JP2001037481A - 抗菊酸モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、抗菊酸モノクローナル抗体の可変領
域をコードする遺伝子、当該遺伝子を含むベクター、当
該ベクターで形質転換した宿主細胞および、前記遺伝子
を用いた抗菊酸モノクローナル抗体の可変領域の製造方
法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明の抗菊酸モノクローナル抗体の可変
領域をコードする遺伝子は、配列表１ないし４のいずれ
かに記載されたアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列
において１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗菊酸モノクロー
ナル抗体の可変領域、すなわち抗原結合部位をコードす
る遺伝子に関する。本発明は、さらに、当該遺伝子を含
むベクター、当該発現ベクターを含有する宿主細胞、お
よび当該宿主細胞を培養することにより抗菊酸モノクロ
ーナル抗体の可変領域を製造する方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】菊酸は、以下の式（１）：

【０００３】

【化１】

【０００４】で表される構造を有し、ピレスリン、アレ
スリン等のピレスロイド系殺虫剤の基本骨格をなす化合
物である。特に、ジクロロビニル菊酸とピレスロイドア
ルコールとのエステルは、高い殺虫効力を有し、また温
血動物に対する毒性が比較的低いことから、例えば、家
庭用殺虫剤として使用されている。

【０００５】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。環境や食品に関する安全確保のためには、これらに
含有される菊酸の量を迅速、かつ正確に測定することが
必要である。

【０００６】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックスおよびバクテリオファージが
適用されてきた。

【０００７】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は特に優れたものとして広
く使用されるに至っている。酵素免疫測定法についての
優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ ０−７２０４−４２
００−１（１９９０）に記載されている。

【０００８】菊酸については、例えば、特開平９−３７
７８３号公報、特開平９−３７７８４号公報、Ｐｅｓｔ
ｉｃ．Ｓｃｉ．１９９８，５４，１８９−１９４および
「抗菊酸モノクローン抗体の反応性と構造」片桐他、
（免疫化学測定法研究会 第２会（１９９７年）学術集
会（１９９７年６月７日）、講演要旨集、第１７頁）
（いずれも本明細書中、参考文献として援用する）に
は、菊酸の末端カルボキシル基に高分子化合物を結合さ
せたものを抗原として、菊酸および菊酸を含むピレスロ
イド系化合物に対する抗体が作製されたことが記載され
ている。具体的には、これらの文献は、菊酸に対するモ
ノクローナル抗体としてＫＣＡ１９０やＫＣＡ２２６を
開示している。モノクローナル抗体ＫＣＡ２２６は、例
えば寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５０５１として工業技術
院生命工学技術研究所に寄託されているハイブリドーマ
より得ることが可能である。

【０００９】しかしながら、本発明前は菊酸に対する抗
体のアミノ酸配列は解明されておらず、また当該抗体を
コードする遺伝子も得られていなかった。よって、抗体
の抗原との結合に重要な領域は明らかでなく、また、当
該抗体またはその抗原結合可能な断片（例えば、Ｆ_ab断
片など）を遺伝子工学的に製造することはできなかっ
た。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗菊酸モノ
クローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を提
供することを目的とする。

【００１１】本発明は、また、抗菊酸モノクローナル抗
体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を提供することを
目的とする。本発明は、さらに、前記抗菊酸モノクロー
ナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベク
ター、および当該ベクターで形質転換された宿主細胞を
提供することを目的とする。

【００１２】本発明は、さらにまた、前記宿主細胞を培
養することにより、抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖お
よび／または軽鎖の可変領域を遺伝子工学的手法により
製造する方法を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
解決を目的として鋭意研究に努めた結果、抗菊酸モノク
ローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、本発明を想
到した。以下、詳述する。

【００１４】一般に、抗体を構成する免疫グロブリンは
分子量５万−７万の重鎖（Ｈ鎖とも言う）と２万−３万
の軽鎖（Ｌ鎖ともいう）とから構成される。免疫グロブ
リンの基本構造のペプチド鎖構造は、それぞれ相同な２
本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合および
非共有結合によって結び合わされ、分子量１５万−１９
万である。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置する領域は、
同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっ
ても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域と呼ばれ
る。一方、これよりＣ末端側のアミノ酸配列は各クラス
毎でほぼ一定で定常領域（または「Ｆｃ領域」）と呼ば
れる。

【００１５】抗体の抗原結合部位は重鎖および軽鎖の可
変領域によって構成され、結合の特異性はこの部位のア
ミノ酸配列によっている。可変領域のうち特に違いの著
しい部分を超可変領域という。本発明は、抗菊酸モノク
ローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域に着目し、そ
の遺伝子を提供するものである。

【００１６】具体的には、本発明は、抗菊酸モノクロー
ナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を提供す
る。本発明において、抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖
可変領域は、以下のｉ）−ｉｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−１１２を有するアミ
ノ酸配列； ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−１１２を有するア
ミノ酸配列；および ｉｉｉ）上記ｉ）もしくはｉｉ）のアミノ酸配列におい
て１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列； からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、
かつ、抗原結合部位を形成して菊酸と相互作用すること
が可能である。

【００１７】好ましくは、本発明の遺伝子によってコー
ドされる抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、
以下のｉ）またはｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−１１２を有するアミ
ノ酸配列；または ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−１１２を有するア
ミノ酸配列 のアミノ酸配列を有する。

