。この相互作用の切断は、例えば溶離液
を切り替えたり、前処理カラムの温度を変更することに
より行うことができる。溶離液の切り替えによる方法が
簡便で好ましい。脱着工程に用いられる溶離液は、ホル
モン様作用物質が脱着する組成であれば特に制限はな
く、上記の溶離液組成物の中などから適宜選択される。

【００１８】本発明１における液体クロマトグラフィー
装置を構成する分離カラムは、疎水性物質の分離を行う
ことができる公知の充填剤が充填されたカラムが用いら
れる。このような充填剤としては、オクチル基、オクタ
デシル基、フェニル基などの疎水性基を有する無機系あ
るいはアクリル酸エステル共重合体などからなる合成高
分子系充填剤などが挙げられる。

【００１９】本発明１におけるＬＣ装置の前処理カラム
に用いられる充填剤は、溶離液中においてホルモン様作
用物質を特異的に吸着し、かつ他の溶離液の条件下では
容易に脱着させることができる素材により構成される。
また充填剤自体からホルモン様作用物質の溶出がないも
のである。さらに一般の充填の特性；すなわち、溶離液
の変更による膨潤および収縮が少ないこと；機械的強度
が十分であること；非特異吸着が少ないこと；カラム寿
命が十分なこと、などの条件を備えている必要がある。

【００２０】上記前処理カラム用充填剤として最も好ま
しい例は、（メタ）アクリル酸エステルである架橋性単
量体を重合して得られる架橋重合体よりなる充填剤であ
る。

【００２１】上記充填剤を構成する（メタ）アクリル酸
エステルである架橋性単量体は、公知の単量体が用いら
れるが、例えば：エチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、
テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポ
リエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピ
レングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレン
グリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレング
リコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリ
コールジ（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、などのアルキレング
リコールジ（メタ）アクリレート類；トリメチロールエ
タントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパ
ントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパ
ントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタ
ントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタ
ンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトー
ルヘキサ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロ
パンテトラ（マタ）アクリレート；ヒドロキシピバリン
酸ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、
１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、
１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、
１，９−ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオ
ペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、２−ヒド
ロキシー１，３−ジ（メタ）アクリロキシプロパン、２
−ヒドロキシ−１アクリロキシー３−メタクリロキシプ
ロパン、ウレタン（メタ）ジアクリレート、グリセロー
ルジ（メタ）アクリレート、グリセロールアクリレート
メタクリレート、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−
４，７−ジオキサデカンー２，９−ジオール、１，１０
−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオ
キサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）
アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデガンー２，６，
１０−トリオールなどの（メタ）アクリル酸エステルの
架橋性単量体を好適に用いることができる。これらは２
種以上混合して用いてもよい。

【００２２】また上記の（メタ）アクリル酸エステルで
ある架橋性単量体の他に、非架橋性の（メタ）アクリル
酸エステルを添加してもよい。例えばメチル（メタ）ア
クリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル
（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、
ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）ア
クリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート類；ヒ
ドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチ
ル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコー
ル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコ
ール（メタ）アクリレート、などが挙げられる。またこ
れらは２種以上混合して用いてもよい。

【００２３】これらの非架橋性（メタ）アクリル酸エス
テルを用いる場合の使用量は、上記架橋性（メタ）アク
リル酸エステル１００重量部に対して０〜２０重量部で
ある。

【００２４】また、（メタ）アクリル酸エステル以外の
単量体を混合して用いてもよい。これらの単量体として
は、例えばトリアリルシアヌレート、トリアリルイソシ
アヌレートなどが挙げられる。

【００２５】（メタ）アクリル酸エステル以外の単量体
を用いる場合の使用量は、（メタ）アクリル酸エステル
単量体の全量１００重量部に対して０〜２０重量部であ
る。またこれらは２種以上混合して用いてもよい。

【００２６】本発明２の充填剤を構成する単量体は、
（メタ）アクリル酸エステル単量体のみで構成されるこ
とが好ましく、特に（メタ）アクリル酸エステルの架橋
性単量体のみで構成されることがより好ましく、その中
でもアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートのみ
で構成されることが最も好ましい。

