JP2001000188A - プロモーター、それを含有する組み換え体及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な高活性プロモーターを提供することに
ある。 【解決手段】 β−アクチンプロモーターの全塩基の約
２／３を欠失させ、新たなプロモーターを得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、プロモーター活性
を有する新規ＤＮＡ分子とその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、組み換えウイルスなどの組み換え
体を、生体に直接接種する生ワクチンタイプの使用が検
討されている（特開平６−０７８７６４号公報など）。
こうした組み換えウイルスをワクチンとして用いる場
合、一つのウイルス（以下、親ウイルスということがあ
る）に複数の病原ウイルス由来の抗原遺伝子を挿入して
多価組み換え体を得、これを多価ワクチンに用いること
が可能である（特開平９−００９７９号公報など）。し
かし、実際にはこうした多価組み換え体のワクチンは実
用化されていない。これは、組織培養、１４巻、４号、
１０７〜１１１頁、１９８８年発行や特開平１０−３２
７８７１号公報などで指摘されているように、一つのウ
イルスゲノム内に複数の抗原遺伝子を挿入されて肥大化
したゲノムを持った多価組み換え体である組み換えウイ
ルスは増殖性が低下したり、挿入した遺伝子が脱落す
る、といった問題をもつことに起因している。通常、親
ウイルスゲノムに対して挿入できる遺伝子は数％である
とされている。そこでゲノムの肥大化を抑えるため、親
ウイルスゲノムの非必須な領域を削除し、そこに抗原遺
伝子などを挿入する方法が広く用いられているが、この
ほか挿入する遺伝子を短くする方法も考えられている。

【０００３】組み換え体には、抗原遺伝子の他にプロモ
ーターなどの機能遺伝子を挿入するのが一般的である。
プロモーターは通常、一つの抗原遺伝子に一つ必要であ
るため、挿入される抗原遺伝子の数が増えれば、挿入さ
れるプロモーターの数も増える。従って親ウイルスゲノ
ムの肥大化を防止するためにも、挿入するプロモーター
を短くする必要が生じている。

【０００４】ところで、プロモーターの下流領域には、
イントロンと呼ばれる領域を持つものがある。一般に、
イントロン領域があることでプロモーターの活性が高ま
ると言われている（Ｇｒｏｓｓ、Ｍ．Ｋ．、Ｋａｉｎ
ｚ、Ｍ．Ｓ． ａｎｄ ＭｅｒＲＩｌｌ、Ｇ．Ｆ．
（１９８７） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７，４
５７６−，Ｂｕｃｈｍａｎ、Ａ．Ｒ． ａｎｄ Ｂｅｒ
ｇ，Ｐ． （１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８、４３９５−，Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ． ａｎｄＳｃａ
ｒｐｕｌｌａ、Ｒ．Ｃ． （１９８９） Ｇｅｎｅ ８
４，１３５−，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｔ．Ｆ． ａｎｄ Ｇ
ｏｒｍａｎ、Ｃ．Ｍ． （１９９０）Ｎｕｃｌ． Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １８、９３７−，）。

【０００５】高発現プロモーターとして知られている鶏
由来のβ−アクチンプロモーターの全長は約１．５ｋｂ
ｐと長い（Ｋｏｓｔ、Ｔ．Ａ．、Ｔｈｅｏｄｏｒａｋｉ
ｓ、Ｎ． ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｈ． （１９８
３） Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉ
ｃ ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ． Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１： ８２８７
−３０１）。この鶏由来のβ−アクチンプロモーターの
発現量をさらに高める目的で、このプロモーターにスプ
ライシングアクセプター配列やエンハンサー配列などを
プロモーターに付加することが提案されている（特開平
２−１５６８９１号公報、特開平３−１６８０８１号公
報、特開平７−２９８８７７号公報など）。しかしなが
ら、こうした高発現プロモーター研究の流れは、上述し
た挿入遺伝子をより短くするという多価組み換え体構築
の要請に合致しない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】かかる従来技術のも
と、全長が短い高発現プロモーターを得るべく鋭意研究
した結果、本発明者らは、これまで高発現化に有効とい
われてきたイントロン部分を欠いても鶏由来のβ−アク
チンプロモーターが高発現を実現できることを見いだし
本発明を完成するに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ分子、ま
たはこれと相同性を有し、配列番号２記載のＤＮＡとは
相同性を有しないプロモーター活性を有するＤＮＡ分子
（以下、これらをまとめて、本発明のプロモーターとい
うことがある）が提供され、また当該ＤＮＡ分子と外来
タンパク質をコードする遺伝子とを有する組み換え体が
提供され、さらに当該組み換え体を有効成分とするワク
チンが提供される。

【０００８】

【発明の実施の態様】以下に、本発明を詳述する。 （１）ＤＮＡ分子 本発明のＤＮＡ分子は、配列番号１記載の塩基配列を有
し、またはこれと相同性を有し、配列番号２記載の塩基
配列と相同性を有さないものである。また、本発明のＤ
ＮＡ分子はプロモーター活性を有する。配列番号１記載
の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモーターの
５’側に存在する塩基配列との相同性が高く、配列番号
２記載の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモータ
ーの３’末端寄りに存在するイントロン中の配列と相同
性が高い。従って、配列番号２記載の塩基配列と相同性
を有さない本発明のＤＮＡ断片は、公知のβ−アクチン
プロモーターとは異なるプロモーターである。

【０００９】本発明のＤＮＡ分子として、配列番号１記
載の塩基配列を有するＤＮＡ分子や配列番号３記載の塩
基配列を有するＤＮＡ分子などが挙げられる。配列番号
１記載のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ合成などにより得ること
ができるほか、β−アクチンプロモーター（以下、単に
アクチンプロモーターということがある）の３’末端側
から６５０ｂｐ以上を削除して得ることもできる。アク
チンプロモーターの具体例として、鶏由来の配列番号４
記載の塩基配列からなるＤＮＡ分子が挙げられる。

【００１０】配列番号３記載のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ合
成などにより得ることができるほか、配列番号１記載の
ＤＮＡ分子の５’側に、サイトメガロウイルス（以下Ｃ
ＭＶと言うことがある）のＩＥプロモーター（以下、単
にＣＭＶプロモーターということがある。Ｂｏｓｈａｒ
ｔ，Ｍ．ら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１，５２１−）の
一部を付加することによって得ることもできる。

