JP2000517183A

JP2000517183A - Ｃｄ９５調節遺伝子配列と転写因子

Info

Publication number: JP2000517183A
Application number: JP10511517A
Authority: JP
Inventors: ディーワトソン、ジェームズ; ルーダート、フリッツ
Original assignee: ジェネシスリサーチアンドデベロップメントコーポレイションリミテッド
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2000-12-26
Also published as: CA2263824A1; US5912168A; NZ334359A; WO1998008965A3; AU4036797A; AU732766B2; WO1998008965A2; EP0956358A2

Abstract

(57)【要約】アポトーシスにおける助けとなる、ＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を抑制及び増強する調節ＤＮＡ配列が開示されている。サイレンサー調節配列及びエンハンサー調節配列に結合する蛋白質性の転写因子がまた開示されており、そしてこれらはＣＤ９５又は他の蛋白質の発現を調節するのに有用である。アポトーシスの調節法は、ガン、ウイルス性およびレトロウイルス性の感染、神経の退化性疾病、免疫システムの逆機能、及び他の疾病を含む、いろいろの疾病に関して治療上および予防上の用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ９５調節遺伝子配列と転写因子発明の分野本発明は、アポトーシス又はプログラムによる細胞死において重要な役割を演じる、ＣＤ９５受容体（レセプター）をコード化する遺伝子発現調節に一般的に関する。更に具体的には、本発明はＣＤ９５遺伝子上の調節部位の同定を通してのＣＤ９５遺伝子発現調節、ＣＤ９５調節部位に結合する蛋白質性の転写因子、及びＣＤ９５遺伝子転写及び発現を調節する方法に関する。発明の背景アポトーシスは、防御、発育、ホメオスタシス及び老化の目的で生理学上の細胞死を調節するために多細胞生物によって用いられる細胞自殺機構である。アポトーシスはそれ自身の調節系統と遺伝学によって調節された活性プロセスであり、細胞とその隣接する細胞との接触の欠如、クロマチン縮合、膜水疱(ｂｌｅｂｂｉｎｇ)、細胞質縮合、ＤＮＡ分解、及び最後には隣の細胞によって貧食され膜に納められるアポトーシス体の発生を含む形態学上の変化によって一般に特徴づけられる。ＣＤ９５（Ｆａｓ又はＡＰＯ−１としても言及される）はアポトーシスにおける重要な受容体である。アポトーシスによる細胞死は、ＣＤ９５受容体とそのリガンドであるＣＤ９５Ｌとの相互作用によって誘発される。ＣＤ９５は細胞表面蛋白質の腫瘍壊痕（ネクローゼ）因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーの一員であり、そしてＣＤ９５Ｌは膜及び分泌した蛋白質のＴＮＦファミリーの一員である。ＣＤ９５は、多種多様の細胞の型に基づいて構成的に又は誘導的に発現される。ＣＤ９５は例えば活性化されたＴ及びＢ細胞上て発現し、そしてそのｍＲＮＡは胸腺、脾臓、肝臓、卵巣、肺及び心臓を含む他の組織中で検出されている。ＣＤ９５は、末梢の免疫システムにおいて非特有Ｔ−細胞・細胞毒性と活性化で誘発された細胞死（ＡＩＣＤ）との間をとりもつことにかかわりをもっている。アポトーシスが抗原受容体を通して活性化によってＴ細胞中で誘発されるときは、信号が細胞中を通過し、このことが細胞の活性化とｃ−ｍｙｃの発現へと導く。この細胞はＣＤ９５とＣＤ９５Ｌの両方をアップレギュレートし、そしてその細胞表面上にこれらを発現する。これらの分子はそれからオートクリン（自己分泌）又はパラクリン様式で互いに反応し、細胞死を誘発する信号を送る通路を開始する。ドメインに信号を送るＣＤ９５受容体の過剰発現はその結果アポトーシスと細胞死となる。アポトーシスを調節することは、アポトーシスが、アルツハイマー病やパーキンソン氏病及び多発性硬化症のような慢性的な神経退化病、免疫抑圧疾病、遺伝的及び後天的のものを含む病状を引き起こす疾患と治療上及び／又は予防上の関係を有する。同様に、アポトーシスを調節することは、アポトーシスが脳卒中や狭心症のような障害の結果として生じる状況の下では治療上の利益を有しうる。アポトーシスを妨害する試剤が、細胞内のアポトーシスの応答を妨害することによって、狭心症、脳卒中又は再灌流傷害のような虚血の状態を処置する際に有用でありうる。アポトーシスの病状の抑圧は、腫瘍疾患やウイルスの感染において重要な因子であると思われる。アポトーシスは、例えば腫瘍細胞を増殖する際に抑圧される。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ感染は、免疫システムの最も重要な防御物、即ちＣＤ−４細胞内において調節されていなくて、且つ不適切なタイミングのアポトーシスを生じさせる。更に、アポトーシスの調節は、ストレスとなる化学療法及び放射線療法の試剤のような薬剤に対する耐性を増大させうるが、アポトーシスの機構が存在しない場合には細胞を殺せないこともありうる。アポトーシスの調節は、またインビトロでの細胞の成長や維持と関係をもちうるし、またもっと強い細胞系統を作り、且つ組換え（型）蛋白質の産生を増大させるために使用されうる。アポトーシスの調節が重要な役割を演じうるような無数の用途が、ＣＤ９５受容体の発現のもっと完全な理解を発展させることの重要さを強調している。ＣＤ９５遺伝子の調節配列の同定は、そのような調節配列と結びついている転写因子と同様に、この重要な受容体の転写と発現を調節するための手段を提供し、それによってアポトーシスを調節する手段を提供するであろう。発明の開示一面において、本発明はＣＤ９５受容体及び類似の調節性能を有するその変種の転写調節に係わりをもつ新規で単離、精製されたポリヌクレオチドを提供する。ＣＤ９５プロモータからの転写を高めたり抑えたりするのに役割を演じるポリヌクレオチドが開示されている。本発明の調節ポリヌクレオチドはＣＤ９５遺伝子のコード部所から約１ｋｂ上方に向かう７０ｂｐ領域に位置している。