JP2001141730A - ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来マンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防方法 - Google Patents
ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来マンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防方法Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由
来のマンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防
法 【解決手段】レプトスピラ・ビフレキサ（Ｌｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）に存在するリポ多糖様レプ
トスピラ属特異的抗原の抗原糖鎖部分とロードトルラ属
（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来のマンナンが、ともに
→３）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→４）−β−Ｄ−Ｍａ
ｎρ−（１→繰り返し単位を含む多糖であることに基づ
いて、このマンナン、およびマンナンから得られるオリ
ゴ糖、配糖体に結合できる抗体の存在を検出することに
よってレプトスピラ症の診断を行う。さらに、このマン
ナンやマンナンから得られるオリゴ糖、配糖体を用い動
物に免疫応答を誘発させ、レプトスピラ症を予防する。
来のマンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防
法 【解決手段】レプトスピラ・ビフレキサ（Ｌｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）に存在するリポ多糖様レプ
トスピラ属特異的抗原の抗原糖鎖部分とロードトルラ属
（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来のマンナンが、ともに
→３）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→４）−β−Ｄ−Ｍａ
ｎρ−（１→繰り返し単位を含む多糖であることに基づ
いて、このマンナン、およびマンナンから得られるオリ
ゴ糖、配糖体に結合できる抗体の存在を検出することに
よってレプトスピラ症の診断を行う。さらに、このマン
ナンやマンナンから得られるオリゴ糖、配糖体を用い動
物に免疫応答を誘発させ、レプトスピラ症を予防する。
Description
【０００１】本発明はレプトスピラ・ビフレキサ（Ｌｅ
ｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）に存在するレプト
スピラ属特異的抗原の代わりに、ロードトルラ属由来の
マンナンを用い、本マンナン抗原に結合可能な抗体の存
在を検出することによってレプトスピラ症の診断を行う
ことに関するものである。さらに、このマンナンは、特
に動物のレプトスピラ症に対する感染防御免疫応答を引
き起こすための抗原性製剤（ワクチン）として、免疫学
的に使用できる。
ｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）に存在するレプト
スピラ属特異的抗原の代わりに、ロードトルラ属由来の
マンナンを用い、本マンナン抗原に結合可能な抗体の存
在を検出することによってレプトスピラ症の診断を行う
ことに関するものである。さらに、このマンナンは、特
に動物のレプトスピラ症に対する感染防御免疫応答を引
き起こすための抗原性製剤（ワクチン）として、免疫学
的に使用できる。
【０００２】レプトスピラ症は世界的に重要なヒト及び
家畜の疾患であり、ほとんどの哺乳類の種に感染可能な
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の病原性菌株
により引き起こされる人獣共通な感染症である。本感染
は感染した動物との直接接触、または汚染された土壌あ
るいは水と接触することにより成立する。レプトスピラ
属の細菌は環境の中で長期間生き残るだけでなく、持続
性の感染、および野生動物や家畜により伝播する能力を
有するため、レプトスピラ症の制圧はきわめて困難であ
る。
家畜の疾患であり、ほとんどの哺乳類の種に感染可能な
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の病原性菌株
により引き起こされる人獣共通な感染症である。本感染
は感染した動物との直接接触、または汚染された土壌あ
るいは水と接触することにより成立する。レプトスピラ
属の細菌は環境の中で長期間生き残るだけでなく、持続
性の感染、および野生動物や家畜により伝播する能力を
有するため、レプトスピラ症の制圧はきわめて困難であ
る。
【０００３】現在入手できるレプトスピラ属に対するワ
クチンは、不活性化された全微生物調製物、または血清
反応性を有するレプトスピラ外層エンベロープ調製物か
らなる。これらのワクチン調製物は、亜種特異性を示
し、約１７０の血清型亜種に分類されている病原性レプ