【００１８】より好ましくは、本発明の遺伝子は、配列
番号１の塩基配列１−３３６または配列番号３の塩基配
列１−３３６を有する。本発明は、また、抗菊酸モノク
ローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を提供
する。本発明において、当該抗菊酸モノクローナル抗体
の軽鎖可変領域は、以下のｉ）−ｉｉｉ）： ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１−９９を有するアミノ
酸配列； ｉｉ）配列番号４のアミノ酸残基１−９９を有するアミ
ノ酸配列；および ｉｉｉ）上記ｉ）もしくはｉｉ）のアミノ酸配列におい
て１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列； からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、
かつ、抗原結合部位を形成して菊酸と相互作用すること
が可能である。

【００１９】好ましくは、本発明の遺伝子によってコー
ドされる抗菊酸モノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、
以下のｉ）またはｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−９９を有するアミノ
酸配列；または ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−９９を有するアミ
ノ酸配列 のアミノ酸配列を有する。

【００２０】より好ましくは、本発明の遺伝子は、配列
番号２の塩基配列１−２９７または配列番号４の塩基配
列１−２９７を有する。上述した本発明の遺伝子は、本
明細書の開示に基づき公知の方法を用いて得ることがで
きる。例えば、限定されるわけではないが、本発明の遺
伝子は、抗菊酸モノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマより得ることができる。先ず、これらのハイブリ
ドーマより公知の方法によりｍＲＮＡを調製し、それを
基に逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成後、本明細
書に開示された抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖または
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列または塩基配列に基づ
き、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等を用いるこ
とによって、本発明の遺伝子を選択的に得ることが可能
である。このような方法は周知であり、当業者は本明細
書の開示に基づいて、本発明の遺伝子を容易に単離する
ことが可能である。

【００２１】抗菊酸モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは、限定されるわけではないが、例えば、前
述した工業技術院生命工学研究所に寄託されているＫＣ
Ａ２６６を用いることができる。あるいは、例えば、特
開平９−３７７８４号公報およびＰｅｓｔｉｃ．Ｓｃ
ｉ．１９９８，５４，１８９−１９４に記載された方法
を用いて作成することも可能である。

【００２２】本発明の遺伝子は、また、本明細書の記載
に基づき、既知の技術を用いて化学的に合成してもよ
い。本発明の遺伝子の配列の例を後述する配列表に開示
する。配列表の配列番号１および２は、各々前記ＫＣＡ
１９０の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする
遺伝子の塩基配列および推定されるアミノ酸配列を示
す。配列番号３および４は、各々前記ＫＣＡ２６６の重
鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子の塩
基配列および推定されるアミノ酸配列を示す。

【００２３】ＫＣＡ１９０およびＫＣＡ２６６の重鎖に
おいてアミノ酸残基２７−３７、５２−６１および１０
１−１０９は超可変領域に相当し、各々Ｈ１、Ｈ２およ
びＨ３と呼ばれる。同様に、ＫＣＡ１９０およびＫＣＡ
２６６の軽鎖においてアミノ酸残基１８−２５、４１−
４６および８０−８７は超可変領域に相当し、各々Ｌ
１、Ｌ２およびＬ３と呼ばれる。一般に、免疫グロブリ
ンにおいて超可変領域は立体構造上で相互に近接し、抗
体活性基を組み立てており、この領域によって結合する
抗原に対する特異性が決定される。ＫＣＡ１９０とＫＣ
Ａ２６６の軽鎖においては、アミノ酸配列はアミノ酸残
基８９においてのみ異なっており、ＫＣＡ１９０ではロ
イシンであり、ＫＣＡ２６６ではフェニルアラニンであ
った。その他の配列は同一であった。ＫＣＡ１９０とＫ
ＣＡ２６６の重鎖のアミノ酸配列は全体で約３５％相違
し、特に前記Ｈ１−Ｈ３では６３％相違していた。よっ
て、菊酸に対する２種の抗体の菊酸に対する親和性は、
重鎖の可変領域のアミノ酸配列の相違、特に、違いの著
しいＣ末端側のＨ３領域における相違により、有意に異
なると考えられる。

【００２４】本発明の遺伝子によってコードされるアミ
ノ酸配列を有する抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖また
は軽鎖の可変領域は、配列表および図面に具体的に記載
されたアミノ酸配列を有するものに限定されず、当該配
列において１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、抗原結
合部位を形成して菊酸と相互作用することが可能であ
る、即ち、抗体の可変領域としての機能を保持するもの
も含む。このような遺伝子には、本明細書に具体的に記
載されたアミノ酸配列よりも菊酸に対する結合能がより
高いものも含まれる。このような遺伝子は、菊酸に対す
る抗体としてＫＣＡ１９０およびＫＣＡ２６６以外の抗
体を産生するハイブリドーマに由来してもよい。あるい
は、本明細書に記載されたＫＣＡ１９０およびＫＣＡ２
６６の塩基配列および／またはアミノ酸配列に基づい
て、オリゴヌクレオチドの合成および結合によって、ま
たは部位特異的変異誘発技術によって調製されたＤＮＡ
構築物から合成してもよい。例えば、本発明の遺伝子
は、ストリンジェントな条件下で（例えば、２ｘＳＳＣ
中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ
中、５０℃で洗浄）配列番号１ないし４のいずれかの塩
基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズし、かつ抗原結
合部位を形成して菊酸と相互作用することが可能である
ペプチドをコードする遺伝子も含む。

