JP2001174463A - 自己免疫疾患又は腫瘍の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】簡便であり、かつより高い信頼度で自己免疫疾
患の徴候を検出しうる、自己免疫疾患の診断方法及び抗
ＣＣＴ自己抗体価測定用キット並びに簡便に、かつより
高い信頼度で腫瘍の診断を行なうことが可能な腫瘍の診
断方法及びＣＣＴ測定用キットを提供すること。 【解決手段】被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価を測定す
ることを特徴とする、自己免疫疾患の診断方法、哺乳類
動物のＣＣＴ抗原タンパク質を含有してなる、前記診断
方法に用いるための抗ＣＣＴ自己抗体価測定用キット、
被検試料中のＣＣＴ量を測定することを特徴とする、腫
瘍の診断方法、及び抗ＣＣＴ抗体を含有してなる、前記
診断方法に用いるためのＣＣＴ測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、自己免疫疾患の診
断方法、抗ＣＣＴ自己抗体価測定用キット、腫瘍の診断
方法及びＣＣＴ測定用キットに関する。さらに詳しく
は、簡便であり、かつより信頼度の高い診断を可能にす
る、自己免疫疾患の診断方法、抗ＣＣＴ自己抗体価測定
用キット、腫瘍の診断方法及びＣＣＴ測定用キットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】熱ショックタンパク質（以下、ＨＳＰと
いう）は、分子シャペロンとして、重要な役割を果た
す。前記ＨＳＰは、原核生物から真核生物まで保存され
ている。サブユニットの分子量が約６０ｋＤａであるＨ
ＳＰ６０ファミリータンパク質は、新規に合成され、変
性されたタンパク質のフォールディングを介助する。前
記ＨＳＰ６０ファミリー（シャペロニンファミリーとも
いう）は、アミノ酸配列における相同性を基に、２つの
群にさらに分類されうる。具体的には、ミトコンドリア
のＨＳＰ６０、マイコバクテリアのＨＳＰ６５、大腸菌
ＧｒｏＥＬ、プラスチドのリブロース−１，５−ビスホ
スフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕ
ｂｉｓｃｏ）サブユニット結合タンパク質は、グループ
Ｉに分類され、真核生物の細胞質シャペロニンＣＣＴ及
び古細菌のシャペロニンは、グループＩＩに分類され
る。

【０００３】例えば、ミトコンドリアＨＳＰ６０、大腸
菌ＧｒｏＥＬ及びマイコバクテリアＨＳＰ６５を含むグ
ループＩのシャペロニンとＣＣＴとは、わずかなアミノ
酸同一性しか示さないという特徴を有する。

【０００４】前記マイコバクテリアＨＳＰ６５は、しば
しば、リウマチ性疾患との関連性が議論されており、マ
イコバクテリアＨＳＰ６５に応答するＴ細胞は、リウマ
チ性疾患の発生に関与するものと考えられている。さら
に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者は、健常者対照より
も、より高いマイコバクテリアＨＳＰ６５に対するＩｇ
Ｇ及びＩｇＡレベルを有することが報告されている。最
近、マイコバクテリアＨＳＰ６５に比べて大腸菌Ｇｒｏ
ＥＬに対する高い抗体価がＲＡ患者の血清と健常成人の
血清とに見出されている。また、ミトコンドリアＨＳＰ
６０と、マイコバクテリアＨＳＰ６５及び大腸菌Ｇｒｏ
ＥＬとは、互いに約５０〜６０％の高いアミノ酸同一性
を示すため、ミトコンドリアＨＳＰ６０に対する自己抗
体は、マイコバクテリアＨＳＰ６５及び大腸菌ＧｒｏＥ
Ｌに対する分子模倣機構により生じることが考えられて
いる。

【０００５】マイコバクテリアＨＳＰ６５、大腸菌Ｇｒ
ｏＥＬ又はミトコンドリアＨＳＰ６０に対する自己抗体
の検出によるリウマチ性疾患の診断が試みられている
が、その有用性、即ち健常者と患者との間の抗体価の差
は、報告ごとにばらつきがあり、必ずしも定説として認
められてはいない。これは、特に細菌のＨＳＰ６０ファ
ミリータンパク質には自己抗原として働く抗原決定基だ
けでなく、外来抗原として認識される抗原決定基も存在
することがその大きな一因と考えられる。

【０００６】また、これまで、前記細胞質シャペロニン
ＣＣＴの発現制御に関する報告は、ほとんどなく、疾病
との関連などの臨床的知見は、全くなかったといってよ
いのが現状である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便であ
り、かつより高い信頼度で自己免疫疾患の徴候を検出し
うる、自己免疫疾患の診断方法及び抗ＣＣＴ自己抗体価
測定用キットならびに簡便に、かつより高い信頼度で腫
瘍の診断を行なうことが可能な腫瘍の診断方法及びＣＣ
Ｔ測定用キットを提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価を測定するこ
とを特徴とする、自己免疫疾患の診断方法、〔２〕 哺
乳類動物のＣＣＴ抗原タンパク質を含有してなる、前記
〔１〕記載の診断方法に用いるための抗ＣＣＴ自己抗体
価測定用キット、〔３〕 被検試料中のＣＣＴ量を測定
することを特徴とする、腫瘍の診断方法、及び〔４〕
抗ＣＣＴ抗体を含有してなる、前記〔３〕記載の診断方
法に用いるためのＣＣＴ測定用キット、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の自己免疫疾患の診断方法
は、該被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価を測定すること
を１つの大きな特徴とする。本発明は、自己免疫疾患患
者の血清中のＣＣＴに反応する抗体価（以下、抗ＣＣＴ
自己抗体価という）が、健常者対照の血清中の抗ＣＣＴ
自己抗体価と比較して有意に高く、かつマイコバクテリ
アＨＳＰ６５、大腸菌ＧｒｏＥＬ又はミトコンドリアＨ
ＳＰ６０に対する抗ＣＣＴ自己抗体価と比較して、さら
に優先的に患者中で上昇するという本発明者らの知見に
基づく。かかる知見は、ＣＣＴが、ミトコンドリアＨＳ
Ｐ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬ及びマイコバクテリアＨＳＰ
６５を含むグループＩのシャペロニンとわずかなアミノ
酸同一性しか示さないため、かかるＣＣＴとリウマチ性
疾患などの自己免疫疾患との関連性は対照とされておら
ず、予想外のことである。