ＣＤ９５プロモータからの転写の増強において調節要素として機能する、現在好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１及び３７に記載されている。配列番号１として同定されるポリヌクレオチドは、調節活性を高める性能を発揮するが、エンハンサーとサイレンサーの両方の調節要素を含んでいる。調節活性を高める性能を発揮するが抑制する性能を発揮しない配列番号３７として同定されるポリヌクレオチドは、活性を高める調節要素として特に好ましい。ＣＤ９５プロモータからの転写を抑制する際に調節要素として機能する、現在好ましいポリヌクレオチドは配列番号２に記載されている。他の面において、本発明はＣＤ９５プロモータからの転写を調節する転写因子を結びつける部位を提供する、新規で単離、精製されたポリヌクレオチドを開示する。配列番号１と２に記載されたポリヌクレオチド配列の全部又は一部がＣＤ９５遺伝子のコード部所の転写を調節する転写因子の結合部位を提供する。ＣＤ９５プロモーターからの転写を増強する転写因子の結合部位を提供する、現在好ましいポリヌクレオチド配列コンセンサスモチーフが配列番号３に記載されている。ＣＤ９５プロモータからの転写を増強する転写因子の結合のための部位を提供する、その他の好ましいポリヌクレオチドは配列番号４，５，６及び３７に述べられている。ＣＤ９５プロモータからの転写を抑制する転写因子を結合する部位を提供する、その他の好ましいポリヌクレオチドは配列番号７と３６に述べられている。本発明の更に他の面は、ＣＤ９５遺伝子の転写を増強し、又は阻害する、上に述べたＣＤ９５のエンハンサー又はサイレンサー領域に特異的に結合する蛋白質性の結合分子又はポリペプチド（これらは転写因子として言及される）に関する。エンハンサー転写因子がエンハンサー調節領域に結合することはＣＤ９５発現を刺激し、サイレンサー転写因子がサイレンサー調節領域に結合することはＣＤ９５発現を阻害する。ここに使用されているような「ＣＤ９５転写因子」なる用語は、ＣＤ９５の転写及び／又は発現を調節するポリヌクレオチドに結合できる一連のポリペプチドの任意のものについて言及している。他の哺乳類の種類と同様に人間から、及び部分的に又は全体的に合成されたポリペプチドより入手されるＣＤ９５転写因子は本発明の範囲内である。上に述べられた、エンハンサー調節配列（配列番号１，３〜６及び３７）に対応するポリヌクレオチド・プローブに結合する転写因子が、約５９ｋＤａ、１１３ｋＤａ及び２００〜３００ｋＤａの分子量を有する独特のＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成する。ＣＤ９５エンハンサー調節ポリヌクレオチドに結合できる転写因子は二本鎖の結合活性を発揮することが、実験による証拠によって論証されている。サイレンサー調節ポリヌクレオチド配列（配列番号２，７及び３６）の全部又は一部に対応するポリヌクレオチドプローブに結合する転写因子が、約４７ｋＤａ、７７ｋＤａ及び１００ｋＤａの分子量を有する独特のＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成する。ＣＤ９５サイレンサー調節ポリヌクレオチドに結合することのできる転写因子は一本鎖の結合活性を発揮することが、実験による証拠によって論証されている。ＣＤ９５調節ポリヌクレオチドに結合し、そしてそれによってＣＤ９５の発現を調節する、幾つかの特定の転写因子が実験によって同定されている。ＣＤ９５サイレンサー調節ポリヌクレオチド配列に結合するポリペプチド転写因子はヒトＹＢ−１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０)；ラットＹＢ− １(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ５７２９９、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２２５６８)；ラットＰｕｒα(配列番号：３８，３９，４１及び４２)；及びラットＰｕｒα状蛋白質（配列番号；４０及び４３）である。ＣＤ９５サイレンサー調節ポリヌクレオチドへのこれらのサイレンサー転写因子の結合は、ＣＤ９５の発現を阻害し、そしてそれによってアポトーシスによる細胞死を阻害する傾向にある。ＣＤ９５エンハンサー調節ポリヌクレオチド配列番号１１に結合するポリペプチド転写因子は、ヒトＹＢ−１及びヒトｈｎＲＮＰＤを含む。ＣＤ９５エンハンサー調節ポリヌクレオチドへのこのエンハンサー転写因子の結合は、ＣＤ９５の発現を刺激し、そしてそれによってアポトーシスによる細胞死を刺激する傾向にある。ＹＢ−１はＣＤ９５サイレンサーフローブ（配列番号２）をもってサウスウエスタンＵＶ−架橋分析によって観察される４７ｋＤ蛋白種である。ＹＢ−１はまた以下のものとして知られている：ヒトのｄｂｐＢ又はＣＣＡＡＴ−結合転写因子１サブユニットＡ（ＣＢＦ−Ａ）又はＥＦ１ａ又はＭＤＲＮＦ−１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０)；ウシＥＦＩＡ＃１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ９５７９３；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０);ラットのｄｂｐＢ又はＥＦ１ａ又はＣＢＦ−Ａ(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ５７２９９；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２２５６８);ネズミのＣＢＦ−Ａ又はＭＵＳＹ１又はＭＳＹ１又はＭＵＳＹＢ（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ６０４１９；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２７８１７）又はＭＹＢ−１Ａ（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ３３１９６；ＳＷＩＳＳ −ＰＲＯＴ受託番号Ｑ６０９５０）又はＭＹＢ−１Ｂ(ＥＭＢＬ受託番号Ｕ３３１９７；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ６０９５１)；ウサギＭＲＮＰｐ５０(ＥＭＢＬ受託番号Ｕ１６８２１；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ２８６１８)；鳥類のＥＦ１ａ又はＲＳＶ−ＥＦ−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｌ１３０３２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ０６０６６）又はｐＹＢα(ＥＭＢＬ受託番号Ｕ４３５１３；ＳＷＩＳＳ− ＰＲＯＴ受託番号Ｑ９０３７６)；及びカエルＦＲＧＹ１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ５９４５３；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２１５７３)、またＹＢ−１は４２ −５０ｋＤ蛋白質として記載されている。