【００２５】一般的には、アミノ酸配列の置換は、保存
的に行われねばならない、即ち、最も好ましい置換アミ
ノ酸は、ＫＣＡ１９０またはＫＣＡ２６６と実質的に等
価な様式で抗原結合部位を形成して菊酸と相互作用する
可変領域の能力に影響を与えないアミノ酸である。保存
的置換の例としては、例えばＫＣＡ１９０またはＫＣＡ
２６６の二次構造および／または三次構造を変化させな
いアミノ酸の置換が含まれる。さらなる例として、Ｉｌ
ｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いに置換すると言
ったような一つの脂肪族残基をもう一つの脂肪族残基に
置換すること、またはＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓ
ｐ；あるいはＧｌｎとＡｓｎの間の置換のような一つの
極性残基をもう一つの極性残基に置換することが含まれ
る。その他のそのような保守的置換では、例えば、同様
の疎水性性質を持つ領域全体の置換が良く知られてい
る。

【００２６】その他の例として、Ｃｙｓ残基が欠失する
または他のアミノ酸で置き換えられる原因となる様に、
Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させ、再生時の不適
当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができ
る。置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、
アスパラギン酸およびリジンからなる基より選択され、
最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファンである。

【００２７】同様に、生物活性への欠失または挿入によ
る潜在的効果を考慮することにより、アミノ酸配列を欠
失または付加することが可能である。例えば、酵母の発
現系を用いると均一の炭水化物が減少した類似体が発現
されるが、Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグルコシル
化を排除することができる。真核生物のポリペプチド内
のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレット、Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｙ（式中，ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸で
あり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。
このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当
な修飾は、Ａｓｎ側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置
換、付加または欠失を結果として生ずるであろう。ある
いは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での
発現を強化するために、二塩基性のアミノ酸残基をコー
ドする配列を修飾することも可能である。抗菊酸モノクローナル抗体の可変領域の発現 本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該発
現ベクターで形質転換させた宿主細胞を培養することに
より、抗菊酸モノクローナル抗体の可変領域を遺伝子工
学的に発現させることが可能である。

【００２８】一般に抗体の重鎖、軽鎖の可変領域は抗原
結合部位を含み、両領域のＤＮＡをリンカーで繋ぎ、宿
主細胞内で発現させることにより、抗原結合能を持った
一本鎖のＦｖ蛋白質（ｓＦｖ）が得られることが知られ
ている。よって、例えば、本発明の重鎖および軽鎖の双
方の可変領域をコードする遺伝子を大腸菌等の宿主細胞
内で発現させることにより、菊酸に結合能を持った蛋白
質を大量に得ることが可能である（図５）。これは、血
清を必要とする培地で培養することにより得られるモノ
クローナル抗体の維持より安価であり、酵素免疫測定法
への応用が期待出来る。あるいは、本発明の遺伝子を含
むベクターを動植物に導入することにより、ピレスロイ
ド系殺虫剤に耐性な動植物を作出することができる。

【００２９】組換え遺伝子工学技術によって抗菊酸モノ
クローナル抗体の可変領域（本明細書中、文脈により単
に「可変領域」という）を発現するための組換え発現ベ
クターには、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の
遺伝子から誘導されたような適当な転写または翻訳調節
ヌクレオチド配列に機能するように）連結させた、可変
領域をコードするｃＤＮＡ配列が含まれる。調節配列の
例としては、遺伝子発現に調節的役割を持つ配列（例え
ば、調節プロモーターまたはエンハンサー）、所望であ
れば転写を制御するためのオペレーター配列、ｍＲＮＡ
リボソーム結合部位をコードする配列、および転写およ
び翻訳の開始ならびに終止を制御する適当な配列が含ま
れる。

【００３０】調節配列が可変領域ＤＮＡ配列と機能上関
係する場合に、ヌクレオチド配列は機能しうるように連
結している。例えば、プロモーターヌクレオチド配列が
可変領域ＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモー
ターヌクレオチド配列は機能しうるように可変領域ＤＮ
Ａ配列に連結している。さらになお、リボソーム結合部
位が翻訳を促進するためにベクター内に位置するなら
ば、リボソーム結合部位は機能しうるように可変領域ポ
リペプチド配列に連結しているであろう。さらに、シグ
ナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に取り
込むこともできる。例えば、シグナルペプチド（分泌リ
ーダー）のＤＮＡ配列を、機能しうるように可変領域Ｄ
ＮＡ配列に連結することができる。

【００３１】可変領域ポリペプチドの発現に適当な宿主
細胞には、原核生物、酵母またはより高度な真核生物細
胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム
陽性の生物体、例えば、大腸菌またはＢａｃｉｌｌｉが
含まれる。形質転換に適当な原核生物宿主細胞には、例
えば、大腸菌、枯草菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ並びにシュードモナス、ストレプトマ
イセスおよびサッカロマイセス属のさまざまなその他の
種が含まれる。より高度な真核生物細胞には、哺乳動物
起源の確立された細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もま
た、本明細書中に開示されたＤＮＡ構築物に基づいて得
られたＲＮＡを用いて可変領域ポリペプチドを生成する
ために用いることができる。細菌、真菌、酵母および哺
乳動物細胞宿主で用いるために適当なクローニング用お
よび発現用ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８５）に記載されている。

【００３２】組換え可変領域ＤＮＡ配列を持つ発現ベク
ターを、適当な宿主微生物または哺乳動物の細胞系の実
質的に均一な培養物内にトランスフェクトまたは形質転
換する。形質転換された宿主細胞は、可変領域ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列で形質転換またはト
ランスフェクトした細胞であり、可変領域ポリペプチド
を発現する。発現した可変領域ポリペプチドは、宿主細
胞および宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に
依存して、宿主細胞内に位置する、および／または培養
液上澄み液体内に分泌されるであろう。

