JP2001054379A - 微生物の培養方法 - Google Patents

微生物の培養方法

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JP2001054379A
JP2001054379A JP11229512A JP22951299A JP2001054379A JP 2001054379 A JP2001054379 A JP 2001054379A JP 11229512 A JP11229512 A JP 11229512A JP 22951299 A JP22951299 A JP 22951299A JP 2001054379 A JP2001054379 A JP 2001054379A
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Japan
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homoserine lactone
siderophore
medium
strain
microorganisms
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JP11229512A
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Gakuraku Kan
楽珞 管
Hiroyuki Onuki
裕之 大貫
Kei Kamino
圭 紙野
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Marine Biotechnology Institute Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 微生物を、シデロフォアー及びアシル化
ホモセリンラクトン若しくはその類似化合物を含有する
培地で培養することを特徴とする微生物の培養方法。 【効果】 従来培養が困難であった海洋細菌の培養が容
易になり、また、鉄イオン濃度の低い条件下でも培養が
可能になるので、培地コストの削減を図ることもでき
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の培養方法
に関する。本発明により、海洋細菌等で従来培養が困難
であった微生物の培養が可能になり、また、鉄イオン濃
度の低い条件下でも培養が容易になるので、培地コスト
の削減も図ることができる。
【0002】
【従来の技術】海洋には、多種多様な微生物が生息して
おり、それらの中には数多くの有用な微生物が含まれて
いると考えられている。しかしながら、それらの微生物
を何らかの用途に利用することに成功した例はあまりな
い。これは、陸上の微生物が、有用物質の生産など様々
な用途に実際に利用されていることと好対照をなす。こ
のように海洋微生物の利用例が少ないことの一番の理由
は、海洋微生物を効果的に増殖させ得る培地の数が少な
く、人工的な環境下においてその微生物の生態を観察す
ることが困難なことにある。現在、市販されている海洋
微生物用の培地としては、Marine Broth 2216(DIFCO社
製)、Tryptic Soy Agar(DIFCO社製)などがある。こ
れらの培地によって増殖可能な微生物も存在するが、増
殖できないものが数多い。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】広範な種類の海洋微生
物を増殖させることのできる培地があれば、海洋微生物
の有効な利用を図ることが可能になる。本発明は、この
ような技術的背景の下になされたものであり、従来の培
地では培養することが困難であった海洋微生物に対して
も効率的に増殖させることのできる培養手段を提供する
ことを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海洋細菌
が鉄イオンが不足する環境中で生合成するシデロフォア
ーと呼ばれる鉄イオンキレーターと一般にオートインデ
ューサーと呼ばれるグラム陰性細菌間の情報伝達物質で
あるアシル化ホモセリンラクトン若しくはその類似化合
物(以下、これらの物質を「アシル化ホモセリンラクト
ン類」という)に着目し、これら2種類の物質を培地中
に添加することにより、従来の培地では増殖できなかっ
た海洋微生物が増殖できるようになるのを見出し、本発
明を完成した。即ち、本発明は、微生物を、シデロフォ
アー及びアシル化ホモセリンラクトン類を含有する培地
で培養することを特徴とする微生物の培養方法である。
【0005】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する本
発明の微生物の培養方法は、シデロフォアー及びアシル
化ホモセリンラクトン類を含有する培地で培養すること
を特徴とするものである。対象とする微生物は、主に海
洋細菌であり、その中でもカイメンから単離される海洋
細菌であるが、他菌種由来のシデロフォアーとアシル化
ホモセリンラクトン類により、生育する微生物であれば
特に限定されない。このような微生物の具体例として
は、例えば、ペラギオバクター属に属する微生物を例示
することができる。また、海洋細菌の中には、実施例5
及び6のSHG1株、SHG2株、SHG3株、SHG4株など既存の富