【００１１】また、本発明のＤＮＡ分子は、少なくとも
配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ分子と相同性
を有し、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さず、
配列番号１記載のＤＮＡ分子と同等またはそれ以上のプ
ロモーター活性を有する限り、常法によって塩基が置
換、欠損、または付加されたものであってもよい（その
例が配列番号３記載のＤＮＡ分子である）。プロモータ
ーとしての機能を十分に発揮させる点からＤＮＡ分子の
全長は、１２０〜８５０ｂｐ、好ましくは１５０〜６０
０ｂｐ、特に好ましくは１５０〜３５０ｂｐである。

【００１２】また、ＴＡＴＡＡＡで表される塩基配列は
転写開始のシグナル領域であり、本発明のプロモーター
に必須であるので、たとえば配列番号１記載のＤＮＡ分
子を修飾する場合でもこの領域を変更することはできな
い。この部分塩基配列の最も５’側の塩基Ｔ（チミジ
ン）より３’末端側の塩基の数の上限が、２００ｂｐ、
好ましくは１８０ｂｐ、より好ましくは１５０ｂｐ、特
に好ましくは１２０ｂｐであり、下限は３０ｂｐ、好ま
しくは５０ｂｐである場合、特に優れたプロモーター活
性を示す。

【００１３】本発明において「相同性を有する」とは、
Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２２７、１４３５−（１９８５）のアルゴニズムを
利用した配列データベースソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（販
売元：宝酒造社、製造元：Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）によって算出され
たスコアが２００以上あることをいう。本発明において
「相同性を有しない」とは同ソフトで算出されたスコア
が１００以下であることをいう。

【００１４】本発明において「プロモーター活性」と
は、当該ＤＮＡ分子の下流にある遺伝子の発現を促す活
性であり、その測定方法はプロモーターと思われるＤＮ
Ａ領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺
伝子を挿入した組み換え体を作成し、マーカー遺伝子産
物の発現量を測定する一般的な方法でよい。

【００１５】より具体的には、以下の手順が例示され
る。プロモーター活性を測定したいＤＮＡ配列の下流に
マーカー遺伝子を挿入したプラスミドベクターを作製す
る。このマーカー遺伝子としてはサンプルの調製および
測定の容易さからルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。こ
のプラスミドは他の領域に同じマーカー遺伝子を含まな
いものであれば特に限定されるものではなく、後述する
組み換え体の説明で例示されるものと同じものが使用で
きる。

【００１６】この組み換えプラスミドを用いて組み換え
ベクターは常法に従って作製される。作製されたベクタ
ーは細胞内に導入される。ここで用いられる細胞は、プ
ロモーターが転写され、マーカー酵素の測定に影響を与
える物質、ルシフェラーゼを例に取れば発光基質、発光
酵素などを含まない細胞であればよい。

【００１７】このように遺伝子導入した細胞を一定時間
培養した後、マーカー遺伝子によって発現されたタンパ
ク質を抽出、回収する。培養時間は、マーカー遺伝子に
よって任意に設定できる。ルシフェラーゼの場合は１０
時間後から５日以内であり、好ましくは１８時間後から
３日以内で、より好ましくは約２４時間後である。培養
時間はあまり短いとプロモーターの活性が完全に現れる
前であり、長すぎると発現したタンパク質が分解され、
プロモーターの活性が正しく測定できない。

【００１８】回収されたマーカ遺伝子産物の活性を測定
し、培養量あたりのマーカー遺伝子産物量を算出し、一
定細胞あたりのプロモーターの量を換算する。マーカー
遺伝子としてルシフェラーゼを使用する場合、発現量の
測定にはルミノメーターを用いるのがよい。既知濃度の
ルシフェラーゼをまず測定し、ルシフェラーゼ量とルミ
ノメーターより読みとれる数値の換算の標準直線を求め
る。この標準線より、ルシフェラーゼの量を換算する。
この方法によれば、マーカー遺伝子産物量を換算するこ
とによって、プロモーター強度を測定することができ
る。

【００１９】（２）組み換え体 本発明の組み換え体は、上述した本発明のプロモーター
とその下流に外来性のタンパク質をコードする遺伝子
（以下、外来遺伝子という）とを有するものである。本
発明において組み換え体は、組み換えウイルスや組み換
えプラスミドなどの組み換えベクターである。組み換え
ウイルスは特に限定されるものではないが、真核生物の
核内でＤＮＡ複製がおこるものが望ましい。具体例とし
ては、組み換えウイルスとしては、組み換えアデノウイ
ルスや組み換えヘルペスウイルスが好ましく、特に組み
換え七面鳥ヘルペスウイルスや組み換えマレック病ウイ
ルスなどの組み換えヘルペスウイルスが好ましい。

【００２０】組み換えウイルスは、例えば、以下のよう
に調製される。ベクターにクローニングされたウイルス
ゲノムの非必須領域に、当該ウイルス内で機能するプロ
モーターとともに他の病原体の抗原遺伝子を組み込む。
ウイルス感染細胞に該ベクターを導入することにより、
相同組み換えを起こさせ、その結果生じた組み換えウイ
ルスを選択、純化する。ここで非必須領域は、外来遺伝
子が挿入されても生体内での増殖低下が起こらないか、
低下が少ないゲノム領域を選択するのが望ましい。

【００２１】組み換えウイルスをワクチンとして用いる
場合、組み込む外来遺伝子として抗原遺伝子を用いる。
具体的な作製方法は以下の通りである。すなわち、あら
かじめウイルスを感染させた細胞に、例えば、リン酸カ
ルシウム共沈法、電気穿孔法、遺伝子銃による挿入、リ
ポフェクチン法等により組み換えベクターが導入するこ
とで、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡと
の間で相同組み換えが起こさせ、組み換えウイルスが構
築される。または、感染性のあるウイルスゲノムＤＮＡ
とともに組み換えベクターを上記方法で細胞に導入する
ことによっても組み換えウイルスを構築することができ
る。