【００３３】原核生物の宿主細胞内にトランスフェクト
された発現ベクターは、一般的には、一つまたはそれよ
り多くの選択可能な表現型マーカーを含んでいる。選択
可能な表現型マーカーは、例えば、抗体耐性を授与する
または栄養素要求性を供給するタンパク質をコードする
遺伝子、および宿主内での増幅を確実にするように宿主
によって認識される複製開始点である。原核生物宿主細
胞のその他の有効な発現ベクターには、商品として入手
可能なプラスミドから誘導された細菌起源の選択可能マ
ーカーが含まれる。この選択可能マーカーは、クローニ
ングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の
遺伝要素を含むことができる。ｐＢＲ３２２は、アンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含
み、それ故、形質転換された細胞を同定するための単純
な手段を提供する。ｐＢＲ３２２の「骨格（ｂａｃｋｂ
ｏｎｅ）」部分を、適当なプロモーターおよび可変領域
ＤＮＡ配列と結合する。その他の商品として入手可能な
ベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が
含まれる。

【００３４】プロモーター配列は、組換え原核生物宿主
細胞発現ベクターに共通して用いられている。共通プロ
モーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａ
ｔｕｒｅ，２７５：６１５，１９７８；およびＧｏｅｄ
ｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４、１９７
９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏ
ｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：
４０５７，１９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）、
およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４１２，１９８２）が含
まれる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系には、ファ
ージλ ＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ不耐熱
性レプレッサー配列が用いられている。アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手
可能な、λ ＰＬプロモーターの誘導体を組み込むプラ
スミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２［大腸菌株
ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）内に常在］およびｐ
ＰＬｃ２８［大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に
常在］が含まれる。

【００３５】可変領域は、サッカロミセス属（例えば、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母宿主細胞内で発現
させることもできる。ピキアまたはクルイベロミセスの
ようなその他の酵母の属もまた、用いることができる。
酵母ベクターは、時として、２μ酵母プラスミドからの
複製開始配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター
領域、ポリアデニル化配列、および転写終止配列を含ん
でいるであろう。望ましくは、酵母ベクターは、複製開
始配列および選択可能マーカーを含む。適当な酵母ベク
ターのプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−
ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３、１９８
０）、あるいはその他の解糖系の酵素（Ｈｅｓｓら、
Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．，７：１４９、１
９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
１７：４９００、１９７８）、例えばエノラーゼ、グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイ
ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベ
ートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、
ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等
が含まれる。酵母発現に用いられるその他の適当なベク
ターおよびプロモーターは、さらに、Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ、ＥＰＡ−７３，６５７に記載されている。

【００３６】また、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養
系を、組換え可変領域ポリペプチドを発現させるために
用いることもできる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例と
しては、サルの腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ，２３：
１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細
胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞系が含まれる。適当な哺乳動
物発現ベクターには、構造遺伝子に連結された、複製開
始点、プロモーター配列、エンハンサーの等の非転写要
素；リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプラ
イスドナーおよびアクセプター部位ならびに転写終止配
列等の５’または３’近接非翻訳配列；が含まれる。

【００３７】哺乳動物の宿主細胞発現ベクターの転写お
よび翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すこと
ができる。例えば、一般に用いられる哺乳動物細胞プロ
モーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウ
イルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（Ｓ
Ｖ４０）およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導さ
れる。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、
例えば、ＳＶ４０開始点、初期および後期プロモータ
ー、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化
部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内で構造遺伝子配列の
発現に必要とされるその他の遺伝要素を提供することが
できる。

【００３８】哺乳動物の発現ベクターは、例えばＯｋａ
ｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，３：２８０、１９８３）によって開示された方法
に従って、構築することができる。Ｃｏｓｍａｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３１２：７６８，１９８４に記載された、
有用な高発現ベクターであるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４
は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。さらな
る有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７
５５６、および米国特許出願番号０７／７０１，４１
５、１９９１年５月１６日出願、ここに参照として採用
される、に記載されている。

【００３９】限定されるわけではないが、重鎖と軽鎖の
可変領域は、間にリンカー配列を存在させタンデムに結
合して発現させるのが好ましい。重鎖および軽鎖を含む
複数の鎖を近接させて発現させることにより、抗体への
結合能が上がり得る。本発明の遺伝子を利用して、重鎖
と掲載をタンデムに結合して大量発現することが可能で
ある。リンカー配列としては、特に限定されないが、長
さは６塩基−２０塩基程度が好ましい。リンカー配列は
市販のものを使用でき、例えば、ファルマシアバイオテ
クのＬｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを使用できる
（図５）。

【００４０】また、本発明の可変領域をコードする遺伝
子は、可変領域を他のタンパク質あるいはポリペプチド
と共有結合または凝集させるように、これらをコードす
る遺伝子と結合させて発現させてもよい。このような融
合体として、例えば、翻訳と同時にまたは翻訳後にその
合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部
位へ複合体を運搬することに関与する、可変領域ポリペ
プチドのＮ末端領域またはＣ末端領域のシグナルまたは
リーダーポリペプチドを含む（例えば、サッカロミセス
のα因子リーダー）。あるいは、可変領域ポリペプチド
融合体は、可変領域の精製および同定を容易にするため
に加えたポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）との融
合体であってもよい。