【００２７】また以下の（１）〜（３）の単量体群は、
本発明２の充填剤を構成する素材として用いることは好
ましくない。

【００２８】（１）スチレン、α−メチルスチレン、ジ
ビニルベンゼンなどのスチレン系；エチレン、プロピレ
ンなどのオレフィン系単量体；ブタジエンなどのジエン
系単量体；フェノキシエチル（メタ）アクリレート、フ
ェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト、ジメチロールトリシクロデカンジ（メタ）アクリレ
ート等のアクリル酸エステルは用いない。これのベンゼ
ン環を有する単量体や直鎖、環状あるいは分岐脂肪族系
単量体は疎水性が強く、ホルモン様作用物質を吸着しや
すい。場合よっては不可逆的にこれらの物質を吸着して
しまうので、短時間測定が困難であったり、カラム寿命
が短くなったりする。さらにこれらの原材料中の不純物
質が溶出し、測定時に悪影響を及ぼす。

【００２９】（２）また（メタ）アクリル酸、イタコン
酸、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートな
どのイオン交換性の官能基を有する単量体も好ましくな
い。これらはイオン交換基は、充填剤とホルモン様作用
物質の相互作用を阻害する。

【００３０】（３）さらにホルモン様作用物質と類似の
構造を有する単量体；例えばビスフェノールＡ構造を有
する２，２−ビス｛４−［（メタ）アクリロキシエトキ
シ］フェニル｝プロパン、２，２−ビス｛４−［（メ
タ）アクリロキシ・ジエトキシ］フェニル｝プロパン、
２，２−ビス｛４−［（メタ）アクリロキシ・ポリエト
キシ］フェニル｝プロパン、ノニルフェノキシポリエチ
レングリコール（メタ）アクリレートなどは、ホルモン
様作用物質の混入が考えられるので使用しない。

【００３１】上記（１）および（２）については、場合
によっては、悪影響のでない範囲で添加することも可能
であるが、その添加量は、上記（メタ）アクリル酸エス
テル単量体１００重量部に対して０〜１０重量部であ
る。（３）は用いない。

【００３２】本発明２の充填剤は、上記単量体あるいは
単量体混合物が重合可能な公知の重合方法により調製す
ることができる。好ましくは分散媒中に単量体を分散さ
せ、重合開始剤存在下で重合する方法；例えば懸濁重合
法、分散重合法、乳化重合法、シード重合法など、重合
体が粒子形状で得られる方法が好ましい。特に懸濁重合
法が簡便で好ましい。懸濁重合法で行う場合は、例えば
ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンなどの分
散剤が溶解した水性分散媒に上記単量体を分散させ、重
合開始剤存在下で撹拌しながら昇温することにより、重
合反応を行うことができる。但し分散剤として界面活性
剤を使用することは好ましくない。残存する界面活性剤
は、充填剤として使用する際に溶出してくる可能性があ
るためである。さらに残存する界面活性剤は、充填剤と
ホルモン様作用物質との相互作用を阻害する。また製造
設備が複雑で重合効率が低く、重合後の溶出物発生が考
えられるエネルギー線重合などは好ましくない。

【００３３】重合時には、公知の添加剤を添加すること
もできる。例えば重合体を大孔径の多孔質体とするため
の多孔質化剤（相分離剤）、連鎖移動剤、ｐＨ調節剤な
どである。この内多孔質化剤は、イソアミルアルコール
やオクタノールなどのアルコール類やヘキサンなどの脂
肪族系炭化水素などが用いられるが、キシレンやトルエ
ンなどの芳香族系炭化水素およびカプリン酸メチル、ラ
ウリン酸メチル、アジピン酸ジイソブチルなどのアルキ
ルエステル類は好ましくない。これらもまた残存する
と、これら自体および混入物が測定時に溶出する可能性
がある。

【００３４】重合後、得られた架橋重合体を洗浄して乾
燥することにより本発明方法に用いられる前処理カラム
用充填剤が得られる。洗浄は、有機溶媒で複数回洗浄す
る必要がある。また好ましくは複数種の有機溶媒で複数
回洗浄する。洗浄に使用する有機溶媒は、用いた単量体
によっても異なるが、メタノール、エタノールなどのア
ルコール類；アセトン、ヘキサン、ジクロロエタンな
ど、ベンゼン環を含まない公知の有機溶媒が用いられ
る。

【００３５】本発明２の充填剤粒子の形状は、真球状あ
るいは略真球状の粒子が好ましい。またその細孔分布に
ついては特に制限はなく、使用環境下で形状が維持され
る強度を有する程度の多孔性であってもよいし、ミクロ
ポア構造であってもよい。

