JP2001033452A

JP2001033452A - 免疫的検出方法および免疫的検出装置

Info

Publication number: JP2001033452A
Application number: JP20714199A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Oka; 美和岡; Osayuki Shigefuji; 修行重藤; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2001-02-09

Abstract

(57)【要約】【課題】検出時間が短く、検出感度が高く、かつ検出
感度のダイナミックレンジが広い免疫的検出方法および
免疫的検出装置を提供する。【解決手段】試料導入部３０１と、標識部３０３と、
判定部３０２と、検出対象である抗原に結合可能な固定
相抗体および標識抗体とを備える。固定相抗体は判定部
３０２に固定化され、標識抗体は、可視化処理が施され
移動できる状態にある。試料３０４が標識部３０３を経
由せずに判定部３０２に到る試料用流路３０５と、標識
抗体が試料導入部３０１を経由せずに判定部３０２に到
る標識抗体用流路３０６とを設け、試料３０４と判定部
３０２が優先的に反応するように構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原・抗体の特異
的結合反応に基づいて試料から極微量の抗原を検出する
免疫的検出方法および免疫的検出装置に関する。特に、
大規模な自動分析設備を有さない小規模医院および飲食
店において、簡便かつ迅速に測定することができる免疫
的検出方法および免疫的検出装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫クロマトグラフィーは、典型的な免
疫的検出装置の一つであり、簡便な体外診断検査器（例
えば、妊娠検査器など）に広く用いられている。検査器
に試料を添加すると、通常約３分程度で陽性・陰性の判
定が素人でも簡単にすることができる。このような免疫
的クロマトグラフィー装置の代表的な構造は、例えば米
国特許第５６０２０４０号に記載されている。

【０００３】従来の典型的な免疫クロマトグラフィー装
置およびそれを用いた免疫的検出方法を、図４を用いて
説明する。

【０００４】試料導入部１０２は試料が導入される部分
であり、導入された試料を迅速に吸収し、かつ速やかに
標識部１０３へと通過させる性質の多孔質担体（例え
ば、ガラス繊維濾紙など）で構成されている。中空ケー
スに収納された免疫クロマトグラフィー装置の場合は、
試料導入部１０２を比較的長い構成とし、その一部をケ
ースから露出することによって、試料導入部１０２に試
料を直接導入することができる。免疫クロマトグラフィ
ー装置全体がケース内に収納されている場合は、試料導
入部１０２と接するケース位置に穴を空けることによ
り、その穴から試料導入部１０２に試料を添加すること
ができる。

【０００５】標識部１０３は、標識抗体を担持した多孔
質担体から構成される。例えば、金コロイドまたは着色
ラテックスに吸着した標識抗体を含む水溶液を多孔質担
体（例えば、ガラス繊維濾紙など）に含浸させた後、凍
結乾燥させることにより、これらの標識抗体を均一に担
持させることができる。

【０００６】判定部１０４は、抗体を固定化しやすい多
孔質担体（例えば、ニトロセルロースなど）が用いられ
る。判定部１０４は固定化部１０５を含み、コントロー
ル部１０６を含むこともある。固定化部１０５には、検
出対象である抗原と特異的に結合する固定相抗体が固定
化されている。固定相抗体は、判定部１０４上の任意の
領域に水溶液として滴下した後、乾燥および洗浄するこ
とにより固定化される。コントロール部１０６には、検
出対象である抗原とは結合しないが標識抗体と結合する
コントロール抗体が固定化される。コントロール抗体
は、固定相抗体と同様の方法で固定化される。コントロ
ール抗体と標識抗体との反応が確認されれば、検査が正
常に終了したことがわかる。

【０００７】吸水部１０７は、過剰の試料を迅速に吸収
するために、優れた吸水力および吸水容量を有する多孔
質担体（例えば、ガラス濾紙など）から構成される。

【０００８】試料導入部１０２、標識部１０３、判定部
１０４、および吸水部１０７を図４に示す配置で組み合
わせて、試料泳動のための試料泳動体１０９が構成され
る。試料泳動体１０９は、各部が全て同じ多孔質担体か
ら構成される場合もあるが、通常、少なくとも一部が他
の部分とは異なる材料から構成される。例えば、抗体を
固定化したニトロセルロース片から構成される判定部１
０４と、ガラス繊維濾紙から構成される標識部１０３、
試料導入部１０２および吸水部１０７とを試料が通過し
得るように接続させて、試料泳動体１０９を構成する。
試料泳動体１０９は、両面テープ１０８に貼り付けら
れ、両面テープ１０８の裏面に貼り付けられた支持体１
０１によって一体として保持される。試料泳動体１０
９、両面テープ１０８、および支持体１０１から、免疫
クロマトグラフィー装置１１０が構成される。