トスピラ属の多くに対して有効な交差感染防御をもたら
すことはないとされている。さらに、その免疫化は不完
全で、または短期間の免疫化しか与えず、年１回以上の
投与を必要としている。このため、より改良されたレプ
トスピラ属ワクチンを開発する必要に迫られている。こ
れらのワクチン調製物に含まれる感染防御免疫源の性質
は完全には解明されてはいないが、リポ多糖類様の物質
が一定の感染防御性を付与することが示されている
［Ｂ．Ｈ．Ｊｏｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２９（１９８９）１１５−１２０］。
クチンは、不活性化された全微生物調製物、または血清
反応性を有するレプトスピラ外層エンベロープ調製物か
らなる。これらのワクチン調製物は、亜種特異性を示
し、約１７０の血清型亜種に分類されている病原性レプ
トスピラ属の多くに対して有効な交差感染防御をもたら
すことはないとされている。さらに、その免疫化は不完
全で、または短期間の免疫化しか与えず、年１回以上の
投与を必要としている。このため、より改良されたレプ
トスピラ属ワクチンを開発する必要に迫られている。こ
れらのワクチン調製物に含まれる感染防御免疫源の性質
は完全には解明されてはいないが、リポ多糖類様の物質
が一定の感染防御性を付与することが示されている
［Ｂ．Ｈ．Ｊｏｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２９（１９８９）１１５−１２０］。
【０００４】一方、レプトスピラ症の診断には主に血清
学的診断法が用いられており、ＭＡＴ法［Ｓ．Ｆｉｎｅ
（編）、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏ
ｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ，（１
９８２）Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａ
ｔｉｏｎ］、間接蛍光抗体法［Ｍ．Ｔｏｒｔｅｎら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１６（１９６６）５３
７−５４３］等が開発されているが、操作の煩雑さ、高
コストなどの理由から、発展途上国においては余り普及
していない。最近、ＬＥＰＴＯ Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法が
開発され［Ｇ．Ｃ．Ｇｕｓｓｅｎｈｏｖｅｎら、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５（１９９７）９２
−９７］、その普及が期待されている。このＬＥＰＴＯ
Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法では、レプトスピラ属特異的抗原
を有するとされるレプトスピラ・ビフレキサ由来の熱安
定性抗原が、抗レプトスピラ抗体を検出する抗原として
用いられている。レプトスピラ・ビフレキサのパトック
Ｉ株（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ ｐａｔｏｃ Ｐａｔｏｃ
Ｉ）に存在する熱安定性のリポ多糖類様の物質が、レプ
トスピラ属特異的抗原性である可能性が示唆されており
［Ｋ．Ｍａｔｓｕｏ ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ
ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉ
ｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９９ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ，ｐ．６０］、リポ多糖類様の物質を血清学的診断試
薬として、あるいは感染予防ワクチンとして利用できる
可能性を示している。しかし、リポ多糖類様の物質を高
度に精製することは非常に困難で、また、その精製標品
が得られたとしてもきわめて少量であり、該当する物質
を血清学的診断試薬として、または感染予防ワクチンと
して利用するのは困難な状況にある。
学的診断法が用いられており、ＭＡＴ法［Ｓ．Ｆｉｎｅ
（編）、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏ
ｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ，（１
９８２）Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａ
ｔｉｏｎ］、間接蛍光抗体法［Ｍ．Ｔｏｒｔｅｎら、
Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１１６（１９６６）５３
７−５４３］等が開発されているが、操作の煩雑さ、高
コストなどの理由から、発展途上国においては余り普及
していない。最近、ＬＥＰＴＯ Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法が
開発され［Ｇ．Ｃ．Ｇｕｓｓｅｎｈｏｖｅｎら、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５（１９９７）９２