【００４１】融合タンパク質は、所望の配列からフラグ
メントを酵素で切断および結合する慣用的技術を用い
て、調製することができる。合成オリゴヌクレオチドを
用いるＰＣＲ技術は、所望のフラグメントを調製および
／または増幅させるために用いることができる。所望の
配列を示す合成のオリゴヌクレオチドもまた、融合タン
パク質をコードするＤＮＡ構築物を調製するために用い
ることができる。また、融合タンパク質は、可変領域、
ならびにリーダー（またはシグナルペプチド）配列、オ
リゴマー化領域（例えば、ロイシンジッパー部分または
適当なジッパー部分）リンカー配列、および融合タンパ
ク質を容易に精製または迅速に検出するための手段を提
供する免疫原性の高い部分をコードする配列等を含む、
１つまたは複数の付加配列を含むことができる。

【００４２】シグナルペプチドは、細胞からのタンパク
質の分泌を促進する。Ｆｌａｇ（登録商標）オクタペプ
チド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
６：１２０４，１９８８）は、融合タンパク質の生物活
性を変化させず、高い免疫原性を持ち、そして発現した
融合タンパク質の迅速な検出および容易な精製を可能に
する、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合
されるエピトープを提供する。また、Ｆｌａｇ（登録商
標）配列は、ウシの粘膜のエンテロキナーゼによって、
Ａｓｐ−Ｌｙｓ対に続くすぐの残基で特異的に切断さ
れ、このペプチドでキャップされた融合タンパク質はま
た、大腸菌内での細胞内分解にも耐性である。Ｆｌａｇ
（登録商標）と結合するネズミのモノクローナル抗体
は、ＡＴＣＣに寄託され（寄託番号 ＨＢ ９２５
９）；Ｆｌａｇ（登録商標）配列を含む融合タンパク質
を抗体を用いて精製する方法は、米国特許第５，０１
１，９１２号に記載されており、ここに参照として採用
される。

【００４３】本発明の可変領域をコードする遺伝子は、
抗体の定常領域（以下、「Ｆｃ領域」と言う）をコード
する遺伝子と結合させて発現させてもよい。定常領域
は、可変領域の由来するモノクローナル抗体と同一のも
のであっても、あるいは、異なるモノクローナル抗体に
由来するものであってもよい。適当なＦｃ領域は、プロ
テインＡあるいはプロテインＧと結合することができる
か、あるいは、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質の精製あ
るいは検出に用いることのできる抗体によって認識され
うる。Ｆｃ領域として例えば、公知のヒトのＩｇＧ１ま
たはネズミのＩｇＧ１のＦｃ領域が使用可能である。適
当なＦｃ領域のフラグメント、例えば、プロテインＡと
の結合に応答するアミノ酸の配列を欠失させ、そうする
ことによってフラグメントがプロテインＧとは結合する
がプロテインＡとは結合しないようにした、ヒトＩｇＧ
１のＦｃ領域もまた、用いることができる。

【００４４】また、抗体を用いる免疫学的測定方法で
は、一般に感度、特異性、有機溶媒耐性等の問題が生じ
うる。本発明の遺伝子を他のタンパク質またはペプチド
との融合タンパク質として発現させることにより、この
ような問題の解決を図ることが可能である。例えば、限
定されるわけではないが、特異性の上昇を目的として高
温で測定を行うために、Ｔｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ、制限酵素Ｔａｑ Ｉ等の耐熱性酵素との融合
タンパク質を産生することができる。組換え可変領域ポリペプチド 本発明の遺伝子を用いて抗菊酸モノクローナル抗体の重
鎖および／または軽鎖の可変領域を製造することが可能
である。具体的には、本発明の遺伝子を含むベクターで
形質転換された宿主細胞を、抗菊酸モノクローナル抗体
の重鎖および／または軽鎖の可変領域の発現を促進する
条件下で培養し、そして、当該培養物から抗菊酸モノク
ローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域を回
収する。

【００４５】可変領域ポリペプチドは、可変領域ポリペ
プチドを発現するために必要な培養条件下で形質転換さ
れた宿主細胞を培養することによって、調製することが
できる。次に、その結果得られた発現したポリペプチド
を、培養液または細胞抽出物より精製することが出来
る。所望であれば、可変領域ポリペプチドを、商品とし
て入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍ
ｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ
限外ろ過ユニットを用いて、濃縮することができる。濃
縮処理の後、濃縮物を、ゲルろ過媒質のような精製用マ
トリックスに負荷することができる。あるいは、陰イオ
ン交換樹脂、例えば、遊離のジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）基を持つマトリックスまたは基質、を用いるこ
とができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロ
ース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質の精
製に共通して用いられるその他の型であることができ
る。あるいは、陽イオン交換体を用いることもできる。
適当な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカル
ボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリックスが
含まれる。スルホプロピル基が好ましい。

【００４６】最終的に、さらに可変領域を精製するため
に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、遊離のメチル
あるいはその他の脂肪族の基を持つシリカゲル）を用い
る一段階またはそれより多段階の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いることができる。
前述の精製手段のいくつかまたはすべてをさまざまに組
み合わせて、実質的に均一な組換えタンパク質を提供す
るために用いることもできる。

【００４７】発現した可変領域ポリペプチドをアフィニ
ティー精製するために、菊酸を結合させたアフィニティ
ーカラムを用いることも可能である。可変領域ポリペプ
チドを、高塩の溶出バッファーでアフィニティーカラム
から取り出し、次に、用いられるより低塩のバッファー
で透析することができる。