【０００９】このような免疫クロマトグラフィー装置１
１０を、以下のように用いて、検出対象である抗原の検
出が行われる。まず、所定量の試料（通常約０．１〜２
ｍｌ）を、免疫クロマトグラフィー装置１１０の試料導
入部１０２に添加する。試料は、試料導入部１０２か
ら、標識部１０３および判定部１０４を通過して、吸水
部１０７に向かって移動する。標識部１０３を試料が通
過する際には、標識部１０３に担持されていた標識抗体
が試料の水分により溶出し、試料とともに判定部１０４
へと移動する。試料中に検出対象である抗原が存在する
場合、標識抗体は抗原と結合する。標識抗体が結合した
抗原は、さらに移動して固定化部１０５に到達した際
に、抗原・抗体の特異的結合反応に基づき、固定相抗体
と結合する。通常、添加される試料の容量は、担持され
ている標識抗体の量に比べて大過剰であるので、抗原と
結合しなかった標識抗体は過剰の試料により洗い流され
て、固定化部１０５から除かれる。

【００１０】以上の結果、検出対象である抗原を含む試
料を導入した場合のみにおいて、固定化部１０５で標識
抗体による着色が確認され、陽性と判断される。一方、
検出対象である抗原を含まない試料では、標識抗体は固
定化部１０５に結合されず、判定部１０４を通過して吸
水部１０７に吸収される。そのため、固定化部１０５に
着色はみられず、陰性と判定される。判定部１０４がコ
ントロール部１０６を含む場合、標識抗体がコントロー
ル部１０６に達すると結合するので、コントロール部１
０６に標識抗体による着色が認められる。コントロール
部１０６の着色により、試料の泳動終了すなわち検査終
了を確認することができる。このようにして、試料中に
検出対象である抗原が存在するか否かを判定することが
できる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかし上記のような従
来の免疫クロマトグラフィー装置１１０およびそれを用
いた免疫的検出方法は、試料導入部１０２から判定部１
０４までが全て多孔質抗体で構成されているので、抗原
の移動に対する抵抗が大きく途中で抗原の移動が阻害さ
れ、判定部１０４に到達する抗原の量が減少するという
理由と、試料中の水分により溶出した標識抗体が抗原よ
りも速く判定部１０４に到達して、固定化部１０５を通
過してしまうという２つの理由により、検出感度が低
く、希薄な試料からの検出対象である抗原の検出が極め
て困難であるという問題を有している。これは、ホルモ
ンに比べてサイズの大きい、微生物菌体等が検出対象で
ある場合に特に顕著であり、陽性であっても陰性の誤作
動を生じるおそれがある。

【００１２】検出感度を向上させる手段として、抗原が
有する多くの結合部位と結合できるポリクローナル抗体
を標識抗体として用いることにより、抗原と標識抗体と
の結合能力を向上させる手段が考えられる。しかし、こ
の手段を用いた場合、試料が標識部１０３に到達した際
に、抗原の周りに標識抗体が結合して抗原の結合部位が
覆われたり、抗原と抗原が標識抗体を介して凝集したり
してしまうので、判定部１０４で抗原が結合できなくな
り検出感度が低下する。

【００１３】また他の手段として、試料の量を増加さ
せ、試料中に存在する抗原の総数を増加させる手段が考
えられる。しかし、試料の移動は多孔質担体中の泳動に
より行われるので流速が遅く、検出時間が長くなるため
に試料の量を増加させることは困難である。

【００１４】本発明は、上記の課題に鑑み、微生物菌体
が検出対象であっても、検出時間が短く、かつ検出感度
が高い免疫的検出方法および免疫的検出装置を提供する
ことを目的とする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために、固定相抗体が固定化された判定部に試料
を導入する第１の工程を行い、次いで、化学的に可視化
処理が施された標識抗体を、前記判定部に導入する第２
の工程を行う免疫的検出方法を提供する。

【００１６】また、本発明は、第１の工程において、判
定部への試料の移動を促進する方向への前記試料の加圧
または／かつ吸引を行う免疫的検出方法を提供する。

【００１７】また、本発明は、試料導入部と、判定部
と、標識部とを備え、固定相抗体が前記判定部に固定化
され、標識抗体が化学的に可視化処理が施された状態で
前記標識部に含有されており、かつ前記試料導入部に導
入された試料が前記標識部を経由せずに前記試料導入部
から前記判定部に到る試料用流路と、前記標識抗体が前
記標識部から前記判定部に到る標識抗体用流路とを備え
ている免疫的検出装置を提供する。

【００１８】また、本発明は、試料用流路において、試
料の移動方向に対して試料導入部の上流側に設けられた
試料加圧部または／かつ試料の移動方向に対して判定部
の下流側に設けられた試料吸引部を備えている免疫的検
出装置を提供する。