ＹＢ−１は、蛋白質のＹ−ボックス・ファミリーとして知られる低温ショック領域を含む、高度に保護された核酸に結合するポリペプチドファミリーの一員である。Ｙ−ボックス核酸に結合するポリペプチドファミリーの低温ショック領域は、６６アミノ酸領域として同定されており、またＤＮＡに結合する領域であると信じられていて、且つ高度に保護されている。これらの蛋白質は、ウォルフ（Ｗｏｌｆｆｅ）他（１９９２）、Ｙ−ボックス因子；人に対して大腸菌から保存されたポリペプチドと結合する核酸のファミリー、ＮｅｗＢｉｏｌ．４、２８０〜２９８頁に記載されている。低温ショック領域を含む、結合蛋白質のＹ−ボックスファミリーの他のメンバーには、以下のものが含まれる。ヒトのｄｂｐＡ(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０６９；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９８９)；ヒトのｄｂｐＡ状蛋白質(ＥＭＢＬ受託番号Ｘ９５３２５；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１２１)、ヒトのｄｂｐＢ状蛋白質(ＥＭＢＬ受託番号Ｌ２８８０９；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０)、ヒトのＮＳＥＰ−１ (ＥＭＢＬ受託番号Ｍ８３２３４；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４９７２) 、及び蛋白−１に結合するヒトのヌクレアーゼ感受性要素(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ８５２３４；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１５３２５)；ラットのＹＢ−２（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ２２８９３；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ６２７６４）及びラットのＲＹＢ−ａ；ネズミのｄｂｐＡ(ＥＭＢＬ受託番号Ｄ１４４８５；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ６１４７８);カエルＦＲＧＹ２又はｐ５６又はＭＲＮＰ４又はＹＢ−２（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ５９４５４；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２１５７４）及びカエルｐ５４又はＭＲＮＰ３(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ８０２５７、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ４５４４１);及びバクテリアのｃｓｐＡ及びｃｓｐＢ。低級生物由来の蛋白質のような低温ショック領域を有する、核酸結合Ｙボックス・ポリペプチド・ファミリーの他の多くのメンバーもまた相同を示し、旦つ本発明の調節ポリヌクレオチドに結合するであろう。ヒトのＹＢ−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０）の低温ショック領域に対して少なくとも９５％そして好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する低温ショック領域をもつポリペプチドが、結合するポリペプチドのＹ−ボックス・ファミリーのメンバーであると考えられ、且つ本発明の構成及び方法において用いられるのに特に好ましい。ＹＢ−１は、優先的に一本鎖のＤＮＡに結合することが示されているけれども、二本鎖と一本鎖のＤＮＡの両方に結合する。ＤＮＡ中で一本鎖構造を誘発するか、又は安定化することも示されている。ＹＢ−１は沢山の遣伝子のための転写因子として記載されており、そして、特に、表皮の成長因子（ＥＧＦ）受容体遺伝子、増殖する細胞核の抗原（ＰＣＮＡ）／サイクリン遺伝子を含む、沢山の成長関連遺伝子の賦活体として記載されている。ＹＢ−１はまたヒトの多薬品に耐えるポンプ（ｍｄｒｌ）遺伝子の賦活体として示されている。ＹＢ−１はまたＭＨＣ分類II遺伝子の抑制因子として、且つヒトのＴ−細胞リンパ趨向性のウイルス−１（ＨＴＶＬ−１）とヒトの免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）の両方のＬＴＲｓの転写を刺激することが示されている。多くの腫瘍細胞は非常に高い水準のＣＤ９５ＬｍＲＮＡと、無視しうるほどの水準のＣＤ９５ｍＲＮＡ（例えば肺、結腸、肝臓及び皮膚癌）をもつ。これらの水準は非悪性の細胞に見られるものの逆である。ＣＤ９５発現の欠損があると、腫瘍がＣＤ９５Ｌの発現を通して細胞溶解のＴ−細胞からのがれることができ、その結果、活性化されたＴ−細胞のアポトーシスを誘発すると信じられている。更にｍｄｒ及び／又はＰＣＮＡ及び／又はＥＧＦ受容体ｍＲＮＡｓの水準は非悪性細胞よりも腫瘍細胞において、しばしばもっと高い。ＹＢ−１はこれらの遺伝子の全ての発現を活性化し、且つ同時にＣＤ９５遺伝子転写を抑制する。このことは、ＹＢ−１及び蛋白質のＹ−ボックスファミリーが悪性腫瘍（癌）の生物学に連累されることを示唆している。