JP2001046083A - 肝臓に発現している新規トランスポーター遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 肝臓透過性薬物のスクリーニングや人工肝臓
の作製に有用な新規蛋白質、および該蛋白質をコードす
るＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号１か
ら６９１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、有機陰イオンの
輸送に関与する新規蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクター
を保持する宿主細胞および該蛋白質の用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】 肝臓は、血液中から内因・外因性物質
を取り込み、代謝・解毒し、胆汁へ排除する機構をつか
さどり、生体の恒常性維持に欠くべからざる重要な役割
を果たしている。種々の内因・外因性物質のうち、胆汁
酸をはじめとする有機陰イオンの肝臓への取り込みに
は、ナトリウム非依存性の有機陰イオントランスポータ
ーと呼ばれる膜蛋白質が関与していることが、摘出臓器
かん流法、遊離肝細胞、初代培養肝細胞、および単離細
胞膜小胞系などを用いた実験により知られていた。これ
らの研究は、主として胆汁生成メカニズムの生理学的研
究や有機陰イオン系色素を用いた肝機能診断の分野で盛
んに行われてきたが、近年、薬物の中に有機陰イオント
ランスポーターを介して肝臓に取り込まれるもののある
ことが報告されてきている。

【０００３】最近になって、ナトリウム非依存性の有機
陰イオントランスポーターの詳細な機能解析をすること
を目的に、ラット肝臓で発現している有機陰イオントラ
ンスポーター遺伝子ｏａｔｐ１（Hagenbuchら、Proc. N
atl. Acad. Sci. USA、第88巻、10629頁、1991年）、ｏ
ａｔｐ２（Jacqueminら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A、第91巻、133頁、1994年）およびｏａｔｐ３（Abe
ら、J. Biol. Chem.、第273巻、22395頁、1998年）がク
ローニングされた。さらに、ヒト肝臓より、ラットｏａ
ｔｐ類に相同性の高いＯＡＴＰ（Kullak-Ublickら、Gas
troentelogy、第109巻、1274頁、1995年）がクローニン
グされた。しかし、ＯＡＴＰは主として脳に存在してお
り、肝臓での発現はきわめて低いことから、ヒト肝臓に
は別の有機陰イオントランスポーターが存在していると
推察されていたが、そのようなものは未だ得られていな
い。ヒト組織試料を実験目的で自由に入手することは困
難であるうえに、肝細胞を単離し初代培養すると有機陰
イオントランスポーター活性は急速に失活してしまうこ
と、また、トランスポーターの発現や活性には動物間種
差のあることが知られている。さらに、肝細胞を単離し
た後、凍結したり初代培養した場合も有機陰イオントラ
ンスポーター活性は急速に失活してしまうことが知られ
ている。

【０００４】現在、肝臓を標的にした薬剤スクリーニン
グは主として実験動物が用いられているが、必ずしもそ
れらの結果がヒトに当てはまるわけではない。その原因
として、種々の薬物代謝酵素やトランスポーター活性に
種差が存在することが挙げられる。近年、凍結ヒト肝臓
が実験に用いられはじめているが、凍結による活性の消
失が認められており、また倫理的・経費的・ウイルス感
染の危険性等の問題がある。

【０００５】また現在、急性および慢性肝機能障害の治
療は不完全ながら肝臓機能を代行する血漿交換治療ある
いは肝臓移植しかないのが現状であるが、医療経済学的
問題や深刻なドナー不足により広く普及するに至ってい
ない。肝不全原因物質の除去を目的とした各種の吸着剤
・イオン交換樹脂を用いた人工肝補助装置の作製が試み
られているが、このような非特異的除去方法では有害物
質の除去が不完全である。一方、ブタやヒヒ肝細胞を培
養して人工肝臓として代用する試みがなされてきたが、
機能的、特に解毒の面で良好な結果が得られておらず、
臨床応用に至るまで具体化されていない。このように、
現時点では肝不全治療に対する満足な肝機能補助治療法
がなく、効果的な人工肝臓の開発が望まれている。

【０００６】そこで、ヒト肝臓由来のトランスポーター
遺伝子を単離し適当な発現系に組み込むことにより、肝
臓機能の詳細な機構解析、人工肝臓の構築、および肝臓
に選択的に取り込まれ作用する薬物のスクリーニングな
どが可能になることから、ヒト肝臓に特異的な有機陰イ
オントランスポーター遺伝子の単離が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】 ヒト肝臓に特異的な
有機陰イオントランスポーター遺伝子を、株化したヒト
培養肝細胞に導入し、ヒトの生体肝臓に近い薬理学的特
性を有する不死化培養細胞系を樹立することにより、動
物実験よりも信頼性の高い肝臓透過性薬物のスクリーニ
ングが可能である。

【０００８】また、肝臓特有に発現する有機陰イオント
ランスポーター遺伝子を、不死化したヒト肝臓細胞株に
導入して、有機陰イオンを含む肝不全原因物質の取り込
み・排出能を維持した肝細胞系を確立し、それを大量培
養することにより、バイオ人工肝臓を作製し、新たな肝
不全治療システムを構築することが可能である。

【０００９】すなわち、本発明の目的は、上記のような
利用が可能な、ヒト肝臓の血管側膜における有機陰イオ
ン輸送に関与する新規な有機陰イオントランスポーター
遺伝子、および該遺伝子がコードするポリペプチドであ
る有機陰イオントランスポーターを提供することにあ
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】 本発明者らは、ヒト肝
臓から、有機陰イオンを輸送する能力を有する新規蛋白
質の遺伝子をクローニングし、さらに、この遺伝子の産
物をアフリカツメガエルの卵母細胞で発現させて有機陰
イオンの輸送能を確認することに成功し、本発明を完成
するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、（１） 配列表の配
列番号２のアミノ酸番号１から６９１で示されるアミノ
酸配列からなる蛋白質、または配列表の配列番号２のア
ミノ酸番号１から６９１で示されるアミノ酸配列におい
て１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換および
／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰
イオンを輸送する能力を有する蛋白質、（２） 肝臓組
織由来である（１）記載の蛋白質、（３） ヒト由来で
ある（１）または（２）記載の蛋白質、（４） 形質転
換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１ ＳＡＮＫ ７１０９
９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４３）に保持される組換えベ
クターに挿入されているＤＮＡにコードされていること
を特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載
の蛋白質、（５） （１）乃至（４）のいずれか一つに
記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、（６） 配列表の配
列番号１のヌクレオチド番号９２から２１６４で示され
るヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（７） 配列表の
配列番号１のヌクレオチド番号９２から２１６４で示さ
れるヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオンを輸
送する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（８）
肝臓組織由来である、（５）乃至（７）のいずれか一
つに記載のＤＮＡ、（９） ヒト由来である、（５）乃
至（８）のいずれか一つに記載のＤＮＡ、（１０） 形
質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１ ＳＡＮＫ ７１
０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４３）に保持される組換
えベクターに挿入されているＤＮＡ、（１１） 形質転
換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１ ＳＡＮＫ ７１０９
９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４３）に保持される組換えベ
クターに挿入されているＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオンを輸送する
能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（１２）
（５）乃至（１１）のいずれか一つに記載のＤＮＡを含
む組換えベクター、（１３） 発現ベクターである、
（１２）記載の組換えベクター、（１４） （１２）ま
たは（１３）記載の組換えベクターを保持する宿主細
胞、（１５） 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１
ＳＡＮＫ ７１０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４
３）、（１６） （１）乃至（４）のいずれか一つに記
載の蛋白質を特異的に認識する抗体、（１７） （１）
乃至（４）のいずれか一つに記載の蛋白質を動物細胞に
発現させ、該蛋白質の有する有機陰イオンを輸送する能
力を利用して被検物質の肝臓透過性を検定する方法、に
関する。

【００１２】本発明において、「有機陰イオンを輸送す
る能力」とは、細胞膜にあって、有機陰イオン、例えば
タウロコール酸（タウロコレート）を細胞外から細胞内
へ細胞膜を通過させて取り込む活性をいう。すなわち、
本発明の蛋白質を発現している細胞におけるタウロコー
ル酸の細胞内取りこみ量は、本発明の蛋白質が発現して
いない細胞に比べ有意に高い。ここで有機陰イオンと
は、胆汁酸（タウロコール酸、コール酸）、抱合型ステ
ロイド（デヒドロエピアンドロステロン硫酸抱合体、エ
ストラジオールグルクロン酸抱合体、エストロン硫酸抱
合体）、各種エイコサノイド（プロスタグランジンＥ
２、トロンボキサンＢ２、ロイコトリエンＣ４、ロイコ
トリエンＤ４、ロイコトリエンＥ４）、甲状腺ホルモン
（Ｔ４、Ｔ３）、葉酸誘導体（葉酸、メトトレキセー
ト）、エンケファリン誘導体（ＤＰＤＰＥ）およびカル
ボン酸を有する薬物（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤：
プラバスタチン、ＡＣＥ阻害剤：テモカプリル）を挙げ
ることができる。より好適には、タウロコール酸、デヒ
ドロエピアンドロステロン硫酸抱合体、エストラジオー
ルグルクロン酸抱合体、エストロン硫酸抱合体、プロス
タグランジンＥ２、トロンボキサンＢ２、ロイコトリエ
ンＣ４、ロイコトリエンＥ４、甲状腺ホルモンＴ４、同
Ｔ３およびプラバスタチンを挙げることができる。