−９７］、その普及が期待されている。このＬＥＰＴＯ
Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法では、レプトスピラ属特異的抗原
を有するとされるレプトスピラ・ビフレキサ由来の熱安
定性抗原が、抗レプトスピラ抗体を検出する抗原として
用いられている。レプトスピラ・ビフレキサのパトック
Ｉ株（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ ｐａｔｏｃ Ｐａｔｏｃ
Ｉ）に存在する熱安定性のリポ多糖類様の物質が、レプ
トスピラ属特異的抗原性である可能性が示唆されており
［Ｋ．Ｍａｔｓｕｏ ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ
ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉ
ｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９９ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ，ｐ．６０］、リポ多糖類様の物質を血清学的診断試
薬として、あるいは感染予防ワクチンとして利用できる
可能性を示している。しかし、リポ多糖類様の物質を高
度に精製することは非常に困難で、また、その精製標品
が得られたとしてもきわめて少量であり、該当する物質
を血清学的診断試薬として、または感染予防ワクチンと
して利用するのは困難な状況にある。
【０００５】本発明は、レプトスピラ・ビフレキサＰａ
ｔｏｃ Ｉ株が産生するリポ多糖類様レプトスピラ属特
異的抗原の糖鎖部分とロードトルラ属より得られるマン
ナンの構造が、ともに→３）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１
→４）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→繰り返し単位を含む
多糖であることに基づいて、ロードトルラ属より得られ
るマンナンを用いたレプトスピラ感染の有無および程度
を分析する方法、およびこの多糖体とその誘導体の投与
により動物に免疫応答を誘発させ、レプトスピラ症を予
防する方法に関するものである。リポ多糖類様レプトス
ピラ属特異的抗原は精製が非常に困難であるが、ロード
トルラ属より得られるマンナンは精製が容易であり、安
価に、かつ大量に製造可能で、レプトスピラ症の診断
法、予防法の開発に寄与するものである。
ｔｏｃ Ｉ株が産生するリポ多糖類様レプトスピラ属特
異的抗原の糖鎖部分とロードトルラ属より得られるマン
ナンの構造が、ともに→３）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１
→４）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→繰り返し単位を含む
多糖であることに基づいて、ロードトルラ属より得られ
るマンナンを用いたレプトスピラ感染の有無および程度
を分析する方法、およびこの多糖体とその誘導体の投与
により動物に免疫応答を誘発させ、レプトスピラ症を予
防する方法に関するものである。リポ多糖類様レプトス
ピラ属特異的抗原は精製が非常に困難であるが、ロード
トルラ属より得られるマンナンは精製が容易であり、安
価に、かつ大量に製造可能で、レプトスピラ症の診断
法、予防法の開発に寄与するものである。
【０００６】我々は公知のように、レプトスピラ・ビフ
レキサＰａｔｏｃ Ｉ株のリポ多糖類様レプトスピラ属
特異的抗原の糖鎖部分（以下ＡＰと称する）は→３）−
Ｄ−Ｍａｎρ−（１→４）−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→を繰
り返し単位とする糖鎖を持ち、多数の病原性レプトスピ
ラ菌に対する抗血清と交差反応を示すことを発見した
［Ｋ． Ｍａｔｓｕｏら、Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉ
ｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９９ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ，ｐ．６０］。一方、ロードトルラ・グルチニスを含
む酵母の一種であるロードトルラ属は、→３）−β−Ｄ
−Ｍａｎρ−（１→４）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→を
繰り返し単位とするマンナンを産生することが報告され
ており［Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．，４３（１９６５）９５０−９５４］、このマン
ナン（以下ＲＧＭと称する）がＡＰと同様にレプトスピ
ラ属特異的抗原として機能することを確認した。
レキサＰａｔｏｃ Ｉ株のリポ多糖類様レプトスピラ属
特異的抗原の糖鎖部分（以下ＡＰと称する）は→３）−
Ｄ−Ｍａｎρ−（１→４）−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→を繰
り返し単位とする糖鎖を持ち、多数の病原性レプトスピ
