JP2001061497A - ヒスタミンセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】試料中のヒスタミン濃度を測定するための電気
化学センサであって、簡便な方法で、低い濃度まで高感
度に、選択性および再現性良く、ヒスタミン濃度を測定
するセンサを提供すること。 【解決手段】試料溶液が流れる流路中の反応器６の内部
にスタミン酸化酵素を固定化し、試料中のヒスタミンを
そのヒスタミン酸化酵素によってほとんど完全に酸化
し、その際に生成する過酸化水素を、フローセル７の内
部に配置され、過酸化水素を還元する性質を有する膜で
修飾された作用電極８の電極反応を介して還元し、その
際に作用電極８に流れる電流を計測することによって、
試料中のヒスタミン濃度を測定することを特徴とするヒ
スタミンセンサを構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食肉、鮮魚などの
食品検査や、脳脊髄液などの生体試料の測定において試
料中に含まれるヒスタミンを高感度、かつ連続的に定量
分析するためのヒスタミンセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミンは生体アミンの一種であり、
消化液の分泌やアレルギー反応に関係するのみならず、
脳内の伝達物質として働く分子である。また、魚介類や
食肉中のヒスチジンが微生物と反応することにより生じ
るため、食品衛生上、食品中の濃度を迅速に測定する方
法が求められている。

【０００３】食品中のヒスタミンについては、北米食品
薬品局（ＦＤＡ）が１９８２年に蛍光法によるヒスタミ
ンの測定法を定めている。蛍光法はヒスタミンとクロマ
トグラフィにおける誘導体化試薬としても良く使用され
ている蛍光試薬である o-フタルアルデヒドとの反応に
より蛍光物質を合成し、その蛍光強度より濃度を求める
ものである。しかしながら、蛍光法は妨害物質の影響を
受けやすく、前もって妨害物質を除去する必要があるこ
とや、蛍光試薬が必要であるなどといった問題があり、
試薬の反応時に正確な時間と温度の制御が必要である。

【０００４】一方、液体クロマトグラフィによるヒスタ
ミンの定量方法も数多く報告されている。例えば、本願
発明者の内の１名は脳などの生体組織に含まれるヒスタ
ミンとメチルヒスタミンの濃度を高速液体クロマトグラ
フィにより感度良く検出している (K. Alam、M. Sasak
i、T. Watanabe and K.Maeyama、Analytical Biochemis
try、229巻、26-34頁 (1995年) 参照）。この方法では
カラムによって数種類のアミンを分離した後、ジアミン
酸化酵素が固定化された酵素カラムによりヒスタミンを
酸化して過酸化水素を発生させ、これに蛍光試薬である
ルミノールとフェリシアン化カリウムを混合して化学発
光を起こし、その発光強度から定量を行っている。

【０００５】液体クロマトグラフィ法では極めて低い検
出限界（即ち高感度）が得られるが、分離プロセスのみ
で１０分以上の時間がかかるため、汎用性、迅速性が損
なわれる。また、細胞からのヒスタミンの放出挙動な
ど、より短い時間分解能が必要な場合には不都合であ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】一方、近年、酵素反応
と電気化学検出器あるいは酸素センサを組み合わせるこ
とによりヒスタミンを検出する方法が提案されている。
モノアミン酸化酵素膜を修飾した酸素電極を用いて溶存
酸素の変化よりヒスタミンを定量する方法が提案されて
いる（I. Karube et al.、Enzyme Microb. Technol.、2
巻、117-120頁(1980年) 参照）。また、被測定液にヒス
タミン酸化酵素を混合し、被測定液の酸素消費量を測定
することによりヒスタミンを迅速に定量する方法が提案
されている（寄藤他、特開平５−２３６９５２号公報、
大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報参照）。

【０００７】しかしながら、前者の方法では、大橋らに
より（大橋他、特開平１０−１７４５９９号公報記載の
ように）修飾膜の作製法や反応温度により特性が変動す
ることなど多くの問題点が指摘されている。一方、後者
では被測定液に含まれるヒスタミン全量を酵素反応によ
り酸化するため、化学量論関係が成立し、測定精度が高
い。しかしながら、被測定液に高価な酵素を添加するた
め費用がかかること、近年、医学生理学の測定で要求さ
れている細胞レベルへのヒスタミンの測定などマイクロ
リットル、ナノリットルレベルの微少量試料の測定では
測定系の酸素濃度をコントロールするのが困難であり、
またヒスタミン濃度が低い場合には酸素のわずかな減少
量を測定する必要があり、酵素反応生成物を測定する方
式に較べて、低濃度での定量性に劣るなどの問題があっ
た。