【００１３】本発明の有機陰イオンを輸送する能力を有
する新規蛋白質、すなわちヒト肝臓有機陰イオントラン
スポーター（ＬＳＴ−１：Liver Specific Transporter
-1）は、生体内においては主として肝臓で発現してお
り、また、その有機陰イオン輸送能（発現細胞への有機
陰イオン取り込み）が細胞外のナトリウムイオンの存在
によって影響を受けない、いわゆるナトリウムイオン非
依存性の有機陰イオントランスポーターである。

【００１４】また、本発明のヒト有機陰イオントランス
ポーターＬＳＴ−１は、既に報告されているヒトの有機
陰イオントランスポーターＯＡＴＰならびにプロスタグ
ランジントランスポーターＰＧＴ（Kanaiら、Science、
第268巻、866頁、1995年)の双方にわずかな相同性を有
する新規な分子種である。さらに、ヒト腎臓からクロー
ニングされた、有機陰イオンとジカルボン酸の交換輸送
を行う有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１（Hosoya
madaら、Am.J.Physiol.、第276巻、F122頁、1999年）と
は相同性がなく、全く別の分子種である。

【００１５】

【発明の実施の形態】 本発明の蛋白質をコードするＤ
ＮＡは、哺乳動物の肝臓の組織や細胞を遺伝子源として
用いてスクリーニングを行うことにより単離取得でき
る。ここで用いられる哺乳動物としては、好ましくはイ
ヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、
ラット、マウスまたはヒトを挙げることができるが、最
も好適にはヒトである。

【００１６】本発明の蛋白質をコードするＤＮＡのスク
リーニングおよび単離は、ライブラリースクリーニング
法により実施できる。例えば、エクスプレスド・シーク
エンス・タグ（以下「ＥＳＴ」という）を含むデーター
ベースを用い、ヒトＯＡＴＰならびにヒトＰＧＴのアミ
ノ酸配列に対して相同的な配列を検索する。得られた配
列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣ
Ｒ」という）用プライマーを作製し、ヒト肝臓ｍＲＮＡ
（クロンテック社）を逆転写したｃＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行う。反応後のサンプルをアガロースゲルにて
電気泳動を行い、増幅されたバンドをゲルより切り出
し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）に
サブクローンニングする。サブクローニングされたイン
サートをそれぞれ切り出し、³²Ｐで放射標識化し、スク
リーニング用プローブとする。

【００１７】一方、ヒト肝臓ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（クロ
ンテク社製）を遺伝子源として、Ｇｕｂｌｅｒ 法に従
ってヒトｃＤＮＡライブラリーを作製する。ヒト肝臓ｃ
ＤＮＡライブラリーを、直径１５ｃｍのプレートあたり
２×１０⁴個のプラークが形成されるように分散させ
る。定法に従い、ナイロンフィルターに、ファージプラ
ークを移しとる。得られたフィルターを、上記³²Ｐ標識
プローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行う。反
応終了後、オートラジオグラフィーを行い、陽性クロー
ンを選択する。得られたクローンについてさらに２次あ
るいは３次スクリーニングまで実施して、完全長に相当
するｃＤＮＡを有するクローンを単離する。

【００１８】このようにして得られるＤＮＡのヌクレオ
チド配列の決定は、例えば、マキサム―ギルバートの化
学修飾法（Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) : "M
ethods in Enzymology" 65, 499-559）やＭ１３ファー
ジを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Messing,
J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276）などに
より行うことができる。また、ラジオアイソトープの代
わりに蛍光色素を用いた自動ＤＮＡ配列解析装置（例え
ば、パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシ
ステムズ社製モデル３７３Ａ等）を使用することもでき
る。

【００１９】なお、本発明の蛋白質として最も好適なも
のをコードするｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを保持
する形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１ ＳＡＮＫ
７１０９９は、平成１１（１９９９）年６月３日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４３が付されている。した
がって、本発明の蛋白質をコードする遺伝子は、該菌株
から取得することが可能である。

【００２０】本発明の蛋白質は、例えば上記のようにし
て得られたｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生
産することができる。例えば、ｃＤＮＡを適当な発現ベ
クターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主
細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産する
ための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、
細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が
挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、
昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが好ましい。

【００２１】原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）
などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内
で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプ
リコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラ
スミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベ
クターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の
選択性を付与することができる配列を有するものが好ま
しい。

【００２２】例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよ
く用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２や
ｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定さ
れず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用
できる。

【００２３】プロモーターとしては、大腸菌において
は、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース
（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（t
ac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモータ
ー、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等
が挙げられ、どのプロモーターも本発明の蛋白質の産生
に使用することができる。

【００２４】枯草菌としては、例えば２０７−２５株が
好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura,
K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）などが用い
られるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα
−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮ
Ａ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可
能となる。

【００２５】真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、
例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1
981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５
０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細
胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素
欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いら
れているが、これらに限定されない。

【００２６】例えば、ポリペプチドを哺乳動物細胞で発
現させる場合には、ｃＤＮＡを適当な発現ベクター（例
えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルス
ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベ
クター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０
プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション
１αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを
構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細
胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養するこ
とによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿
主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、
チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞
または、腎臓組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬ
Ｃ−ＰＫ１細胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞
株等が挙げられる。

【００２７】宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合
を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製
起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であ
り、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、お
よびＲＮＡスプライス部位を具えたものを用いることが
できる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusso
n, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リ
ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and
van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、
および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982)
EMBO J. 1, 841-845）などによりＣＯＳ細胞に取り込ま
せることができ、かくして所望の形質転換細胞を得るこ
とができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる
場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性
マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベク
ター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1
989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（S
outhern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. G
enet. 1, 327-341）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ
４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明の
蛋白質を安定に産生する形質転換細胞を得ることができ
る。

【００２８】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞
由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichopl
usia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. e
t al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）などが
宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストラン
スファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイ
ルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモータ
ーを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられ
る（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of b
aculoviruses as expression vectors. Applied Bioche
mistry and Biotechnology 42, 137-159)。この他に
も、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロ
モーターを利用したベクターも使用できる。さらに、Ａ
ｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグ
ナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、
組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能
である（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 3
79, 167-174)。

【００２９】真核微生物を宿主細胞とした発現系として
は、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカ
ロミセス属酵母、例えばパン酵母Saccharomyces cerevi
siaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母な
どの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アル
コール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen,J.
L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 301
8-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター
（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 80, 1-5）などを好ましく利用できる。また、
分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル
配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知
のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体と
して発現することも可能である。例えば、トリプシン型
セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石
油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファク
ターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロ
テアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活
性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られて
いる（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Ap
pl. Biochem. 28,125-131)。

【００３０】上記のようにして得られる形質転換体は、
常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、
または細胞外に本発明の蛋白質が産生される。該培養に
用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣
用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯ
Ｓ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ改
変イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地
に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加した
ものを使用できる。

【００３１】上記のようにして得られたｃＤＮＡが、有
機陰イオントランスポーターをコードするｃＤＮＡであ
ること、すなわち、ｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物
が有機陰イオントランスポーターであることは、例え
ば、下記実施例で示すように、得られたｃＤＮＡから調
製したｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞内に導入
して発現させ、有機陰イオンであるタウロコール酸を基
質として用い、細胞に取り込まれる基質量が、ｃＤＮＡ
の代わりに水のみをアフリカツメガエル卵母細胞内に導
入した陰性対照と比較して明らかに亢進している事を確
認する試験により検証できる。

【００３２】また、発現細胞について、同様の取り込み
実験を応用して、本発明の蛋白質の特性、例えば、輸送
のナトリウムイオン依存性や基質特異性などを調べるこ
とができる。

【００３３】さらに、上記のようにして得られたｃＤＮ
Ａを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮ
ＡライブラリーまたはゲノミックＤＮＡライブラリーを
スクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生
物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することが
できる。