同定されたＣＤ９５サイレンサーポリヌクレオチドに対するＹ−ボックス蛋白質の結合を調節することを通して、ＣＤ９５遺伝子転写の調節は、活性化されたＴ−細胞がアポトーシスを受けにくくし、そして同時に細胞毒の薬に対する耐性を授与する。ＣＤ９５の発現の調節は、また自動的に誘発された、又はＴ−細胞がとりなす機構によって悪性の細胞のアポトーシスを増強するようにも使われうる。ｓｓＣＲＥ−ＢＰ又はＳＰＳＦＩとしても知られるＰｕｒαは、一本鎖のＤＮＡ−結合活性を有する３４−４２ｋＤ蛋白質である。ヒトのＰｕｒα（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ９６６８４：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ００５７７）及びネズミのＰｕｒα（ＥＭＢＬ受託番号Ｕ０２０９８；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ４２６６９）は完全に配列されている。ヒト、ネズミ及びラットのＰｕｒα は高度に保護されている；ヒトとネズミのＰｕｒαは９９．３％同一である。Ｐｕｒαはしばしばダイマー又はオリゴマーを生成する。発明者によって単離され且つ同定されたラットのＰｕｒα転写因子の第５’部分は、配列番号３８として同定されたポリヌクレオチドによってコード化されており、また発明者によって単離され、且つ同定されたラットのＰｕｒαの転写因子の第３’部分は、配列番号３９として同定されたポリヌクレオチドによってコード化されている。配列番号３８と３９で説明されたポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドは、それぞれ配列番号４１と４２において同定されている。ヒトのＰｕｒα（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ９６６８４；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ００５７７）に対して少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドは、本発明の構成と方法に使用するのに好ましい。配列番号４１と４２において同定されるポリペプチドは、また“ Ｐｕｒα”なる用語の範囲内に包含され、そして配列番号４１と４２において同定されるポリペプチドを含んでなる転写因子もまた、本発明の構成と方法において用いられるのに好ましい。ＰｕｒαはＤＮＡの複製及びまた転写の細胞周期制御に連累される因子であることが示されている。ＹＢ−１ｍＲＮＡと同様に、Ｐｕｒα ｍＲＮＡは試験された各組織中に発見されている。転写因子として、Ｐｕｒαは２つの異なったレトロウイルス、即ちヒトのポリオーマウイルス（ＪＣＶ）とラウス肉腫ウイルス（ｖ−ｓｒｃ）によって活性化された遺伝子の転写の制御に関係している。ＰｕｒαはＹＢ−１と相互に作用してＪＣＶエンハンサーの配列と結合する。そしてこのことが早いウイルスの遺伝子転写から遅いウイルスの遺伝子転写への移行を誘発すると信じられている。Ｐｕｒαはまたヒトの免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）Ｔａｔ蛋白質と相互作用しＪＣＶの転写を活性化することが示されている。ＴａｔはＨＩＶ−１に感染した人達のＣＤ４⁺Ｔ細胞のＣＤ９５によってとりなされるアポトーシスを調節することに関係している。このように、ＴａｔとＰｕｒαとの相互作用は、ＨＩＶ−１患者におけるＣＤ９５の発現を調節することに転写のレベルで寄与しうる。Ｐｕｒαはまた、腫瘍サプレッサー遺伝子によってコード化されている網膜芽種蛋白質（Ｒｂ）と関係することが示されている。 “Ｐｕｒαのような転写因子”して言及される３２ｋＤの分子量を有する他のＣＤ９５サイレンサー結合ポリペプチドが同定されている。Ｐｕｒαのようなポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの第５’部分は、配列番号４０において提供される。配列番号４０として同定されるポリヌクレオチドによってコード化されるＰｕｒαのような転写因子のＮ−末端アミノ酸配列は配列番号４３において提供される。これは新規なポリペプチド転写因子であると信じられている。配列番号４３に於いて同定されるポリペプチドを含んでなる転写因子及び１配列番号４３に於いて同定されるポリペプチドに対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する蛋白質が“Ｐｕｒαのような転写因子”なる用語の意味内容に包含され、そしてこれらは本発明の構成及び方法に用いられるのに好ましい。ＣＤ９５エンハンサー調節配列に結合し、そしてそれによってＣＤ９５発現を調節する２つのポリペプチド転写因子；ヒトのＹＢ−１とヒトのｈｎＲＮＰＤ（ＥＭＬＢ受託番号Ｄ５５６７２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１０１とＱ１４１０３）が同定された。ヒトのＹＢ−１は上に述べられている。ＨｎＲＮＰＤはまたｈｎＲＮＰＤ０及びＡＵＦ１（ＥＭＢＬ受託番号Ａ５４６０１；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１２７７２）として知られており、そして３３ｋＤの分子量を有する不均一な核のリボヌクレオプロテインである。ヒトのｈｎＲＮＰＤ（ＥＭＢＬ受託番号Ｄ５５６７２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１０１とＱ１４１０３）に対して少なくとも９５％そして好ましくは少なくとも９８％同一性を有するポリペプチドが、本発明の構成及び方法に用いられるのに好ましい。ＨｎＲＮＰＤはＵＵＡＧ−特異性ＲＮＡ結合蛋白質として記載されている。他の不均一な核のリボヌクレオプロテイン、ｈｎＲＮＰＫは、最近ｃ−ｍｙｃ遺伝子プロモーターの発現を活性化する転写因子であることが示されている。本発明の他の面は、ＣＤ９５以外の遺伝子と同様、ＣＤ９５遺伝子の転写を調節するための、調節ポリヌクレオチド及び／又は本発明の転写因子の使用に関する。