【０００８】一方、酵素反応生成物を測定する方法とし
て、ジアミン酸化酵素を修飾した白金電極を利用するア
ンペロメトリックなセンサも報告されている（例えば、
S.Tombelli et al.、Anal. Chim. Acta、358巻、3号、2
77-284頁、(1998年）参照）。この方法では、酸素濃度
が基質濃度より充分大きい場合、酵素反応生成物である
過酸化水素を再現性良く測定できる。特にヒスタミン濃
度が低い場合、酸素消費量が少ないため、試料内の酸素
濃度を調整する必要がなく、酸素減少量を測定する方法
に比べて簡便である。また、センサも容易に微小化でき
る。しかしながら、過酸化水素を酸化して測定を行うに
は白金電極の電位を 500 mV 以上（銀／塩化銀参照電極
に対して）にする必要があり、試料中に共存し電気化学
的に酸化されやすい Ｌ-アスコルビン酸、尿酸などの妨
害を受けやすい問題点があった。また、ジアミン酸化酵
素は多くのジアミン類と反応するため、ヒスタミンを選
択性良く測定することができなかった。一方、過酸化水
素を、ペルオキシダーゼ系の酵素を用い、電子伝導性の
膜を介して電極反応により還元する方法が提案されてい
る（例えば、M. Vreeke、R. Maidan、A. Heller、Analy
tical Chemistry、64巻、 3084-3090頁、(1998年）参
照)。発明者らはポリビニルピリジンのオスミウム錯体
に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した膜とヒスタミ
ン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用いることにより
0 V 付近の低い電位でヒスタミンを高感度に測定でき
ることを報告した（丹羽、栗田、堀内、鳥光、前山、谷
沢、日本分析化学会第４７年会要旨集、51頁参照）。こ
の方法では低い検出限界が得られるものの、膜に固定さ
れた酵素の量や膜厚により信号の絶対値が変化する問題
があった。

【０００９】本発明の目的は、試料中のヒスタミン濃度
を測定するための電気化学センサにおける上記課題を解
決し、簡便な方法で、低い濃度まで高感度に、選択性お
よび再現性良く、ヒスタミン濃度を測定するセンサを提
供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために、試料液の流路中に固定化されたヒスタミ
ン酸化酵素を有し、その下流に、酵素と基質との反応生
成物である過酸化水素を電極反応を介して還元する性質
を有する物質が修飾された電極を有するヒスタミンセン
サを構成する。

【００１１】この構成においては、ヒスタミンをほぼ完
全に酸化するために十分な量のヒスタミン酸化酵素を用
いることができるので、上記のポリビニルピリジンのオ
スミウム錯体に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した
膜とヒスタミン酸化酵素膜を２層に修飾した電極を用い
る場合における問題点、すなわち固定された酵素の量や
膜厚により信号の絶対値が変化する問題を解消すること
ができる。

【００１２】この構成のヒスタミンセンサを用い、セン
サ内に導入されるヒスタミンを酵素反応によりほとんど
完全に酸化し、その酵素反応において生成した過酸化水
素を、電極反応を介し、低い電位で還元して、その時に
流れる電流を測定することにより、ヒスタミン濃度を、
高い精度と高い感度と良好な選択性で測定することがで
きる。

【００１３】

【発明の実施の形態】図１は、本発明に関わるヒスタミ
ンセンサの基本的な構造図である。センサはシリンジポ
ンプ１や高速液体クロマトグラフィに用いるプランジャ
ーポンプ２によりキャリア液３をヒスタミンセンサに送
液し、その途中で、インジェクター４により試料を一定
量のみ導入する。試料は前電解用電極５に接触した後に
ヒスタミン酸化酵素が固定化された反応器６に入る。前
電解用電極５の役割は、試料中に多量のＬ-アスコルビ
ン酸が含まれるような場合に、それを電極酸化して、ヒ
スタミンの定量に影響を与えないようにすることにあ
る。反応器６に導入された溶液に含まれるヒスタミン
は、反応器６内に固定化されたヒスタミン酸化酵素によ
ってほぼ完全に酸化され、この酸化反応によって生成し
た過酸化水素はフローセル７に入って、作用電極８上の
電極反応により検出される。フローセル７には、作用電
極８に対する対向電極９と参照電極１０とが配置されて
いる。各電極への電圧の印加および電極電流の計測はポ
テンシオスタット１１により行われ、計測の結果はレコ
ーダ１２によって記録される。電極反応後の液は廃液１
３としてフローセル７外に排出される。

【００１４】図２は図１におけるフローセル７の拡大断
面図を示す。図２に示したように、グラッシーカーボン
電極上に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含
有するオスミウムポリビニルピリジン誘導体の修飾膜
（図中、Ｏｓ-ｇｅｌ-ＨＲＰフィルムと表示）を形成し
たものである。作用電極と対向電極との間の間隔はガス
ケットによって一定に保たれ、両電極間の間隙が流路の
一部となって、液中の過酸化水素はここで電極反応によ
って還元される。