【００３４】また、開示された本発明の遺伝子のヌクレ
オチド配列（配列番号１に示されたヌクレオチド配列、
もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プ
ライマーを用い、通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブ
ラリーまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子
を単離することができる。

【００３５】ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノミックＤ
ＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、
「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」
［Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年
に発刊］に記載の方法により調製することができる。あ
るいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いて
もよい。

【００３６】本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番
号１で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含む
もののほか、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を
有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このように
ハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードさ
れる蛋白質が有機陰イオンを輸送する能力を有するもの
であればよい。このようなＤＮＡは、配列番号１で示さ
れたヌクレオチド配列と、通常、７０％以上、好ましく
は８０％以上のヌクレオチド配列のホモロジーを有す
る。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変
異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物
由来の相同遺伝子等が含まれる。

【００３７】本発明において、ストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェ
ントな条件（ローストリンジェントな条件）では、ハイ
ブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化
ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）または
これと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、
３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳ
Ｃまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予
備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃
度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、
より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリ
ンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１
×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で行うこと
により実施できる。

【００３８】本発明の有機陰イオントランスポーター遺
伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくポリヌクレオ
チド）は、有機陰イオントランスポーター遺伝子を検出
するためのプローブとして使用できるほか、有機陰イオ
ントランスポーター遺伝子の発現を変調させるために、
例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドや、リボザイ
ム、デコイとして使用することもできる。このようなヌ
クレオチドとしては、例えば、配列番号１または２で示
されるヌクレオチド配列の中の通常、連続する１４ヌク
レオチド以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含
むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズを
より特異的とするためには部分配列としてより長い配
列、例えば２０ヌクレオチド以上あるいは３０ヌクレオ
チド以上の配列を用いてもよい。

【００３９】このようにして本発明のＤＮＡを利用し
て、遺伝子工学的手法により得られる物質が、有機陰イ
オンを輸送する能力を発現するためには、必ずしも配列
表の配列番号２のアミノ酸番号１から６９１のアミノ酸
配列の全てを有するものである必要はなく、例えばその
部分配列であっても、それが有機陰イオンを輸送する能
力を示す限り、それらのアミノ酸配列もまた本発明の蛋
白質に包含される。また、該蛋白質をコードするＤＮＡ
も本発明に含まれる。

【００４０】このような有機陰イオンを輸送する能力を
有する蛋白質としては、配列表の配列番号２に示される
アミノ酸配列のアミノ酸番号１のメチオニン残基をＮ末
端とする６９１個のアミノ酸からなる蛋白質を例示でき
る。また、該蛋白質をコードするＤＮＡとして好適なも
のとしては、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号９
２から２１６４で示されるヌクレオチド配列からなるＤ
ＮＡを挙げることができる。

【００４１】一般に真核生物の遺伝子は、インターフェ
ロン遺伝子などで知られているように、多型現象（poly
morphism）を示すと考えられ（例えば、Nishi, T. et a
l. (1985) J. Biochem. 97, 153-159を参照）、この多
型現象によって、一個またはそれ以上のアミノ酸が置換
される場合もあれば、ヌクレオチド配列の置換はあって
もアミノ酸は全く変わらない場合もある。配列表の配列
番号２のアミノ酸番号１から６９１に示されるアミノ酸
配列からなる本発明の蛋白質の前駆体、あるいは同アミ
ノ酸番号１から６９１に示されるアミノ酸配列からなる
本発明の蛋白質の成熟体のアミノ酸配列中の、一つもし
くは二つ以上の部位において、一つもしくは二つ以上の
アミノ酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換されてい
る蛋白質でも、有機陰イオンを輸送する能力を有するこ
とが多い（天然型のアミノ酸配列が置換したアミノ酸配
列を有する蛋白質が、天然型蛋白質と同等の活性を有す
る例として、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）
遺伝子のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリ
ンに相当するヌクレオチド配列に変換して得られた蛋白
質が、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Wa
ng, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433））。
それらの蛋白質は、有機陰イオンを輸送する能力を有す
る限り、全て本発明に含まれる。また、これらの蛋白質
をコードする、同効のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ
も全て本発明に含まれる。

【００４２】このような各種の本発明のＤＮＡは、上記
有機陰イオンを輸送する能力を有する蛋白質の情報に基
づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkap
iller, M. et al. (1984) Nature 310, 105-111）など
の常法に従い、化学合成により製造することもできる。

【００４３】なお、所望のアミノ酸に対応するコドン
は、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコド
ン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。（Granth
am, R.et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-17
4）。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部
改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特
異的変異導入法（site specific mutagenesis）（Mark,
D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1, 5662-5666）などに従うことができる。また、任意の
一つもしくは二つ以上のアミノ酸残基を欠失させた改変
体を作製するためには、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１
等を用いてＤＮＡを末端から削る方法（岸本 利光ら
“続生化学実験講座１・遺伝子研究法ＩＩ”335-354)、
カセット変異法（岸本 利光、“新生化学実験講座２・
核酸ＩＩＩ 組換えＤＮＡ技術 ”242-251）などに従う
ことができる。

【００４４】また、本発明の有機陰イオントランスポー
ターまたはこれと免疫学的同等性を有するポリペプチド
を用いて、その抗体を取得することができ、抗体は、有
機陰イオントランスポーターの検出や精製などに利用で
きる。抗体は、本発明の有機陰イオントランスポータ
ー、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチ
ド等を抗原として用いて製造できる。ポリクローナル抗
体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を
接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造す
ることができる。

【００４５】また、本発明の蛋白質と特異的に結合する
モノクローナル抗体は、以下に記載する方法で取得する
ことができる。

【００４６】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、（ｂ）抗
原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取
しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してか
ら、抗体産生細胞を調製する工程、（ｃ）骨髄腫細胞
（以下「ミエローマ」という）の調製、（ｄ）抗体産生
細胞とミエローマとの細胞融合、（ｅ）目的とする抗体
を産生するハイブリドーマ群の選別、（ｆ）単一細胞ク
ローンへの分割（クローニング）、（ｇ）場合によって
は、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブ
リドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物
の飼育、（ｈ）このようにして製造されたモノクローナ
ル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、ある
いは標識試薬としての特性の検定、等である。

【００４７】以下、モノクローナル抗体の作製法を上記
工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限
されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエロ
ーマを使用することもできる。

【００４８】（ａ）抗原の精製 抗原としては、前記したような方法で調製した本発明の
蛋白質またはその一部を使用することができる。さら
に、本発明により本発明の蛋白質の全一次構造が明らか
にされたので、当業者に周知の方法により、配列表の配
列番号２のアミノ酸番号１から６９１に示されるアミノ
酸配列の部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として
使用することもできる。

【００４９】（ｂ）抗体産生細胞の調製 工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または
不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助
剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験
動物としては、マウスが最も好適に用いられるが、これ
に限定されない。

【００５０】マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注
射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射い
ずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好まし
い。

【００５１】免疫は、一回、または、適当な間隔で（好
ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なう
ことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に
対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を
抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効
果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜
５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用い
ることが好ましい。

【００５２】ここで用いられる抗体価の測定法として
は、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」とい
う）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」とい
う）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知
技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、およ
び操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法また
はＥＬＩＳＡ法がより好適である。

【００５３】本発明における抗体価の測定は、例えばＥ
ＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により
行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原
をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着さ
せ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関
係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳ
Ａ」という）により覆い、該表面を洗浄後、一次抗体と
して段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触さ
せ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させ
る。さらに二次抗体として酵素標識されたマウス抗体に
対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵
素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の
変化等を測定することにより、抗体価を算出する。

【００５４】（ｃ）ミエローマの調製工程 ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株
化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ
／ｃ由来）ミエローマ株P3X63Ag8U.1(P3-U1)（Yelton,
D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Imm
unology, 81, 1-7(1978)）、P3／NSI ／1-Ag4-1(NS-1)
（Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511
-519 (1976)）、Sp2 ／O-Ag14 (SP-2)（Shulman, M. et
al. Nature, 276, 269-270 (1978)）、P3X63Ag8.653
(653)（Kearney, J. F. et al. J.Immunology, 123, 15
48-1550 (1979)）、P3X63Ag8(X63)（Horibata, K. and
Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)）などを
用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培
地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ１６４０培
地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマ
イシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）
を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地] 、イス
コフ修正ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecc
o's Medium ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはＤＭ
ＥＭで継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培
地（例えば、１０％ ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地
（味の素（株）社製））で継代培養し、融合当日に２×
１０⁷以上の細胞数を確保しておく。