鉄富栄養培地や貧鉄貧栄養培地では増殖できない菌株も
存在する。本発明の培養方法は、このような微生物の培
養に特に好適である。
【0006】本発明に使用するシデロフォアーは、適当
なアシル化ホモセリンラクトン類と共存することによ
り、対象とする微生物を生育させる機能を有するもので
あればどのようなものでもよい。本発明に使用可能なシ
デロフォアーの具体例としては、V0902株由来のシデロ
フォアー、V0304株由来のシデロフォアーなどを挙げる
ことができるが、これら以外にもアグロバクテリウム
属、ビブリオ属、マリノバクテリウム(Marinobacteriu
m)属に属する微生物、α-proteobacterium sp.に属す
る微生物の生産するシデロフォアーを使用することがで
きる。培地中のシデロフォアー濃度は、対象とする微生
物にシデロフォアーの生合成を開始させ得る範囲内であ
れば特に限定されない。
【0007】本発明に使用するアシル化ホモセリンラク
トン類は、他菌種由来のシデロフォアーと共存すること
により、対象とする微生物にシデロフォアーの生合成を
開始させる機能を有するものであればどのようなもので
もよい。アシル化ホモセリンラクトンの類似化合物とし
ては、例えば、N-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン(C
4)、N-((3R)-3-ヒドロキシブタノイル)-L-ホモセリン
ラクトン(3OHC4)、N-ヘキサノイル-L-ホモセリンラク
トン(C6)、N-(3-オキソヘキサノイル)-L-ホモセリン
ラクトン(3OC6)、N-オクタノイル-L-ホモセリンラク
トン(C8)、N-(3-オキソオクタノイル)-L-ホモセリン
ラクトン(3OC8)、N-デカノイル-L-ホモセリンラクト
ン(C10)、N-(3-オキソデカノイル)-L-ホモセリンラ
クトン(3OC10)、又はN-(3-オキソドデカノイル)-L-ホ
モセリンラクトン(3OC12)等を挙げることができる
が、これらに限定されるわけではない。
【0008】培地中のアシル化ホモセリンラクトン類の
濃度は限定されるわけではないが、1nM以下であること
が好ましい。培地中のシデロフォアー及びアシル化ホモ
セリンラクトン類以外の成分の有無、及びその濃度は特
に限定されないが、実施例5のSHG1株、SHG2株、SHG3
株、SHG4株のように富鉄富栄養条件では、シデロフォア
ー及びアシル化ホモセリンラクトン類を添加しても増殖
しない菌株も存在するので、そのような菌株に対しては
通常よりも鉄イオン及び栄養塩等を少なくすることが望
ましい。また、本発明の培養方法によれば、通常の培養
方法では微生物が増殖できないような低い鉄イオン濃度
でも微生物の増殖が可能なので、コスト面から培地中の
鉄イオン濃度は低め(例えば、5.6×10-3mg/l以下)に
設定することが望ましい。
【0009】
【実施例】〔実施例1〕鉄イオンが不足し、アシル化ホ
モセリンラクトン類及びV0902株由来のシデロフォアー
を含む培地中で、V0110株を培養し、アシル化ホモセリ
ンラクトン類及びシデロフォアーがV0110株の生育に与
える影響を調べた。Fijiで採取したカイメン(Jaspis j
oinstoni)約10 gをホモジナイザーで破砕し、破砕溶液
を滅菌海水で10倍、100倍、1000倍で希釈した。それぞ
れ100μlを1/10マリンアガー培地に移し、30℃で2日間
培養し、V0110株を単離した。1/10液体MB培地からchele
x-100(Sigma社)で鉄イオンを除いた後、FeCl3を終濃
度0.1μMになるよう加えた。この培地にV0902株を植菌
し、30℃、100rpm、48時間振盪培養をした。培養液を80
00rpm、15分遠心し、得られた上清を0.2μmのフィルタ
ーで2回濾過し、V0902株由来のシデロフォアーを含む
培養上清を得た。
【0010】CAS寒天培地(表1)に、V0902株の培養上
清250 μlを添加し、V0110株を植菌して30℃で10日間培
養した。また、V0902株の培養上清に加え、5種類のアシ
ル化ホモセリンラクトン類(C4, 3OHC4, C6, 3OC6, C
8)を、それぞれ最終濃度10nMになるよう添加した寒天
培地を作製し、上記と同様に30℃で10日間培養した。ア
シル化ホモセリンラクトン類の合成はChhabraなどらの
文献を参考にした(Chhabra, S. R., P. Stead, N. J.
Bainton, G. P. C. Salmond, G. S. A. B. Stewart, P.
Williams, and B. W. Bycroft. 1993. Autoregulation
of carbapenem biosynthesis in Erwinia carotovora
by analogues of N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lac
tone. J. Antibiot. 46:441-454.、Zhang, L., P. J.
Murphy,A. Kerr, and M. E. Tate. 1993. Agrobacteriu
m conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homo
serine lactones. Nature 362:446-448.、Schaefer A.