【００１５】本発明に関わるヒスタミンセンサを用いて
ヒスタミンを測定する際の反応式を次に示す。

【００１６】

【化１】

【００１７】ヒスタミンは、酵素反応器に固定化された
ヒスタミン酸化酵素により、式１に示すように酸化さ
れ、１分子のヒスタミンから１分子の過酸化水素（Ｈ₂
Ｏ₂）が生成する。生成した過酸化水素は電極上のペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）により還元されるが、その際に
ペルオキシダーゼ自身は酸化体となり、電極とペルオキ
シダーゼとの間の電子移動を仲介する膜を酸化する（式
２）。その後、膜が、式３に示すように、電極により還
元されることにより電極に電流（還元電流）が流れ、そ
れがポテンシオスタットによって測定される。これらの
反応式から明らかなように、酸化されたヒスタミンの量
と、電極より供給される電子の量とは比例するために、
電極を流れる還元電流値を時間について積分して電子の
量を求めることによりヒスタミンを定量することができ
る。

【００１８】ペルオキシダーゼの膜を介した還元反応
は、銀／塩化銀参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位
で行うことができる。このように、電極反応に還元反応
を用いることにより、妨害物質の影響の少ない低い電位
での測定が可能になる。一方、培養細胞から放出される
試料を連続的に測定する場合においては、センサの廃液
側をシリンジポンプなどで吸引して試料を導入すること
もできる。また、試料量を減らすために反応器と検出器
を集積化した微小化センサをマイクロマシン技術を用い
てガラスやシリコン基板に作製して用いることもでき
る。

【００１９】本発明に関わるセンサの製造工程において
は、まず、ヒスタミン酸化酵素の流路への固定化を行
う。

【００２０】図３はヒスタミン酸化酵素の固定化の方法
を説明する図である。すなわち、ヒスタミン酸化酵素の
固定化の方法としてはビーズに酵素を固定化し、それを
直接あるいは、図３（ａ）に示すように、カラムに充填
した形で反応器内に設置する方法や、図３（ｂ）に示す
ように、流路の内壁へ酵素を固定化して中空の反応器を
作製する方法等をあげることができる。なお、酵素を固
定化する方法としては、後述の実施例１におけるよう
に、共有結合による固定化方法、あるいは、後述の実施
例４におけるように、高分子膜内に取り込む形で固定化
する方法などがある。

【００２１】一方、検出用のフローセルは、高速液体ク
ロマトグラフィやフローインジェクション分析に用いる
市販の電気化学フローセルを使用する方法やホトリソグ
ラフィとスパッタ、蒸着、ＣＶＤ（化学気相堆積法）な
どの薄膜形成技術を用いて作製した電極と流路を組みあ
わせることにより得られる。電極の上には過酸化水素を
還元し電極から電子を受け取る性質を有する膜を形成す
る。具体的には例えば導電性高分子に過酸化水素を還元
するペルオキシダーゼを複合した膜などが利用可能であ
る。

【００２２】更に、試料溶液にＬ-アスコルビン酸など
の電気化学測定の妨害となる物質を含む場合は、膜中に
更にＬ-アスコルビン酸酸化酵素を複合するか、あるい
は、最上層にアニオン性の高分子膜を修飾し、膜の静電
的な反発作用によりＬ-アスコルビン酸等の妨害物質の
影響を除くことができる。

【００２３】導電性高分子膜としては、ポリピロールや
その誘導体、ポリアニリンやその誘導体が挙げられる。
これらの膜はペルオキシダーゼ、あるいはペルオキシダ
ーゼとそれぞれの高分子のモノマーを塩化カリウムなど
の電解質と共に溶解させた水溶液にセンサ用の電極を参
照電極、対向電極と共に浸した後、各電極をポテンシオ
スタットの対応する端子に繋ぎ、センサ用の電極に電位
を印加することにより酵素を取り込んだ膜を形成するこ
とができる。あるいはペルオキシダーゼを含むポリビニ
ルフェロセン膜やオスミウム-ポリビニルピリジン膜な
どの酸化還元性の高分子も使用することができる。最上
層へ修飾するアニオン性の膜としてはナフィオン等をあ
げることができる。

【００２４】すでに述べたように、本発明に関わるヒス
タミンセンサにおいては、電極還元反応を、銀／塩化銀
参照電極に対して 0 mV 以下の低い電位で行う。このた
め、肥満細胞や脳神経細胞のヒスタミンを計測する際に
共存する電気化学的に活性なＬ-アスコルビン酸が電極
で直接酸化されない電位で測定を行うことができ、高い
選択性を実現することができる。一方、ペルオキシダー
ゼが過酸化水素を還元する際に、多量のＬ-アスコルビ
ン酸が存在すると、酸化状態にあるペルオキシダーゼや
導電性高分子がＬ-アスコルビン酸により還元される（
R. Maidan andA. Heller、Amalytical Chemistry、64
巻、2889-2896頁、(1992年) 参照）。このため、ヒスタ
ミンが酸化されて生成する過酸化水素の量が一定の場合
でも、Ｌ-アスコルビン酸の膜内濃度が増加すると、電
極上で観測される還元電流は減少する。この反応は、修
飾電極最上部にナフィオンなどのアニオン性の膜をコー
ティングするか、あるいは酵素反応器の上流に電極（図
１の前電解用電極５）を組み込み、前電解により試料に
含まれるＬ-アスコルビン酸をほとんど酸化することに
より防ぐことができる。