【００５５】（ｄ）細胞融合 抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞である
リンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得ても
よく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを
適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細
胞が最も一般的に用いられる。

【００５６】最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウ
スから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出
し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞
と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段と
して現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比
較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを
用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順より
なる。

【００５７】脾細胞とミエローマとを無血清培地（例え
ばＲＰＭＩ１６４０）、またはＰＢＳでよく洗浄し、脾
細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度
になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈
澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの
５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０
００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その
後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分
離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」
という）液およびマウスインターロイキン−２（以下
「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培
地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレ
ート」という）の各ウェルに分注し、５％ 炭酸ガス存
在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培
地を補う。

【００５８】（ｅ）ハイブリドーマ群の選択 上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である
場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である
場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエロ
ーマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生
存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あ
るいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリド
ーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの
融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中で
の培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエロー
マ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハ
イブリドーマを選択することができる。

【００５９】コロニー状に生育してきたハイブリドーマ
について、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地
（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以
後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法に
より抗体価を測定する。

【００６０】以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用
いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドー
マの選択方法に応じて使用することができ、その場合使
用する培地組成も変化する。

【００６１】（ｆ）クローニング 工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定すること
により、特異的抗体を産生することが判明したハイブリ
ドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。こ
のクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個
のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限
界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟
寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの
細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１
個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられ
るが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。

【００６２】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安
定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。

【００６３】（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクロ
ーナル抗体の調製 クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ
培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大
型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行
われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当
業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明
の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得る
ことができる。また、同系統のマウス（例えば、上記の
ＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で
該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモ
ノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができ
る。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル
抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧIIキッ
ト；ファルマシア社製）等を利用することもできる。

【００６４】かくして得られるモノクローナル抗体は、
本発明の蛋白質に対して高い抗原特異性を有する。

【００６５】（ｈ）モノクローナル抗体の検定 かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプお
よびサブクラスの決定は以下のように行うことができ
る。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlon
y ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗
体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、
ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清
をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに二次抗体と
して各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに
対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体
のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能であ
る。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキ
ット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社
製）等を利用することもできる。

【００６６】さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウ
リー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（Ｏ
Ｄ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出
する方法により行うことができる。

【００６７】このようにして得られる本発明のモノクロ
ーナル抗体は、その特異性を利用した本発明の蛋白質の
検出や分離精製に用いることができる。

【００６８】

【実施例】 以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各
操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニン
グ（MolecularCloning）」［Sambrook, J.,Fritsch, E.
F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Labora
tory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行う
か、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販
品の指示書に従って使用した。

【００６９】実施例１ ヒト有機陰イオントランスポー
ターＬＳＴ−１のクローニング （１）ヒト有機陰イオントランスポーターＬＳＴ−１の
クローニング １）プローブの調製 ヒトＯＡＴＰならびにヒトＰＧＴのアミノ酸配列に対し
て相同的な配列を得るために、ＥＳＴ法（Adams ら、Sc
ience、第252巻、1651頁、1991年; Adams ら、Nature、
第355巻, 632頁、1992年）により作成されたＥＳＴを含
むデータベースを、ＴＢＬＡＳＴＮ アルゴリズムを用
いて検索した（ HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov/BLAST/blast#references.html http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/blast#references.html）。その結果
３種類のクローン（Genbank accession no.Ｈ６２８９
３、Ｔ７３８６３およびＲ２９４１４）が、ＯＡＴＰな
らびにＰＧＴの両者に対して相同的な配列として同定さ
れた。そこで、報告されているこれらＨ６２８９３、Ｔ
７３８６３およびＲ２９４１４それぞれの部分配列を増
幅するためのＰＣＲプライマー： 5'- gttcttggca gctctgtca -3' (プライマー１：Ｈ６２８９３のヌクレオチド番号１７
８−１９６のセンスプライマー：配列表の配列番号
３）； 5'- cgattccaat taactttgg -3' （プライマー２：Ｈ６２８９３のヌクレオチド番号３７
１−３８９のアンチセンスプライマー：配列表の配列番
号４）； 5'- tcccctgtat gttatgtttg -3' （プライマー３：Ｔ７３８６３のヌクレオチド番号１０
９６−１１１５のセンスプライマー：配列表の配列番号
５）； 5'- caattccaac ggtgttca -3' （プライマー４：Ｔ７３８６３のヌクレオチド番号１２
９６−１３１３のアンチセンスプライマー：配列表の配
列番号６）； 5'- tcagttgccg gactaaccat -3' （プライマー５：Ｒ２９４１４のヌクレオチド番号１３
９１−１４１０のセンスプライマー：配列表の配列番号
７）；および 5'- ttcccattga ctttcatcac -3' （プライマー６：Ｒ２９４１４のヌクレオチド番号１４
８５−１５０４：配列表の配列番号８） を合成した。プライマー１と２、プライマー３と４、お
よびプライマー５と６の３種類のプライマーの組み合わ
せで、ヒト肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社製）を逆転写
して得られたｃＤＮＡ［下記２）参照］を鋳型とし、Ｐ
ＣＲ（９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で２分を３
０回）を行った。反応後の３種類の反応液について０．
８％アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅されたバ
ンドをゲルより切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ス
トラタジーン社製）にサブクローニングした。挿入断片
のヌクレオチド配列の解析を行い、３種類の挿入断片の
ヌクレオチド配列が目的のもの、すなわちＨ６２８９
３、Ｔ７３８６３およびＲ２９４１４の部分配列である
ことを確認した。これら挿入断片をそれぞれ切り出し、
ＤＮＡラベリングキット（ランダムプライマーＤＮＡラ
ベリングキット：宝酒造（株）社製）を用いて³²Ｐで標
識したものを、下記３）以下のスクリーニングに用いる
ためのプローブとした。

【００７０】２）ｃＤＮＡライブラリーの調製 ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子源としてヒト
肝臓ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（クロンテック社製）を用いて
作製したヒトｃＤＮＡライブラリーを用いた。ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製は、Ｇｕｂｌｅｒ法に従って行っ
た。すなわち、５μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ、および２
４単位の逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ：ギ
ブコ・ビーアールエル社製）を５０μｌの反応液（５０
ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、８ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、３０ｍＭ 塩化カリウム、０．３ｍＭ ジチ
オスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ
ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＴＴＰ、１０ｍＣｉ［α−
³²Ｐ］ｄＣＴＰ、１ｍｇ オリゴ（ｄＴ）プライマー中
で４２℃、１時間反応させた。次にその相補的（２ｎｄ
ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡを２００μｌの反応液（２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、１０００ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ
ーゼ ３６単位（宝酒造（株）社製）、リボヌクレアー
ゼＨ ３単位（宝酒造（株）社製）中で１６℃、２．５
時間反応させた。このようにして得られたｃＤＮＡの末
端を平滑化し、ＥｃｏＲＩアダプター（プロメガ社製）
を付加した後、リン酸化した。得られたｃＤＮＡを、超
遠心チューブ中に作成した酢酸カリウムの密度勾配（５
−２０％）に重層して、５００００ｒｐｍ、２２℃で３
時間遠心した。遠心終了後、チューブの底部までガラス
キャピラリーを上からさし込み、ペリスタポンプで吸引
しながら３００μｌずつの画分１６本を採取した。各画
分にアクリルキャリアを入れた後エタノール沈殿し（Ga
illard, C.とStrauss, F.、Nucleic Acids Research 第
18巻第２号、378頁、1990年）得られた沈殿を５μｌに
溶解して、その１μｌを０．８％アガロースで電気泳動
して各画分に含まれるｃＤＮＡの長さを調べた。その結
果、２ｋｂｐ以上のサイズのｃＤＮＡを含む画分を集め
てファージベクターλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社
製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。この
組み込んだファージＤＮＡをギガパックＩＩＩ（ストラ
タジーン社製）を用いてファージにパッケージングし、
５０万の独立クローンを含むｃＤＮＡライブラリーを得
た。

【００７１】３）一次スクリーニング 上記のようにして得られたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ
ー（５×１０⁵プラーク）を、直径１５ｃｍのプレート
あたり２×１０⁴個のプラークが形成されるように分散
させた。ナイロンフィルターを、プレートにのせて、フ
ァージプラークを移しとった。５分間放置した後、フィ
ルターを剥がして、アルカリ溶液（０．１Ｎ 水酸化ナ
トリウム、１．５Ｍ 塩化ナトリウム）で５分間、中性
溶液（１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ
塩化ナトリウム）で５分間処理した後、室温で１時間風
乾した。風乾後、８０℃にて２時間乾燥させた。