【００１０】また、本発明者らは、抗ＣＣＴ自己抗体
が、グループＩの前記３種のタンパク質と交差反応し、
ＣＣＴと他のＨＳＰ６０ファミリータンパク質とにより
共有される１若しくは複数のエピトープを認識するとい
う予想外の性質を有することを明らかにしている。

【００１１】本発明の自己免疫疾患の診断方法は、健常
者対照における場合と比較して力価が有意に高く、優先
的に患者中で上昇する抗ＣＣＴ自己抗体価を測定するた
め、より高い信頼度で自己免疫疾患の徴候を検出しうる
という優れた効果を発揮する。

【００１２】ＣＣＴは、細胞質タンパク質のフォールデ
ィングを介助するヘテロオリゴマーの分子シャペロンと
して機能し、ＡＴＰの存在下にアクチン及びチューブリ
ンなどの細胞質タンパク質のフォールディングを容易に
するタンパク質である。前記ＣＣＴは、８種のサブユニ
ット、α、β、γ、δ、ε、ζ−１（精巣中のζ−２を
含む）、η及びθを含有しており、該サブユニットは、
ＧｒｏＥＬの１４量体複合体と同様に１６量体複合体に
会合する。前記サブユニットは、互いに約３０％のアミ
ノ酸配列の同一性を示す。

【００１３】ミトコンドリアＨＳＰ６０と大腸菌Ｇｒｏ
ＥＬとの間のアミノ酸同一性は約５０％であり、一方、
ＣＣＴとＨＳＰ６０（又はＧｒｏＥＬ、ＨＳＰ６５）と
の間の同一性はわずか１５〜２０％にすぎないが、血清
吸収実験及び抗体価の相関のデータより、ほとんどの抗
ＣＣＴ自己抗体がＣＣＴとミトコンドリアＨＳＰ６０の
両方を認識し、ＧｒｏＥＬとＨＳＰ６５とに対しても交
差反応することが示唆されるため、前記抗ＣＣＴ自己抗
体の１若しくは複数のエピトープは、恐らく保存されて
局在するか、あるいはアミノ酸配列又は立体構造を保存
すると考えられる。

【００１４】ＣＣＴとＨＳＰ６０との両方に交差反応す
る自己抗体の有意に高い抗体価が健常成人の血清に比べ
てリウマチ性自己免疫疾患の血清で見られることが示唆
される。また、主に細胞質に局在するＣＣＴは、自己抗
体に反応する他のＨＳＰ６０ファミリータンパク質であ
ると考える。ＣＣＴは、全てのタイプの細胞で発現さ
れ、増殖期の細胞において、豊富に発現される必須な細
胞質タンパク質の１つである。リウマチ性疾患進行中の
関節破壊は、ＣＣＴを含む細胞質タンパク質の血液流へ
の漏れを引き起こすと考えられる。抗ＣＣＴ自己抗体と
抗原抗体複合体を形成し、全身性エリテマトーデスにお
けるループス腎炎などのより厳しい疾患状態、及び上皮
細胞傷害を引き起こすと考えられる。

【００１５】本発明の診断方法を適用しうる自己免疫疾
患としては、リウマチ性疾患に分類される疾患であれば
よく、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シ
ェーグレン症候群、混合性結合組織病、強皮症、皮膚筋
炎、リウマチ熱、結節性多発動脈炎、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉
芽腫症、ベーチェット病などが挙げられる。本発明の自
己免疫疾患の診断方法は、慢性関節リウマチ、全身性エ
リテマトーデス、シェーグレン症候群及び混合性結合組
織病の診断に好適である。

【００１６】被検試料としては、血液、血清、滑膜液な
どが挙げられる。前記被検試料の由来は、特に限定され
るものではなく、例えば、動物、具体的には、哺乳類動
物、特にヒトなどが挙げられる。例えば、被検物質が血
液である場合、通常の採血手法により該血液を採取する
ことができる。

【００１７】被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価は、ＣＣ
Ｔ抗原タンパク質と被検試料とを接触させて、抗原抗体
反応を検出及び／又は定量することにより測定されう
る。

【００１８】抗原抗体反応の検出及び／又は定量は、特
に限定されないが、標識されたＣＣＴ抗原タンパク質を
用いて、例えば、エンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝
集法などの慣用の方法により行なうことができる。かか
る方法においては、「免疫生化学研究法」〔東京化学同
人、（１９８６）〕、「単クローン抗体−ハイブリドー
マとＥＬＩＳＡ−」〔講談社、（１９８３）〕などを参
照することができる。本発明においては、操作の簡便性
及び安全性の観点から、ＥＬＩＳＡが望ましい。