【００３６】また本発明２の充填剤は、粒子状である場
合、平均粒径が０．１μｍ〜１０００μｍであることが
好ましい。０．１μｍ以下では送液が難しく、１０００
μｍ以上では分離性能が低下する。これらの粒径範囲の
充填剤を得るため、必要に応じて上記架橋重合体を分級
してもよい。

【００３７】本発明で分離及び測定の対象となるホルモ
ン様作用物質とは、生物由来のホルモン類、および生体
内においてホルモン類似作用が報告されている物質また
はホルモン類似作用が疑われる物質であり、いわゆる内
分泌攪乱化学物質と呼ばれる物質を含む。例えば、ダイ
オキシン類；ポリ塩化ビフェニール類；４−ｔ−ブチル
フェノール、４−ｎ−ヘプチルフェノール、ノニルフェ
ノール、４−ｔ−オクチルフェノールなどのアルキルフ
ェノール類；ビスフェノールＡ；２，４−ジクロロフェ
ノール；フタル酸ジー２−エチルヘキシル、フタル酸ジ
−ｎ−ブチル、フタル酸ジエチルなどのフタル酸エステ
ル類；アジピン酸ジ−２−エチルヘキシル；ベンゾ
（ａ）ピレン、ベンゾフェノン、４−ニトロトルエン、
スチレン、スチレン２量体、スチレン３量体などの芳香
族化合物；エストラジオールなどのエストロジェン類；
などが挙げられる。その他、ホルモン様作用物質には、
第２６回日本環境化学会講演会予稿集（ｐ２〜３、１９
９８年）に記載があるような物質も含まれる。本発明
は、特にアルキルフェノール類、ビスフェノールＡ、フ
タル酸エステル類、ダイオキシン類、エストロジェン類
について好適に適用することが可能である。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３９】［実施例１］トリエチレングリコールジメ
タクリレート（新中村化学製）５００ｇに、過酸化ベン
ゾイル（重合開始剤：キシダ化学製）１．０ｇを溶解し
た。これを４％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍ
Ｌに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下で８０℃に昇
温した。８０℃で２４時間重合した後、内容物をイオン
交換水で３回、アセトンで１回、エタノールで４回洗浄
した。洗浄後乾燥して充填剤を得た。平均粒径は５．０
μｍであった。

【００４０】［実施例２］エチレングリコールジメタク
リレート（新中村化学製）４００ｇおよびテトラメチロ
ールメタントリアクリレート１００ｇの混合物に、過酸
化ベンゾイル（重合開始剤：キシダ化学製）１．０ｇを
溶解した。これを２％ポリビニルアルコール水溶液２５
００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下で８０
℃に昇温した。８０℃で２４時間重合した後、内容物を
イオン交換水で３回、アセトンで１回、エタノールで４
回洗浄した。洗浄後乾燥して充填剤を得た。平均粒径は
１０μｍであった。

【００４１】［実施例３］テトラエチレングリコールジ
メタクリレート（新中村化学製）４００ｇに、メチルメ
タクリレート１００ｇ、過酸化ベンゾイル（重合開始
剤：キシダ化学製）１．０ｇを溶解した。これを４％ポ
リビニルアルコール水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら
分散させ、窒素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で
２４時間重合した後、内容物をイオン交換水で３回、ア
セトンで１回、エタノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥
して充填剤を得た。平均粒径は３０μｍであった。

【００４２】［比較例１］スチレン（和光純薬製）２０
０ｇおよびジビニルベンゼン（キシダ化学製）２００ｇ
の混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：キシダ化
学製）１．０ｇを溶解した。これを４％ポリビニルアル
コール水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒
素雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で２４時間重合
した後、内容物をイオン交換水で３回、アセトンで１
回、エタノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥して充填剤
を得た。平均粒径は６．５μｍであった。

【００４３】［比較例２］２，２−ビス｛４−［（メ
タ）アクリロキシ・ジエトキシ］フェニル｝プロパン
（Ａ−ＢＰＥ−４：新中村化学製）５００ｇに、過酸化
ベンゾイル（重合開始剤：キシダ化学製）１．０ｇを溶
解した。これを４％ポリビニルアルコール水溶液２５０
０ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素雰囲気下で８０℃
に昇温した。８０℃で２４時間重合した後、内容物をイ
オン交換水で３回、アセトンで１回、エタノールで４回
洗浄した。洗浄後乾燥して充填剤を得た。平均粒径は３
０μｍであった。