【００７２】得られたフィルターを、５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０
７５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液
（１％ウシ血清アルブミン、１％ ポリビニルピロリド
ン、１％ フィコール４００）、１％ ＳＤＳ、１００
ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２
℃、１２時間プレハイブリダイゼーションした後、³²Ｐ
で放射標識化したプローブを含む５０％ホルムアミド、
５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ ＳＤＳ、１０
０ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む反応液中で、
４２℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。

【００７３】反応終了後、フィルターを、０．１×ＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳを含む溶液で、６８度で１時間洗浄し
た。次にハイブリダイゼーションしたフィルターをオー
トラジオグラフィー用フィルム（ＸＯＭＡＴ−ＡＲ、コ
ダック社）に−８０度で一晩感光させたのち現像した。
その結果、一次スクリーニングで５２ヶの陽性プラーク
が検出された。この時、３種類のＥＳＴクローンより作
成したプローブを用いたスクリーニングにより得られた
シグナルは、すべて共通していた。

【００７４】４）ｃＤＮＡクローンの単離 上記３）で得られた陽性クローンについて、上記と同様
の操作を繰り返すことにより、二次および三次スクリー
ニングを行って、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して得られ
る挿入断片が最も長いクローン（以下「ｐＨ１」とい
う）を単離した。このプラスミドｐＨ１を保持する形質
転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１ ＳＡＮＫ ７１０
９９は、平成１１（１９９９）年６月３日付で工業技術
院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６７４３が付された。

【００７５】プラスミドｐＨ１に挿入されているｃＤＮ
Ａの全ヌクレオチド配列をジデオキシ法により決定し
た。なお、一部配列は自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢ
Ｉプリズム３７７：（株）パーキンエルマー・ジャパン
・アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析し
た。その結果、配列表の配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列が得られた。ｐＨ１に挿入されているｃＤＮＡ
は、２７８１ｂｐからなり、メチオニンで始まる６９１
個のアミノ酸から成るオープン・リーディング・フレー
ム（ＯＲＦ）を有することが明らかとなった。また、Ｏ
ＲＦにコードされているアミノ酸配列について、ＥＭＢ
ＬおよびＧｅｎＢａｎｋのヌクレオチドデータベース、
ＮＢＲＦおよびＳＷＩＳＳプロテインデータベースを検
索したところ、ヒト有機陰イオントランスポーターＯＡ
ＴＰと４２．２％、プロスタグランジントランスポータ
ーＰＧＴと３４．９％の相同性を持つ、新規なポリペプ
チドをコードすることが明らかとなった。このＯＲＦに
コードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示
す。

【００７６】疎水性プロット（Kyte-Doolittle hydropa
thy analysis：Kyte J と Doolittle R.F.J.、J.Mol.Bi
ol.、第157巻、105頁、1982年）により、配列表の配列
番号２に示されるアミノ酸配列を解析した結果、１２個
の膜貫通領域（membrane-spanning domains）の存在が
予測された。

【００７７】（２）ノーザンブロット解析 上記のようにして得られたＤＮＡの発現分布を知る目的
で、ノーザンブロット解析を行った。（１）で得られた
ｃＤＮＡ挿入断片より３’末端側非翻訳部位のＥｃｏＲ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ消化断片（８３８ｂｐ）を調製し、ＤＮ
Ａラベリングキット（ランダムプライマーＤＮＡラベリ
ングキット：宝酒造（株）社製）を用いて、³²Ｐにて標
識したものをプローブとして用いた。ヒト組織ノーザン
ブロットフィルター（クローンテック社製）を、５×Ｓ
ＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、５０％ホルム
アミド、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む
溶液中で、４２℃、１２時間プレハイブリダイゼーショ
ンした後、上記標識プローブ、５×ＳＳＣ、５×デンハ
ルト溶液、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳおよび１０
０ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４
２℃、一晩ハイブリダイゼーションを行った。反応終了
後、フィルターを室温で、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含
む溶液で１０分、さらに０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ
を含む溶液で６５度で１時間洗浄した後、オートラジオ
グラフィーを行った。その結果、図１に示すように、ヒ
ト肝臓（Liver）にバンドが観察され、そのサイズは、
分子量マーカーによる検量線より、約３ｋｂであること
が明らかとなった。一方、心臓（Heart）、脳（Brai
n）、胎盤（Placenta）、肺（Lung）、骨格筋（Skeleta
l muscle）、腎臓（Kidney）、膵臓（Pancreas）、脾臓
（Spleen）、胸腺（Thymus）、前立腺（Prostate）、精
巣（Testis）、卵巣（Ovary）、小腸（Small intestin
e）、大腸（Colon）および白血球（Leukocyte）ではバ
ンドは認められず、本発明の蛋白質は肝臓に特異的に発
現していることが明らかとなった。

【００７８】次に、プラスミドｐＨ１のｃＤＮＡ全長を
³²Ｐで標識したプローブを用いて、ラット組織ノザンブ
ロットフィルターおよびマウス組織ノザンブロットフィ
ルター（いずれもクローンテック社製）のノーザンブロ
ット解析を行った。フィルターを、ヒト組織の場合と同
様にプレハイブリダイゼーションした後、³²Ｐで標識し
たプローブを含む、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、
２５％ホルムアミド、１％ ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ
の変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃、一夜ハ
イブリダイゼーションを行った。反応終了後、フィルタ
ーを２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳを含む溶液で、５５度で
１時間洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。

【００７９】その結果、ラット（図２）およびマウス
（図３）のいずれにおいても、肝臓にのみ一本のバンド
が検出され、本発明の蛋白質のホモローグが肝臓に特異
的に発現していることが明らかとなった。

【００８０】実施例２ 活性評価 （１）陰イオントランスポーター活性 上記により得られたプラスミドｐＨ１からｃＲＮＡを調
製し、阿部らの方法（阿部ら、J. Biol. Chem.、第273
巻、22395頁、1998年）に準じて、アフリカツメガエル
の卵母細胞に注入し本発明の蛋白質を発現させ、基質の
取り込み実験を行った。

【００８１】まずｃＲＮＡは、プラスミドｐＨ１を制限
酵素ＮｏｔＩで消化して直鎖状にしたものを鋳型とし
て、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）
を用いて合成された。なお、反応にはｍＣＡＰ ＲＮＡ
キャッピングキット（ストラタジーン社製）を用いた。

【００８２】雌のアフツメリカガエル（Xenopus laevi
s：浜松生物教材（株）社より購入）を、氷冷した０．
１％ ３−アミノ安息香酸エチルエステル（ＭＳ−２２
２）／０．３％ 重炭酸カリウム溶液に浸し麻酔した。
腹部を切開し、片側の卵巣を適当量取り出した後、ＯＲ
２緩衝液（８２．５ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩
化カリウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、ｐＨ７．５）を浸したシャーレに入れ、卵母細
胞２０−３０個程度に細切した。２％ コラゲナーゼ溶
液（ＯＲ２緩衝液に溶解）中で３０分間ゆっくり振とう
した後、新しいコラゲナーゼ溶液に交換し、ほとんどの
卵母細胞がバラバラになるまで、さらに６０乃至９０分
間振とうした。卵母細胞をバースの溶液（Barth's Solu
tion）（８８ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ 塩化カリ
ウム、０．３３ｍＭ 硝酸カルシウム、０．４１ｍＭ
塩化カルシウム、０．８２ｍＭ 塩化マグネシウム、
２．４ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン、１０単位／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、
２．５ｍＭ ピルビン酸、ｐＨ７．４）を浸したシャー
レに移し、実体顕微鏡下で段階Ｖおよび段階ＶＩの卵母
細胞（Dumontら、J. Morphol.、第136巻、153頁、1972
年）を選別した。

【００８３】実体顕微鏡下、マイクロマニピュレーター
（ＭＮ−１５３：ナリシゲ社製）を用いて、上記ｃＲＮ
Ａ溶液または水のみを５０ｎｌずつ卵母細胞に注入した
後、バースの溶液を満たした２０ｍｌのガラスバイアル
に移し、３日間培養した。すべての操作は、１８℃に調
節された恒温室内で行なった。