【００２２】得られた組み換えウイルスを、イーグルＭ
ＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、組み
込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーシ
ョン法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子
の発現等の方法により、生育してくるプラークの中から
候補株を純化する。候補株が目的の組み換えウイルスで
あることは、組み込んだ抗原遺伝子のコードするポリペ
プチドに対する抗体を使用したイムノアッセイ等の方法
により確認できる。例えば、マーカー遺伝子としてｌａ
ｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えウイルスの場
合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、その基
質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
社製）存在下で青いプラークを形成するので、その性質
を利用して選択、純化することができる。宿主細胞とし
ては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可能な
ものであれば特に限定されず、例えば、組み換え七面鳥
ヘルペスウイルスを用いた場合は、ＣＥＦ細胞や、発育
鶏卵しょう尿膜細胞等が挙げられる。

【００２３】（ウイルス）組み換えウイルスを作製する
ために用いるウイルス（親ウイルス）は、真核生物の核
内で増殖するいかなるウイルスでもよいが、鶏、七面
鳥、アヒルなどの家禽類の細胞中で増殖可能な、例えば
トリアデノウイルスや、七面鳥ヘルペスウイルス（以
下、ＨＶＴということがある）、マレック病ウイルス
（以下、ＭＤＶということがある）、伝染性咽頭気管炎
ウイルス（以下、ＩＬＴＶということがある）などのヘ
ルペスウイルスが例示される。

【００２４】ヘルペスウイルスの具体例としては、ＨＶ
ＴではＦＣ１２６（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ
−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲ
Ｓ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適
に使用することができる。また、ＭＤＶとしては、具体
的にはＣＶＩ９８８やＳＢ１などが挙げられる。ここに
例示されたウイルスは、寄託機関、市販ワクチンとして
あるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡＴＣＣ）などの機関から入手できる。

【００２５】（非必須領域を含有するベクター）組み換
え用ベクターの構築に用いられるウイルスの非必須領域
をクローニングするためのベクターは、特に限定されな
い。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファージ、Ｍ
１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミド
などのベクターを適当な制限酵素で処理して、ウイルス
の非必須領域を組み込めばよい。

【００２６】（非必須領域）ウイルスの非必須領域は、
親ウイルスゲノムと相同組み換えを起こしうる領域であ
って、親ウイルスの増殖に非必須な領域であれば特に制
限されない。こうした非必須領域は、公知のものを用い
ることができ、例えばＷＯ９９／１８２１５号公報に記
載された遺伝子間領域などを利用することもできる。よ
り具体的に好ましい非必須領域としては、七面鳥ヘルペ
スウイルスのＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子間が挙げ
られる。

【００２７】（抗原遺伝子）抗原遺伝子は、組み換えウ
イルスが感染細胞中で、転写、翻訳し抗原タンパク質と
して発現しうるものであればよく、例えば、ニューカッ
スル病ウイルス（以下、ＮＤＶということがある）のＨ
Ｎタンパク質をコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７
（１９８６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（Ｍ
ｃＧｉｎｎｅｓら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，５、３４３
−３５６（１９８６））、ＭＤＶの糖タンパク質ｇＢを
コードする遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、７０、１７８９−１８０４（１９８８））、伝染
性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶという
ことがある）の構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子
（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７
１、１３０３−１３１２（１９９０））、マイコプラズ
マ（以下、ＭＧということがある）のアドヘシンタンパ
ク質、ＨＭＷ関連タンパク質、４０Ｋタンパク質（ＷＯ
９３／２４６４６号公報）、６６Ｋタンパク質、６７Ｋ
タンパク質など（ＷＯ９７／０３１８７号公報）、伝染
性喉頭気管炎ウイルスのｇＢタンパク質（Ｐｏｕｌｓｅ
ｎら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、５、３３５−３４７
（１９９１）、ＵＳＰ５，４４３，８３１）、ＵＬ３２
タンパク質（ＷＯ９８／０７８６６号公報）等の感染防
御に関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。

【００２８】また、これら抗原遺伝子のうち、特にＩＢ
ＤＶのＶＰ２タンパク質などは株間によって変異が激し
いことが知られているが、挿入される遺伝子は株によっ
て特定されるものではなく、日本の超強毒株である、岡
山株、愛媛株、徳島株、ヨーロッパの超強毒株であるＵ
Ｋ６６１、アメリカの強毒株であるＳＴＣ株やＶｉｒｕ
ｌｅｎｔＥ株など由来のＶＰ２遺伝子（Ｙａｍａｇｕｃ
ｈｉ Ｔ．ら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．、１４２、１４
４１−１４５８（１９９７））を例示することができ
る。

【００２９】（組み換え用ベクター）本発明で用いる組
み換え用ベクターは、非必須領域に抗原遺伝子とそれを
支配するプロモーターが挿入されたものである。前述の
非必須領域中に前述の抗原遺伝子及びそれを支配する本
発明のプロモーターを挿入すればよい。さらに、組み換
えウイルスの純化などの効率化のために大腸菌由来のｌ
ａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子をプロモーターとと
もに組み込んでもよい。

【００３０】（プロモーター）本発明で用いるプロモー
ターは、上述した本発明のプロモーターである。このプ
ロモーターは上述した外来遺伝子の発現を支配するよう
にウイルスゲノム中で、プロモーターの下流に抗原遺伝
子が位置するように挿入される。マーカーを挿入する場
合、マーカーの発現を支配するプロモーターを用いる。
ここで用いるプロモーターは特に制限されず、組み換え
ウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するもの
であればよい。

【００３１】（エンハンサー）さらに、本発明の組み換
え体には、請求項１記載のプロモーターにエンハンサー
配列を入れると発現量を高めることができる場合があ
る。本発明のプロモーターは全長が短いので、エンハン
サーを含ませても遺伝子の脱落が生じにくい。エンハン
サーは公知のものを用いることができるが、具体例とし
ては、サイトメガロウイルス由来のＩＥプロモーターの
一部などが例示される。

【００３２】（３）ワクチン 本発明を利用する生ワクチンは、上述した本発明の組み
換え体を１種類以上含有し、これが有効成分となってい
るワクチンである。即ち、本発明の組み換え体、好まし
くは組み換えウイルスを単独、または２種類以上混合ま
たは併用して用いることができる。さらにこのほか、本
発明のワクチンと他のワクチンとを組み合わせてもよ
い。ここで、組み合わせ可能な他のワクチンとしては、
たとえば特開平２−１５７３８１号公報や特開平３−２
７２８４号公報記載の抗ＮＤＶワクチンとなる組み換え
アビポックスウイルスや特開平６−７８７６４号公報や
米国特許出願第０８／４９９，４７４号明細書に記載さ
れている抗ＭＤＶワクチンとなる組み換えアビポックス
ウイルスなどの組み換えワクチン、抗ＭＤＶワクチンと
して用いられる七面鳥ヘルペスウイルスワクチンなどが
例示される。また、組み換え体以外にも薬理学的に問題
のないキャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含
んでいてもよい。