ＣＤ９５遺伝子の転写の調節作用は、例えばエンハンサー又はサイレンサー調節領域に転写因子が結合するのを阻止することによって、或いは１又はそれ以上の転写因子の発現を調節することによって、成いは１又はそれ以上の転写因子の結合活性を調節することによって、或いは１つ又はそれ以上の転写因子の機能的活性を調節することによって達成されうる。ＣＤ９５遺伝子の転写の調節作用は、アポトーシスによる細胞死を選択的に刺激したり成いは阻害したりすることによって、いろいろの健康状態や疾患の状態を治療するために実施されうる。ＣＤ９５調節領域への転写因子の結合を阻止することは、例えば転写因子の結合を妨げることによって遺伝子発現を制御するために特定のＣＤ９５調節配列を標的とするオリゴデオキシリボヌクレオチド、合成ポリアミド類、又はその他の低分子といった低分子を導入することによって達成されうる。具体的には、転写因子の結合を阻害するために配列番号１〜７，３６及び３９として同定される調節配列を標的として結合する、又はそれでなければ協同する低分子の導入が好ましい。好適な低分子の同定や開発については、例えばカイ（Ｃａｉ）等(１９９６)、転写を調節する医薬品；機構と選択性、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｎｏ. 、７（６）：６０８〜６１５頁や、ゴッテスフェルト（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ）等(１９９７)、低分子による遺伝子発現の調節、Ｎａｔｕｒｅ３８７（６６２９）２０２〜２０５頁、に記載されている。ＣＤ９５調節領域に転写因子が結合するのを阻止することは、追加的に、又は二者択一的に、例えばオリゴヌクレオチド指向の三重ラセン体を用いることで達成されうる。このような方法を用いることは、例えはマーエル（Ｍａｈｅｒ）、Ｌ．Ｊ．(１９９２)、ＤＮＡ三重ラセン体：人工的な遺伝子抑制因子へのアプローチ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１４(１２)：８０７〜８１５頁や、チャン（Ｃｈａｎ）等(１９９７)、三重のＤＮＡ：遺伝子治療の基礎、進歩及び潜在的な応用、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（４）２６７〜２８２頁、で裏付けられている。代わりとして、転写因子は過剰の１又はそれ以上のポリヌクレオチド、具体的には配列番号１〜７，３６及び３７として同定される調節された配列からなるポリヌクレオチドを導入することによって、ＣＤ９５調節領域に結合するのを阻害されうる。過剰のポリヌクレオチドは、当業界でよく知られた様々の技術を使って導入されうる。細胞中で配列（配列番号２又は３６）に結合するＹＢ−１転写因子を含んでなるポリヌクレオチドを過剰に発現することは、例えば内因性のＹＢ−１が導入されたポリヌクレオチドに結合するという結果になるであろう。その結果としてＣＤ９５サイレンサー調節領域に結合する不充分な内因性のＹＢ− １があり、そして、このことはＣＤ９５の転写の活性化という結果になるであろう。転写因子の発現を調節することは、例えば関連した転写因子の翻訳を阻害することで達成されうる。関連した転写因子の翻訳は、例えばアンチセンス発現ベクターを導入することで、又はアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドもしくはアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドを導入することで、又はアンチセンスオリゴリボヌクレオチドもしくはアンチセンスホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチドを導入することで、又は当業界でよく知られた他の手段によって阻害することができる。アンチセンスポリヌクレオチドが関係した技術を使用することは、当業界でよく知られており、そして例えばロビンソン−ベニオン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎ）等(１９９５)、アンチセンス技術、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．２５４（２３）：３６３〜３７５頁、やカワサキ（ｋａｗａｓａｋｉ）等(１９９６)、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ２０(８)：８３６〜８４８頁、に記載されている。望ましい転写因子は、代わりの方法として望ましい転写因子の集合体を大きくするための望ましいエンハンサー又はサイレンサー転写因子をコードするＤＮＡ構造物を導入することによって過剰発現されうる。好適なＤＮＡ構造物は、関連した転写因子をコード化するポリヌクレオチドと適当なプロモーター及びターミネーター配列を含んでなる。具体的には、このようなＤＮＡ構造物に使用する好ましいポリヌクレオチドの例としては、結合する蛋白質のＹ−ボックスファミリーの一員をコード化するポリヌクレオチド、配列番号３８と３９を含む、Ｐｕｒ α蛋白質をコード化するポリヌクレオチド、配列番号４０を含む、Ｐｕｒαのような蛋白質をコード化するポリヌクレオチド及びｈｎＲＮＰＤ蛋白質をコード化するポリヌクレオチドが挙げられる。このようなＤＮＡ構造物をつくり、導入し、且つ発現する方法は、当業界でよく知られている。ＣＤ９５遺伝子の転写とＣＤ９５の発現は、あるいは１以上の転写因子の活性又は機能を調節することによって調節されうる。このことは、例えば、それらの結合活性又は機能を阻害または活性化する転写因子と相互作用する医薬品を導入することで達成されうる。上記の方法によるＣＤ９５以外の遺伝子の調節は、例えば、選択された遺伝子の暗号部分が本発明の調節ポリヌクレオチド及び適当なプロモーターと一緒に操作しうるように連結されているＤＮＡ構造物をつくることによって達成されうる。適切な転写因子はインビトロで、又はインビボで導入されうるし、また選択された遺伝子の転写と発現を調節する役割を演じる。同様に、ＣＤ９５の発現を調節するための上記の技術のいずれもが、本発明の調節配列と操作しうるように連結した他の遺伝子の発現を調節するために採用されうる。この型の機能的ＤＮＡ構造物を合成するための技術はよく知られている。本発明の更に他の面は、ＣＤ９５転写の開始部位の同定に関する。そのような部位の幾つかが以下に明らかにされている。本発明の調節ポリヌクレオチドと転写因子には、沢山の用途と応用がある。