【００４４】［比較例３］Ｎ−ビニルピロリドン（和光
純薬製）２００ｇおよびジビニルベンゼン３００ｇの混
合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤：キシダ化学
製）１．０ｇを溶解した。これを４％ポリビニルアルコ
ール水溶液２５００ｍＬに撹拌しながら分散させ、窒素
雰囲気下で８０℃に昇温した。８０℃で２４時間重合し
た後、内容物をイオン交換水で３回、アセトンで１回、
エタノールで４回洗浄した。洗浄後乾燥して充填剤を得
た。平均粒径は７．０μｍであった。

【００４５】［比較例４］ジビニルベンゼン（三共化成
製）１００ｇ、エチレングリコールジメタクリレート
（新中村化学製）１００ｇ、酢酸ブチル（和光純薬製）
２００ｇ、イソアミルアルコール（和光純薬製）５０ｇ
およびアゾビスイソブチロニトリル（重合開始剤：和光
純薬）の混合液を０．２重量％のメチルセルロール水溶
液１Ｌに懸濁し、撹拌しながら８０℃で６時間反応させ
た。洗浄後乾燥させて吸着剤を得た。平均粒径は７．０
μｍであった。

【００４６】［比較例５］アクリル酸ナトリウム（和光
純薬製）６０．４ｇ、メトキシポリエチレングリコール
アクリレート（共栄社化学製）３３９．６ｇ、ノナエチ
レングリコールジアクリレート１．８ｇをイオン交換水
５９３．０ｇに添加した。４０℃に昇温した後、１０重
量％の２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）塩
酸塩（重合開始剤：和光純薬製）水溶液５．２ｇを添加
した。その後温度を８０℃で１時間保ち反応を終了し
た。得られた重合体を粉砕し、乾燥して吸着剤を得た。
平均粒径は８．０μｍであった。

【００４７】［試験例１］上記実施例および比較例で調
製した前処理カラム用充填剤からの、ホルモン様作用物
質などの疎水性物質の溶出の有無を確認した。

【００４８】各充填剤１ｇをメタノール１０ｍＬに分散
させてよく撹拌した。この分散液を３０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した後上清を採取し、上清を遠心エバポ
レータで１ｍＬに濃縮した後、その１００μＬをＬＣに
注入することにより、充填剤から上清メタノール中に溶
出した疎水性物質を測定した。下記ＬＣ装置を用い、下
記測定条件にて測定を行った。得られたクロマトグラム
を図４〜６に示す。

【００４９】［ＨＰＬＣ装置］送液ポンプ：ＬＣー９Ａ（島津製作所）試料導入装置：ＡＳＵ−４２０（積水化学）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所）

【００５０】［ＨＰＬＣ測定条件］カラム：Wakosil Agri-9（和光純薬製：４．６×２５０ｍｍ）溶離液：Ａ液＝リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝７０／３０Ｂ液＝リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝２０／８０溶出条件：０〜１０分：Ａ液４０％からＢ液１００％へのリニアグラジエント１０〜１５分：Ｂ液１００％検出波長：２２５ｎｍ注入量：１００μＬ

【００５１】図４は、ビスフェノールＡ（ＢＰＡ：ピー
ク１１）およびノニルフェノール（ＮＰ：ピーク１２）
の標準品（いずれも和光純薬製）、図５は、実施例１の
充填剤からの溶出物を測定した結果である。図５では、
ＢＰＡおよびＮＰの溶出位置にピークが確認されず、実
施例１からの溶出は確認されなかった。実施例２および
３の充填剤も同様の結果であった。

【００５２】一方比較例１の充填剤からの溶出物を測定
した結果を図６に示す。ＢＰＡおよびＮＰの溶出位置に
ピークが確認されただけでなく、その他にも多くの疎水
性物質の溶出が確認された。また比較例２〜５の吸着剤
からの溶出物を測定した結果も図６と同様に疎水性物質
が多く溶出した。特に比較例２の充填剤からは、ＢＰＡ
溶出位置に大きなピークが出現した。これは比較例２で
用いた単量体（Ａ−ＢＰＥ−４）がＢＰＡ構造を含むた
め、ＢＰＡあるいはＢＰＡ類似構造の不純物が多く含ま
れ、溶出してきたものと思われる。これらのピークは充
填剤を繰り返し洗浄しても消去できなかった。