【００３３】本ワクチンの調製法は、組み換えウイルス
を用いる場合、その感染細胞を当該ウイルスが生育でき
る細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、ウイルス
を増殖させた後、感染細胞を回収し、ウイルスをワクチ
ンとして調製する。ＨＶＴの生ワクチンの場合を例にと
って説明する。宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好
ましく、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ腎
細胞などを好適に使用することができる。このような宿
主細胞に感染させ、ウイルスを増殖させた後、細胞をス
クレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によっ
て感染細胞と上清とに分離する。得られた感染細胞は、
１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培
養用培地に懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワ
クチンとして使用するときは１００倍量のリン酸緩衝液
にこの凍結保存品を溶かして使用する。

【００３４】液体窒素下で上記感染細胞を保存するため
の安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定に
生存でき、かつレシピエントにとって薬理学的に問題の
ない成分であれば特に限定されない。

【００３５】本発明のワクチンの投与方法は特に限定さ
れない。ＨＶＴの生ワクチンの場合は皮下に注射により
接種する方法が一般的に用いられており、現行のＨＶＴ
ワクチンと同じである。接種量も従来ワクチンと同様で
よく、１０〜１０^５ＴＣＩＤ _５０を接種、好ましくは初
日齢に鶏の背部皮下においての１０^３ＴＣＩＤ_５０接種
である。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。

【００３７】（実施例１）高活性Ｐｅｃプロモーターの
構築と活性測定 １−１ 末端切り縮めβ−アクチンプロモーター ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載された、ｐＵＣ１８
のマルチクローニングサイトにｐｏｌｙＡ付加シグナル
とＳｆｉＩサイトを導入したプラスミドｐＧＩＭＩＣＳ
ｐｏｌｙＡＳｆｉ（全長２７７３ｂｐ）を制限酵素Ｎｈ
ｅＩで処理して得られた断片と、Ｐｉｃａｇｅｎｅ Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ２（全長５０６４ｂｐ。東洋インキ社
製）をＮｈｅＩ及びＸｂａＩで切り出して得られた１７
２１ｂｐとを連結し、プラスミドｐＬＵＣ−ｐｒｏ（全
長４４９４ｂｐ）を作製した。

【００３８】次に、ニワトリのゲノムバンクを作製し、
これをテンプレートとして、配列番号８記載のプライマ
ーＰｒＢａｃ１（５’−ＣＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧ
ＣＴＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣ
−３’）及び配列番号９記載のプライマーＰｒＢａｃ２
（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣ
ＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡ
ＡＧＧＧ−３’）を用いてＰＣＲによりβ−アクチンプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得
た。

【００３９】この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで処理して
得られた約１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ−ｐ
ｒｏをＰｓｔＩおよびＸｂａＩで処理して得られた４４
８２ｂｐのＤＮＡ断片とを連結して、β−アクチンプロ
モータ領域を含むｐＬＵＣ−ｂａｃ（５９８６ｂｐ）を
作製した。

【００４０】得られたｐＬＵＣ−ｂａｃをＢａｍＨＩと
ＢｇｌＩＩで処理した後、５９５８ｂｐの断片を回収、
ライゲーションしてｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを作製し
た。このｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを、５’側の切り縮
めにはＰｓｔＩとＳｍａＩ、３’末端側にはＳａｃＩと
ＸｂａＩを用いて処理した。引き続き、得られたＤＮＡ
断片をＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、ＥｘｏＩＩＩ
と３分間反応させ、１分おきにサンプルを分取し、約２
００ｂｐ〜約１５００ｂｐのプロモーター断片を含むプ
ラスミドを多数取得した。

【００４１】ルシフェラーゼ活性測定は、東洋インキ製
造株式会社（販売元：和光純薬）の「ピッカジーン」を
用いた。まず、これらのプラスミド２９個について各１
μｇを、２×１０^６個の細胞に、０．４ｃｍギャップの
キュベットを用いて、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ社）を用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件
にて遺伝子を導入した。約２４時間培養した後、培養液
を捨て、細胞融解液を加えた後、−８０℃で１時間凍結
し、細胞を完全に融解した。得られた液体を遠心分離し
て得られた上澄み活性測定用のサンプルとした。１００
μｌずつ分注した前述記載のＫｉｔ添付の基質液に、１
０μｌのサンプルを加え、１分後にルミノメータ（型番
「ｍｏｄｅｌ１１２５３」、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用
いて、発光の強さ（単位：ＲＬＵ）からルシフェラーゼ
生産量を算出し、プロモータ活性を調べた（図１参
照）。

【００４２】全長β−アクチンプロモーターのルシフェ
ラーゼ生産量を１とすると、５’側の切り縮めサンプル
は図１のように、ＴＡＴＡＡＡの配列より５’側が１２
０ｂｐ以上欠損しているものの活性が急激に低下した。
一方、切り縮めた長さと活性には相関がなく、約８５０
ｂｐ切り縮めたときの活性が最も高く、逆に１００ｂｐ
足らずの切り縮めサンプルでは活性が全長の０．２倍に
とどまった。

【００４３】１−２ コアシークエンスプロモーター ｐＬＵＣ−ｂａｃのβ−アクチンプロモーターを鋳型と
して、配列番号１０記載の５’−ＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣ
ＡＧＣＧＡＴ−３’、配列番号１１記載の５’−ＡＣＧ
ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴ−３’
及び配列番号１３記載の５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＡ
ＡＣＧＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡ−３’をプライマーと
したＰＣＲを行ったところ、２７３ｂｐ、２１１ｂｐの
他、１７５ｂｐ、１６３ｂｐの長さの断片も得られた。
得られたＤＮＡ断片をコアシークエンスプロモーター
（ＣＯＡ）と名付けた。これらのＣＯＡを、ＰｓｔＩ及
びＸｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ
−ｐｒｏをＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理して得られた約
４４８２ｂｐの断片とをライゲーションしてプラスミド
を得た。得られたプラスミドをそれぞれｐＵＬＣ−ＣＯ
Ａ２７３、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ２１１、ｐＵＬＣ−ＣＯＡ
１７５、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ１６３と銘々した。得られた
プラスミドを用いてプロモーターの活性を、前記１−１
の方法と同様にして測定したところ、全長β−アクチン
プロモーターのルシフェラーゼ生産量を１とすると２７
３ｂｐで０．９７、２１１ｂｐで０．７６、１７５ｂｐ
で０．９６、１６３ｂｐで０．３４となった。