そのようなポリヌクレオチドと転写因子は、例えばＣＤ９５転写の調節の研究や、ＣＤ９５遺伝子又は他の遺伝子のコード部分の転写と発現を調節するのを、上に述べたようにインビトロで、及びインビボの双方で行うのに有用である。本発明の調節ポリヌクレオチドとＣＤ９５転写因子とは、インビトロ及びインビボの双方においてＣＤ９５の調節を研究するのに有用てある。例えば、調節ポリヌクレオチドとＣＤ９５転写因子は、調節能力を増強する及び／又は抑制するＣＤ９５転写を有する細胞型と集合体を同定するのに有用である。沢山の技術が使用できる。プローブとしてＣＤ９５調節ポリヌクレオチドを使って、例えば、いろいろの細胞源からの核の抽出物は、それぞれのＤＮＡ／ポリペプチド複合体の存在又は不存在に関して、電気泳動移動度分析（ＥＭＳＡ）によって、ふるいわけされうる。そのようなプローブに結合することができる転写因子の発現は、それらのｃＤＮＡの部分を増幅することによって、例えばポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）によって、又はノーザーン分析法又はＲＮａｓｅ保護分析のような、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を使い、これらの因子のｍＲＮＡを検出することによって、直接に分析できる。ＣＤ９５サイレンサー及びエンハンサーポリヌクレオチドは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子、レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子、又は緑の蛍光蛋白質遺伝子のような、いろいろのよく確立したリポーター遺伝子の発現のような細胞転写システムにおいて、それぞれの調節因子の存在及び／又は活性に関して、ふるいにかけるために使用されうる。ＣＤ９５調節因子を含む、細胞型と集合体の同定は、治療及び病気の予防の薬を開発する上で重大な影響を有する。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＣＤ９５転写を調節するもの（肯定的に又は否定的に調節するもの）の同定に関しての適用がある。スクリーニング分析法では、例えば、ＣＤ９５転写を評価するために本発明の調節ポリヌクレオチドからなる、一時時に又は安定的に移入されたリポーター構造物を使用しうる。上に記載されたように、調節サイレンサー及び／又はエンハンサー配列を、上述のリポーター遺伝子の１つの発現を制御する適切なプロモーターに融合させうる。そのようなリポーター構造物は、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン又はＣａ−ホスフェート共沈殿法によって、適切な細胞系統又は一次細胞に一時的に移入されうる。リポーター活性は、化学発光、蛍光、ＥＬＩＳＡに基づく、又は酵素による方法（放射性又は非放射性の方法）によって測定できる。そのようなスクリーニング分析法は、ＣＤ９５受容体の蛋白質の折りたたみを測定する分析法と比較して優れている。本発明の他の面に従って、ＣＤ９５遺伝子の調節され、誘導された転写を模写した、本発明の調節ポリヌクレオチドを移入された真核の宿主細胞を使うことで、ＣＤ９５転写の生理学上の増強剤と抑制剤の効力を同定し、テストすることができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＣＤ９５遺伝子の調節部分に結合することができ、そしてそれによってＣＤ９５遺伝子の転写を調節することができる分子を同定するスクリーニング分析法において有用である。ポリヌクレオチド・プローブを使用しての、結合分子を同定するための分析は、当業界においてよく知られており、そして例えば、ビオチン化された結合配列とともに形成された特異的なＤＮＡ／ポリペプチド複合体をストレプトアビジン・マトリックスに捕獲することを用いる、又は活性化されたアガロース又はセファロースのような適当なカラム・マトリックスに、結合部位を含むポリヌクレオチドを共有結合させるアフィニティー精製を含む。ＣＤ９５調節ポリヌクレオチドは、またいろいろの生化学的及び／又は生物物理学的な分画食療法による処置の後、適当な由来の核の又は全細胞の抽出物の個々の断片の特異的な結合活性を監視するのに使われうる。ＣＤ９５調節ポリヌクレオチドはまた、酵母ワン−ハイブリッド機能的クローニングシステムにおいて使用されうる。調節ポリヌクレオチドは、生合成の標識、又は同族の転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ｃＤＮＡライブラリーによって提供され、且つ他の適切な転写因子の活性化ドメインと共にハイブリッドとして第２のベクター中で発現される）が少なくともこの配列に結合するときに発現される生存遺伝子の転写を活性化するために、酵母シャトルベクター中でクローン化されうる。そのような結合分子の同定、単離及び精製は、ＣＤ９５遺伝子のコード化された部分の転写をインビトロ及びインビボの両方で調節するための機構を提供する。同様に、本発明のＣＤ９５転写因子は、機能的に協同する調節ポリペプチドの同定と精製に有用である。転写因子それ自身、又はそれらに対抗するために生じたモノクロナール抗体が、このような調節ポリペプチドを含む細胞型の同定のために使われうる。モノクロナール抗体を生じさせるために、よく知られた技術が使用されうる。ＣＤ９５遺伝子の調節部分に対応する本発明のポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドの部分は、他の種から、対応するゲノムの領域を同定し、単離するためのプローブとして使用されうる。そのような領域の同定は、保存機能もまた発揮しうる、構造的に保護された特定物を同定する際の助けになる。保存された調節要素の同定は、ヒト以外の由来の実験データよりヒトのＣＤ９５遺伝子の発現を推定するための重要な予言要素である。本発明の調節ポリヌクレオチドは、また同定された配列に対して相同性を発揮する、ヒト以外の由来のポリヌクレオチドを同定するスクリーニングの目的のために有用である。ＣＤ９５調節ポリヌクレオチドの同定と単離は、サイレンサー又はエンハンサー調節領域に欠ける、修飾されたＣＤ９５遺伝子構造を有する遺伝形質転換性哺乳類種の開発を可能にする。