【００１９】ＥＬＩＳＡによる抗原抗体反応の検出及び
／又は定量は、例えば、下記のように検出及び／又は定
量を行なうことができる。すなわち、慣用のＥＬＩＳＡ
の手法に従い、例えば、ＣＣＴ抗原タンパク質で被覆し
たマルチウェルプレートの各ウェルに被検物質の希釈物
を供し、各ウェルに酵素標識した２次抗体を添加して反
応させ、酵素基質を添加した後、該酵素により生じた産
物を検出及び／又は定量することにより、抗原抗体反応
の検出及び／又は定量を行なう。

【００２０】前記ＥＬＩＳＡの場合、標識に用いられる
酵素としては、通常、ＥＬＩＳＡに用いられる慣用の酵
素であればよく、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、β−
Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられる。より高感度で
安定な検出を達成することが可能である観点から、ペル
オキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが望ましい。
また、酵素基質は、用いる酵素により適宜選択すること
ができ、例えば、ペルオキシダーゼの場合、３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジンなどが用いられ、ア
ルカリホスファターゼの場合、パラニトロフェニルリン
酸ナトリウムなどが用いられる。

【００２１】酵素により生じた産物の検出及び／又は定
量は、該産物の吸光度を測定することにより行なうこと
ができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合、４５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定すればよい。

【００２２】本発明の自己免疫疾患の診断方法において
は、健常者対照の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価と被
検体の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価とを比較し、健
常者対照の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価よりも被検
体の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価が高い場合を自己
免疫疾患陽性の指標とする。

【００２３】さらに、本発明の自己免疫疾患の診断方法
においては、健常者対照の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗
体価と被検体の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価との間
の有意差がｐ＜０．０５、好ましくはｐ＜０．０１であ
ることがより望ましい指標である。

【００２４】本発明の抗ＣＣＴ自己抗体価測定キット
は、本発明の自己免疫疾患の診断方法に好適である。か
かる抗ＣＣＴ自己抗体価測定キットは、哺乳類動物のＣ
ＣＴ抗原タンパク質を含有する。

【００２５】哺乳類動物のＣＣＴ抗原タンパク質は、例
えば、ガオら[Gao,Y., et al., Cell 69, 1043-1050 (1
992)] 、フリードマンら[Frydman, J., et al., EMBO
J., 11, 4767-4778 (1992)]及びノーカム[Norcum, M.
T., Prot. Sci. 5, 1366-1375(1996)] に記載の方法の
組み合わせにより、後述の実施例２に従って製造するこ
とができる。

【００２６】例えば、ヒトのＣＣＴ抗原タンパク質は、
以下に示すように調製することができる。

【００２７】ＢＡＬＬ−１細胞を凍結融解することによ
り、細胞抽出物を調製する。得られた細胞抽出液を緩衝
液Ａ（５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％グリセロール、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．６）で平衡化された
Ｑ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテッ
ク社製）カラムに供し、ついで０．１〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌのリニアグラジェントにより溶出する。抗ＣＣＴ抗
体を用いたウエスタンブロッティングによりＣＣＴ画分
を決定し、ＣＣＴピーク画分をプールする。なお、ウエ
スタンブロッティングは、モレキュラークローニング：
ア・ラボラトリーマニュアル第２版[ザンブルーク(Samb
rook)ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Se
condeds.,(1980)]などに記載の慣用の条件により行なう
ことができる。得られた画分を前記緩衝液Ａで平衡化さ
れたヘパリン−セファロース（アマシャム ファルマシ
ア バイオテック社製）カラムに供し、ついで０．１〜
０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出す
る。抗ＣＣＴ抗体を用いたウエスタンブロッティングに
よりＣＣＴ画分を決定し、ＣＣＴピーク画分をプールす
る。得られた画分を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含んだ１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡化された
セファクリル Ｓ−４００（アマシャムファルマシア社
製）カラムに供する。抗ＣＣＴ抗体を用いたウエスタン
ブロッティングによりＣＣＴ画分を決定し、ＣＣＴピー
ク画分をプールし、ヒトＣＣＴ標品が得られる。なお、
本発明者らは、特に腫瘍組織において、前記ＣＣＴの発
現亢進が認められることを見出している。したがって、
この知見により、後述の腫瘍の診断方法をも提供されう
る。

【００２８】なお、抗ＣＣＴ抗体は、いずれのサブユニ
ットに対する抗体でも使用可能である。細胞や生体試料
からの精製ＣＣＴ、大腸菌組換えＣＣＴサブユニットタ
ンパク質もしくは部分タンパク質、化学合成ペプチドな
どを抗原としてマウス、ラット、ウサギ、ヤギなどに免
疫し、血清からはポリクローナル抗体、脾細胞などの抗
体産生細胞を細胞融合法などで得た細胞からモノクロー
ナル抗体を調製することにより得ることができる。

【００２９】本発明の抗ＣＣＴ自己抗体価測定用キット
は、前記哺乳類動物のＣＣＴ抗原タンパク質に加え、抗
原抗体反応の検出及び／又は定量に必要な試薬などを適
宜含有してもよい。