【００４４】１−３ エンハンサー領域の付加 配列番号５記載のＣＭＶ由来（５９０ｂｐ）のエンハン
サー、配列番号６記載のＲＳＶ由来のエンハンサー（９
０ｂｐ）は、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプ
ロモーターより上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入し
た。これらは、プラスミドへの挿入のために、５’側に
はＣＴＧＣＡＧの６塩基を、３’末端側にはＧＡＡＴＴ
Ｃの６塩基が付加されている。配列番号７記載のＳＶ４
０由来のエンハンサー（２００ｂｐ）を、プラスミドｐ
ＬＵＣ−ＣＯＡ２７３のルシフェラーゼ遺伝子より下流
側に位置するＥｃｏＲＩサイトに挿入した。これらエン
ハンサー付加プラスミドについて、上述と同様の方法に
よりルシフェラーゼ生産量で求められるプロモーター活
性を測定したところ、ＲＳＶエンハンサーを有するプラ
スミドでは１．４倍、ＳＶ４０を有するプラスミドでは
３．６倍に活性が上昇することが確認された（図２参
照）。また、ＣＭＶエンハンサーについては、切り縮め
たＤＮＡ断片を用意した。具体的には、配列番号５記載
の第７番目〜第３７０番目、同配列の第７番目〜第２８
２番目、同配列の第７番目〜第１５９番目、同配列の第
７番目〜第８９番目、同配列の第９３番目〜第３７０番
目、同配列の第９３番目〜第２８２番目、第９３番目〜
第１５９番目のＤＮＡ断片を用意し、これらの断片を、
プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプロモーターよ
り上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入しプロモーター
活性への影響を確認した。その結果、挿入する領域によ
って活性促進の効果が異なっていたが、配列番号５記載
の第７〜２８２番目の２７５ｂｐを付加した場合にプロ
モーター活性が６．５倍と最も高い活性を示した。

【００４５】この最も高い活性が得られたプラスミドに
は、ＣＭＶ２７５ｂｐエンハンサーとコアシークエンス
２７３ｂｐプロモーターとからなるキメラＤＮＡ領域が
含まれている。このエンハンサーとプロモーターとから
なるキメラＤＮＡ領域（Ｐｅｃ（＋））のサイズは５５
７ｂｐである。また、このキメラＤＮＡ領域中、５’側
にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣ）から
Ｔを、３’末端側にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＡＣ
ＴＴＧＧＣ）のＡとＴの間のＣを欠失させた５５５ｂｐ
のキメラＤＮＡ領域を含むプラスミドｐＬＵＣ−Ｐｅｃ
（全長５０３７ｂｐ）も作成した。いずれのプラスミド
においても、従来組み換えＨＶＴの外来遺伝子用プロモ
ーターであるＲＳＶやＣＭＶプロモーターの数倍以上の
活性を示した（図３参照）。

【００４６】（実施例２）組み換えベクターの構築 ２−１ ＩＢＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６
Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓの構築 新規合成プロモーターＰｅｃ（＋）でＩＢＤＶのＶＰ２
を発現させる組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰＥＣ
（＋）ＶＰ２Ｓを、以下の手順で構築した。ｐＧＩＭＣ
ＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＢｇｌＩで処理して得ら
れた１２０ｂｐのマルチクローニングサイトを含むＤＮ
Ａ断片を、制限酵素ＳｆｉＩで処理したｐＮＺ４５／４
６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂｐ、ＷＯ９９／１８２１５号
公報）に挿入し、ｐＮＺ４５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡ
（全長５６０６ｂｐ）を作製した。次に、制限酵素Ｐｓ
ｔＩおよびＸｂａＩで切り出したプロモーターＰｅｃ
（＋）領域を含むＤＮＡ断片（５６１ｂｐ）とｐＮＺ４
５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで処
理したＤＮＡ断片（それぞれ３６１７ｂｐ、１９７７ｂ
ｐ）の３断片をライゲーションによってｐＮＺ４５／４
６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡ（全長６１５５ｂｐ）
を構築した。

【００４７】ＩＢＤＶ超強毒株である岡山株よりｃＤＮ
Ａを合成して、ＰＣＲにより、ｐＵＣ１９ＳｍａＩ部位
にクローニングした３つの断片（Ｖｉｒｏｌ．２２３，
２１９−２２３，１９９６）を岐阜大学より入手した。
これら３つの断片をＣｌａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩを
用いて接続して、ＳｅｇｍｅｎｔＡ全長約３．２Ｋｂｐ
を持つｐＵＣ１９ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭを作製した。この
ｐＵＣ１８ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭをテンプレートとして、
配列番号１３記載のプライマーＰｒＶＰ２−２（５’−
ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡ
ＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号１４記載のプライマー
ＰｒＶＰ２−３（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴ
ＣＣＴＴＡＧＧＧＣＣＣ−３’）を用いたＰＣＲによ
り、ＶＰ２のみを含有するＤＮＡ断片を得た。

【００４８】このＰＣＲ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＳａｌＩで切り出したＩＢＤＶのＶＰ２Ｓ遺伝子を、
ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限
酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片
（６１１３ｂｐ）にライゲーションによって挿入し、ｐ
ＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）（全
長７４９０ｂｐ）を構築した。

【００４９】２−２ ＮＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ
４５／４６ＰｅｃＦＨＮの構築 新規合成プロモーターＰｅｃでＮＤＶのＦおよびＨＮ遺
伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／
４６ＰｅｃＦＨＮを以下の手順で構築した。ｐＬＵＣ−
Ｐｅｃから制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切り出し
たＰｅｃ領域を含むＤＮＡ断片（５５９ｂｐ）と、ｐＧ
ＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＰｓｔＩおよびＸ
ｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片（２７６１ｂｐ）
と連結し、ｐＧＩＰｅｃ（全長３３２０ｂｐ）を作製し
た。