相同組換えやノックアウト戦略のような技術がよく知られている。このような哺乳類種は、ＣＤ９５遺伝子調節やアポトーシスをインビボで研究するのにモデルとして有用である。レポーター遺伝子に融合した本発明の調節配列を有するＣＤ９５プロモーター又は非相同プロモーターの部分をもつ遺伝形質転換種は、例えば、同定されたポリヌクレオチドモチーフの交雑種調節活性をインビボで分析するのに使用されうる。遺伝形質転換種はまた、ＣＤ９５発現の固有の調節物質を組織用に選択するためのインビボのモデルとしても役に立ちうる。サイレンサー配列と共に、又はそれなしに、ＣＤ９５プロモーター及びエンハンサーによって調節される、ベーターガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子を発現する遺伝形質転換種は、またＣＤ９５発現の特異的な調節物質を組織用に選択するインビボのモデルとして役立ちうる。そのような遺伝形質転換種に引きわたされる化合物は、異なった構造物中のレポーター遺伝子の転写に関するそれらのインビボの効果について分析が行われうる。全身性自己免疫の１つのネズミモデルにおいて、ｌｐｒ同形接合のネズミ、例えば、キー異常（奇形）はＣＤ９５遺伝子の不完全な発現である(アブルケー・アバス(ＡｂｕｌＫ．Ａｂｂａｓ)、“ＤｉｅａｎｄＬｅｔＬｉｖｅ：危険なリンパ球を取除くこと”、Ｃｅｌｌ８４：６５５〜６５７頁、１９９６年)。ＣＤ９５遺伝子及びＣＤ９５転写因子の調節部分に対応するポリヌクレオチドはまた、沢山の治療に応用できる。ＣＤ９５エンハンサーとサイレンサーポリヌクレオチドは例えば、標的／作動因子遺伝子を天然ＣＤ９５やアポトーシスを受ける標的細胞と共に、共同発現させるために使用されうる。天然ＣＤ９５遺伝子プロモーター又は異形のプロモーターの正面においてクローン化したＣＤ９５調節ポリヌクレオチドは、ＣＤ９５を発現する細胞型であって、その幾らかはまた活性化で誘発される細胞死を受けやすいものにおいて、アポトーシスの抑制剤又は刺激剤の調節された共同発現のために使われうる。ＣＤ９５アポトーシスの抑制剤の例としては、ＣｒｍＡ、アポトーシスに連累されるＩＣＥ類似のシステインプロテアーゼの生体の抑制剤、及びＣＤ９５と協同したプロテインＦＡＤＤの優性ネガティブ突然変異体が挙げられる。野生型ＦＡＤＤの発現はアポトーシスを誘発するのに使用されうる。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＣＤ９５発現を増強し、又は抑制するための遺伝子治療の応用に使用できる。例えば、ＣＤ９５ｃＤＮＡに融合した（自然な発現を要求する）ｈＣＤ９５プロモーター中のヌクレオチド位置−１０３２から−１を含みうるＣＤ９５最小の調節配列からなるミニ遺伝子は、遺伝子療法を通じてＣＤ９５転写と発現を高めるのに有用である。このようなミニ遺伝子は、例えば、ＣＤ９５の不足している自己免疫患者における機能形成遺伝子療法において導入されうる。ＣＤ９５突然変異又は発現欠陥をもった自己免疫患者の適当な細胞型において野生型ＣＤ９５の調節された発現を再構成するために、患者又は適合性のある供与者からの粗骨髄細胞（又はリンパ球に関して豊富化された細胞分画）は、ウイルス性の、又は非ウイルス性のベクター中でクローン化されたＣＤ９５ミニ遺伝子を導入されうる。そして、これらの細胞は、放射線及び／又は化学療法によって、患者の残りの導入されていない骨髄細胞の破壊の後に患者に再注入される。他の適切な遺伝子及び／又は細胞治療アプローチは当業界において知られている。ここに開示されたエンハンサー又はサイレンサー調節配列の全部又は一部を含むポリヌクレオチドは、またＣＤ９５遺伝子上の調節結合部位用の内因性結合蛋白質又は転写因子との競争相手として治療上の応用がある。適切なデリバリー技術は当業界で知られている。ＣＤ９５発現はこの技術を使ってインビトロ又はインビボで調節されうる。同様に、転写因子が、ＣＤ９５発現を調節するために、競争的又はアンチセンス戦略を使用して、用いられうる。サイレンサー及び／又はエンハンサー配列を含む、減成安定化されたホスホールチオデートオリゴヌクレオチドは、リポソームの中へ被膜で覆うように入れられ、そして標的部位へ直接に又は静脈内に注射を打つことによって患者へ運び込まれうる。代わりに、レトロウイルス性又はアデノウイルス性のベクター、又はエンハンサー及び／又はサイレンサー転写因子のアンチセンスＲＮＡを発現する裸のＤＮＡが、インビトロの患者の細胞に、又は適切なルートでインビボの患者に直接に運び込まれうる。適切な技術が当業者で知られている。ここで使用されるような“ポリヌクレオチド”なる語は、ヌクレオチドの重合の集まりを意味し、センス及びアンチセンス鎖両方のＤＮＡ及びＲＮＡを含み、且つｃＤＮＡ、ゲノムのＤＮＡ、及び全面的に又は部分的に合成されたポリヌクレオチドを包含する。操作しうるアンチセンスポリヌクレオチドは全ての配列の断片からなりうること、そして“ポリヌクレオチド”の定義はそれ故に全てのそのような操作しうるアンチセンス断片を含むことが理解されるであろう。ヒトのゲノムのＤＮＡ及び異形種ＤＮＡｓの同定は、適当にきびしい条件の下で、適当なライブラリーを選択するプローブとしてｃＤＮＡ配列の全部または一部を使って、標準のＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド化技術によって達成されうる。代わりに、公知のゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び蛋白質配列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使うＰＣＲ技術は、ゲノムとｃＤＮＡの配列を増幅し、Ｈつ同定するために使用されうる。同定された配列及び変種に対応する合成ＤＮＡｓが慣用の合成法によって製造されうる。ここに述べられるポリヌクレオチドの全てが単離され、且つ精製される。ポリヌクレオチドとの関連において、ここで使用される“変種”なる語は、特異的に同定された配列とは異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、且つこの同定された配列の調節活性の明らかな損失なしに、１以上のヌクレオチドが削除もしくは置換され、又は１以上のヌクレオチドが加えられているものを包含する。ポリヌクレオチド変種は、天然に存在している対立形質の変種であってもよいし、或いは天然には存在していない変種であってもよい。