L., B. L. Hanzelka, A. Eberhard, and E. P. Greenbe
rg. 1996. Quorum sensing in Vibrio fischeri: Prob
ing autoinducer-LuxR Interactions with autoinducer
analogs. J. Bacteriol. 178: 2897-2901.、Gao, J.-
G. and E. A. Meighen. 1993. Biosynthesis and Stere
ochemistry of the autoinducer controlling luminesc
ence in Vibrio harveyi. J. Bacteriol. 175:3856-38
62.)。その結果、他菌種由来のシデロフォアーが存在
し、さらにアシル化ホモセリンラクトン類のうちC8が存
在するときのみV0110株はコロニーを形成し、生育が認
められた(表2)。コロニーの周りにはオレンジハーロ
ーも見られ、V0110株がシデロフォアーを生合成したこ
とも確認された。
【0011】
【表1】
【0012】
【表2】
【0013】〔実施例2〕鉄イオンが不足し、アシル化
ホモセリンラクトン類及びV0902株由来のシデロフォア
ーを含む培地中で、V0110株を培養し、その生育曲線を
観察した。液体培地としては、BSM培地(表3)を用い
た。鉄イオンを通常の1/100にした(最終濃度は0.1 μ
M)。
【0014】
【表3】
【0015】12本のL字管にBSM液体培地10mlを入れ、V0
902株由来のシデロフォアーを添加したものと添加しな
いものとに、アシル化ホモセリンラクトン類5種類をを
それぞれ終濃度1nMになるように添加して培地とした。
そこへ、OD値が0.3になるよう前培養したV0110株の菌液
1 mlを加え、ADVANTICの振盪温度勾配培養装置TN-2612
で、30℃, 50rpm, 120時間培養し、培養液のOD値を指標
として各培地におけるV0110株の生育の状況を調べた。
その結果図3のような生育曲線を得、V0902株由来のシ
デロフォアーとアシル化ホモセリンラクトン類C8を同時
に添加した培養液でのみV0110 株の生育が認められるこ
とを確認した。
【0016】〔実施例3〕実施例1と同様の培地を用い
て、8種類の海洋細菌を培養し、アシル化ホモセリンラ
クトン類及びV0902株由来のシデロフォアーが各細菌に
与える影響を調べた。8種類の海洋細菌の由来を表4
に、細菌の生育状態を表5に示す。
【0017】
【表4】
【0018】
【表5】
【0019】〔実施例4〕実施例1と同様の培地を用い
て、5種類の海洋細菌を培養し、アシル化ホモセリンラ
クトン類及びV0304株由来のシデロフォアーが各細菌に
与える影響を調べた。各細菌の生育状態を表6に示す。
なお、V0304株は、その16S rDNAがVibrio sp.と97%の相
同性を示す菌株である。また、V0304株の生産するシデ
ロフォアーは、ペーパー電気泳動での移動度が異なるこ
とから、V0902株が生産するシデロフォアーとは異なる
物質であると推測される。
【0020】
【表6】
【0021】〔実施例5〕鉄イオンが豊富な培地中でも
生育しない海洋細菌について、アシル化ホモセリンラク
トン類及びV0304株由来のシデロフォアーが生育に与え
る影響を調べた。海洋細菌SHG1, SHG2, SHG3, SHG4は沖
縄で採取した海水から次のように単離した。modified−
CAS寒天培地(鉄イオンの終濃度は0.1μM、通常の10分
の1)の成分を表7に示す。
【0022】
【表7】
【0023】沖縄で採取した海水100μlを、1μM N-(3-
オキソヘキサノイル)-L‐ホモセリンラクトン (3OC6) 1
00μl + V0304のシデロフォアー成分100μlを添加したm
odified−CAS寒天培地に加え、30℃で培養した。3週間
後4種のコロニーを得、それぞれSHG1, SHG2, SHG3, SH
G4と名付けた。この4種類の菌を以下のa,b,c,dを加え
たmodified−CAS寒天培地に植菌し培養した。
【0024】a. 添加物なし。 b. 1μM 3OC6 100μl c. V0304のシデロフォアー成分 100μl d. 1μM 3OC6 100μl + V0304のシデロフォアー成分100
μl 各菌の生育状態を表8に示す。
【0025】
【表8】
【0026】このSHG1, SHG2について、液体培地中で富
鉄富栄養条件下(市販のMB培地)と貧鉄貧栄養条件下(mod
ified−CAS培地)での生育を比較した。modified−CAS培
地の組成を表9に、各菌の生育状態を表10に示す。
【0027】
【表9】
【0028】
【表10】
【0029】富鉄富栄養条件であるMB培地中ではシデロ
フォア成分とアシル化ホモセリンラクトン類を添加して
も生育しない海洋細菌SHG1,SHG2は、貧鉄貧栄養条件で
あるmodified−CAS培地にシデロフォア成分とアシル化
ホモセリンラクトン類を添加することでのみ生育する。
【0030】
【発明の効果】本発明により、従来培養が困難であった
海洋細菌の培養が容易になり、また、鉄イオン濃度の低
い条件下でも培養が可能になるので、培地コストの削減
も図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】アシル化ホモセリンラクトン類の化学構造を示
す図である。
【図2】アシル化ホモセリンラクトン類の化学構造を示
す図である。
【図3】V0110株の生育曲線を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 紙野 圭 静岡県清水市袖師町1900番 株式会社海洋 バイオテクノロジー研究所清水研究所内 Fターム(参考) 4B065 AA99X BB12 BB28 CA46

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 微生物を、シデロフォアー及びアシル化
    ホモセリンラクトン若しくはその類似化合物を含有する
    培地で培養することを特徴とする微生物の培養方法。
  2. 【請求項2】 アシル化ホモセリンラクトンの類似化合
    物が、N-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン、N-((3R)-3
    -ヒドロキシブタノイル)-L-ホモセリンラクトン、N-ヘ
    キサノイル-L-ホモセリンラクトン、N-(3-オキソヘキサ
    ノイル)-L-ホモセリンラクトン、N-オクタノイル-L-ホ
    モセリンラクトン、N-(3-オキソオクタノイル)-L-ホモ
    セリンラクトン、N-デカノイル-L-ホモセリンラクト
    ン、N-(3-オキソデカノイル)-L-ホモセリンラクト
    ン、又はN-(3-オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラク
    トンであることを特徴とする請求項1記載の培養方法。
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