【００５０】ＸＬＩＩＩ１０Ｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、７，２４１−２５５（１９８７））をテンプ
レートとして、配列番号１５記載のプライマーＰｒＦ１
（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＧ
ＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣ−
３’）及び配列番号１６記載のプライマーＰｒＦ２
（５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡ
ＡＧＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ
を行いＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断
片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで切り出したＮＤ
ＶのＦ遺伝子を含む領域（１８８９ｂｐ）を同じ制限酵
素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿
入し、ｐＧＩＰｅｃＦ（全長５１９１ｂｐ）を作製し
た。

【００５１】同様に、ＸＬＩＩＩ１０Ｈをテンプレート
として、配列番号１７記載のプライマーＰｒＨＮ１
（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧ
ＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣ−
３’）及び配列番号１８記載のプライマーＰｒＨＮ２
（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧ
ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧ
ＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣＧ−３’）を用いて、ＰＣ
Ｒを行い、ＨＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤ
ＮＡ断片をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで処理し（１８４２ｂ
ｐ）、同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲー
ションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＨＮ（全長５１２
３ｂｐ）を作製した。

【００５２】ｐＧＩＰｅｃＦのプロモーターおよび抗原
遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２５
３８ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂ
ｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮ
Ｚ４５／４６ＰｅｃＦ（全長８０２４ｂｐ）を構築し、
次にｐＧＩＰｅｃＨＮのプロモーターおよび抗原遺伝子
領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２４７０ｂ
ｐ）、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに
挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮ
（全長１０４９４ｂｐ）を構築した。

【００５３】２−３ ＭＧ用組み換えベクターｐＮＺ４
５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ 新規合成プロモーターＰｅｃでＭＧの４０Ｋ遺伝子を発
現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅ
ｃ４０ＫＳを、以下の手順で構築した。ｐＧＴＰｓ４０
Ｋ−Ｓ（ＷＯ９７／３６９２４、全長３９６７ｂｐ）よ
り制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＭＧ
の４０Ｋを含む領域（１３４４ｂｐ）を同じ制限酵素処
理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入
し、ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳ（全長４６２２ｂｐ）を作製
した。ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳのプロモーターおよび抗原
遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（１９
６７ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４９３ｂ
ｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮ
Ｚ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ（全長１１４０５ｂｐ）を
構築した。

【００５４】２−４ ＩＬＴＶ用組み換えベクターｐＮ
Ｚ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ 新規合成プロモーターＰｅｃでＩＬＴＶのＵＬ３２およ
びｇＢ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮ
Ｚ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢを、以下の手順で
構築した。ＷＯ９８／０７８６６号公報記載のｐＧＴＰ
ｓＩＬＵＬ３２（全長４３８３ｂｐ）より制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＩＬＴＶのＵＬ３２
遺伝子を含む領域（１７６０ｂｐ）、およびＷＯ９８／
０７８６６号公報記載のｐＧＴＰｓＩＬｇＢ（ＢｇｌＩ
−）（全長５３０７ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＫｐｎＩで切り出したｇＢ遺伝子を含む領域２６４８
ｂｐをそれぞれ挿入領域を切り出した制限酵素と同じ制
限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによっ
て挿入し、ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２（全長５０３８ｂ
ｐ）、およびｐＧＩＰｅｃＩＬｇＢ（全長５９１８ｂ
ｐ）を作製した。ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２のプロモー
ターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって
切り出し（２３８５ｂｐ）、これをｐＮＺ４５／４６Ｓ
ｆｉ（全長５４９３ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入す
ることによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２
（全長７８７８ｂｐ）を構築し、次にｐＧＩＰｅｃＩＬ
ｇＢのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素Ｂ
ｇｌＩによって切り出し（３２６５ｂｐ）、これをｐＮ
Ｚ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに挿入するこ
とによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ
（全長１１１４３ｂｐ）を構築した。

【００５５】（実施例３）組み換えウイルスの構築純化 実施例２に記載のプラスミドについて、以下のブラック
プラーク法を用いた純化法によって、組み換えＨＶＴの
構築・純化を行った。まず、Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａ
ＶＩＡＮ ＤＩＳＥＡＳＥＳ、３４：３４５−３５１
（１９９０））によって、野生型ＨＶＴ（以下ｗｔＨＶ
Ｔ）のＤＮＡの調製を行った。組み換えベクターは、骨
格領域にユニークに存在する制限酵素サイトを利用して
直鎖状に加工した。

【００５６】遺伝子導入は電気穿孔法を用い、具体的に
は以下の方法で行った。組み換えベクターＤＮＡ ５μg
および2５μgのＨＶＴ-ＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉ
ｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カ
リウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５
ｍＭリン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁し
た。２×１０^６コのニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を
０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅＧに懸濁し、上記ＤＮＡ液を
加え、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を
用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子導
入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清
を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５、ＭｃＣｏ
ｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｎ（ともにＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社製）（以下、ＬＭ（＋）と言う）を加え、６ｃｍ径
の細胞培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社）で、３７
℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター中で６日、培養し
た。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣ
ＥＦと混ぜ、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏ
ｎ）に分注し、プラークがでるまで培養した。各プレー
トから２枚ずつレプリカのプレートを作製し、同様にプ
ラークがでるまで培養した。そのうちの１枚をメタノー
ルで固定し、挿入遺伝子に対するウサギ抗体を１次抗体
とした抗原抗体反応により、組み換えＨＶＴが存在して
いるかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認さ
れたｗｅｌｌに相当するレプリカより細胞を回収、希釈
し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣＥＦとまぜて９６ｗｅｌｌ
ｐｌａｔｅに分注し、培養した。この、希釈・レプリ
カの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ｗｅ
ｌｌから由来するプラークがほぼ１００％組み換えＨＶ
Ｔであることを確認できるまで行った。この組み換えＨ
ＶＴを１０^５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破
砕処理を行い、遠心上清を、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ
に新たに調製したＣＥＦに感染させた。再び、希釈・レ
プリカの作製を、組み換えＨＶＴが１００％になるまで
繰り返した。