【００８４】この卵母細胞についてタウロコレートの取
り込み実験、および培養液に添加する塩の影響を調べ
た。すなわち、卵母細胞をバースの溶液を満たした栄研
チューブに６乃至１０個ずつ移し、室温（２１℃〜２２
℃）に静置した。バースの溶液をアスピレーターを用い
て取り除いた後、³Ｈ−タウロコレート（ＮＥＮライフ
サイエンスプロダクツ社製）３０μＭを含む取り込み溶
液１００μｌを添加して室温で培養した。１時間後、氷
冷した緩衝液で卵母細胞を洗浄し、一つずつシンチレー
ションバイアルに移し、１０％ ＳＤＳ溶液 ５００μ
ｌで溶解した後、シンチレーションカクテル（ピコフロ
ー：パッカード社製）４ｍｌを加え、放射能を測定し
た。放射能の測定には、シンチレーションカウンター
（２２５０ＣＡ：パッカード社製）を用いた。コントロ
ールには等量の水を注入した卵母細胞を用いた。ただ
し、塩として塩化コリンイオンを添加した場合の影響を
みる場合には、ナトリウム取り込み溶液（１００ｍＭ
塩化ナトリウム、２ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ 塩化
カルシウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に代えて、塩化コリン取り込み
溶液（１００ｍＭ 塩化コリン、２ｍＭ 塩化カリウ
ム、１ｍＭ 塩化カルシウム、１ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を用いた。

【００８５】その結果、図４に示すように、ｃＲＮＡを
注入した卵母細胞への³Ｈ−タウロコレートの取り込み
は、コントロールとして水を注入した卵母細胞への取り
込みに比べ１０倍高かった。また、細胞外のナトリウム
をコリンと置換しても、タウロコレート取り込みに何ら
影響を与えなかった。このことから、本発明の蛋白質は
ナトリウムイオン非依存性にタウロコレートを取り込む
活性を有することが示された。

【００８６】さらに、基質タウロコレートの濃度の違い
によるタウロコレートの取り込み率の変化を調べる動力
学試験を行った。上記ｃＲＮＡを注入した卵母細胞への
³Ｈ−タウロコレートの取り込みから、水を注入した卵
母細胞への取り込みを差し引いた値を、本発明の蛋白質
に依存性の取りこみとした。ただし、³Ｈ−タウロコレ
ート取り込みは３０分間測定した。その結果、本発明の
蛋白質に依存性のタウロコレートの取りこみは、基質濃
度の上昇とともに飽和するミカエリス−メンテン式に従
う速度論的性質を示し、３例の試験より得られた、本発
明の蛋白質に依存性の取りこみのＫｍ値は１３．６±
５．６μＭであった。

【００８７】（２）基質選択性 基質として、³Ｈ−タウロコレートに代えて、放射能標
識された下記に示す各種の化合物（Ｓ−アデノシル−¹⁴
Ｃ−メチオニンはアマシャム・ライフサイエンス社製、
それ以外は全てＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社
製）を用い、上記（１）記載の方法で取り込み実験を実
施した。陰性対照には水のみを注入した卵母細胞を用い
た。その結果を表１に示す。

【００８８】

【表１】 本発明の蛋白質は、胆汁酸（³Ｈ−タウロコレート）の
ほか、抱合型ステロイド（³Ｈ−エストラジオール−１
７β−グルクロニド、³Ｈ−エストロン−サルフェート
および³Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン−サルフェ
ート）、エイコサノイド（³Ｈ−プロスタグランジンＥ
２、³Ｈ−トロンボキサンＢ２、³Ｈ−ロイコトリエンＣ
４および³Ｈ−ロイコトリエンＥ４）および¹⁴Ｃ−プラ
バスタチンを取り込んだが、アミノ酸（¹⁴Ｃ−フェニル
アラニン、¹⁴Ｃ−トリプトファン、 ¹⁴Ｃ−チロシンおよ
びＳ−アデノシル−¹⁴Ｃ−メチオニン）、非抱合型ステ
ロイド（³Ｈ−アルドステロン、³Ｈ−テストステロンお
よび³Ｈ−エストラジオール）、脂溶性ビタミン（³Ｈ−
ビオチン、³Ｈ−レチノイン酸および³Ｈ−ヒドロキシビ
タミンＤ３）および³Ｈ−馬尿酸は取り込まなかった。

【００８９】さらに、甲状腺ホルモン（Ｔ４およびＴ
３）取り込みのミカエリス−メンテン動力学試験を行っ
た。ｃＲＮＡを注入した卵母細胞への¹²⁵Ｉ−Ｔ４およ
び¹²⁵Ｉ−Ｔ３の取り込みから、水を注入した卵母細胞
への取り込みを差し引いた値を、本発明の蛋白質に依存
性の取りこみとした。ただし、取り込みは２０分間測定
した。その結果、３例の試験より得られた、本発明の蛋
白質に依存性の取りこみのＫｍ値はそれぞれ３．０±
１．３μＭおよび２．７±１．１μＭであった。

【００９０】以上の結果より、本発明の蛋白質は胆汁酸
や抱合型ステロイドのほかエイコサノイド類を取り込む
能力を有し、有機陰イオントランスポーターＯＡＴＰと
プロスタグランジントランスポーター（ＰＧＴ）の中間
的な基質選択性を有することが明らかとなった。また、
本発明の蛋白質は生理活性物質である甲状腺ホルモン
（Ｔ４およびＴ３）や、薬物であるプラバスタチンも取
り込んでおり、広い基質選択性を有することが示され
た。

【００９１】 試験例１ 肝臓透過性薬物スクリーニング法の構築 実施例１で得られたｃＤＮＡを含む動物細胞用発現ベク
ターをヒト培養肝細胞ＨｅｐＧ２（アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ） ＨＢ−８０
６５。なおＨｅｐＧ２では既に有機陰イオントランスポ
ーター活性は消失していることが知られている）に電気
穿孔法による遺伝子導入装置を使用して導入し、ベクタ
ーの選択マーカーの発現（例えば抗生物質Ｇ４１８耐
性）を指標にして選択・クローニングを行い、該ＤＮＡ
が導入された細胞を単離する。このようにして単離され
た形質転換細胞株における実施例１で得られたＤＮＡの
発現は、ノーザンブロット法，ウエスタンブロット法に
より確認する。

【００９２】得られた形質転換細胞を９６穴プレート等
で培養し、培地中に種々の薬物またはその誘導体（放射
標識または蛍光標識されたもの等）を加えて、一定時間
培養後、培地を除去し、細胞内への薬物またはその誘導
体の取り込みを測定することにより、薬物またはその誘
導体の肝臓における透過性を検討する。

【００９３】試験例２ バイオ人工肝臓の構築 実施例１で得られたＤＮＡを含む動物細胞用発現ベクタ
ーをヒト培養肝細胞ＨｅｐＧ２に電気穿孔法による遺伝
子導入装置を使用して導入し、ベクターの選択マーカー
の発現（例えば抗生物質Ｇ４１８耐性）を指標にして選
択・クローニングを行い、該ＤＮＡが導入された細胞を
単離する。このようにして単離された形質転換細胞株に
おける実施例１で得られたＤＮＡの発現は、ノーザンブ
ロット法，ウエスタンブロット法により確認する。例え
ば形質転換細胞株をダブルチャンバーシステム（例え
ば、コースター社製トランスウェル）内に培養し、一方
のチャンバーに入れた種々の有機アニオン（放射標識ま
たは蛍光標識されたもの等）の細胞内取り込み・分泌
を、対側チャンバーへの輸送を測定することにより検討
する。また、総胆管結紮モデルラットの血清を用いて、
形質転換細胞に閉塞性黄疸時の血清を添加し、培養液中
ビリルビン・コール酸・デオキシコール酸等の肝不全物
質の排出能力を評価する。さらに、細胞外マトリックス
でコートしたホロファイバー大量培養系と組み合わせる
ことで、生体肝臓に代替する肝不全物資排出システムで
ある人工肝臓を構築する。

【００９４】

【発明の効果】 以上のごとく、本発明により新規肝臓
特異的有機陰イオントランスポーターおよびそれをコー
ドするＤＮＡが提供された。本発明は肝臓透過性薬物の
スクリーニングや人工肝臓の作製に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト各種組織由来ＲＮＡを用いたノーザンブ
ロット解析の結果を表す図