【００２５】以下に、本発明の実施の形態について、実
施例を用いて、更に詳しく説明する。

【００２６】（実施例１）上記において説明した本願発
明の電気化学検出器を用いて次のような実験を行った。

【００２７】図４に、ヒスタミン酸化酵素をガラスビー
ズに固定化する工程を示す。

【００２８】（ａ）ガラスビーズ（直径 20μｍ）を約
1ｇ、３-アミノプロピルトリエトキシシラン 1％を溶解
させたアセトン中にけん濁させ、70℃で３時間反応させ
た。この反応（シランとビーズ表面との反応）により、
ビーズの表面が末端にアミノ基（−ＮＨ₂）をもつ分子
で修飾される。

【００２９】（ｂ）反応後、ガラスビーズが沈降するの
を待ち、上澄み液を捨て、再度アセトンを加えてその操
作を３回くり返すことにより洗浄した。アセトンを蒸発
させた後、今度は 2％のグルタルアルデヒド水溶液にビ
ーズをけん濁させ１時間反応させた。この反応により、
ビーズの表面が末端にアルデヒド基（−ＣＨＯ）をもつ
分子で修飾された形になる。

【００３０】（ｃ）反応後、ビーズをフィルターにより
ろ過回収し、水洗を行って未反応のグルタルアルデヒド
を完全に除いた。次にヒスタミン酸化酵素を溶解させた
100ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ 7.0、酵素濃度：10 ユ
ニット／ｍリットル）にビーズを溶解させ、３時間以上
放置し酵素をビーズ上のグルタルアルデヒドと反応させ
て、酵素をビーズに固定化した。図中、酵素を、Ｅと表
示した正方形で示す。

【００３１】（ｄ）酵素固定化後、 1％グリシン水溶液
で洗浄して未反応のアルデヒド残基をグリシンと反応さ
せて、分子の末端を化学的に比較的安定なカルボキシル
基（−ＣＯＯＨ）とし、ヒスタミン酸化酵素の固定化工
程を終了した。

【００３２】次に高速液体クロマトグラフイの配管に使
用するピークチューブ（内径 0.5ｍｍ、長さ 4ｃｍ）の
一方の出口に円筒型のフェルト（外径 0.5ｍｍ、長さ 3
ｍｍ）を挿入し、フィルタとした。次にもう一方の出口
よりシリンジを用いて緩衝溶液にけん濁させた酵素固定
化ビーズを充填した。充填後、もう一方の出口も円筒型
のフェルトで塞ぎ、酵素反応器を得た。

【００３３】次にグラッシーカーボン電極（直径 6ｍ
ｍ：ビーエ一エス社製）上に西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）を含むオスミウムポリビニルピリジン誘導
体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を 2μリットル
塗布し乾燥させて高分子膜を形成した。この電極をフロ
ーセル中にセットし、上流側にヒスタミン酸化酵素を固
定化したビーズを充填したカラムを挿入し、ポンプや前
電解用電極をセットして図１に示したセンサを構成し
た。

【００３４】センサの作用電極（図１の８）、前電解用
の白金円管電極（図１の５）、銀／塩化銀参照電極（図
１の１０）および対向電極（ステンレスブロック製、図
１の９）をポテンシオスタットＬＣ４Ｃ（Bioanalytica
l Systems 社製、図１のポテンシオスタット１１）のそ
れぞれに対応する端子に接続した。またセンサは高速液
体クロマトグラフィ用のポンプを用いて送液し、ヒスタ
ミン酸化酵素固定化カラム（図１の反応器６）とポンプ
の間にはサンプルインジェクター（図１の４）を組み込
んだ。

【００３５】センサの作用電極の電位を銀／塩化銀参照
電極に対して 0Ｖに保持し、ポンプにより流速 10μリ
ットル／分で送液しながらサンプルインジェクターより
一定量のサンプルを注入した。その結果を図５に示す。

【００３６】濃度 1μＭのヒスタミン溶液を 10μリッ
トル注入すると 25ｎＡのピークが得られた。一方、メ
チルヒスタミンを濃度 1μＭで注入すると、電流値は
3.5ｎＡ程度であった。一方、ジアミンであるプトレシ
ンやカダベリンを加えると応答は数百分の１となり、高
い選択性が得られることが分かった。