【００５７】組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ
（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）を用いた場合、抗ＶＰ２タ
ンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によっ
て、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１６（以下、ＨＦ−Ｐｅｃ
ＶＰ２と言うことがある）を作製した。また、組み換え
ベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮを用いた場合、
抗ＮＤＶウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によっ
て、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１８（以下、ＨＦ−Ｐｅｃ
ＨＮＦと言うことがある）を作製した。同様に、組み換
えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＭＧを用いた場合、
抗ＭＧ４０Ｋタンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法に
よる純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−Ｐｅｃ４０
ＫＳを、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬ
ＵＬ３２ｇＢを用いた場合、抗ｇＢタンパク質およびＵ
Ｌ３２タンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純
化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−ＰｅｃＩＬＴを作
製した。

【００５８】純化の終了したウイルスＤＮＡをＭｏｒｇ
ａｎらの方法により回収し、制限酵素で処理し、アガロ
ース電気泳動後にナイロン膜に移した。挿入抗原遺伝子
を鋳型としたランダムプライマー法でサザンハイブリダ
イゼーションを行った。その結果、組み換えウイルス中
に挿入遺伝子が設計どおり正しく存在することが確認さ
れた。

【００５９】（実施例４）挿入遺伝子の安定性 挿入遺伝子の安定性を選択なしに５代継代を重ねた組み
換えウイルスについて調べた。ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦの組
み換え体について、継代後のウイルスを用いて、抗ＮＤ
Ｖ抗体を用いたＢＰＡ法によって純度の検定を行ったと
ころ、すべてのプラークが継代前と全く同様に陽性であ
った。また、組み換えに用いた相同領域および挿入遺伝
子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行
ったところ、正しい組み換えが起こっていると得られる
理論どおりの大きさの、継代前と同様な位置にバンドを
検出することができ、これら挿入遺伝子がウイルス中で
安定に存在することを確認した。

【００６０】（実施例５）免疫蛍光抗体法による挿入遺
伝子発現の確認 ＨＦ−Ｐｅｃ４０ＫＳおよびＨＦ−ＰｅｃＩＬＴについ
て、免疫蛍光抗体法を行った。それぞれの組み換え体を
ＣＥＦに感染させ、３７℃でプラークが出現するまで培
養後、冷アセトンで固定し、抗４０Ｋウサギ抗体または
抗ＵＬ３２、抗ｇＢウサギ抗体を一次抗体として、１０
０から１０００倍に希釈して反応させた。これらの培養
細胞をさらに蛍光物質（ＦＩＴＣ）を結合した抗ウサギ
イムノグロブリンと反応させ、非特異反応部分を洗い流
したのち蛍光励起波長光下で顕微鏡観察した。反応性は
表１に示した。

【００６１】

【表１】

【００６２】この結果から本発明によるプロモーターに
よって抗原遺伝子が非常に良く発現していることがわか
った。

【００６３】（実施例６）鶏感染防御試験 ６−１ ＮＤＶに対する効果実験 実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効
果を判定するためにワクチン効果実験を実施した。各群
１０羽以上の市販されている白色レグホン（Ｄｅｋａｌ
ｂ鶏、神奈川養鶏連合会）から生まれた初生鶏に、新規
プロモーターの組み換えＨＶＴ：ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦを
接種した。陽性対照群にはＮＤＶの市販生ワクチン（Ｎ
ＤＶ−Ｂ１ｓｔｒａｉｎ日本生物科学研究所）を接種
し、陰性対照群は非接種とした。

【００６４】初生鶏に、組み換えＨＶＴを鶏の背部皮下
に１０^３ＴＣＩＤ_５0となるように２６Ｇの注射針を使
って接種した。陽性対照群に使用した市販のＮＤＶ生ワ
クチンは、７日齢鶏に用法通り点眼接種した。接種４週
後に、各群の雛に強毒ＮＤＶ（Ｓａｔｏ株）を１０^４ｐ
ｆｕとなるように右大腿部にチャレンジした。チャレン
ジ後４日目にＮＤＶの発症の有無を観察した。また、Ｎ
ＤＶウイルスをチャレンジする前に各鶏から採血を行
い、各鶏の血清中のＮＤＶに対する赤血球凝集抑制抗体
の検出を行った。判定は市販されているＮＤＶ赤血球凝
集素（日本生物科学研究所）の使用説明書に従った。結
果を表２にまとめた。

【００６５】

【表２】

【００６６】なお、初生齢のＨＩ抗体価は２^９であっ
た。この結果から明らかなように、ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦ
を接種した群ではＮＤＶのチャレンジに対してほぼ完璧
なワクチン効果が示された。また、チャレンジ時のＨＩ
抗体価も非接種群（＜２）と比較して明らかに高い値を
示した。これらの結果から明らかなように、本発明によ
る組み換えＨＶＴによる生ワクチンは移行抗体鶏に対し
ても充分な感染防御を付与できることが示された。

【００６７】６−２ 鶏ワクチンのＩＢＤＶに対する効
果実験 実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効
果を判定するためにＩＢＤＶに対するワクチン効果実験
を実施した。なお、プロモーター配列がＣＭＶであるこ
とを除き、実施例２，３とほぼ同様な手順で作製した組
み換えＨＶＴをコントロールとして用いた。各群１０羽
以上の試験用ＳＰＦ鶏（ＬｉｎｅＭ：日本生物科学研究
所）に、ＰｅｃプロモーターまたはＣＭＶプロモーター
に制御されるＶＰ２遺伝子を発現する組み換えＨＶＴを
接種した。陽性対照群にはＩＢＤＶの市販のワクチンを
接種し、陰性対照群は非接種とした。

【００６８】試験用ＳＰＦ鶏が孵化したとき、各組み換
えＨＶＴを鶏の背部皮下に１０^４ＰＦＵとなるように２
６Ｇの注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用し
た市販のＩＢＤＶワクチン（北里研究所）は、１６日齢
の雛に用法通り点眼接種した。