【図２】 ラット各種組織由来ＲＮＡを用いたノーザン
ブロット解析の結果を表す図

【図３】 マウス各種組織由来ＲＮＡを用いたノーザン
ブロット解析の結果を表す図

【図４】 アフリカツメガエル卵母細胞系を用いた有機
陰イオン取り込み実験の結果を表す図

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sankyo Company, Limited <120> Novel Transporter Gene Expressed in Liver <130> 2000060SS <140> <141> <150> JP H11-156750 <151> 1999-06-03 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2781 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (92)..(2164) <400> 1 gttgcagttg ctgtaggatt ctaaatccag gtgattgttt caaactgagc atcaacaaca 60 aaaacatttg tatgatatct atatttcaat c atg gac caa aat caa cat ttg 112 Met Asp Gln Asn Gln His Leu 1 5 aat aaa aca gca gag gca caa cct tca gag aat aag aaa aca aga tac 160 Asn Lys Thr Ala Glu Ala Gln Pro Ser Glu Asn Lys Lys Thr Arg Tyr 10 15 20 tgc aat gga ttg aag atg ttc ttg gca gct ctg tca ctc agc ttt att 208 Cys Asn Gly Leu Lys Met Phe Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ser Phe Ile 25 30 35 gct aag aca cta ggt gca att att atg aaa agt tcc atc att cat ata 256 Ala Lys Thr Leu Gly Ala Ile Ile Met Lys Ser Ser Ile Ile His Ile 40 45 50 55 gaa cgg aga ttt gag ata tcc tct tct ctt gtt ggt ttt att gac gga 304 Glu Arg Arg Phe Glu Ile Ser Ser Ser Leu Val Gly Phe Ile Asp Gly 60 65 70 agc ttt gaa att gga aat ttg ctt gtg att gta ttt gtg agt tac ttt 352 Ser Phe Glu Ile Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Phe Val Ser Tyr Phe 75 80 85 gga tcc aaa cta cat aga cca aag tta att gga atc ggt tgt ttc att 400 Gly Ser Lys Leu His Arg Pro Lys Leu Ile Gly Ile Gly Cys Phe Ile 90 95 100 atg gga att gga ggt gtt ttg act gct ttg cca cat ttc ttc atg gga 448 Met Gly Ile Gly Gly Val Leu Thr Ala Leu Pro His Phe Phe Met Gly 105 110 115 tat tac agg tat tct aaa gaa act aat atc aat tca tca gaa aat tca 496 Tyr Tyr Arg Tyr Ser Lys Glu Thr Asn Ile Asn Ser Ser Glu Asn Ser 120 125 130 135 aca tcg acc tta tcc act tgt tta att aat caa att tta tca ctc aat 544 Thr Ser Thr Leu Ser Thr Cys Leu Ile Asn Gln Ile Leu Ser Leu Asn 140 145 150 aga gca tca cct gag ata gtg gga aaa ggt tgt tta aag gaa tct ggg 592 Arg Ala Ser Pro Glu Ile Val Gly Lys Gly Cys Leu Lys Glu Ser Gly 155 160 165 tca tac atg tgg ata tat gtg ttc atg ggt aat atg ctt cgt gga ata 640 Ser Tyr Met Trp Ile Tyr Val Phe Met Gly Asn Met Leu Arg Gly Ile 170 175 180 ggg gag act ccc ata gta cca ctg ggg ctt tct tac att gat gat ttc 688 Gly Glu Thr Pro Ile Val Pro Leu Gly Leu Ser Tyr Ile Asp Asp Phe 185 190 195 gct aaa gaa gga cat tct tct ttg tat tta ggt ata ttg aat gca ata 736 Ala Lys Glu Gly His Ser Ser Leu Tyr Leu Gly Ile Leu Asn Ala Ile 200 205 210 215 gca atg att ggt cca atc att ggc ttt acc ctg gga tct ctg ttt tct 784 Ala Met Ile Gly Pro Ile Ile Gly Phe Thr Leu Gly Ser Leu Phe Ser 220 225 230 aaa atg tac gtg gat att gga tat gta aat cta agc act atc agg ata 832 Lys Met Tyr Val Asp Ile Gly Tyr Val Asn Leu Ser Thr Ile Arg Ile 235 240 245 act cct act gat tct cga tgg gtt gga gct tgg tgg ctt aat ttc ctt 880 Thr Pro Thr Asp Ser Arg Trp Val Gly Ala Trp Trp Leu Asn Phe Leu 250 255 260 gtg tct gga cta ttc tcc att att tct tcc ata cca ttc ttt ttc ttg 928 Val Ser Gly Leu Phe Ser Ile Ile Ser Ser Ile Pro Phe Phe Phe Leu 265 270 275 ccc caa act cca aat aaa cca caa aaa gaa aga aaa gct tca ctg tct 976 Pro Gln Thr Pro Asn Lys Pro Gln Lys Glu Arg Lys Ala Ser Leu Ser 280 285 290 295 ttg cat gtg ctg gaa aca aat gat gaa aag gat caa aca gct aat ttg 1024 Leu His Val Leu Glu Thr Asn Asp Glu Lys Asp Gln Thr Ala Asn Leu 300 305 310 acc aat caa gga aaa aat att acc aaa aat gtg act ggt ttt ttc cag 1072 Thr Asn Gln Gly Lys Asn Ile Thr Lys Asn Val Thr Gly Phe Phe Gln 315 320 325 tct ttt aaa agc atc ctt act aat ccc ctg tat gtt atg ttt gtg ctt 1120 Ser Phe Lys Ser Ile Leu Thr Asn Pro Leu Tyr Val Met Phe Val Leu 330 335 340 ttg acg ttg tta caa gta agc agc tat att ggt gct ttt act tat gtc 1168 Leu Thr Leu Leu Gln Val Ser Ser Tyr Ile Gly Ala Phe Thr Tyr Val 345 350 355 ttc aaa tac gta gag caa cag tat ggt cag cct tca tct aag gct aac 1216 Phe Lys Tyr Val Glu Gln Gln Tyr Gly Gln Pro Ser Ser Lys Ala Asn 360 365 370 375 atc tta ttg gga gtc ata acc ata cct att ttt gca agt gga atg ttt 1264 Ile Leu Leu Gly Val Ile Thr Ile Pro Ile Phe Ala Ser Gly Met Phe 380 385 390 tta gga gga tat atc att aaa aaa ttc aaa ctg aac acc gtt gga att 1312 Leu Gly Gly Tyr Ile Ile Lys Lys Phe Lys Leu Asn Thr Val Gly Ile 395 400 405 gcc aaa ttc tca tgt ttt act gct gtg atg tca ttg tcc ttt tac cta 1360 Ala Lys Phe Ser Cys Phe Thr Ala Val Met Ser Leu Ser Phe Tyr Leu 410 415 420 tta tat ttt ttc ata ctc tgt gaa aac aaa tca gtt gcc gga cta acc 1408 Leu Tyr Phe Phe Ile Leu Cys Glu Asn Lys Ser Val Ala Gly Leu Thr 425 430 435 atg acc tat gat gga aat aat cca gtg aca tct cat aga gat gta cca 1456 Met Thr Tyr Asp Gly Asn Asn Pro Val Thr Ser His Arg Asp Val Pro 440 445 450 455 ctt tct tat tgc aac tca gac tgc aat tgt gat gaa agt caa tgg gaa 1504 Leu Ser Tyr Cys Asn Ser Asp Cys Asn Cys Asp Glu Ser Gln Trp Glu 460 465 470 cca gtc tgt gga aac aat gga ata act tac atc tca ccc tgt cta gca 1552 Pro Val Cys Gly Asn Asn Gly Ile Thr Tyr Ile Ser Pro Cys Leu Ala 475 480 485 ggt tgc aaa tct tca agt ggc aat aaa aag cct ata gtg ttt tac aac 1600 Gly Cys Lys Ser Ser Ser Gly Asn Lys Lys Pro Ile Val Phe Tyr Asn 490 495 500 tgc agt tgt ttg gaa gta act ggt ctc cag aac aga aat tac 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gtc tac ttg ggc ttg tct tca atg 1984 Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Arg Val Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Met 620 625 630 tta aga gtc tca tca ctt gtt tta tat att ata tta att tat gcc atg 2032 Leu Arg Val Ser Ser Leu Val Leu Tyr Ile Ile Leu Ile Tyr Ala Met 635 640 645 aag aaa aaa tat caa gag aaa gat atc aat gca tca gaa aat gga agt 2080 Lys Lys Lys Tyr Gln Glu Lys Asp Ile Asn Ala Ser Glu Asn Gly Ser 650 655 660 gtc atg gat gaa gca aac tta gaa tcc tta aat aaa aat aaa cat ttt 2128 Val Met Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser Leu Asn Lys Asn Lys His Phe 665 670 675 gtc cct tct gct ggg gca gat agt gaa aca cat tgt taaggggaga 2174 Val Pro Ser Ala Gly Ala Asp Ser Glu Thr His Cys 680 685 690 aaaaaagcca cttctgcttc tgtgtttcca aacagcattg cattgattca gtaagatgtt 2234 atttttgagg agttcctggt cctttcacta agaatttcca catcttttat ggtggaagta 2294 taaatatgcc tatgaactta taataaaaca aactgtaggt agaaaaaatg agagtactca 2354 ttgttacatt atagctacat atttgtggtt aaggttagac tatatgatcc atacaaatta 2414 aagtgagaga catggttact gtgtaataaa agaaaaaata cttgttcagg taattcttaa 2474 taaaacaaat gagtatcata caggtagagg ttaaaaagga ggagctagat tcatatccta 2534 agtaaagaga aatgcctagt gtctatttta ttaaacaaac aaacacagag tttgaactat 2594 aatactaagg cctgaagtct agcttggata tatgctacaa taatatctgt tactcacata 2654 aaattatata tttcacagac tttatcaatg tataattaac aattatcttg tttaagtaaa 2714 tttagaatac atttaagtat tgtggaagaa ataaagacat tccaatattt gcaaaaaaaa 2774 aaaaaaa 2781 <210> 2 <211> 691 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Gln Asn Gln His Leu Asn Lys Thr Ala Glu Ala Gln Pro Ser 1 5 10 15 Glu Asn Lys Lys Thr Arg Tyr Cys Asn Gly Leu Lys Met Phe Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Ser Leu Ser Phe Ile Ala Lys Thr Leu Gly Ala Ile Ile Met 35 40 45 Lys Ser Ser Ile Ile His Ile Glu Arg Arg Phe Glu Ile Ser Ser Ser 50 55 60 Leu Val Gly Phe Ile Asp Gly Ser Phe Glu Ile Gly Asn Leu Leu Val 65 70 75 80 Ile Val Phe Val Ser Tyr Phe Gly Ser Lys Leu His Arg Pro Lys Leu 85 90 95 Ile Gly Ile Gly Cys Phe Ile Met Gly Ile Gly Gly Val Leu Thr Ala 100 105 110 Leu Pro His Phe Phe Met Gly Tyr Tyr Arg Tyr Ser Lys Glu Thr Asn 115 120 125 Ile Asn Ser Ser Glu Asn Ser Thr Ser Thr Leu Ser Thr Cys Leu Ile 130 135 140 Asn Gln Ile Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Pro Glu Ile Val Gly Lys 145 150 155 160 Gly Cys Leu Lys Glu Ser Gly Ser Tyr Met Trp Ile Tyr Val Phe Met 165 170 175 Gly Asn Met Leu Arg Gly Ile Gly Glu Thr Pro Ile Val Pro Leu Gly 180 185 190 Leu Ser Tyr Ile Asp Asp Phe Ala Lys Glu Gly His Ser Ser Leu Tyr 195 200 205 Leu Gly Ile Leu Asn Ala Ile Ala Met Ile Gly Pro Ile Ile Gly Phe 210 215 220 Thr Leu Gly Ser Leu Phe Ser Lys Met Tyr Val Asp Ile Gly Tyr Val 225 230 235 240 Asn Leu Ser Thr Ile Arg Ile Thr Pro Thr Asp Ser Arg Trp Val Gly 245 250 255 Ala Trp Trp Leu Asn Phe Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Ile Ile Ser 260 265 270 Ser Ile Pro Phe Phe Phe Leu Pro Gln Thr Pro Asn Lys Pro Gln Lys 275 280 285 Glu Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu His Val Leu Glu Thr Asn Asp Glu 290 295 300 Lys Asp Gln Thr Ala Asn Leu Thr Asn Gln Gly Lys Asn Ile Thr Lys 305 310 315 320 Asn Val Thr Gly Phe Phe Gln Ser Phe Lys Ser Ile Leu Thr Asn Pro 325 330 335 Leu Tyr Val Met Phe Val Leu Leu Thr Leu Leu Gln Val Ser Ser Tyr 340 345 350 Ile Gly Ala Phe Thr Tyr Val Phe Lys Tyr Val Glu Gln Gln Tyr Gly 355 360 365 Gln Pro Ser Ser Lys Ala Asn Ile Leu Leu Gly Val Ile Thr Ile Pro 370 375 380 Ile Phe Ala Ser Gly Met Phe Leu Gly Gly Tyr Ile Ile Lys Lys Phe 385 390 395 400 Lys Leu Asn Thr Val Gly Ile Ala Lys Phe Ser Cys Phe Thr Ala Val 405 410 415 Met Ser Leu Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Phe Phe Ile Leu Cys Glu Asn 420 425 430 Lys Ser Val Ala Gly Leu Thr Met Thr Tyr Asp Gly Asn Asn Pro Val 435 440 445 Thr Ser His Arg Asp Val Pro Leu Ser Tyr Cys Asn Ser Asp Cys Asn 450 455 460 Cys Asp Glu Ser Gln Trp Glu Pro Val Cys Gly Asn Asn Gly Ile Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Ser Pro Cys Leu Ala Gly Cys Lys Ser Ser Ser Gly Asn Lys 485 490 495 Lys Pro Ile Val Phe Tyr Asn Cys Ser Cys Leu Glu Val Thr Gly Leu 500 505 510 Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Ala His Leu Gly Glu Cys Pro Arg Asp Asp 515 520 525 Ala Cys Thr Arg Lys Phe Tyr Phe Phe Val Ala Ile Gln Val Leu Asn 530 535 540 Leu Phe Phe Ser Ala Leu Gly Gly Thr Ser His Val Met Leu Ile Val 545 550 555 560 Lys Ile Val Gln Pro Glu Leu Lys Ser Leu Ala Leu Gly Phe His Ser 565 570 575 Met Val Ile Arg Ala Leu Gly Gly Ile Leu Ala Pro Ile Tyr Phe Gly 580 585 590 Ala Leu Ile Asp Thr Thr Cys Ile Lys Trp Ser Thr Asn Asn Cys Gly 595 600 605 Thr Arg Gly Ser Cys Arg Thr Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Arg Val 610 615 620 Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Met Leu Arg Val Ser Ser Leu Val Leu Tyr 625 630 635 640 Ile Ile Leu Ile Tyr Ala Met Lys Lys Lys Tyr Gln Glu Lys Asp Ile 645 650 655 Asn Ala Ser Glu Asn Gly Ser Val Met Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser 660 665 670 Leu Asn Lys Asn Lys His Phe Val Pro Ser Ala Gly Ala Asp Ser Glu 675 680 685 Thr His Cys 690 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gttcttggca gctctgtca 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cgattccaat taactttgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcccctgtat gttatgtttg 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caattccaac ggtgttca 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcagttgccg gactaaccat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttcccattga ctttcatcac 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 BA80 CA04 CA09 CA11 DA02 DA03 EA04 GA12 GA14 GA18 HA12 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ43 QQ61 QQ75 QQ77 QQ91 QQ94 QR41 QR56 QR62 QR77 QR80 QS03 QS24 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 BA15 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA03 BA04 BA08 BB06 BB08 BB13 BC01 BC50 CA24 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA72 FA74 HA06