【００１９】また、本発明は、試料用流路において、判
定部を除く部分が中空容器からなる免疫的検出装置を提
供する。

【００２０】また、本発明は、試料導入部と判定部を分
離および連結することが可能である免疫的検出装置を提
供する。

【００２１】

【発明の実施の形態】（実施の形態１）以下、本発明の
実施の形態１について図１を用いて説明する。

【００２２】本実施の形態においては、判定部２０１と
吸水部２０２から構成された免疫的検出装置を用いる。

【００２３】ここで、判定部２０１および吸水部２０２
は多孔質担体から構成されており、判定部２０１には、
試料の移動に伴う位置の変化が実質的に起きない強度
で、検出対象である抗原に結合する固定相抗体が固定化
されている。

【００２４】このような免疫的検出装置を用いて、以下
に示す免疫的検出方法により、検出対象である抗原の検
出を行う。

【００２５】まず、図１（ａ）に示す第１の工程で、検
出対象である抗原を含む試料２０５を、ピペット２０３
等の器具を用いて判定部２０１に滴下することにより試
料２０５を判定部２０１に導入した後、泳動により判定
部２０１を通過させる。この際、試料２０５中の抗原
が、判定部２０１に固定化されている固定相抗体に結合
する。

【００２６】次に、図１（ｂ）に示す第２の工程で、検
出対象である抗原に結合し、かつ化学的に可視化処理が
施された標識抗体を含む標識抗体溶液２０６を、ピペッ
ト２０４等の器具を用いて判定部２０１に滴下すること
により標識抗体を判定部２０１に導入した後、泳動によ
り判定部２０１を通過させる。この際、判定部２０１に
抗原が結合している場合、抗原を介して標識抗体と固定
相抗体が結合し、判定部２０１において標識抗体による
着色が確認され、陽性と判定される。一方、判定部２０
１に抗原が結合していない場合は、判定部２０１におけ
る着色は認められず、陰性と判定される。このようにし
て、試料２０５中に検出対象である抗原が存在するか否
かを確認することができる。

【００２７】本実施の形態によると、まず第１の工程
で、試料２０５を直接判定部２０１に導入して、試料２
０５中の抗原を判定部２０１の固定相抗体と結合させて
いるため、多孔質担体中での移動の阻害により判定部２
０１に到達する抗原の量が減少することがなく、試料２
０５中の抗原が効率的に判定部２０１に濃縮される。ま
た、第２の工程で、標識抗体溶液２０６を判定部２０１
に導入することにより、判定部２０１の固定相抗体と結
合している抗原を介して固定相抗体と標識抗体とを結合
させるため、標識抗体が固定相抗体と結合せずに通過し
てしまうことがなくなる。よって、従来よりも抗原の検
出感度が向上し、抗原濃度の低い試料からでも抗原を検
出することができる。

【００２８】（実施の形態２）以下、本発明の実施の形
態２について図２を用いて説明する。

【００２９】本実施の形態においては、図２（ａ）に示
すように、試料導入部３０１と、判定部３０２と、標識
部３０３と、試料３０４が標識部３０３を経由せずに試
料導入部３０１から判定部３０２に到る試料用流路３０
５と、標識抗体が試料導入部３０１を経由せずに標識部
３０３から判定部３０２に到る標識抗体用流路３０６と
から構成された免疫的検出装置を用いる。

【００３０】ここで、実施の形態１と同様に、判定部３
０２は多孔質担体から構成されており、試料３０４の移
動に伴う位置の変化が実質的に起きない強度で、検出対
象である抗原に結合する固定相抗体が固定化されてい
る。判定部３０２の形状はシート状で、判定部支持体３
０７に包含されていることが好ましい。

【００３１】試料導入部３０１、標識部３０３、試料用
流路３０５および標識抗体用流路３０６は中空容器によ
り構成される。また試料導入部３０１および標識部３０
３はシリンジの形状をしており、試料加圧部であるピス
トン３０８および標識抗体加圧部であるピストン３０９
を備えている。

【００３２】このような免疫的検出装置を用いて、以下
に示す免疫的検出方法により、検出対象である抗原の検
出を行う。

【００３３】まず、図２（ｂ）に示す第１の工程で、検
出対象である抗原を含む試料３０４が保持されている試
料導入部３０１のピストン３０８を押して、試料用流路
３０５を通して試料３０４を判定部３０２に導入した
後、判定部３０２を通過させる。この際、試料３０４中
の抗原が、判定部３０２に固定化されている固定相抗体
に結合する。

【００３４】次に、図２（ｃ）に示す第２の工程で、検
出対象である抗原に結合し、かつ化学的に可視化処理が
施された標識抗体を含む標識抗体溶液３１０が保持され
ている標識部３０３のピストン３０９を押して、標識抗
体用流路３０６を通して標識抗体を判定部３０２に導入
した後、判定部３０２を通過させる。この際、判定部３
０２に抗原が結合している場合、抗原を介して標識抗体
と固定相抗体が結合し、判定部３０２において標識抗体
による着色が確認され、陽性と判定される。一方、判定
部３０２に抗原が結合していない場合は、判定部３０２
における着色は認められず、陰性と判定される。このよ
うにして、試料３０４中に検出対象である抗原が存在す
るか否かを確認することができる。