【００３０】さらに、本発明者らは、特に腫瘍組織にお
いて、前記ＣＣＴの発現量の亢進が認められることを見
出しており、これにより腫瘍の診断方法をも提供するこ
とができる。かかる腫瘍の診断方法も本発明の範囲に含
まれる。これまで、細胞質シャペロニンＣＣＴの発現制
御に関する報告はほとんどなく、疾病との関連などの臨
床的知見は、全くなかったといってよい。本発明は、Ｃ
ＣＴの細胞内発現量が細胞の増殖速度と高い正の相関を
示すことが見出され、それにより、この現象について細
胞増殖がその疾病の第１要因となっている腫瘍性疾患、
具体的には癌のマーカーとしての応用、とりわけ悪性度
の高さの１つの要素である高増殖性のマーカーとしての
応用への可能性を示したことに基づく。

【００３１】本発明の腫瘍の診断方法は、被検試料中の
ＣＣＴ量を測定することを１つの特徴とする。本発明の
腫瘍の診断方法によれば、ＣＣＴの発現量を診断の指標
とするため、より簡便に、かつより信頼度の高い診断を
可能にする。

【００３２】被検試料中のＣＣＴ量は、ＣＣＴに対する
抗体（抗ＣＣＴ抗体）を用いた方法、ＣＣＴをコードす
る核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし
うるオリゴヌクレオチドを用いた方法などにより、測定
することができる。

【００３３】前記抗ＣＣＴ抗体を用いた方法としては、
例えば、ウエスタンブロッティング、エンザイムイムノ
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、ドットブロッティング、ラテックス凝集法などが
挙げられる。

【００３４】例えば、ウエスタンブロッティングによ
り、ＣＣＴ量を測定する場合、下記のように測定するこ
とができる。すなわち、被検体の腫瘍化部と非腫瘍化部
のそれぞれの試料をホモジナイズし、得られた試料につ
いて、慣用の条件により、抗ＣＣＴ抗体を用いてウエス
タンブロッティングを行ない、バンドの濃度を基に、総
タンパク質量に対するＣＣＴの量を算出する。

【００３５】本発明の腫瘍の診断方法においては、非腫
瘍化部におけるＣＣＴ量を対照として用い、該非腫瘍化
部におけるＣＣＴ量に比べ、被検試料中のＣＣＴ量が有
意に上昇している場合を腫瘍陽性の指標とする。

【００３６】この場合、被検試料中の非腫瘍化部におけ
るＣＣＴ量と腫瘍化部のＣＣＴ量との有意差がｐ＜０．
０５、好ましくはｐ＜０．０１であることがより望まし
い指標となりうる。

【００３７】本発明のＣＣＴ測定用キットは、前記腫瘍
の診断方法に好適である。かかるＣＣＴ測定用キットと
しては、抗ＣＣＴ抗体を含有したキット、ＣＣＴをコー
ドする核酸（配列番号：１）にストリンジェントな条件
下にハイブリダイズしうる少なくとも１種のオリゴヌク
レオチドを含有したキットなどが挙げられる。

【００３８】

【実施例】実施例１ 血清 血清は、「免疫生化学研究法」（東京化学同人）１９８
６年に記載の方法に従い、慢性関節リウマチ（ＲＡ）を
罹患した２５患者、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
を罹患した２５患者、シェーグレン症候群（ＳＳ）を罹
患した９患者、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）を罹患し
た１５患者及び２５人の健常者対照から得た。診断は、
ＲＡ、ＳＬＥ、ＳＳ、及びＭＣＴＤの診断基準〔Arnet
t, F. C.,et al., Arthritis Rheum 31, 315-324 (198
8) 、Tan, E. M., et al., Arthritis Rheum 25, 1271
-1277 (1982) 、Vitali, C., et al., Arthritis Rheum
36, 340-347 (1993)、Kasukawa, R., et al., "Mixed
connective tissue diseaseand anti-nuclear antibodi
es", 41-47, Elsevier (1987) 〕に基づいた。

【００３９】実施例２ 抗原 ガオら[Gao,Y., et al., Cell 69, 1043-1050 (1992)]
、フリードマンら[Frydman, J., et al., EMBO J., 1
1, 4767-4778 (1992)]及びノーカム[Norcum, M.T., Pro
t. Sci. 5, 1366-1375 (1996)] に記載の方法の組み合
わせによりヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１細胞か
らＣＣＴを調製した。以下にＣＣＴの調製の概略を示
す。

【００４０】ＢＡＬＬ−１細胞を凍結融解することによ
り、細胞抽出物を調製した。得られた細胞抽出液を緩衝
液Ａ（５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％グリセロール、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．６）で平衡化された
Ｑ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテッ
ク社製）カラムに供し、ついで０．１〜０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌのリニアグラジェントにより溶出した。ラット抗Ｃ
ＣＴαモノクローナル抗体８４ａ（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ
社製) を用いたウエスタンブロッティングによりＣＣＴ
画分を決定し、ＣＣＴピーク画分をプールした。なお、
ウエスタンブロッティングは、前記モレキュラークロー
ニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版などに記載
の慣用の条件により行なった。

【００４１】得られた画分を前記緩衝液Ａで平衡化され
たヘパリン−セファロース（アマシャム ファルマシア
バイオテック社製）カラムに供し、ついで０．１〜
０．５Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出し
た。抗ＣＣＴα抗体８４ａを用いたウエスタンブロッテ
ィングによりＣＣＴ画分を決定し、ＣＣＴピーク画分を
プールした。

【００４２】得られた画分を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含
んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で平衡
化されたセファクリル Ｓ−４００（アマシャムファル
マシア社製）カラムに供した。抗ＣＣＴα抗体８４ａを
用いたウエスタンブロッティングによりＣＣＴ画分を決
定し、ＣＣＴピーク画分をプールした。その結果、２０
ｇの全可溶性タンパク質から約１０ｍｇのヒトＣＣＴ標
品が得られた。