【００５３】以上から、実施例１〜３で得られた本発明
の充填剤は、充填剤自体からのホルモン類作用物質など
の疎水性物質溶出がほとんどないので、ホルモン様作用
物質の測定に有効である。一方従来技術により調製した
比較例１〜５の充填剤は、ホルモン様作用物質などの疎
水性溶出物が多く、ホルモン様作用物質の測定には使用
できない。

【００５４】［試験例２］上記実施例および比較例で調
製した前処理カラム用充填剤における、ホルモン様作用
物質の吸着性能を確認した。

【００５５】まず実施例１の充填剤を用いて、ＢＰＡの
吸着性能を確認した。ＢＰＡ標準原液（和光純薬製）か
らＢＰＡ１００ｎｇ／ｍＬの１０％ＭｅＯＨ水溶液を
調製し、これに実施例１の充填剤０. １ｇを分散させ、
よく撹拌した。得られた分散液を３０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離した後上清を採取し、上清を遠心エバポレ
ータで蒸発乾固させた後、ＥＬＩＳＡ用リン酸緩衝液に
溶解して、ＥＬＩＳＡ系で測定を行った。

【００５６】ＥＬＩＳＡ系での分析は、以下の手法で行
った。抗ＢＰＡ抗体固相化プレートに検体５０μＬを添
加し、さらにＨＲＰ（horse radish peroxidase ）標識
ＢＰＡ５０μＬを添加して室温で２時間反応させた。プ
レートを洗浄した後、ｏ−フェニルジアミン（ＯＰＤ）
を添加して１５分反応させ、４９２ｎｍで吸光度を測定
した。

【００５７】充填剤を用いずに同様の操作を行った場合
の上清中のＢＰＡ量を１００とした場合の相対比較によ
り吸着率を求めた。その結果を、１００％のＢＰＡが吸
着された。

【００５８】その他のホルモン様作用物質についても同
様に測定を行ったところ、表１に示すようにＢＰＡと同
様にその９９％以上が吸着された。また実施例２および
３において調製された充填剤においても、実施例１の充
填剤と同様に良好な除去率を示した。

【００５９】一方比較例１では、ＢＰＡの吸着率が１５
０％以上となった。これは充填剤自体からの溶出のため
と考えられる。一方その他の物質に対しては、いずれも
７０％以下と吸着率が極めて低かった。比較例２〜５の
高分子担体の場合も同様の結果であった。

【００６０】

【表１】

【００６１】［試験例３］吸着・脱着を繰り返し行った
際の吸着能の変化を確認した。実施例１で得られた充填
剤０．１ｇを、容量３ｍＬのカラム（ポリプロピレン
製）に充填した。これにＢＰＡ標準液（１００ｎｇ／ｍ
Ｌの１０％ＭｅＯＨ水溶液）を添加した。カラムからの
流出液を、上記試験例２と同様にしてＥＬＩＳＡ法によ
りＢＰＡを測定した。

【００６２】さらにカラムにメタノール５ｍＬを通液し
（脱着処理）、脱着液を回収した。その後再び、ＢＰＡ
標準液を添加し、同様に脱着液中のＢＰＡを測定した。
これらの操作を繰り返し、吸着能を測定した。

【００６３】結果を表２に示す。吸着能は変化せず、メ
タノールによる簡便な脱着処理により、初期と変わらな
い吸着能が得られので、繰り返し使用できることがわか
った。実施例３の充填剤の場合も同様であった。また他
のホルモン様作用物質についても同様の結果であった。

【００６４】一方比較例１では、吸着能が初期値より大
きく低下し、再使用はできないと考えられる。また比較
例２〜４の充填剤も同様の結果であった。

【００６５】比較例５では、使用初期の吸着能は、他の
比較例に比べて良好であったが、繰り返し使用により急
激に吸着能が低下した。

【００６６】

【表２】

【００６７】［試験例４］実施例および比較例で得られ
た前処理カラム用充填剤をカラムに充填し、ホルモン様
作用物質の測定を行った。

【００６８】充填剤０．６ｇをアセトニトリル３０ｍＬ
に分散させ、５分間超音波処理した後、充填用パッカー
（梅谷精機製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サ
ヌキ工業製）を接続し、３００ｋｇで加圧して、内径
４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填
した。