【００３５】本実施の形態によると、まず第１の工程
で、試料３０４を直接判定部３０２に導入して、試料３
０４中の抗原を判定部３０２の固定相抗体と結合させた
後、第２の工程で、標識抗体を含む標識抗体溶液３１０
を判定部３０２に導入することにより、判定部３０２の
固定相抗体と結合している抗原を介して固定相抗体と標
識抗体とを結合させるため、実施の形態１と同様に、従
来よりも抗原の検出感度を向上させることができる。

【００３６】また、試料３０４の移動方向に対して試料
導入部３０１の上流側に試料加圧部であるピストン３０
８を備えており、ピストン３０８を押して試料３０４を
加圧することにより試料３０４の流速を増加させること
ができるため、試料３０４の量が多い場合でも検出時間
の増加を抑制することができる。よって、試料３０４の
量を増加させて判定部３０２で濃縮される抗原量を増加
させることにより、さらに検出感度を向上させることが
できる。

【００３７】また、判定部３０２以外の部分が中空容器
で構成されているため、この効果がより顕著となる。

【００３８】（実施の形態３）以下、本発明の実施の形
態３について図３を用いて説明する。

【００３９】本実施の形態においては、図３（ａ）に示
すように、試料導入部４０１と、判定部４０２と、標識
部４０３と、試料４０４が標識部４０３を経由せずに試
料導入部４０１から判定部４０２に到る試料用流路４０
５と、標識抗体が試料導入部４０１を経由せずに標識部
４０３から判定部４０２に到る標識抗体用流路４０６と
から構成された免疫的検出装置を用いる。

【００４０】ここで、実施の形態１および２と同様に、
判定部４０２は多孔質担体から構成されており、試料４
０４の移動に伴う位置の変化が実質的に起きない強度
で、検出対象である抗原に結合する固定相抗体が固定化
されている。判定部４０２の形状はシート状で、判定部
支持体４０７に包含されていることが好ましい。

【００４１】試料導入部４０１および標識部４０３は中
空容器により構成される。また試料導入部４０１および
標識部４０３は二重のシリンジ形状をしており、標識抗
体加圧部であるピストン４０８を備えている。標識部４
０３は試料加圧部としても機能する。

【００４２】標識部４０３には、標識抗体用担体４０９
と標識抗体溶解用水溶液４１０とを備えている。ここ
で、標識抗体用担体４０９には、検出対象である抗原に
結合し、かつ化学的に可視化処理が施された標識抗体が
担持されている。標識抗体の担持方法としては、例え
ば、ガラス繊維濾紙に標識抗体を含む水溶液を含浸さ
せ、その後凍結乾燥する方法が挙げられる。さらに標識
抗体用担体４０９と標識抗体溶解用水溶液４１０とが接
触しないように、標識抗体用担体４０９と標識抗体溶解
用水溶液４１０との間に上隔膜４１１を設けている。ま
た標識部４０３の排出口には、試料導入部４０１から試
料４０４を排出する際に、試料４０４と標識抗体用担体
４０９が接触しないように下隔膜４１２を設けている。
使用する際には、標識抗体加圧部であるピストン４０８
を用いて標識抗体溶解用水溶液４１０を加圧することに
より、上隔膜４１１が破壊され標識抗体用担体４０９に
含浸された標識抗体を標識抗体溶解用水溶液４１０に溶
解させた後、下隔膜４１２が破壊され標識抗体溶液が排
出口を通して排出されるようにしている。

【００４３】このような免疫的検出装置を用いて、以下
に示す免疫的検出方法により、検出対象である抗原の検
出を行う。

【００４４】まず、図３（ｂ）に示す第１の工程で、試
料加圧部として機能する標識部４０３を押して、検出対
象である抗原を含む試料４０４が保持されている試料導
入部４０１から、試料用流路４０５を通して試料４０４
を判定部４０２に導入した後、判定部４０２を通過させ
る。この際、試料４０４中の抗原が、判定部４０２に固
定化されている固定相抗体に結合する。

【００４５】次に、図３（ｃ）に示す第２の工程で、標
識抗体加圧部であるピストン４０８を用いて上部から加
圧することにより、標識抗体用担体４０９に含浸された
標識抗体を標識部４０３内の標識抗体溶解用水溶液４１
０に溶解させ、続いてその標識抗体溶液を標識部４０３
の排出口および試料導入部４０１の排出口を通して排出
し、試料４０４と接触することなく判定部４０２を通過
させる。この際、判定部４０２に抗原が結合している場
合、抗原を介して標識抗体と固定相抗体が結合し、判定
部４０２において標識抗体による着色が確認され、陽性
と判定される。一方、判定部４０２に抗原が結合してい
ない場合は、判定部４０２における着色は認められず、
陰性と判定される。このようにして、試料４０４中に検
出対象である抗原が存在するか否かを確認することがで
きる。