【００４８】細菌培養で生成した組換えタンパク質は、
通常、最初に宿主細胞の崩壊、遠心分離、不溶性ポリペ
プチドであれば細胞ペレットからの、または、可溶性ポ
リペプチドであれば上澄み液からの抽出、さらに、一段
階またはそれより多段階の濃縮、塩析、イオン交換、ア
フィニティー精製または限外ろ過クロマトグラフィーに
よって、単離される。最終的には、ＲＰ−ＨＰＬＣを最
終精製段階に用いることができる。微生物細胞は、凍結
融解循環、音波処理、機械的崩壊または細胞溶解剤の使
用を含む、任意の慣用的方法に従って崩壊させることが
できる。

【００４９】形質転換した酵母の宿主細胞は、望ましく
は、分泌ポリペプチドとして可変領域を発現させるため
に用いられる。このことは精製を簡易化する。酵母宿主
細胞の発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒ
ｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，２９６：１７
１，１９８４）によって開示された方法に類似した方法
に従って、精製することができる。Ｕｒｄａｌらは、調
製用ＨＰＬＣカラム上でヒトの組換えＩＬ−２を精製す
るために順々に行う２段階の逆相ＨＰＬＣについて記載
している。

【００５０】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００５１】

【実施例】実施例 （１） 抗菊酸抗体ｍＲＮＡの部分精製 抗菊酸モノクローナル抗体ＫＣＡ１９０およびＫＣＡ２
６６を産生するハイブリドーマ細胞（マウス）（ＫＣＡ
２６６はＦＥＲＭ Ｐ−１５０５１として工業技術院生
命工学技術研究所に寄託されている）の１０ｘ１０
⁶を、ＲＮＡ調製溶液（ＩＳＯＧＥＮ溶液、和光純薬よ
り購入）１ｍｌに縣濁し細胞を破壊した。５分間室温で
放置した後、クロロホルムを０．２ｍｌ加えボルテック
スで１５秒間攪拌後、３分間静置することにより細胞か
らＲＮＡを抽出した。日立遠心機Ｒ１５を用い１２，０
００ｒｐｍ、３分間遠心し上清にＲＮＡを回収した。上
清を新しいチューブに移し、０．５ｍｌのイソプロパノ
ールを加えＲＮＡを沈殿させた。上記遠心機で１２，０
００ｒｐｍ、１０分間遠心しＲＮＡを沈殿として回収し
た。７５％エタノール溶液で洗浄後、沈殿を乾燥させ
た。ＲＮＡの沈殿を水に溶かし２６０ｎｍの吸光度から
濃度を求めた。

【００５２】次に得られたＲＮＡ約２００μｇに抽出用
緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，
１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＳＤＳ）と等量のＯｌｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ラッテクス（宝酒造より購入）溶
液２００μｌを加え、６５℃で５分間加温した。その後
氷中で３分間急冷し、さらに５Ｍの塩化ナトリウム溶液
を１０分の１量加え３７℃で１０分間加温することによ
りＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０にｍＲＮＡのみを結合させた。
上記遠心機で１２，０００ｒｐｍで３分間遠心した。沈
殿したＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０に２００μｌの滅菌水を加
えた後、６５℃で５分間加温した後氷中で３分間急冷し
ｍＲＮＡを樹脂から解離させた。再び遠心することによ
り上澄みとしてｍＲＮＡを回収した。 （２） 抗菊酸モノクローナル抗体重鎖、軽鎖各可変領
域ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成は、Ｍｏｕｓｅ ＳｃＦｖ Ｍｏｄｕｌ
ｅ／Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシアバイオテクより購
入）を用いた。軽鎖、重鎖用にｍＲＮＡ各約８００ｎ
ｇ、２１μｌを６５℃で１０分間加温した後、氷中で急
冷しｍＲＮＡの２次構造を破壊した。その後Ｐｒｉｍｅ
ｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｍｉｘ（ファルマシア
バイオテクより購入）溶液１μｌと ＤＤＴ溶液１μｌ
を加え３７℃で１時間反応させた。軽鎖用には、Ｌｉｇ
ｈｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（ファルマシアバイオテク
より購入）を２μｌと滅菌水６４μｌ、重鎖用には、Ｈ
ｅａｖｙ Ｐｒｉｍｅｒ １を２μｌ、Ｈｅａｖｙ Ｐ
ｒｉｍｅｒ ２を２μｌ（ファルマシアバイオテクより
購入）滅菌水６２μｌを加え、９５℃で５分間加温し
た。その後ＡｍｐｒｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（パーキンエルマーより購入）１μｌを加え、９
５℃ １分間、５５℃ ２分間、７２℃ ２分間を３０
回繰り返した。これにより、抗菊酸モノクローナル抗体
の重鎖、軽鎖の可変領域に対するｃＤＮＡ断片を得た。
各断片は、電気泳動後の１．５％アガロースより、ＧＥ
ＮＥＣＲＥＡＮ ＩＩ（ＢＩＯ１０１より購入）を用い
て抽出した。 （３） 抗菊酸モノクローナル抗体重鎖、軽鎖各可変領
域ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築 得られた各ｃＤＮＡを５０ｎｇとＬｉｎｋｅｒ Ｐｒｉ
ｍｅｒ Ｍｉｘ（ファルマシアバイオテクより購入）４
μｌ、１０ｘＰｆｕ用緩衝液（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ
ＣＬＯＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳより購入）５μｌ、２
０ｍＭ ｄＮＴＰ（ファルマシアバイオテクより購入）
２．５μｌ、２５ｍＭ 塩化マグネシウム ５μｌ、Ｐ
ｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＳＴＲＡＴＡ
ＧＥＮＥＣＬＯＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳより購入）５
Ｕ １μｌを加え、滅菌水で５０μｌにし、９４℃で１
分間、６３℃で４分間を７回繰り返した後、Ｐｆｕ Ｄ
ＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １μｌ、１０ｘＰｆｕ用
緩衝液（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ ＣＬＯＮＩＮＧ ＳＹ
ＳＴＥＭＳより購入）５μｌ、２０ｍＭ ｄＮＴＰ（フ
ァルマシアバイオテクより購入）１μｌ、ＰＳ Ｐｒｉ
ｍｅｒ Ｍｉｘ（ファルマシアバイオテクより購入）４
μｌ、滅菌水３９μｌを加え、再び、９５℃ １分間、
５５℃ ２分間、７２℃ ２分間を３０回繰り返した。
得られた重鎖と軽鎖可変領域ｃＤＮＡ断片がリンカーで
結合されたＤＮＡ断片は、電気泳動後の１．５％アガロ
ースより、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ
１０１より購入）を用いて抽出した。この断片はＨｉｎ
ｃＩＩで平滑末端となる様に一箇所切断されたｐＵＣ１
９プラスミドにライゲーションされた。つまり、３ｐｍ
ｏｌのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９ＨｉｎｃＩＩ切断断片
０．００３ｐｍｏｌとライゲーションキット（宝酒造よ
り購入）Ａ液ＤＮＡ溶液の６倍量とＢ液等量を加え、１
６℃で一晩反応させた。反応液をエタノール沈殿後、１
０μｌの滅菌水に溶かし、ＪＭ１０９コンピーテントセ
ル（東洋紡より購入）に加え、形質転換を行った。 （４） ｃＤＮＡインサートの塩基配列の決定および抗
菊酸モノクローナル抗体重鎖、軽鎖各可変領域のアミノ
酸配列 ダイデオキシ法を用いて、ｃＤＮＡインサートの全塩基
配列を決定した。プライマーとして、ｐＵＣ用ユニバー
サルプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ， Ｒｅｖｅｒｓｅ）
（ＢＲＬより購入）とリンカー部分のプライマー（Ｓ
３， Ｓ４）（ファルマシアバイオテクより購入）を用
い、Ｄｙｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕ
ｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ （パーキンエルマージャパンより購入）によりＤ
ＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（パーキ
ンエルマージャパンより購入）で反応を行った。