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号１か
   ら６９１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、また
   は配列表の配列番号２のアミノ酸番号１から６９１で示
   されるアミノ酸配列において１個もしくは２個以上のア
   ミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有す
   る蛋白質。
2. 【請求項２】 肝臓組織由来である請求項１記載の蛋白
   質。
3. 【請求項３】 ヒト由来である請求項１または２記載の
   蛋白質。
4. 【請求項４】 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ１
   ＳＡＮＫ ７１０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４３）
   に保持される組換えベクターに挿入されているＤＮＡに
   コードされていることを特徴とする、請求項１乃至３の
   いずれか一つに記載の蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の
   蛋白質をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
   ９２から２１６４で示されるヌクレオチド配列からなる
   ＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号
   ９２から２１６４で示されるヌクレオチド配列からなる
   ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
   し、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有する蛋白質を
   コードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 肝臓組織由来である、請求項５乃至７の
   いずれか一つに記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 ヒト由来である、請求項５乃至８のいず
   れか一つに記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ
    １ ＳＡＮＫ ７１０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４
    ３）に保持される組換えベクターに挿入されているＤＮ
    Ａ。
11. 【請求項１１】 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ
    １ ＳＡＮＫ ７１０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４
    ３）に保持される組換えベクターに挿入されているＤＮ
    Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
    つ有機陰イオンを輸送する能力を有する蛋白質をコード
    するＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項５乃至１１のいずれか一つに記
    載のＤＮＡを含む組換えベクター。
13. 【請求項１３】 発現ベクターである、請求項１２記載
    の組換えベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１２または１３記載の組換えベ
    クターを保持する宿主細胞。
15. 【請求項１５】 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＨ
    １ ＳＡＮＫ ７１０９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７４
    ３）。
16. 【請求項１６】 請求項１乃至４のいずれか一つに記載
    の蛋白質を特異的に認識する抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１乃至４のいずれか一つに記載
    の蛋白質を動物細胞に発現させ、該蛋白質の有する有機
    陰イオンを輸送する能力を利用して被検物質の肝臓透過
    性を検定する方法。