【００３７】図６にヒスタミン濃度と電流の関係を示
す。図が示すように、きわめて広いヒスタミン濃度範囲
において、濃度と電流値の直線関係が得られていること
が分かる。このような実用上好ましい直線関係が得られ
る理由は、本発明に関わるヒスタミンセンサにおいて、
試料中のヒスタミンがヒスタミン酸化酵素によってほと
んど完全に酸化されていることにある。この酸化が不完
全であると、特にヒスタミン濃度が高い範囲において、
電流値が比例計算で求められる値よりも小さくなり、そ
の分だけ測定誤差を生じる。また、ヒスタミンの濃度を
10ｎＭまで減らしても測定を行うことができ、低い検
出限界を達成することができた。一方、図４のピークを
時間に関して積分すると、最も高濃度である 100μＭの
ヒスタミンを 10μリットル注入した場合、1.9×10^-4Ｃ
の電荷が観測され、化学量論的数値計算によって、注入
したヒスタミンがほぼ 100％反応していることが分かっ
た。次に、電極電位を -50ｍＶ（銀／塩化銀参照電極に
対して）にしてＬ-アスコルビン酸（10μＭ、10μリッ
トル）を注入すると、0.4ｎＡの酸化電流が観測される
のみであり、Ｌ-アスコルビン酸単独ではほとんど電流
が流れないことが分かった。しかしながら、1μＭのヒ
スタミンとＬ-アスコルビン酸を両方含む溶液を 10μリ
ットル注入すると、還元電流は 4.7ｎＡに減少した。こ
れは、ヒスタミン酸化酵素の反応で発生した過酸化水素
がＨＲＰで還元されＨＲＰにオスミウム-ポリビニルピ
リジン膜を通して電極から電子が供給される際に、ＨＲ
Ｐや高分子がＬ-アスコルビン酸により還元され、電極
から供給される電子が減少するためである。そこで、図
１に示した前電解用電極５に 700ｍＶの電位を印加し、
Ｌ-アスコルビン酸が反応器６に入る前に酸化されるよ
うな処置を講じてから、同一の試料を注入すると、電流
値は 24.3ｎＡまで回復し、Ｌ-アスコルビン酸の影響を
ほぼ完全に除去できることが分かった。

【００３８】試料として、常温で５日間放置したハマチ
切り身と解凍直後のハマチの切り身をホモジナイザーで
すり潰し、ろ過した液を各 10μリットルずつセンサに
注入した。その結果、前者では 21(±0.5、n = 5)ｎ
Ａ、後者では 0.02ｎＡのピークが得られ、鮮度の測定
に十分便用可能であることが分かった。ここに、n = 5
は、データの個数が５であることを示している。

【００３９】（実施例２）実施例１と同様な方法で作製
した電極をセットしたフローセルと、ヒスタミンを固定
化したビーズを充填したカラムを用いた測定系を図７に
示す。図７において、フローセルの廃液側をシリンジポ
ンプに接続し、カラムをテフロン細管を介して、先端を
熱で延伸したキャピラリーに接続した。センサの作用、
参照、対向電極を実施例１と同じポテンシオスタットに
接続し、作用電極に銀／塩化銀対向電極に対して -50ｍ
Ｖの電位を印加した。ガラス管を顕微鏡用のマイクロポ
ジショナーに取り付けた。顕微鏡観察下にラットＲＢＬ
-２Ｈ３培養細胞を入れたシャーレを置き、顕微鏡観察
下でガラス管の先端を細胞のコロニーに 1μｍの距離ま
で近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３セルはあらかじめ１０時
間前に培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加え
て置いたものを使用した。細胞近傍液を流速4μリット
ル／分で吸引しながら、細胞を牛血清アルブミンにジニ
トロフェノールを結合させたもの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を
含む緩衝溶液を加えると、還元電流の増加が観測され
た。一方、ＢＳＡ-ＤＮＰを含んでいない溶液では電流
値の増加は全く観測されず、抗原抗体反応に伴うヒスタ
ミン放出をセンサによりリアルタイム検出することがで
きた。

【００４０】（実施例３）図８は、本発明に関わるヒス
タミンセンサの一実施例におけるセンサの構造を示す。
図８において、８１はシリンジポンプ、８２はＨＲＰを
含オスミウム-ポリビニルピリジン膜を修飾した作用電
極、８３は銀参照電極、８４は対向電極、８５は前電解
用電極、８６はヒスタミン酸化酵素を充填した微少量反
応器、８７はサンプリング用ガラスキャピラリー、８８
は電極が形成された基板、８９は微小流路が形成された
基板、９０は微小流路である。ここで、電極が形成され
た基板８８は絶縁性基板であり、その上に各電極が薄膜
電極の形で形成されている。

【００４１】図８において、サンプリング用ガラスキャ
ピラリー８７より連続的に採取されたヒスタミンは微少
量反応器８６中で酵素反応し、生成した過酸化水素は作
用電極８２上でＨＲＰを含むオスミウム-ポリビニルピ
リジン膜を介して電極還元される。