ラ菌に対する抗血清と交差反応を示すことを発見した
［Ｋ． Ｍａｔｓｕｏら、Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉ
ｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９９ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ，ｐ．６０］。一方、ロードトルラ・グルチニスを含
む酵母の一種であるロードトルラ属は、→３）−β−Ｄ
−Ｍａｎρ−（１→４）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→を
繰り返し単位とするマンナンを産生することが報告され
ており［Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｇｏｒｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．，４３（１９６５）９５０−９５４］、このマン
ナン（以下ＲＧＭと称する）がＡＰと同様にレプトスピ
ラ属特異的抗原として機能することを確認した。
【０００７】ＲＧＭの精製はＧｏｒｉｎ［Ｐ．Ａ．Ｊ．
Ｇｏｒｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，４３（１９６
５）９５０−９５４］の方法に従った。ロードトルラ・
グルチニスＡＨＵ３４７９株（北海道大学農学部保存菌
株）を５％のグルコースを含むイースト・ナイトルジェ
ン・ベース培地（Ｄｉｆｃｏ社）で２７℃、４日振盪培
養した。菌体を遠心分離および濾過により除去後、培養
上清からエタノール沈殿により粗多糖標品を得た。粗多
糖標品を水に溶解後、フェーリング液を滴下し、マンナ
ンを沈殿させた。沈殿したマンナンを脱イオン水で十分
に洗浄し、０．４Ｍ塩酸溶液に溶解後、エタノールを滴
下し沈殿させ、精製マンナン標品（ＲＧＭ）を得た。Ａ
ＰおよびＲＧＭの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較すると
（図１）主たるプロトンのシグナルが一致しており、両
多糖は同一の構造単位を保有していることが確認され
た。
Ｇｏｒｉｎら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，４３（１９６
５）９５０−９５４］の方法に従った。ロードトルラ・
グルチニスＡＨＵ３４７９株（北海道大学農学部保存菌
株）を５％のグルコースを含むイースト・ナイトルジェ
ン・ベース培地（Ｄｉｆｃｏ社）で２７℃、４日振盪培
養した。菌体を遠心分離および濾過により除去後、培養
上清からエタノール沈殿により粗多糖標品を得た。粗多
糖標品を水に溶解後、フェーリング液を滴下し、マンナ
ンを沈殿させた。沈殿したマンナンを脱イオン水で十分
に洗浄し、０．４Ｍ塩酸溶液に溶解後、エタノールを滴
下し沈殿させ、精製マンナン標品（ＲＧＭ）を得た。Ａ
ＰおよびＲＧＭの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較すると
（図１）主たるプロトンのシグナルが一致しており、両
多糖は同一の構造単位を保有していることが確認され
た。
【０００８】ＲＧＭの抗原性は、以下に示すＥＬＩＳＡ
により確認した。ポリスチレン製の９６穴ウェルマイク
ロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）を使用した。ＲＧＭ
をｐＨ７．２のリン酸緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ
と称する）に溶解し、抗原溶液（４μｇ／ｍｌ）を調製
後、５０μｌの抗原溶液を分注し、３７℃で２時間静置
することにより固相支持体上にＲＧＭを吸着させた。抗
原溶液を取り除き、０．５％ゼラチン１００μｌを分注
し、３７℃で２時間静置し非特異性結合部位をブロック
した。未結合のＲＧＭおよびゼラチンは０．０５％ツイ
ーン２０を含むＰＢＳ（以下ツイーン−ＰＢＳと称す）
による洗浄により除去し、ＲＧＭ被覆９６穴プレートを
作製した。ＲＧＭ被覆９６穴プレートにツイーン−ＰＢ
Ｓによって１００００倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗レプトスピラ・ビフレキサ抗体（ウサギ由来、Ｖｉｒ
ｏＳｔａｔ社）５０μｌを分注し、３７℃で３０分間静
置した。その後、抗体希釈溶液を取り除き、未結合の抗
レプトスピラ・ビフレキサ抗体をツイーン−ＰＢＳによ
る洗浄により除去した。ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）５０μｌを分注し、室温で１０分間静
置した。４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＧＭと
抗レプトスピラ・ビフレキサ抗体との免疫反応を検出し
た。この結果から、ＲＧＭは抗レプトスピラ・ビフレキ
サ抗体と免疫反応をすることが確認された。
により確認した。ポリスチレン製の９６穴ウェルマイク
ロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）を使用した。ＲＧＭ
をｐＨ７．２のリン酸緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳ
と称する）に溶解し、抗原溶液（４μｇ／ｍｌ）を調製
後、５０μｌの抗原溶液を分注し、３７℃で２時間静置
することにより固相支持体上にＲＧＭを吸着させた。抗
原溶液を取り除き、０．５％ゼラチン１００μｌを分注
し、３７℃で２時間静置し非特異性結合部位をブロック
した。未結合のＲＧＭおよびゼラチンは０．０５％ツイ
ーン２０を含むＰＢＳ（以下ツイーン−ＰＢＳと称す）
による洗浄により除去し、ＲＧＭ被覆９６穴プレートを
作製した。ＲＧＭ被覆９６穴プレートにツイーン−ＰＢ
Ｓによって１００００倍希釈したペルオキシダーゼ標識
抗レプトスピラ・ビフレキサ抗体（ウサギ由来、Ｖｉｒ
ｏＳｔａｔ社）５０μｌを分注し、３７℃で３０分間静
置した。その後、抗体希釈溶液を取り除き、未結合の抗
レプトスピラ・ビフレキサ抗体をツイーン−ＰＢＳによ
る洗浄により除去した。ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）５０μｌを分注し、室温で１０分間静
置した。４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＧＭと
抗レプトスピラ・ビフレキサ抗体との免疫反応を検出し
た。この結果から、ＲＧＭは抗レプトスピラ・ビフレキ
サ抗体と免疫反応をすることが確認された。
【０００９】次にＲＧＭに対して、各種病原性レプトス
ピラに対する抗血清（ウサギ由来）の交差反応性をＥＬ
ＩＳＡにより確認した。抗血清は公知の方法により得た
［Ｅ．Ｉｓｏｇａｉ ら、Ｚｂｌ．Ｂａｃｔ．Ｈｙ
ｇ．，２６１（１９８６）５３−６４］。ＲＧＭ被覆９
６穴プレートにツイーン−ＰＢＳによって１０００倍希
釈した病原性レプトスピラに対する抗血清５０μｌを分
注し、３７℃で３０分間静置した。抗血清溶液を取り除
き、ツイーン−ＰＢＳにより洗浄後、ＰＢＳによって１
００００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｈ＋Ｌ）（ヤギ由来、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌ
ｅｘ社）５０μｌを分注し、３７℃で３０分間静置し
た。抗ウサギＩｇＧ溶液を取り除き、ツイーン−ＰＢＳ
により洗浄後、免疫反応を上記と同様に検出した。その
結果、ＲＧＭは各種の病原性レプトスピラに対する抗血
清と交差反応を示す事が確認された。判定結果をＡＰに
関する結果と、実際に測定された吸光度とともに表１に
示す。対照（レプトスピラ非感染のウサギ）が与える吸
光度の２倍以上の吸光度を示す場合、陽性と判定した。
このことからＲＧＭはレプトスピラ属特異的抗原として
利用できることが確認できた。
ピラに対する抗血清（ウサギ由来）の交差反応性をＥＬ
ＩＳＡにより確認した。抗血清は公知の方法により得た
［Ｅ．Ｉｓｏｇａｉ ら、Ｚｂｌ．Ｂａｃｔ．Ｈｙ
ｇ．，２６１（１９８６）５３−６４］。ＲＧＭ被覆９
６穴プレートにツイーン−ＰＢＳによって１０００倍希
釈した病原性レプトスピラに対する抗血清５０μｌを分
注し、３７℃で３０分間静置した。抗血清溶液を取り除
き、ツイーン−ＰＢＳにより洗浄後、ＰＢＳによって１
００００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｈ＋Ｌ）（ヤギ由来、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌ
ｅｘ社）５０μｌを分注し、３７℃で３０分間静置し
た。抗ウサギＩｇＧ溶液を取り除き、ツイーン−ＰＢＳ
により洗浄後、免疫反応を上記と同様に検出した。その
結果、ＲＧＭは各種の病原性レプトスピラに対する抗血
清と交差反応を示す事が確認された。判定結果をＡＰに
関する結果と、実際に測定された吸光度とともに表１に
示す。対照（レプトスピラ非感染のウサギ）が与える吸
光度の２倍以上の吸光度を示す場合、陽性と判定した。
このことからＲＧＭはレプトスピラ属特異的抗原として
利用できることが確認できた。
【００１０】ＲＧＭを利用したＥＬＩＳＡで、ヒト血清
中の抗レプトスピラ抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ）の検出を試
みた。ツイーン−ＰＢＳで１００００倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体とペルオキシダーゼ
標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ由来、ＣＨＥＭＩＣＯＮ
社）を用いた。検体試料として、確定診断を受けたレプ
トスピラ症患者血清（日本人患者血清、１０検体とフィ
リピン人患者血清、５検体）は１０００倍希釈して使用
した。健康人の血清を対照として使用し、その吸光度の
２倍以上の吸光度を示した試料を陽性と判定した。判定
結果は、実際に測定された吸光度とともに表２に示す。
１５検体試料の１２検体（８０％）に抗レプトスピラ抗
体の存在が確認された。また、特異性を確認するために
実施した健康人（１０検体試料）、ライム病患者血清
（１０検体試料）、梅毒患者血清（１０検体試料）はい
ずれも陰性の結果を与えた。現在レプトスピラ症の血清
学的診断に利用されている方法（ＥＬＩＳＡ、ＬＥＰＴ
Ｏ Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法、ＭＡＴ法）による検出確度は