【００４３】なお、ウエスタンブロッティングは、クボ
タら[Kubota, H., et al., Eur. J.Biochem. 262, 492-
500 (1999)]に記載の方法に従って行なった。

【００４４】ついで、得られたヒトＣＣＴ標品を、３〜
１０％リニアグラジェントポリアクリルアミドゲルでの
ネイティブＰＡＧＥ又は１０〜２０％リニアグラジェン
トポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た。クボタら[Kubota, H., et al., Eur. J. Biochem.
262, 492-500 (1999)]に記載のように、イムノブロッテ
ィングを行なった。すなわち、ゲル上のタンパク質をポ
リビニリデンジフロリドフィルターに転写し、ついで該
フィルターを５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキ
ングした。フィルターとヒト血清とのインキュベーショ
ンの後、５％スキムミルクを含むＰＢＳＴで１００倍に
希釈し、二次抗体及び基質として、アルカリホスファタ
ーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（Ｂ
ｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）
と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
トテトラゾリウム／ニトロブルーテトラゾリウム溶液と
を用いて特異的結合を視覚化した。

【００４５】図１に示すように、ヒトＣＣＴ標品は、ネ
イティブＰＡＧＥにより約９００ｋＤａの単一バンドを
示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは５９〜６５ｋＤａの複数の
バンドのクラスターとして示された。図１の結果より、
ＣＣＴは、約６０ｋＤａの８種のサブユニットの１６量
体複合体であることが示唆された。また、前記ＣＣＴ標
品の泳動パターンは、クボタら[Kubota, H., et al., C
urr. Biol., 4, 89-99(1994)]、ガオら[Gao, Y., Cell
69, 1043-1050 (1992)]、Frydman, J., EMBOJ. 11, 476
7-4778 (1992)]及びノーカム[Norcum, M. T., EMBO J.
11, 4767-4778 (1992)] に記載されたものと同様であっ
た。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によ
り、他のバンドは観察されなかった。

【００４６】さらに、ＨＳＰ６０特異的モノクローナル
抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ミトコ
ンドリアＨＳＰ６０の混入は検出されなかった。

【００４７】ヒトミトコンドリアＨＳＰ６０、大腸菌Ｇ
ｒｏＥＬ、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ ＨＳＰ６５及び
ヒトＨＳＰ７０は、それぞれＳｔｒｅｓｓＧｅｎ社より
購入した。

【００４８】実施例３ 被検試料における抗体価の評価 （１）ＥＬＩＳＡ 実施例２に記載の抗原を１μｇ／ｍｌの濃度で５０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈し、９６
ウェルマルチプレートに分注した。４℃で一晩インキュ
ベートした後、ウェルを２％ヒト血清アルブミンで３７
℃で２時間ブロックした。ヒト血清を０．０５％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝化生理食塩水（以下、Ｐ
ＢＳＴという）で１０００倍に希釈した。得られた希釈
物を抗原被覆プレートに供した後、３７℃で９０分間イ
ンキュベートした。各ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、
３０，０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結
合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ特異的）抗体（ＢｉｏＳｏ
ｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）をウェル
に分注し、３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢ
ＳＴで洗浄した後、特異的結合を、基質として３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（ＫＰＬ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社製）で検出し
た。１Ｍ リン酸の添加により反応を停止した後、４５
０ｎｍにおける吸収を測定した。得られた測定値を抗体
価とした。

【００４９】（２）統計学的分析 Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、２つのグループ間の
抗体価を比較した。Ｓｐｅａｒｍａｎのランク相関検定
により、２つの抗原に対する抗体のレベルの相関を算出
した。

【００５０】（３）結果 （ｉ）自己免疫疾患患者の血清中におけるＨＳＰ６０フ
ァミリータンパク質に対する抗体価の評価 ＥＬＩＳＡ解析において、１０００倍希釈した血清を用
いた。その結果、この希釈律で全ての抗原及び血清の抗
体価とＥＬＩＳＡ示数値（Ａ₄₅₀ ）との間に直線性が確
認された。

【００５１】

【表１】

【００５２】図２及び表１に示されるように、ＲＡ、Ｓ
ＬＥ、ＳＳ及びＭＣＴＤ患者の血清中のＣＣＴに対する
抗体価は、健常者対照の血清における力価よりも、より
有意に高いことが分かる。

【００５３】対照的に、図２及び表１に示されるよう
に、大腸菌ＧｒｏＥＬに対する抗体価は、ＲＡ、ＳＬ
Ｅ、ＭＣＴＤ群において、数例について高い陽性を示す
が、該抗体価の平均値としては、健常者対照と患者との
有意な差異が認められない。また、結核菌ＨＳＰ６５に
対する抗体価は、低く、またＭＣＴＤ群において、健常
者との間に有意な差異が認められるのみで、他の症候群
においては有意な差異が認められない。さらにミトコン
ドリアＨＳＰ６０に対する抗体価は、健常者との有意差
を示すｐ値がＣＣＴよりも低く、シェーグレン症候群の
群では、有意差が認められない。

【００５４】（ii）ＨＳＰ６０ファミリータンパク質に
対する抗体価間の相関 図３に示すように、ＣＣＴに対する抗体価とミトコンド
リアＨＳＰ６０に対する抗体価は、高い相関率（ｒ２＝
０．７２６）を示した。対照的に、結核菌ＨＳＰ６０に
対する抗体価はＣＣＴに対する抗体価とミトコンドリア
ＨＳＰ６０に対する抗体価とのより低い相関を示し、大
腸菌ＧｒｏＥＬといかなる他の抗原との間において抗体
価の非常に低い相関が観察されるか、あるいは相関が観
察されなかった。