【００４２】センサは微小流路が形成された基板８９と
電極が形成された基板８８とを貼り合わせて作製されて
いる。このセンサの作製工程を以下に示す。

【００４３】まず、微小な矩形断面の流路を有する基板
を次のようにして作製した。すなわち、パイレックスガ
ラスウェハ（３インチ）上にポリイミド（東レ製）を厚
さ20μｍになるようスピンコート（回転塗布）した。次
に、シリコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フ
ォトレジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（回転塗
布機、ミカサ社製）により 2000回転／分で回転塗布し
た。その後、流路パタンが描かれたフォトマスクをウェ
ハに重ね、マスクアライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン
製）を用いて流路のパタンを露光した。露光後、アルカ
リ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレジストパタ
ンを形成した。現像後のウェハでは流路以外の部分がシ
リコン系レジストパタンに覆われているので、このレジ
スト付き基板を反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-
４５１、アネルバ製）に入れ、シリコン系レジストパタ
ンをマスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われ
ていない部分のポリイミド膜を除去した。エッチング条
件は、圧力 5Ｐａ、パワー 100Ｗ、酸素流量 100ＳＣＣ
Ｍで時間は 110分とした。ポリイミドパタンを形成後、
基板を別の反応性イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５
１、アネルバ製）に入れ、ポリイミドをマスクにしてＣ
₂Ｆ₆ガスのプラズマによりガラスをエッチングした。条
件は圧力 2Ｐａ、パワー 500Ｗ、流量 100ＳＣＣＭ、時
間 120分とし、深さを 22μｍとした。ガラス流路を形
成後、酸素の反応性イオンエッチング装置により、残っ
たポリイミド膜を取り除きガラス流路を得た。その後、
流路の両端から約 7ｍｍ程ダイシングソー（ディスコ社
製）により、端から 1ｍｍが400μｍの深さになるよう
に、幅 400μｍカットしキャピラリー接続用の溝とし
た。

【００４４】一方、薄膜電極を有する基板を次のように
して作製した。すなわち、まず、３インチのパイレック
スガラスウェハを用い、熱ＣＶＤ法により炭素薄膜（膜
厚：100 ｎｍ）を形成した。ＣＶＤ法は、石英基板をガ
ラス管内において 1000℃に加熱し、出発物質としてフ
タロシアニンを用い、400℃で昇華、ウェハ上で熱分解
させる方法を用いた。炭素膜が形成されたウェハ上にシ
リコン系反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）用フォトレ
ジスト（ＮＴＴ-ＡＴ社製）をスピナー（ミカサ社製）
により 4000回転／分で回転塗布した。その後、電極パ
タンが描かれたフォトマスクをウェハに重ね、マスクア
ライナーＰＬＡ-５０１（キヤノン製）を用いて４電極
のパタンを露光した。露光後、アルカリ現像液中で現像
を行い、水洗、乾燥してレジストパタンを形成した。現
像後のウェハでは電極パタンの部分のみがレジストパタ
ンに覆われているので、このレジスト付き基板を反応性
イオンエッチング装置（ＤＥＭ-４５１、アネルバ製）
に入れ、レジストパタンをマスクにして酸素プラズマに
よりレジストに覆われていない部分の炭素膜を除去し
た。エッチング条件は、パワー70Ｗ、圧力 2Ｐａ、酸素
流量 100ＳＣＣＭとした。その後、アセトン中で、レジ
ストを剥離し電極パタンを得た。電極はサンプリング用
のキャピラリーが接続されている側から前電解用電極、
作用電極、参照電極、対向電極として用いた。作用電極
上にはＨＲＰを含むオスミウムポリビニルピリジン誘導
体溶液（Bioanalytical Systems 社製）を塗布し、膜を
形成した。また、参照電極用基板上には参照物質として
銀ペーストを薄く塗布した。

【００４５】その後、キャピラリーを接続した矩形断面
流路が形成された基板と酵素／高分子修飾薄膜電極が形
成された基板とを両方の流路が向かい合うように押しあ
て位置合わせ後、光硬化性の接着剤を周りから浸み込ま
せた。接着剤が浸みこんだ後、高圧水銀ランプを用いて
光を照射し、基板を接着し、センサチップを完成させ
た。

【００４６】図９は上記のようにして作製したヒスタミ
ンセンサの流路の上からの見取り図である。流路は酵素
を充填するための幅の広い部分とその下流側に酵素を押
さえるためのグレーティング状のフィルターが形成され
た構造を有している。溶融石英キャピラリー（サイズ、
外径 375μｍ、内径 150μｍ、ＧＬサイエンス社製）を
フィルタを挟んで幅の広い流路がある反対側の出口（図
９における右側斜線部分）に埋め込み接着剤により固定
し、その末端をシリンジポンプに接続した。実施例１で
使用したヒスタミン酸化酵素を固定化したビーズをけん
濁させた液に、センサチップのキャピラリーを接続して
いない側（図９における左側斜線部分）を浸し、液をマ
グネットスターラで撹拌しながら、シリンジで吸引する
とビーズが流路内に導入され、反応器部分に充填され
た。その後、先端を熱で延伸して細くしたキャピラリー
（図８中の８７）をセンサの流路（図９における左側斜
線部分）に挿入し、光硬化性樹脂により接着した。