【００５３】インサートの構造を図５に示し、重鎖、軽
鎖各可変領域の塩基配列とそのアミノ酸配列を図１ない
し図４に示した。得られた重鎖可変領域は、ＫＣＡ１９
０、ＫＣＡ２２６とも、３３６塩基、アミノ酸１１２残
基からなり、軽鎖可変領域は、２９７塩基、アミノ酸９
９残基であった。得られたアミノ酸配列は、プロテイン
データーベース登録の２種以上のマウス抗体遺伝子の可
変領域と７０％以上の相同性を示し、抗体遺伝子である
ことが確認できた。

【００５４】

【発明の効果】本発明により、抗菊酸モノクローナル抗
体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする遺伝子が提
供され、可変領域のアミノ酸配列および塩基配列が明ら
かとなった。本発明は、特に２種類の抗菊酸モノクロー
ナル抗体の遺伝子を解析することにより、可変領域にう
ち特に抗原との結合に関与すると考えられる領域等を詳
細に比較検討された。

【００５５】本発明によって提供された遺伝子を用いて
宿主細胞内で発現させることにより、菊酸に結合能を持
ったタンパク質を大量に得ることが可能となった。これ
は、血清を必要とする培地で培養することにより得られ
るモノクローナル抗体の維持より安価であり、酵素免疫
測定法への応用が可能である。また、本発明の遺伝子を
動植物に導入することにより、ピレスロイド系殺虫剤に
耐性な動植物を作出が可能となった。本発明の遺伝子
は、さらに改変により、より結合能の優れた抗体や耐熱
性酵素と融合させることにより、抗体の持つ酵素免疫測
定法の実施における一般的な問題点である、感度、特異
性、有機溶媒耐性などの克服も可能とする。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 環境免疫技術研究所 <120> 抗菊酸モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子 <130> 990370 <160> 4 <170> JIS <210> 1 <211> 336 <212> DNA <400> 1 atg gcc cag gtc aag ctg cag gag tca gga cct gag ctg gtg aag 45 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 1 5 10 15 cct ggg gct tca gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggc tac tcc 90 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser 20 25 30 ttc att gac cac tat ata aac tgg gtg aag cag aag cct gga cag 135 Phe Ile Asp His Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 gga ctt gag tgg att gga tgc ttt ttt cct gga agc ggt aat agt 180 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Phe Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ser 50 55 60 aag tac att gag aac ttc agg ggc aag gcc aca ttg act gta gac 225 Lys Tyr Ile Glu Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp 65 70 75 aca tcc tcc agt aca gcc tac atg cag ctc agc agt ctg gca tct 270 Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser 80 85 90 gag gac act gct gtc tat ttc tgt gca agg gat gat tcc gac gga 315 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Asp Ser Asp Gly 95 100 105 gct atg gac tac tgg ggc caa 336 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 110 112 <210> 2 <211> 297 <212> DNA <400> 2 gca atc atg tct gca tct cca ggg gag agg gtc acc atg acc tgc 45 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys 1 5 10 15 agt gcc agc tca agt ata cgt tac ata tat tgg tac caa cag aag 90 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 cct gga tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat gac aca tcc aac gtg 135 Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Val 35 40 45 gct cct gga gtc cct ttt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc 180 Ala Pro Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 tct tat tct ctc aca atc aac cga atg gag gct gag gat gct gcc 225 Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala 65 70 75 act tat tac tgc cag gag tgg agt ggt tat ccg tac acg ctc gga 270 Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Leu Gly 80 85 90 ggg ggg acc aag ctg gaa atc aaa cgg 297 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 95 99 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <400> 3 atg gcc cag gtg aaa ctg cag gag tca gga act gag gtg gtg aag 45 Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Glu Val Val Lys 1 5 10 15 cct ggg gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac atc 90 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile 20 25 30 ttc aca agt tat gat ata gac tgg gtg agg cag acg cct gaa cag 135 Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln 35 40 45 gga ctt gag tgg att gga tgg att ttt cct gga gag ggg agt act 180 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr 50 55 60 gaa tac aat gag aag ttc aag ggc agg gcc aca ctg agt gta gac 225 Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp 65 70 75 aag tcc tcc agc aca gcc tat atg gag ctc act agg ctg aca tct 270 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser 80 85 90 gag gac tct gct gtc tat ttc tgt gct aga ggg gac tac tat agg 315 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg 95 100 105 cgc tac ttt gac ttg tgg ggc 336 Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 110 112 <210> 4 <211> 336 <212> DNA <400> 4 gca atc atg tct gca tct cca ggg gag agg gtc acc atg acc tgc 45 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys 1 5 10 15 agt gcc agc tca agt ata cgt tac ata tat tgg tac caa cag aag 90 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Arg Tyr Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 cct gga tcc tcc ccc aga ctc ctg att tat gac aca tcc aac gtg 135 Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Val 35 40 45 gct cct gga gtc cct ttt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc 180 Ala Pro Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60 tct tat tct ctc aca atc aac cga atg gag gct gag gat gct gcc 225 Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala 65 70 75 act tat tac tgc cag gag tgg agt ggt tat ccg tac acg ttc gga 270 Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly 80 85 90 ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgt 297 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 95 99