【００４６】本実施の形態によると、まず第１の工程
で、試料４０４を直接判定部４０２に導入して、試料４
０４中の抗原を判定部４０２の固定相抗体と結合させた
後、第２の工程で、標識抗体溶液を判定部４０２に導入
することにより、判定部４０２の固定相抗体と結合して
いる抗原を介して固定相抗体と標識抗体とを結合させる
ため、実施の形態１および２と同様に、従来よりも抗原
の検出感度を向上させることができる。

【００４７】また、試料４０４の移動方向に対して試料
導入部４０１の上流側に試料加圧部として機能する標識
部４０３を備えており、標識部４０３を押して試料４０
４を加圧することにより試料４０４の流速を増加させる
ことができるため、実施の形態２と同様に、試料４０４
の量が多い場合でも検出時間の増加を抑制することがで
きる。よって、試料４０４の量を増加させて判定部４０
２で濃縮される抗原量を増加させることにより、さらに
検出感度を向上させることができる。

【００４８】また、判定部４０２以外の部分が中空容器
で構成されているため、実施の形態２と同様に、この効
果がより顕著となる。

【００４９】また、試料導入部４０１および標識部４０
３が二重のシリンジ形状であるため、実施の形態２より
も装置を小型化することができる。

【００５０】実施の形態１、２および３において、試料
は、水を溶媒として含む任意の試料を用いることができ
る。例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、乳、汗など
の体液およびそれらの分画物のような生体由来の液体、
または井戸水、地下水、水道水、果汁のような天然由来
の液体、または食料品、野菜、肉、卵などの粉砕物を水
に懸濁したものが挙げられる。

【００５１】また、検出対象となる抗原としては、絨毛
性ゴナドトロビン、Ｃ反応性タンパク質、黄体形成ホル
モン、成長ホルモン、ガン胎児性抗原、αフェトプロテ
イン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形
成ホルモン放出ホルモン、低密度リポタンパク質、高密
度リポタンパク質のような哺乳動物由来のペプチドもし
くはタンパク質、またはサルモネラ菌、大腸菌、赤痢
菌、結核菌のような微生物由来のタンパク質もしくは微
生物菌体自体、またはＨＩＶウイルス、Ａ型肝炎ウイル
ス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウ
イルスのようなウイルス由来のタンパク質もしくはウイ
ルス粒子自体が挙げられるが、本発明による免疫的検出
方法および免疫的検出装置は、抗原が微生物菌体である
場合に特に効果を発揮する。

【００５２】また、標識抗体は特に限定されないが、ポ
リクローナル抗体であることが好ましい。本発明による
免疫的検出方法および免疫的検出装置では、試料中の抗
原を判定部の固定相抗体と結合させた後、抗原を介して
固定相抗体と標識抗体とを結合させているので、抗原の
周りに標識抗体が結合して抗原の結合部位が覆われた
り、抗原と抗原が標識抗体を介して凝集したりしてしま
うことがないため、抗原との結合部位が多いポリクロー
ナル抗体を用いることにより、検出感度を向上させるこ
とができる。固定相抗体および標識抗体のクラスは特に
限定されないが、作製の容易さの点から、好ましくはＩ
ｇＧである。

【００５３】また、標識抗体の可視化処理は、金コロイ
ド、ラテックス粒子、有機色素、顔料、金属、金属酸化
物および酵素のうちのいずれか、またはこの中のいくつ
かと結合させることにより、行われていることが好まし
い。次の構造式（化１）で表されるシアニン系色素は、
好ましい有機色素の例である。

【００５４】

【化１】

【００５５】また、標識抗体溶液を作製するために用い
る液体および標識抗体溶解用水溶液としては、リン酸緩
衝食塩水（以下、ＰＢＳ溶液で表す）のように、標識抗
体が活性を失わないｐＨである任意の水溶液を用いるこ
とができる。

【００５６】実施の形態２および３において、試料導入
部、判定部支持体および標識部の材料は、検出対象であ
る抗原に対する非特異的な吸着を実質的に示すことがな
い材料であることが好ましい。例えば、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネートの
ようなプラスチック、またはガラス、シリコン樹脂等が
挙げられる。試料導入部の容量は、約１０〜１０００ｍ
ｌが好ましい。

【００５７】実施の形態１、２および３において、判定
部の材料は、検出対象である抗原に対する非特異的な吸
着を実質的に示すことがなく、かつ試料の移動を可能に
する多孔質担体であることが好ましい。例えば、セルロ
ース、ニトロセルロース、ガラス繊維濾紙、スチロール
樹脂、ビニル系樹脂等が挙げられる。さらに好ましく
は、ニトロセルロース、ガラス繊維濾紙である。

【００５８】また、判定部への固定相抗体の固定化は、
判定部がニトロセルロースである場合、固定相抗体を含
む溶液をニトロセルロース上に滴下した後、乾燥および
洗浄することにより行うことができる。他の固定化法と
して、例えば特開平８−２８３２９７号公報に記載のよ
うに、糖コンジュゲートを用いて、抗体をガラス濾紙な
どに固定してもよい。判定部の表面は、検出反応の際の
非特異的吸着によるバックグラウンドの発色を防止する
ため、固定相抗体の固定化の後、例えば、ウシ血清アル
ブミンなどで処理することができる。この操作はブロッ
キングと呼ばれ、当該分野で公知である。