【００６９】以下の各装置を図３のように接続した。試
料を前処理カラムに注入し、この吸着工程の排出液は、
排出口８より排出した。この後、バルブ７を分離カラム
５側に切り替えて、かつ溶離液をＢ液に切り替え前処理
カラムに吸着された目的物質を分離カラムに導き分析を
行った。

【００７０】送液ポンプ：ＬＣー９Ａ（島津製作所）試料導入装置：ＡＳＵ−４２０（積水化学）検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所）分離カラム：Wakosil Agri-9（和光純薬製：４．６×
２５０ｍｍ）

【００７１】また、溶離条件を以下に示す。溶離液：Ａ液＝リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）Ｂ液＝リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：メタノール＝２０／８０検出波長：２２５ｎｍ試料濃度：１ｐｇ／ｍＬ注入量：１００μＬ

【００７２】実施例１の充填剤を用い、ＢＰＡおよびＮ
Ａを測定して得られたクロマトグラムを図７、フタル酸
エステル類を測定した例を図８に示す。いずれも短時間
に良好な分離を示した。また実施例２および３の充填剤
を用いた場合も実施例１と同様に良好な分離を示した。

【００７３】比較例１の充填剤を用いて同様の測定を行
った例を図９（ＢＰＡとＮＰ）および図１０（フタル酸
エステル類）に示す。図７および図８に比べ、測定時間
が長いにも関わらず分離性能は悪い。比較例２〜４の充
填剤も同様であった。比較例５の充填剤は、架橋度が低
く機械的強度が小さいため、充填剤粒子が破損し充填で
きなかった。

【００７４】

【発明の効果】本発明のホルモン様作用物質の測定方法
は、微量のホルモン様作用物質を前処理カラム内に吸着
・濃縮させることで、測定感度を向上させ、短時間で簡
便にホルモン様作用物質を測定でき、大量検体の処理に
容易に対応できる。また本発明の前処理カラム用充填剤
は、構成する単量体の全てあるいはほとんどが架橋性単
量体であり、高架橋度の重合体であるため、機械的強度
が大きく、高圧下の流路系に接続できる。これにより前
処理の自動化ができ、測定が短時間で行うことができ
る。さらに、充填剤自体から不要の溶出物が少なく測定
に悪影響を与えない。従って低濃度のホルモン様作用物
質を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における液体クロマトグラフィー装置の
一実施例を表わした図(1) 。

【図２】本発明における液体クロマトグラフィー装置の
一実施例を表わした図(2) 。

【図３】本発明における液体クロマトグラフィー装置の
一実施例を表わした図(3) 。

【図４】ＢＰＡ及びＮＰの標準品の溶出測定の結果を
示す図。

【図５】実施例１の充填剤からの溶出物を測定した結
果を示す図。

【図６】比較例１の充填剤からの溶出物を測定した結
果を示す図。

【図７】実施例１の充填剤を用いた場合の、ＢＰＡ及
びＮＰの測定結果を示す図。

【図８】実施例１の充填剤を用いた場合の、フタル酸
エステル類の測定結果を示す図。

【図９】比較例１の充填剤を用いた場合の、ＢＰＡ及
びＮＰの測定結果を示す図。

【図１０】比較例１の充填剤を用いた場合の、フタル
酸エステル類の測定結果を示す図。

【符号の説明】

１溶離液２溶離液送液ポンプ３試料導入装置４前処理カラム５分離カラム６検出器７切替バルブ８排出口１１ビスフェノールＡのピーク１２ノニルフェノールのピーク１３フタル酸ジエチルのピーク１４フタル酸ジ−ｎ−ブチルのピーク１５フタル酸ジ−ｎ−ヘキシルのピーク１６フタル酸ジ−２−エチルヘキシルのピーク

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも、送液ポンプ、試料導入装置、
前処理カラム、分離カラム及び検出器より構成される液
体クロマトグラフィー装置を用いた、ホルモン様作用物
質の測定方法において、少なくとも、上記前処理カラムに試料を１回以上注入
し、試料中のホルモン様作用物質を前処理カラムに吸着
させる吸着工程、及び該前処理カラムに吸着されたホルモン様作用物質を
脱着させて分離カラムに導入する工程を含むことを特徴
とするホルモン様作用物質の測定方法。
【請求項２】請求項１記載の測定方法における前処理カ
ラムに用いられる充填剤であって、（メタ）アクリル酸
エステルである架橋性単量体を重合して得られる架橋重
合体よりなる、前処理カラム用充填剤。