約８０％であることから［Ｇ．Ｃ．Ｇｕｓｓｅｎｈｏｖ
ｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５
（１９９７）９２−９７］、本ＲＧＭを用いたＥＬＩＳ
Ａはそれら血清学的診断方法と同程度の成績を与えるこ
とが確認された。
中の抗レプトスピラ抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ）の検出を試
みた。ツイーン−ＰＢＳで１００００倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体とペルオキシダーゼ
標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ由来、ＣＨＥＭＩＣＯＮ
社）を用いた。検体試料として、確定診断を受けたレプ
トスピラ症患者血清（日本人患者血清、１０検体とフィ
リピン人患者血清、５検体）は１０００倍希釈して使用
した。健康人の血清を対照として使用し、その吸光度の
２倍以上の吸光度を示した試料を陽性と判定した。判定
結果は、実際に測定された吸光度とともに表２に示す。
１５検体試料の１２検体（８０％）に抗レプトスピラ抗
体の存在が確認された。また、特異性を確認するために
実施した健康人（１０検体試料）、ライム病患者血清
（１０検体試料）、梅毒患者血清（１０検体試料）はい
ずれも陰性の結果を与えた。現在レプトスピラ症の血清
学的診断に利用されている方法（ＥＬＩＳＡ、ＬＥＰＴ
Ｏ Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法、ＭＡＴ法）による検出確度は
約８０％であることから［Ｇ．Ｃ．Ｇｕｓｓｅｎｈｏｖ
ｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５
（１９９７）９２−９７］、本ＲＧＭを用いたＥＬＩＳ
Ａはそれら血清学的診断方法と同程度の成績を与えるこ
とが確認された。
【００１１】精製ＡＰ標品は１リットル規模の菌体培養
からわずか０．４ｍｇしか得られず、加えて、レプトス
ピラの培養は大量の不活性化したウサギ血清を必要と
し、長時間の培養を必要とするため、大規模な精製ＡＰ
標品の精製はコスト面で不利となる。他方ロードトルラ
の培養は特殊な培地を必要とせず、１リットル程度の培
養で３８０ｍｇのＲＧＭが調製可能である。従って、精
製ＡＰ標品の調製と比較し、はるかに効率がよく、コス
ト面でも優れており、加えて精製操作の簡略化も可能
で、利用に適したレプトスピラ属特異的抗原と同様の抗
原多糖をロードトルラ属から調製できる。
からわずか０．４ｍｇしか得られず、加えて、レプトス
ピラの培養は大量の不活性化したウサギ血清を必要と
し、長時間の培養を必要とするため、大規模な精製ＡＰ
標品の精製はコスト面で不利となる。他方ロードトルラ
の培養は特殊な培地を必要とせず、１リットル程度の培
養で３８０ｍｇのＲＧＭが調製可能である。従って、精
製ＡＰ標品の調製と比較し、はるかに効率がよく、コス
ト面でも優れており、加えて精製操作の簡略化も可能
で、利用に適したレプトスピラ属特異的抗原と同様の抗
原多糖をロードトルラ属から調製できる。
【００１２】これらの結果は、ＲＧＭがレプトスピラ症
の診断試薬として応用できることを示すものである。ま
た、多糖および配糖体は哺乳動物の免疫応答を誘発し、
感染防御能を付与することが確認さている［Ｈ．Ｊ．Ｊ
ｅｎｎｉｎｇｓ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１（１９８３）１５５−２０
８、Ａ．Ｍｉｄｗｉｎｔｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，３３（１９９０）１９９−２０４］。よ
って、ＲＧＭおよびＲＧＭから得られるオリゴ糖あるい
は配糖体を、感染予防用ワクチンとして動物に投与する
ことにより、感染防御能を強化することが期待される。
の診断試薬として応用できることを示すものである。ま
た、多糖および配糖体は哺乳動物の免疫応答を誘発し、
感染防御能を付与することが確認さている［Ｈ．Ｊ．Ｊ
ｅｎｎｉｎｇｓ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１（１９８３）１５５−２０
８、Ａ．Ｍｉｄｗｉｎｔｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，３３（１９９０）１９９−２０４］。よ
って、ＲＧＭおよびＲＧＭから得られるオリゴ糖あるい
は配糖体を、感染予防用ワクチンとして動物に投与する
ことにより、感染防御能を強化することが期待される。
【図１】ＡＰ（Ａ）、ＲＧＭ（Ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲスペ
クトル。
クトル。
【表１】
【表２】
フロントページの続き (72)発明者 荒木 義雄 札幌市北区麻生町４丁目７−14 Ｆターム(参考） 4C085 AA13 CC07 4C086 AA01 EA01 EA20 MA01 MA04 NA14 ZB09 ZB35 ZC61
Claims (5)
- 【請求項１】哺乳動物においてレプトスピラ感染の有無
および程度を分析することを目的とし、動物から入手し