【００５９】実施の形態２および３において、試料導入
部と判定部は分離できることが好ましい。この場合、試
料導入部と判定部の間に、家庭用のジューサーのように
試料の水分を抽出する機能を有するもの、または家庭用
のミキサーのように試料を粉砕し水分と混合する機能を
有するもの、またはプレフィルターのように、試料中に
存在する粒子径の大きい異物を除去する機能を有するも
の等を設置することができるためである。

【００６０】なお、実施の形態２および３では、試料導
入部および標識部としてシリンジ形状のものを用いた
が、それに限定されるものではなく、試料および標識抗
体を含む溶液を保持できるものであればよい。

【００６１】また、試料の移動を促進させる手段とし
て、試料導入部の上流側に試料加圧部であるピストンを
設けたが、試料加圧部はピストンに限定されるものでは
なく、また判定部の下流側にピストンや真空ポンプ等の
試料吸引部を設け、試料を下流側から吸引しても同様の
効果を得ることができる。

【００６２】また、標識部において、実施の形態１およ
び２では、標識抗体を含む標識抗体溶液が保持されてお
り、実施の形態３では、乾燥状態の標識抗体を担持した
標識抗体用担体と標識抗体溶解用水溶液とが保持されて
いるとしたが、実施の形態１および２において、標識抗
体用担体と標識抗体溶解用水溶液とを用い、実施の形態
３において標識抗体溶液を用いてもよい。

【００６３】

【実施例】以下、本発明の実施例を詳しく説明する。

【００６４】（本発明の免疫的検出装置の作製）判定部
４０２を構成する多孔質担体として、直径約１.５ｃｍ
の円盤状に裁断したニトロセルロースのシートを用い
た。ニトロセルロース面に対して垂直方向から、抗サル
モネラポリクローナル抗体５ｍｇ／ｍｌを含有する５μ
ｌのＰＢＳ溶液を円形状に滴下した後、４０℃で４時間
遮光状態で乾燥することにより、抗サルモネラポリクロ
ーナル抗体を固定化した。得られた抗体固定化ニトロセ
ルロースを、１％スキムミルクを含有する０.１Ｍトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下、トリスで
表す）溶液（ｐＨ８．２）に浸潤し、３０℃で３０分間
シェイカーにて震とうすることによりブロッキングし
た。ブロッキング後の抗体固定化ニトロセルロースを、
０.１Ｍトリス溶液（ｐＨ８．２）により３０℃で３０
分間洗浄する操作を３回繰り返した後、デシケータ内に
て一晩乾燥させた。乾燥後の抗体固定化ニトロセルロー
スを、試料等の導入口および排出口として機能する管を
上下に備えた、判定部支持体４０７である直径約２.０
ｃｍで厚さ約０.３ｃｍのプラスチック製円盤型容器に
納めた。

【００６５】試料導入部４０１としては、直径約５ｃｍ
で長さ約１５ｃｍのプラスチック製シリンジを用いた。
これは約２００ｍｌの試料４０４を保持することが可能
である。試料導入部４０１の排出口は、判定部支持体４
０７の導入口と連結することが可能である。また試料加
圧部として機能する標識部４０３を用いて、試料導入部
４０１内の試料４０４を加圧することにより、試料導入
部４０１の排出口を通して試料４０４を排出することが
できる。

【００６６】標識部４０３としては、直径約４ｃｍで長
さ約１４ｃｍのプラスチック製シリンジを用いた。標識
抗体であるシアニン標識ＩｇＧの作製は以下のように行
った。まず、５ｍｇ（３．３×１０^-5ｍｍｏｌ）のＩｇ
Ｇを２ｍｌのＰＢＳ溶液に溶解し、室温で撹拌しながら
６．９ｍｇ（６．７×１０^-3ｍｍｏｌ）の構造式（化
１）で表されるシアニン系色素のＰＢＳ溶液０.１ｍｌ
を滴下した。室温で10分間撹拌した後、４℃で一晩放置
した。未反応のシアニン系色素を取り除くため、反応液
を１０ＬのＰＢＳ溶液に対して一晩透析し、約３ｍｌの
シアニン標識ＩｇＧ溶液を得た。このシアニン標識Ｉｇ
Ｇ溶液０．３ｍｌを、約１.０ｃｍ×５.０ｃｍの矩形状
に裁断したガラス繊維濾紙に含浸した後、凍結乾燥する
ことにより標識抗体含浸ガラス繊維濾紙を作製した。こ
れを約１.０ｃｍ×約１.０ｃｍの矩形状に裁断し、標識
抗体用担体４０９として標識部４０３の底面部に設置し
た。標識部４０３内の標識抗体用担体４０９上には、標
識抗体溶解用水溶液としてＰＢＳ溶液４１０（１ｍｌ）
を包含した。ＰＢＳ溶液４１０と標識抗体用担体４０９
とが接触しないように、また標識抗体用担体４０９が湿
気の影響を受けないように、ＰＢＳ溶液４１０と標識抗
体用担体４０９との間に上隔膜４１１を設けた。また標
識部４０３の排出口には、試料導入部４０１から試料４
０４を排出する際に、試料４０４と標識抗体用担体４０
９が接触しないように下隔膜４１２を設けた。使用する
際は、標識抗体加圧部であるピストン４０８を用いてＰ
ＢＳ溶液４１０を加圧することにより、上隔膜４１１が
破壊され標識抗体用担体４０９に含浸された標識抗体を
ＰＢＳ溶液４１０に溶解させた後、下隔膜４１２が破壊
され標識抗体溶液が排出口を通して排出されるようにし
た。