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、抗菊酸モノクローナル抗体１９０の重
鎖可変領域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を表す。

【図２】図２は、抗菊酸モノクローナル抗体１９０の軽
鎖可変領域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を表す。

【図３】図３は、抗菊酸モノクローナル抗体２２６の重
鎖可変領域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を表す。

【図４】図３は、抗菊酸モノクローナル抗体２２６の軽
鎖可変領域の塩基配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を表す。

【図５】図５は、ｐＫＣＡ１０９及び２２６の構成を表
したもので、黒棒と斜線部がそれぞれ重鎖と軽鎖の可変
領域のＤＮＡ領域を示している。両端に制限酵素Ｓｆｉ
ＩとＮｏｔＩ切断部位があり、遺伝子が切り出し可能で
ある。細線部分は、ｐＵＣ１９の塩基配列を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 CA04 DA02 DA03 DA05 DA11 EA04 4B064 AG27 CA02 CA05 CA10 CA11 CA19 CC24 DA13 4B065 AA01X AA57X AA88X AA90X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖可変領域
   をコードする遺伝子であって、当該抗菊酸モノクローナ
   ル抗体の重鎖可変領域が、以下のｉ）−ｉｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−１１２を有するアミ
   ノ酸配列； ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−１１２を有するア
   ミノ酸配列；および ｉｉｉ）上記ｉ）もしくはｉｉ）のアミノ酸配列におい
   て１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列； からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、
   かつ、抗原結合部位を形成して菊酸と相互作用すること
   が可能である、前記遺伝子。
2. 【請求項２】抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖可変領域
   が、以下のｉ）またはｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−１１２を有するアミ
   ノ酸配列；または ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−１１２を有するア
   ミノ酸配列 のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号１の塩基配列１−３３６または配
   列番号３の塩基配列１−３３６を有する、請求項１また
   は２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】抗菊酸モノクローナル抗体の軽鎖可変領域
   をコードする遺伝子であって、当該抗菊酸モノクローナ
   ル抗体の軽鎖可変領域が、以下のｉ）−ｉｉｉ）： ｉ）配列番号２のアミノ酸残基１−９９を有するアミノ
   酸配列； ｉｉ）配列番号４のアミノ酸残基１−９９を有するアミ
   ノ酸配列；および ｉｉｉ）上記ｉ）もしくはｉｉ）のアミノ酸配列におい
   て１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列； からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有し、
   かつ、抗原結合部位を形成して菊酸と相互作用すること
   が可能である、前記遺伝子。
5. 【請求項５】抗菊酸モノクローナル抗体の軽鎖可変領域
   が、以下のｉ）またはｉｉ）： ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１−９９を有するアミノ
   酸配列；または ｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１−９９を有するアミ
   ノ酸配列 のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の遺伝子。
6. 【請求項６】配列番号２の塩基配列１−２９７または配
   列番号４の塩基配列１−２９７を有する、請求項４また
   は５に記載の遺伝子。
7. 【請求項７】請求項１ないし６のいずれか１項に記載の
   遺伝子を含むベクター。
8. 【請求項８】プラスミドである、請求項７に記載のベク
   ター。
9. 【請求項９】宿主細胞内で自己増殖可能な請求項６また
   は７に記載のベクター。
10. 【請求項１０】請求項７ないし９のいずれか１項に記載
    のベクターで形質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖および
    ／または軽鎖の可変領域を製造する方法であって、請求
    項７ないし９のいずれか１項に記載のベクターで形質転
    換された宿主細胞を、抗菊酸モノクローナル抗体の重鎖
    および／または軽鎖の可変領域の発現を促進する条件下
    で培養し、そして、当該培養物から抗菊酸モノクローナ
    ル抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域を回収する
    ことを含む方法。