た検体試料中で本マンナン抗原と結合可能な抗体を検出
する方法で、本マンナン抗原に対する抗体の結合を検出
する段階を含み、抗原がロードトルラ属より得られる→
３）−β−Ｄ−Ｍａｎρ−（１→４）−β−Ｄ−Ｍａｎ
ρ−（１→構造を繰り返し単位を有する多糖すなわち試
料を利用する方法。 - 【請求項２】請求項１記載の試料が、請求項１記載の多
糖から得られるオリゴ糖もしくは配糖体であることを特
徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】請求項１記載の多糖または請求項２記載の
オリゴ糖、配糖体と結合可能な抗体に対して結合可能な
抗原を検体試料中から検出する方法で、本請求項記載の
抗体と対象とする抗原の結合を検出する段階を含む、検
体試料中のレプトスピラの感染を検出する方法。 - 【請求項４】免疫学的に有効な量の、請求項１記載の多
糖および請求項２記載のオリゴ糖、配糖体を単独または
組み合わせた製薬用に認可された担体中に含む、動物に
病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘発するために
有用な製薬学的組成物。 - 【請求項５】免疫学的に有効な量の、請求項１記載の多
糖、請求項２記載のオリゴ糖、配糖体と結合可能な抗体
を製薬用に認可された担体中に含む、動物に病原性レプ
トスピラに対する免疫応答を誘発するために有用な製薬
学的組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35785099A JP2001141730A (ja) | 1999-11-11 | 1999-11-11 | ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来マンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35785099A JP2001141730A (ja) | 1999-11-11 | 1999-11-11 | ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来マンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001141730A true JP2001141730A (ja) | 2001-05-25 |
Family
ID=18456253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35785099A Pending JP2001141730A (ja) | 1999-11-11 | 1999-11-11 | ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）由来マンナンを利用した、レプトスピラ症の診断と予防方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001141730A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004230373A (ja) * | 2003-01-31 | 2004-08-19 | Systec Inc | 複数の移動相流を脱気および混合するための統合装置 |
| JP2005060288A (ja) * | 2003-08-11 | 2005-03-10 | Japan Science & Technology Agency | 免疫賦活剤及び抗腫瘍剤 |
| CN103091204A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-08 | 苏州浙远自动化工程技术有限公司 | 一种中药醇沉工艺过程药液乙醇浓度在线检测方法 |
| CN106404598A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-15 | 安徽华润金蟾药业股份有限公司 | 华蟾素醇沉过程乙醇浓度检测方法 |
-
1999
- 1999-11-11 JP JP35785099A patent/JP2001141730A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004230373A (ja) * | 2003-01-31 | 2004-08-19 | Systec Inc | 複数の移動相流を脱気および混合するための統合装置 |
| JP2005060288A (ja) * | 2003-08-11 | 2005-03-10 | Japan Science & Technology Agency | 免疫賦活剤及び抗腫瘍剤 |
| CN103091204A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-08 | 苏州浙远自动化工程技术有限公司 | 一种中药醇沉工艺过程药液乙醇浓度在线检测方法 |
| CN106404598A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-15 | 安徽华润金蟾药业股份有限公司 | 华蟾素醇沉过程乙醇浓度检测方法 |
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