【００５５】これらの結果により、抗ＣＣＴ自己抗体価
は、自己免疫疾患の良い指標であり、また、ＣＣＴは、
ＨＳＰ６０ファミリータンパク質に対する自己抗体を検
出するための良い抗原候補であることが示唆される。

【００５６】また、グラム陰性細菌である大腸菌のＧｒ
ｏＥＬに対する抗体価は、グラム陽性細菌である結核菌
ＨＳＰ６５に対する抗体価よりも一般的に高くなる。細
菌、特にグラム陰性細菌による感染によって、おそらく
ＨＳＰ６０ファミリータンパク質に対する一次免疫応答
を引き起こすことが示唆される。また、ＣＣＴ又はミト
コンドリアＨＳＰ６０に対して交差反応する抗体の誘導
は、健常者で抑制されるが、自己免疫疾患患者では抑制
されないように思われる。

【００５７】実施例４ イムノブロット解析 ヒト血清を用い、ヒトＣＣＴ、ミトコンドリアＨＳＰ６
０及び大腸菌ＧｒｏＥＬのイムノブロット解析を行なっ
た。

【００５８】まず、ＣＣＴ、ミトコンドリアＨＳＰ６０
及び大腸菌ＧｒｏＥＬ（各０．２μｇ／レーン）を３〜
１０％リニアグラジェントポリアクリルアミドゲルでの
ネイティブＰＡＧＥ又は１０〜２０％リニアグラジェン
トポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た。クボタら[Kubota, H., et al., Eur. J. Biochem.
262, 492-500 (1999)]に記載のように、イムノブロッテ
ィングを行なった。すなわち、ゲル上のタンパク質をポ
リビニリデンジフロリドフィルターに転写し、ついで該
フィルターを５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキ
ングした。フィルターとヒト血清とのインキュベーショ
ンの後、５％スキムミルクを含むＰＢＳＴで１００倍に
希釈し、二次抗体及び基質として、アルカリホスファタ
ーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（Ｂ
ｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）
と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー
トテトラゾリウム／ニトロブルーテトラゾリウム溶液と
を用いて特異的結合を視覚化した。

【００５９】その結果、図４のパネルＡ及びＢに示すよ
うに、ＣＣＴ、ミトコンドリアＨＳＰ６０及び大腸菌Ｇ
ｒｏＥＬを用いた、ネイティブＰＡＧＥ後のイムノブロ
ッティングは、約７００〜９００ｋＤａの特定のバンド
を示した。ＣＣＴ又はミトコンドリアＨＳＰ６０のバン
ドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のイムノブロッティングには
検出されなかった。また、図４のパネルＣに示されるよ
うに、大腸菌ＧｒｏＥＬに特異的なバンドは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ後のイムノブロッティングにより約６０ｋＤａ
で検出された。かかる結果は、ＳＤＳ処理により、自己
免疫疾患患者の自己抗体により認識される、ＣＣＴ及び
ミトコンドリアＨＳＰ６０中のエピトープ構造は破壊す
るが、ヒト血清中のＧｒｏＥＬ特異的抗体は配列特異的
エピトープを認識するため該構造は維持されることが示
される。

【００６０】換言すれば、ヒト血清中抗体のうちＣＣＴ
と交差反応する画分は、バンドがネイティブＰＡＧＥ後
で観察されるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後では観察されなか
ったため、恐らく、シャペロニンタンパク質の１若しく
は複数のＳＤＳ感受性エピトープを認識するであると思
われる。

【００６１】実施例５ 血清吸収実験 ＨＳＰ６０ファミリータンパク質のリン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）溶液又はヒト血清アルブミンのＰＢＳ溶
液（対照）と等量のＰＢＳ１０倍希釈ヒト血清とを混合
した。３７℃で１時間のインキュベートの後、混合物を
ＰＢＳで１００倍に希釈した後、ＥＬＩＳＡにより抗体
の特異的結合を解析した。その結果を図５に示す。

【００６２】図５に示されるように、ＣＣＴに対するＩ
ｇＧ抗体及びミトコンドリアＨＳＰ６０に対する抗体
は、ほとんど完全に互いを吸収した。また、抗ＣＣＴ抗
体及び抗ＨＳＰ６０抗体は、ＲＡ＃２７における抗ＨＳ
Ｐ６０を除き、大腸菌ＧｒｏＥＬ又は結核菌ＨＳＰ６５
により、ほとんど完全に吸収された。対照的に、抗Ｇｒ
ｏＥＬ抗体の結合は、他のＨＳＰ６０ファミリータンパ
ク質を同程度に添加することにより、ＲＡ＃２７を除い
て、Ｎｏｒｍａｌ＃７２、ＳＬＥ＃６及びＭＣＴＤ＃９
４においては阻害されず、Ｎｏｒｍａｌ＃５２、ＲＡ＃
２７、ＳＳ＃８０及びＭＣＴＤ＃８８においては、部分
的に阻害された。いくつかの血清中における抗結核菌Ｈ
ＳＰ６５の結合は、ＣＣＴ又はミトコンドリアＨＳＰ６
０の添加により、ＲＡ＃２７及びＳＳ＃８０において
は、ほぼ完全に阻害され、Ｎｏｒｍａｌ＃７２、ＲＡ＃
４１及びＭＣＴＤ＃８８においては、部分的に阻害され
た。４つのＨＳＰファミリー抗原への結合は、他のファ
ミリーの分子シャペロンタンパク質、ＨＳＰ７０の添加
により、阻害されなかった。これらの結果により、ＣＣ
Ｔ及びＨＳＰ６０に反応する抗体は２つの抗原間に類似
した１若しくは複数のエピトープを認識し、ＧｒｏＥＬ
及び結核菌ＨＳＰ６５も類似した１若しくは複数のエピ
トープを含むことが示唆される。対照的に、ＧｒｏＥＬ
又は結核菌ＨＳＰ６５を認識する抗体は、ＧｒｏＥＬ及
び／又は結核菌ＨＳＰ６５に特異的なものを含む。抗Ｇ
ｒｏＥＬ又は抗結核菌ＨＳＰ６５は、Ｎｏｒｍａｌ＃５
２、Ｎｏｒｍａｌ＃７２、ＳＬＥ＃６及びＭＣＴＤ＃９
４の場合において、抗原により、お互いに一部分であっ
た。この結果により、ＧｒｏＥＬ及び結核菌ＨＳＰ６５
は、ＣＣＴ及びＨＳＰ６０により共有される１若しくは
複数のエピトープに加えて、特異的なエピトープを有す
ることが示唆される。