【００６７】（本発明の免疫的検出装置による測定）試
料４０４として、サルモネラ菌を１×１０¹〜１×１０⁹
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲の各種濃度でＰＢＳ溶液に分散
した分散液を用いた。サルモネラ菌を含まないＰＢＳ溶
液をコントロール用試料として用いた。

【００６８】試料導入部４０１に試料４０４を２００ｍ
ｌ導入した後、試料加圧部である標識部４０３を用いて
上部から圧力を加えることにより、判定部４０２を約１
０分間で通過させた。それにより判定部４０２に担持さ
れた固定相抗体とサルモネラ菌を結合させ、判定部４０
２にサルモネラ菌を濃縮した。試料導入部４０１から判
定部４０２に試料が全て移動した後、標識抗体加圧部で
あるピストン４０８を用いて上部から加圧することによ
り、標識抗体用担体４０９に含浸された標識抗体を標識
部４０３内のＰＢＳ溶液４１０に溶解させ、続いてその
標識抗体溶液を標識部４０３の排出口および試料導入部
４０１の排出口を通して排出し、試料４０４と接触する
ことなく判定部４０２を通過させた。それにより、判定
部４０２において各濃度に応じた発色が確認できた。

【００６９】（比較例の免疫クロマトグラフィー装置の
作製）比較のため、従来と同じ免疫クロマトグラフィー
装置を作製し、測定を行った。

【００７０】判定部の多孔質担体としては、約０.７ｃ
ｍ×１.２ｃｍの矩形状に裁断したニトロセルロースの
シートを用いた。ニトロセルロースの短辺の端から約
０.５ｃｍの部分に、その短辺と平行に端から端まで幅
約１.０ｍｍのライン上に、抗サルモネラポリクローナ
ル抗体５ｍｇ／ｍｌを含有するＰＢＳ溶液１.０μｌを
滴下した後、４０℃で４時間遮光状態で乾燥することに
より、抗サルモネラポリクローナル抗体を固定化した。
得られた抗体固定化ニトロセルロースに、１％スキムミ
ルクを含有させることによりブロッキングした。ブロッ
キングした抗体固定化ニトロセルロースを、０.１Ｍト
リス溶液（ｐＨ８．２）により３０℃で３０分間洗浄す
る操作を３回繰り返した後、デシケータ内にて一晩乾燥
させた。

【００７１】標識部としては、本発明の実施例において
記した方法により作製した凍結乾燥後のガラス繊維濾紙
を用い、本発明の実施例と同一形状かつ同一サイズのも
のを使用した。

【００７２】試料導入部および吸水部の多孔質担体とし
ては、ともに約０.７ｃｍ×約２.５ｃｍの矩形状のガラ
ス繊維濾紙を用いた。

【００７３】約０.７ｃｍ×６.２ｃｍの矩形状の白色硬
質塩化ビニル板からなる支持体の表面に、両面テープを
用いて、上記の試料導入部、標識部、判定部、および吸
水部を順番に貼り付けることにより、免疫クロマトグラ
フィー装置を作製した。

【００７４】（比較例の免疫クロマトグラフィー装置に
よる測定）試料として、サルモネラ菌を１×１０¹〜１
×１０⁹ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲の各種濃度でＰＢＳ溶
液に分散した分散液を用意した。サルモネラ菌を含まな
いＰＢＳ溶液を、コントロール試料として用いた。試料
導入部に試料を２００μｌ添加し、約１０分間放置し
た。

【００７５】（測定結果の比較）約１０分間放置後、比
較例の免疫クロマトグラフィー装置および実施例の免疫
的検出装置での判定部における発色強度の違いを評価し
た。発色強度の測定は、反射吸光度測定によるもので、
構造式（化１）で表されるシアニン色素の吸収波長であ
る、波長５５０ｎｍの入射光に対する反射光の強度を測
定した。比較例の免疫クロマトグラフィー装置および実
施例の免疫的検出装置についての測定結果を図５に示
す。