【００４７】センサの前電解用電極、ヒスタミンを測定
するための作用電極、参照及び対向電極（それぞれ、図
８中の８５、８２、８３及び８４）をポテンシオスタッ
トＬＣ４Ｃのそれぞれに対応する端子に接続した。測定
はシリンジポンプを用いてサンプリング用のキャピラリ
ーから溶液を吸引しながら、作用電極に -50ｍＶの電位
を印加して行った。流速 1μリットル／分で溶液を吸引
し、試料として 1μＭのヒスタミンを吸引すると 5.2ｎ
Ａの還元電流が観測され、吸引されたヒスタミンがほぼ
100％反応していることが分かった。

【００４８】一方、同一濃度のメチルヒスタミンを測定
すると 0.8ｎＡの還元電流が観測された。また、ジアミ
ンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数百
分の１であり、高い選択性が確認された。ヒスタミン濃
度を下げていくと、20ｎＭの試料を注入してもＳ／Ｎ比
が２以上で電流値の増加を観測することができた。ま
た、流速 8μリットル／分で測定を行うと、試料導入開
始後、約 20秒以内に定常状態に達し、これまで提案さ
れているヒスタミンの酵素反応に伴う酸素消費を測定す
る方法に比較して優れた応答性が確認された。応答性は
流速を上げると更に向上させることができた。

【００４９】センサをマニピュレータに接続し、培養し
たラットＲＢＬ-２Ｈ３セルのコロニー（直径 100μｍ
以下）に、顕微鏡観察下で、センサのサンプリングキャ
ピラリー先端を 1μｍまで近接させた。ＲＢＬ-２Ｈ３
セルはあらかじめ１０時間まえに培養液中にイムノグロ
ブリンＥ（ＩｇＥ）を加えて置いたものを使用した。細
胞近傍液を流速 1μリットル／分で吸引しながら、細胞
を牛血清アルブミンにジニトロフェノールを結合させた
もの（ＢＳＡ-ＤＮＰ）を加えると、図１０に示すよう
に還元電流が増加し、僅かな量の細胞試料からのヒスタ
ミンの放出をリアルタイムに近い形で高感度に測定する
ことができた。

【００５０】（実施例４）実施例３と同様な方法によ
り、微小流路が加工されたガラス基板と、炭素薄膜電極
が形成された基板を作製した。微小流路が加工された基
板の流路両端には実施例３と同様に２本の溶融石英キャ
ピラリーを接続した。両基板の見取り図を図１１に示
す。図中、作用電極を、銀／塩化銀参照電極、対向電極
と共にポテンシオスタットＢＡＳ１００Ｂ（Bioanalyti
cal Systems 社製）に接続し、80000ユニット／リット
ルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、0.05Ｍの
塩化カリウム、0.05Ｍのピロールを含む水溶液を入れた
容器に浸した。銀／塩化銀電極に対して 1Ｖの電位を 2
0秒間印加してポリピロール／酵素複合膜で修飾された
電極を得た。更にこの電極をアニオン性高分子であるナ
フィオンを３％含む溶液（アルドリッチ社製）に一瞬浸
漬した後乾燥しヒスタミンセンサを作製した。次にヒス
タミン酸化酵素 2重量％、牛血清アルブミン 2％、グル
タルアルデヒド 0.2％含む水溶液を微小流路が加工さ
れた基板の流路幅が太い部分と、電極が形成された基板
の、前電解用電極とポリピロール／ＨＲＰ複合膜の間に
塗布し、乾燥させた。乾燥後、両基板を位置合わせをし
た後、紫外線硬化樹脂により張り合わせ、センサを得
た。このセンサを実施例３と同様にヒスタミン溶液（濃
度 1μＭ）を連続的に吸引注入すると、流速 8μリット
ル／分では 18.0ｎＡ（±1.7ｎＡ、n = 5）の還元電流
が得られ、反応率が約７０％で、くり返し測定における
ばらつきも大きかった。

【００５１】一方、流速 4μリットル／分で測定を行う
と、12.7ｎＡ（±0.5ｎＡ、n = 5）の値が得られ、セン
サに導入されたヒスタミンが全て反応していることが分
かった。また、100％反応時ではくり返し測定によるデ
ータのばらつきが小さいことが分かった。一方、作用電
極上がアニオン性高分子であるナフィオン膜により被覆
されているため、前電解電極に電位を印加せずとも、Ｌ
-アスコルビン酸の影響を抑制することができた。同様
の効果は、ヒスタミン酸化酵素と共にＬ-アスコルビン
酸酸化酵素を固定化した時や、電極上のポリピロール膜
に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵素をＨＲＰと共に固定化
した時にも観測された。

【００５２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明は下記の効
果を有する。すなわち、 １．試料より不純物などを分離することなく、直接、ヒ
スタミンの測定を行うことができる。

【００５３】２．基質であるヒスタミンを完全に酵素反
応させ、それによって生成する過酸化水素を完全に電極
反応させることにより、高い測定精度でヒスタミンの測
定を行うことができる。