【００６３】実施例６ 腫瘍とＣＣＴ発現量との関連性 （１）各種マウス細胞株におけるＣＣＴの発現量 種々のマウス細胞株におけるＣＣＴサブユニットタンパ
ク質の発現量をウエスタンブロッティングにより調べ
た。用いたマウス細胞株は、ＦＭ３Ａ（乳癌）、７ＴＤ
１（ＩＬ−６依存性ハイブリドーマ）、ＤＡ３（ＩＬ−
３依存性ミエロイド細胞）、Ｌ５１８７Ｙ（リンパ
腫）、ＬＬＣ−１（肺癌）、Ｌ９２９（繊維芽細胞）、
Ｊ７４４Ａ．１（単球マクロファージ株）である。

【００６４】その結果、細胞によってＣＣＴサブユニッ
トタンパク質の量は大きく異なっていることが示され
た。特に、細胞増殖の早い浮遊細胞の方が増殖の遅い付
着細胞よりも発現量が多かった。

【００６５】そこで、細胞増殖能とＣＣＴの発現量との
関連性を検討するため、細胞増殖速度の指標として[³H]
- チミジンの取り込み能を求め、得られたチミジン取り
込み値と前記ウエスタンブロッティングで求めたＣＣＴ
の細胞内タンパク質量との関連性を調べた。その結果を
図６に示す。

【００６６】図６のパネルＡ〜Ｄの結果より、いずれの
サブユニットにおいても高い正の相関性を示すことがわ
かる。

【００６７】（２）癌組織又は正常組織におけるＣＣＴ
の発現量 ＣＣＴの発現量と細胞の増殖とが、密接な正の関係のあ
ることが明らかとなったので、増殖性細胞が関係する疾
患の１つとして癌について検討した。

【００６８】１９癌患者の手術検体のうち、同一患者か
ら得られた摘出組織の腫瘍化部と非腫瘍化部とのペアに
ついて、ＣＣＴの発現量の差異を調べた。

【００６９】臓器試料をホモジナイザーでホモジナイズ
後、遠心し、得られた可溶性画分のタンパク質３μｇ相
当量を用いて、総タンパク質量に対するＣＣＴの量につ
いてウエスタンブロッティングにより検討した。結果を
図７、表２及び図８に示す。

【００７０】

【表２】

【００７１】図７、表２及び図８の結果より、原発巣癌
のうち、大腸癌（１０症例中８症例）及び肝細胞癌（７
症例中５症例）において、腫瘍化部でＣＣＴ発現が亢進
していることがわかる。

【００７２】また、他のシャペロン〔ＨＳＰ７０、Ｇｒ
ｐ７８（グルコース調節タンパク質７８）、ＯＲＰ１５
０など）についても、腫瘍化部で発現の亢進が認められ
ている例も多く認められたが、ＣＣＴに比べて発現亢進
の認められる頻度は低かった。

【００７３】さらに、細胞増殖と関連があり、癌マーカ
ーとしても用いられている増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）
とＣＣＴの発現量を比較した。

【００７４】なお、前記ＰＣＮＡは、サイクリンもしく
はＤＮＡポリメラーゼδ関連タンパク質としても知られ
ている約３６ｋＤａのタンパク質であり、細胞周期の初
期Ｇ１〜Ｓ期で合成され、増殖細胞のマーカーとして組
織染色などでよく使用される指標である。