【００６９】生ワクチン接種１７日後に、各群の雛に超
強毒ＩＢＤＶ（Ｏｋａｙａｍａ株）を１．５×１０^３.8
ＥＩＤ_５0となるように経口でチャレンジした。チャレ
ンジ後約３日までの鶏の生死を観察した。その後生存し
た鶏を屠殺し、ＩＢＤＶの発症の有無をファブリキウス
嚢の病変形成状態を指標として効果を判定した。ファブ
リキウス嚢の病変形成状態は、出血（Ａ）、嚢内チーズ
様浸出物形成（Ｂ）、黄色病変（Ｃ）、ゼリー様浸出物
形成（Ｄ）、水腫（Ｅ）の５点で判定した。各病変スコ
アは、病変を示した鶏羽数で表した。結果は表３に示し
た。

【００７０】

【表３】

【００７１】ファブリキウス嚢体重比について各群間で
統計的処理（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓ
ｔ）で有意差検定を実施したところ、ＣＭＶ−ＶＰ２接
種群および市販ワクチン接種群は非接種対照群と有意差
（ｐ＜０．０５）を示したが、ＨＦ−ＰｅｃＶＰ２接種
群はさらに強い有意差（ｐ＜０．０１）を示した。この
結果から明らかなように、本発明によるプロモーターを
有する組み換えＨＶＴを接種した群では従来のプロモー
ターを有する組み換えＨＶＴに比較してより効果の良い
スコアを示した。また、このスコアは市販ワクチン接種
よりもより高い感染防御効果を示していることがわかっ
た。

【００７２】

【発明の効果】本発明によれば、必要領域が短く高活性
かつ安全で安定な新規プロモーターが提供され、そのプ
ロモーターを含む組み換えベクター、および組み換えベ
クターを利用し創出される組み換えウイルス、組み換え
ウイルスを主成分とする遺伝子組み換えワクチン、ある
いは組み換えＤＮＡワクチンが提供される。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON ZEON Co. Ltd., <120> Novel Promoter, Recombinant Thereof, and the Uses Thereof <130> pec promoter ID01-18 <140> <141> <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 159 <212> DNA <213> chicken <400> 1 ggggcggggc caggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 60 cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 120 gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttc 159 <210> 2 <211> 102 <212> DNA <213> chicken <400> 2 tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 60 ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg ga 102 <210> 3 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Pec Promoter <400> 3 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 60 gttacataac ttacggtaaa tggcccgccg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180 gggtggagta tttacggtaa actgcccatt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240 tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggatgcag tattttgtgc agcgatgggg 300 gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360 gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420 ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480 tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540 ctgactgacc gcgtctagag g 561 <210> 4 <211> 1495 <212> DNA <213> chicken <400> 4 gctgcagctc agtgcatgca cgctcattgc ccatcgctat ccctgcctct cctgctggcg 60 ctccccggga ggtgacttca aggggaccgc aggaccacct cgggggtggg gggagggctg 120 cacacgcgga ccccgctccc cctccccaac aaagcactgt ggaatcaaaa aggggggagg 180 ggggatggag gggcgcgtca cacccccgcc ccacaccctc acctcgaggt gagccccacg 240 ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttttt 300 tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 360 gggcggggcc aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 420 ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 480 cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc 540 gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 600 gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt 660 ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg 720 ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc 780 ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg 840 ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg 900 cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta 960 acccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc 1020 tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg 1080 tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc 1140 ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 1200 gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg 1260 cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa 1320 tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc 1380 ggggctgccg cgggggaccg ctgccttcgg gggggcgggg cagggcgggg ttcggcttct 1440 ggcgtgtgac cggcggggtt tatatcttcc cttctctgtt cctccgcagc cagcc 1495 <210> 5 <211> 599 <212> DNA <213> cytomegalovirus <400> 5 ctgcagagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 60 ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 120 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 180 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 240 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 300 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 360 attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 420 cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 480 caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 540 cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca gatatgcat 599 <210> 6 <211> 101 <212> DNA <213> Rous sarcoma virus <400> 6 ctgcagaatt ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg 60 ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca cctccatgca t 101 <210> 7 <211> 269 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 7 caattggatc tgctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 60 gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 120 ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 180 gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 240 ccccatggtt cagatcctct agggaattc 269 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrBac1 <400> 8 cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc 39 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrBac2 <400> 9 gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg 50 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:non <400> 10 tttctgcagt attttgtgca gcgat 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:non2 <400> 11 acgtctagaa ggcaacgcag cgact 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:non3 <400> 12 ctgtctagat aacgcggtca gtcaga 26 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-2 <400> 13 gcggatcccc cgcagcgatg acgaacctgc 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-3 <400> 14 gcgtcgactc acctccttag ggccc 25 <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:prF1 <400> 15 gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc 45 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:prF2 <400> 16 gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg 34 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrHN1 <400> 17 gcggatcctc ttcagtcatg gaccgcgcag ttagccaagt tgcgc 45 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PrHN2 <400> 18 gcggtaccgc atgcgggccc gctagcgagc tcgcgccggt actcagtttg attcttggcg 60

【図面の簡単な説明】

【図１】切り縮めたプロモーターの相対活性を示した図
である。尚、図中１５００番目は切り縮める前のβ−ア
クチンプロモータの活性であり、この活性を基準（１．
０）とした。

【図２】プロモーターとエンハンサーの連結様式と相対
活性を示した図である。

【図３】本発明のプロモーターと従来のプロモーターと
の相対活性を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/215 Ａ６１Ｋ 39/215 Ｃ０７Ｋ 14/125 Ｃ０７Ｋ 14/125 14/165 14/165 14/30 14/30 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 DA02 EA04 FA02 GA14 HA01 4B065 AA90X AA95Y AA99Y AB01 BA03 CA24 CA45 4C085 AA03 BA48 BA51 BA59 BA71 CC04 CC08 DD62 EE01 EE03 GG04 4H045 AA10 AA30 BA10 CA01 CA11 DA86 EA31 FA74

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮ
   Ａ分子、またはこれと相同性を有し、配列番号２記載の
   ＤＮＡとは相同性を有しないプロモーター活性を有する
   ＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ分子と外来タンパ
   ク質をコードする遺伝子とを有する組み換え体。
3. 【請求項３】 組み換え体がウイルスである請求項２記
   載の組み換え体。
4. 【請求項４】 外来タンパク質がニューカッスル病ウイ
   ルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性喉頭
   気管炎ウイルス、及びマイコプラズマからなる群より選
   択される病原体由来のタンパク質である請求項３記載の
   組み換え体。
5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれかに記載の組み換
   え体を有効成分とするワクチン。