【００５４】３．細胞から放出されるヒスタミンなどの
マイクロリットル以下の微少量試料中のヒスタミンの測
定に使用することができる。

【００５５】４．極めて感度が高く、20ｎＭ（0.01ｍｇ
／1000ｇ）以下の検出限界が得られる。

【００５６】５．微細化が容易なため、応答性が極めて
速いセンサが得られ、30秒以下で応答を得ることができ
る。

【００５７】本発明に関わるヒスタミンセンサは、上記
の優れた特徴を有するので、従来、ヒスタミンセンサの
有力な応用分野とされてきた食肉、鮮魚などの食品検査
の分野のみならず、上記の優れた特徴を活かして、細胞
計測など医学や生理学分野においても応用される可能性
が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の構成を説明する図である。

【図２】本発明に関わるヒスタミンセンサのフローセル
の構成を説明する断面図である。

【図３】本発明に関わるヒスタミンセンサにおけるヒス
タミン酸化酵素の固定化の方法を説明する図である。

【図４】本発明に関わるヒスタミンセンサの構成要素で
あるヒスタミン酸化酵素固定化ビーズの作製工程を説明
する図である。

【図５】実施例１における測定結果を示す図である。

【図６】実施例１における測定結果を示す図である。

【図７】本発明の実施例２に示したヒスタミンセンサの
構造と使用方法とを説明する模式図である。

【図８】実施例３におけるヒスタミンセンサの構造を説
明する模式図である。

【図９】実施例３におけるヒスタミンセンサの流路の上
からの見取り図である。

【図１０】実施例３における測定結果を示す図である。

【図１１】実施例４におけるヒスタミンセンサの構成を
説明する図である。

【符号の説明】

１…シリンジポンプ、２…プランジャポンプ、３…キャ
リア液、４…インジェクタ、５…前電解用電極、６…反
応器、７…フローセル、８…作用電極、９…対向電極、
１０参照電極、１１…ポテンシオスタット、１２…レコ
ーダ、１３…廃液、８１…シリンジポンプ、８２…作用
電極、８３…銀参照電極、８４…対向電極、８５…前電
解用電極、８６…微少量反応器、８７…サンプリング用
ガラスキャピラリー、８８…電極が形成された基板、８
９…微小流路が形成された基板、９０…微小流路。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 堀内 勉 東京都千代田区大手町二丁目３番１号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 鳥光 慶一 東京都千代田区大手町二丁目３番１号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 栗田 僚二 東京都新宿区西新宿二丁目１番１号 エ ヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株 式会 (72)発明者 前山 一隆 愛媛県松山市湯の山３丁目１番地７ (72)発明者 谷澤 克行 大阪府豊能郡豊能町希望ケ丘２−30−２ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ16 QQ61 QR02 QR03 QR83 QS20 QX05

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料溶液が流れる流路の一部分に、固定化
   されたヒスタミン酸化酵素を有し、前記流路の前記固定
   化されたヒスタミン酸化酵素の位置よりも下流部分に、
   電極反応を介して過酸化水素を還元する性質を有する膜
   で修飾された電極を有していることを特徴とするヒスタ
   ミンセンサ。
2. 【請求項２】請求項１記載のヒスタミンセンサにおい
   て、前記電極が絶縁性基板上に形成された薄膜電極であ
   ることを特徴とするヒスタミンセンサ。
3. 【請求項３】請求項１または２記載のヒスタミンセンサ
   において、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素がビー
   ズに固定化されたヒスタミン酸化酵素であることを特徴
   とするヒスタミンセンサ。
4. 【請求項４】請求項１または２記載のヒスタミンセンサ
   において、前記固定化されたヒスタミン酸化酵素が前記
   流路の内壁に、共有結合によって固定化されるかあるい
   は高分子膜内に取り込まれた形で固定化されたヒスタミ
   ン酸化酵素であることを特徴とするヒスタミンセンサ。
5. 【請求項５】請求項１乃至４記載のヒスタミンセンサに
   おいて、前記過酸化水素を電極反応を介して還元する性
   質を有する膜がペルオキシダーゼ系の酵素を含有する膜
   であることを特徴とするヒスタミンセンサ。
6. 【請求項６】請求項１乃至５記載のヒスタミンセンサに
   おいて、前記電極反応を介して過酸化水素を還元する性
   質を有する膜で修飾された電極が、更に、アニオン性の
   高分子膜、あるいはＬ-アスコルビン酸酸化酵素を含有
   する膜で修飾されていることを特徴とするヒスタミンセ
   ンサ。
7. 【請求項７】請求項１乃至５記載のヒスタミンセンサに
   おいて、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵
   素の位置よりも上流部分に、Ｌ-アスコルビン酸酸化酵
   素を含有する膜を有することを特徴とするヒスタミンセ
   ンサ。
8. 【請求項８】請求項１乃至７記載のヒスタミンセンサに
   おいて、前記流路の前記固定化されたヒスタミン酸化酵
   素の位置よりも上流部分に、電気化学的に酸化されやす
   い物質を酸化するための電極を有することを特徴とする
   ヒスタミンセンサ。