【００７５】その結果、図７、表２及び図８に示すよう
に、ＰＣＮＡとＣＣＴの発現量の間に非常によい相関性
が認められることがわかる。

【００７６】

【発明の効果】本発明の自己免疫疾患の診断方法は、健
常者対照と比較して力価が有意に高く、優先的に患者中
で上昇する抗ＣＣＴ自己抗体価を測定するため、簡便で
あり、かつより高い信頼度で自己免疫疾患の徴候を検出
することができるという優れた効果を奏する。また、本
発明の抗ＣＣＴ自己抗体価測定用キットは、前記自己免
疫疾患の診断方法に好適であり、より信頼度の高い診断
を可能にする。さらに、本発明の腫瘍の診断方法によれ
ば、ＣＣＴの発現量を診断の指標とするため、より簡便
に、かつより信頼度の高い診断を可能にする。また、本
発明のＣＣＴ測定用キットは前記腫瘍の診断方法に好適
であり、より信頼度の高い診断を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ネイティブＰＡＧＥ及びＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる精製ＣＣＴ標品のキャラクタリゼーションを
示す図である。ネイティブＰＡＧＥは、３〜１０％濃度
勾配ポリアクリルアミドゲルで行なった。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥは、８．５％ポリアクリルアミドゲルで行なった。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、８つの異なるサブユニットを
示す６０ｋＤａ前後の複数のバンドとして泳動された。
ネイティブＰＡＧＥのためのサイズマーカーとして、チ
ログロブリン（６６９ｋＤａ）、フェリチン（４４０ｋ
Ｄａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）及び乳酸デヒドロ
ゲナーゼを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサイズマーカーと
して、ホスホリラーゼｂ（９４ｋＤａ）、アルブミン
（６７ｋＤａ）、オブアルブミン（４３ｋＤａ）、炭酸
アンヒドラーゼｂ（３０ｋＤａ）を用いた。

【図２】図２は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者、全身
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、シェーグレン症候
群患者、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）患者及び健常者
におけるヒトＣＣＴ、ヒトミトコンドリアＨＳＰ６０、
大腸菌ＧｒｏＥＬ及び結核菌のＨＳＰ６５に対するＩｇ
Ｇ力価の比較を示す図である。各抗原をマイクロタイタ
ープレートに被覆し、１０００倍に希釈されたヒト血清
を該プレートに供した。ＥＬＩＳＡにより測定した抗体
価は４５０ｎｍにおける吸収として表わされた。平均及
び標準誤差を右側に示す。各群間の統計学的有意性を２
つの星印（ｐ＜０．０１）及び１つの星印（ｐ＜０．０
５）で示す。

【図３】図３は、ヒト血清におけるヒトＣＣＴ、ミトコ
ンドリアＨＳＰ６０、大腸菌ＧｒｏＥＬ及び結核菌ＨＳ
Ｐ６５に対する抗体価間の相関関係を示す図である。示
された数値は、図２と同じである。

【図４】図４は、ヒト血清を用いたヒトＣＣＴ、ミトコ
ンドリアＨＳＰ６０及び大腸菌ＧｒｏＥＬのイムノブロ
ット解析の図である。ＣＣＴ、ＨＳＰ６０又はＧｒｏＥ
ＬをネイティブＰＡＧＥ又はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、
膜にブロットした。得られた膜をヒト血清とインキュベ
ートし、ついでアルカリホスファターゼ結合抗ヒトＩｇ
Ｇとインキュベートした。その結果、全てのシャペロニ
ンに対する抗体に対して、健常者対照血清＃５２及び＃
７２は、陽性であるが、＃６３及び＃６７は、陰性であ
った。矢印は、各抗原の位置を示す。分子量マーカーの
移動度を左側に示す。

【図５】図５は、ヒトＣＣＴ、ミトコンドリアＨＳＰ６
０、大腸菌ＧｒｏＥＬ及び結核菌ＨＳＰ６５に対する抗
体の各抗原による吸収を示す図である。希釈ヒト血清を
示された抗原で吸収し、ＥＬＩＳＡに供した。図中、Ｈ
ＳＡはヒト血清アルブミン（対照）を示す。

【図６】図６は、マウス細胞株におけるＣＣＴの発現量
と細胞増殖能との関連性を調べた結果の図である。パネ
ルＡは、ウエスタンブロットの結果を示す図である。パ
ネルＢは、ＣＣＴの各サブユニット量と細胞への[³H]−
チミジンの取り込みの相関性を示す図である。パネルＣ
は、ＣＣＴの基質（アクチン、チューブリン）量と細胞
への[³H]−チミジンの取り込みの相関性を示す図であ
る。パネルＤに、パネルＢ及びＣのデータから算出した
相関係数を示す。

【図７】図７は、同一患者由来の腫瘍化組織と正常組織
とにおける各タンパク質発現量をウエスタンブロッティ
ングにより調べた結果の図である。

【図８】図８は、ＣＣＴ及びＰＣＮＡタンパク質の同一
患者における腫瘍化部又は非腫瘍化部における発現量の
相関性を示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価を測定
   することを特徴とする、自己免疫疾患の診断方法。
2. 【請求項２】 哺乳類動物のＣＣＴ抗原タンパク質と被
   検試料とを接触させて抗ＣＣＴ自己抗体価を測定する、
   請求項１記載の診断方法。
3. 【請求項３】 自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、全
   身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群及び混合性
   結合組織病からなる群より選ばれた少なくとも１種であ
   る、請求項１又は２記載の診断方法。
4. 【請求項４】 健常者対照の被検試料中の抗ＣＣＴ自己
   抗体価と被検体の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価とを
   比較し、健常者対照の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価
   よりも被検体の被検試料中の抗ＣＣＴ自己抗体価が大き
   い場合を自己免疫疾患陽性の指標とする、請求項１〜３
   いずれか記載の診断方法。
5. 【請求項５】 哺乳類動物のＣＣＴ抗原タンパク質を含
   有してなる、請求項１〜４いずれか記載の診断方法に用
   いるための抗ＣＣＴ自己抗体価測定用キット。
6. 【請求項６】 被検試料中のＣＣＴ量を測定することを
   特徴とする、腫瘍の診断方法。
7. 【請求項７】 抗ＣＣＴ抗体を含有してなる、請求項６
   記載の診断方法に用いるためのＣＣＴ測定用キット。