【００７６】比較例の免疫クロマトグラフィー装置で
は、判定部での発色を目視により確認することが可能
な、吸光度０．０５以上が得られたサルモネラ菌濃度範
囲は２×１０⁶〜１×１０⁹ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。
一方、本発明による免疫的検出装置では、吸光度０．０
５以上が得られたサルモネラ菌濃度範囲は２×１０²〜
１×１０⁹ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。

【００７７】この結果から、比較例の免疫クロマトグラ
フィー装置と比較して、実施例による免疫的検出装置を
用いることにより、試料の導入量が比較例の１０００倍
の場合、約１００００倍の検出下限濃度の低減が可能で
あることが示された。試料の導入量が多い場合でも、試
料導入部の加圧部を用いて試料の流速を速くすることが
できるため、さらに試料の導入量を増加させることによ
り、検出時間を増加させることなく、さらに検出感度を
向上させ、検出下限濃度の低減すなわち検出感度のダイ
ナミックレンジ拡大が可能である。

【００７８】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、試料中
の抗原を効率的に判定部に濃縮することが可能となり、
検出時間を増加させることなく、検出感度の向上および
検出感度のダイナミックレンジ拡大を達成することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態１における免疫的検出方法
の各工程を説明する斜視図

【図２】本発明の実施の形態２における免疫的検出装置
の各工程での動作を説明する断面図

【図３】本発明の実施の形態３における免疫的検出装置
の各工程での動作を説明する断面図

【図４】従来の免疫クロマトグラフィー装置を示す斜視
図

【図５】実施例および比較例の免疫的検出装置により測
定した、試料中のサルモネラ濃度と判定部における発色
強度（吸光度）との関係を示すグラフ

【符号の説明】

１０１支持体１０２，３０１，４０１試料導入部１０３，３０３標識部１０４，２０１，３０２，４０２判定部１０５固定化部１０６コントロール部１０７，２０２吸水部１０８両面テープ１０９試料泳動体１１０免疫クロマトグラフィー装置２０３，２０４ピペット２０５，３０４，４０４試料２０６，３１０標識抗体溶液３０５，４０５試料用流路３０６，４０６標識抗体用流路３０７，４０７判定部支持体３０８ピストン（試料加圧部）３０９，４０８ピストン（標識抗体加圧部）４０３標識部（試料加圧部）４０９標識抗体用担体４１０標識抗体溶解用水溶液（ＰＢＳ溶液）４１１上隔膜４１２下隔膜

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原・抗体の特異的結合反応に基づいて試
料中の検出対象である抗原を検出する免疫的検出方法で
あって、固定相抗体が固定化された判定部に、前記試料
を導入する第１の工程を行い、次いで、前記判定部に標
識抗体を導入する第２の工程を行い、前記固定相抗体お
よび前記標識抗体は前記抗原と結合し、かつ前記標識抗
体は化学的に可視化処理が施されていることを特徴とす
る免疫的検出方法。
【請求項２】第１の工程において、判定部への試料の移
動を促進する方向への前記試料の加圧または／かつ吸引
を行うことを特徴とする請求項１記載の免疫的検出方
法。
【請求項３】検出対象である抗原が微生物菌体であるこ
とを特徴とする請求項１または請求項２記載の免疫的検
出方法。
【請求項４】標識抗体がポリクローナル抗体からなるこ
とを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記
載の免疫的検出方法。
【請求項５】抗原・抗体の特異的結合反応に基づいて試
料中の検出対象である抗原を検出する免疫的検出装置で
あって、試料導入部と、判定部と、標識部とを備え、前
記抗原に結合する固定相抗体が前記判定部に固定化さ
れ、前記抗原に結合する標識抗体が、化学的に可視化処
理が施された状態で前記標識部に含有されており、かつ
前記試料導入部に導入された前記試料が前記標識部を経
由せずに前記試料導入部から前記判定部に到る試料用流
路と、前記標識抗体が前記標識部から前記判定部に到る
標識抗体用流路とを備えていることを特徴とする免疫的
検出装置。
【請求項６】試料用流路において、試料の移動方向に対
して試料導入部の上流側に設けられた試料加圧部または
／かつ試料の移動方向に対して判定部の下流側に設けら
れた試料吸引部を備えていることを特徴とする請求項５
記載の免疫的検出装置。
【請求項７】試料用流路において、判定部を除く部分が
中空容器からなることを特徴とする請求項５または請求
項６記載の免疫的検出装置。
【請求項８】試料導入部と判定部を分離および連結する
ことが可能であることを特徴とする請求項５ないし請求
項７のいずれかに記載の免疫的検出装置。
【請求項９】検出対象である抗原が微生物菌体であるこ
とを特徴とする請求項５ないし請求項８のいずれかに記
載の免疫的検出装置。
【請求項１０】標識抗体がポリクローナル抗体からなる
ことを特徴とする請求項５ないし請求項９のいずれかに
記載の免疫的検出装置。