変種ポリヌクレオチドは好ましくは、同定された調節配列及びｃＤＮＡ配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を発揮する。変種ポリヌクレオチドは、同定された調節配列の任意の８ヌクレオチド隣接部分及び同定されたｃＤＮＡ配列の任意の５０ヌクレオチド隣接部分に対して、より好ましくは少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を発揮する。更により好ましくは、変種ポリヌクレオチドは５ヌクレオチド又はそれより少ない置換、欠失又は付加によって、同定された調節又はｃＤＮＡ配列と異なる。ポリヌクレオチドの同定は、例えば、ｃＤＮＡ比較用のＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴ調査プロクラム（ＧＣＧソフトウエアパッケージ、ウィシコンシン大学）及びトランスファック（Ｔｒａｎｓｆａｃ）データベース（ＧＢＦ、ブラウンシュベイッヒ(Ｂｒａｎｎｓｃｈｗｅｉｇ)、ドイツ）を調査するためのＴＦＳＥＡＲＣＨ（アキヤマユタカ、京都大学）のようなプログラムからのアルゴリズム、又は調節配列を比較するためにＴＥＳＳデータベースに於いて使用される調査アルゴリズムを使って配列を比較することによって決定されうる。ここに使用される“ポリペプチド”なる語は、完全な長さの蛋白質を含む任意の長さのアミノ鎖であって、アミノ酸残基同士が共有ペプチド結合によって連結されているものを包含する。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産生物であってもよいし、また部分的に又は全体的に組換え技術を使って産生されてもよい。このようなポリペプチドは、哺乳類の又は他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されていてもよいし、又はグリコシル化されてなくてもよい。調節ポリヌクレオチドと転写因子は、調節ポリヌクレオチド配列と適当なプロモーターに適当に結合したＣＤ９５遺伝子又は他の遺伝子のコード部分の転写を “増強すること”又は“抑制すること”に連累する活性に関してここで述べられている。そのような調節活性は、インビトロおよびインビボの両方で観察され、評価されうる。異なった発展段階及び生理学的な又はインビトロの条件における細胞と同様に、異なった型の生体や細胞が実質的に異なった転写活性を発揮しうることが理解されよう。“増強する”又は“抑制する”活性を有するとしてここに述べられている調節ポリヌクレオチドは、ＣＤ９５基底プロモーター（−４２１／−１−ＣＡＴ）又はＨＳＶtkプロモーターを有するＣＤ９５遺伝子の転写に関して記載される。転写活性は、ＣＤ９５基底プロモーター又はＨＳＶ tkプロモーターの存在下、実質的に同じ条件の下で測定された転写活性に比べて、調節ポリヌクレオチドの存在下の転写活性のレベルに少なくとも５０％、そしてさらに好ましくは少なくとも１００％の変動があるときに、“増強される”又は“抑制される”と判断される。同様に、転写活性は、転写因子又はポリヌクレオチド／転写因子がないだけで実質的に同じ条件下で測定された転写活性に比べて、転写因子又はポリヌクレオチド／転写因子複合体の存在下での転写活性のレベルに少なくとも５０％、そしてさらに好ましくは少なくとも１００％の変動があるときに、“増強される”又は“抑制される” と判断される。ポリペプチド転写因子は、おおよその分子量に関してここに記載される。“おおよその”分子量は、５０ｋＤａまでの所定の分子量の５％までの変動；５１ｋＤａから１００ｋＤａまでの所定の分子量の１０％までの変動；及び１０１から３００ｋＤａの所定の分子量の２５％までの変動を予期している。ポリペプチド転写因子のポリヌクレオチドへの結合、及びＤＮＡ／ポリペプチド複合体の形成は、以下に述べる標準的なＥＭＳＡ技術を使用してインビトロで、又はＣＤ９５遺伝子もしくは、調節ポリヌクレオチド及び適切なプロモーターに適当に連結した他の遺伝子からの転写の増強又は抑制を測定することによってインビボで、評価しうる。ここで使用されている“単離された”、及び“精製された”なる語句および他の用語は、これらの技術で認知された意味に従って使用されている。図面の簡単な説明出願人の発明の好ましい態様が図面を引用して以下に記載される。この図面において、図１は、ＣＡＴレポーター構造物の一時的な移入によるｈＣＤ９５遺伝子５’−フランキング領域の機能的分析の結果を示している。このｈＣＤ９５遺伝子の５’−フランキング領域は、以下のような略語：Ｈ，Ｈｉｎｄ III；Ｐ，ＰｓｔＩ；及びＳ，ＳａｃIIを使って同定されたサブクローニングに関係した制限部位と共に図の上面に図示されている。個々のリポーター構造物が、ｈＣＤ９５遺伝子のサブクローン化された領域のヌクレオチドの位置に言及する構造物名と共に図示されている。ＨｅＬａとＣＯＳ −７細胞への一時的な導入の結果が、それぞれＢとＣのレーンに図示されている。これらの結果は、ｈＣＤ９５プロモーターからの転写を増強する（Ｅ１；−１００７から−９６４まで）及び抑制する（Ｓ１；−１０３５から−１００８まで）ｈＣＤ９５遺伝子における領域を同定している。図２は、ジュルカット（Ｊｕｒｋｕｔ）細胞(レーン１)、ラットの肺細胞（レーン２）及びラットの小腸細胞（レーン３）からの全ＲＮＡに関するプライマー伸長分析による、ｈＣＤ９５遺伝子用の転写開始部位の同定を図示している。図３は、ｈＣＤ９５エンハンサー領域中に存在する、配列番号５（ＩＲ２）において同定される、ヘキサマーの転化された繰返し配列がジュルカット細胞核抽出物における転写因子の配列固有結合を仲介することを論証する電気泳動移動度分析（ＥＭＳＡ）の結果を図示している。明瞭なＤＮＡ／ポリペプチド複合体が矢と矢じりによって印をつけられている。レーンの上に示されるような、配列番号５において同定されるヘキサマーの転化された繰返し配列の突然変異の精査が、結合への個々のヌクレオチド位置の寄与をはっきりと規定し、且つ配列番号３において同定される変質したエンハンサーコンセンサスモチーフポリペプチド配列を確証した。図４は、新規なＤＮＡ／ポリペプチド複合体が配列の特異的な方法で形成されることを論証するＥＭＳＡ分析の結果を図示している。１ｂｐと４ｂｐによって行間をあけたｈＣＤ９５エンハンサー領域モチーフで形成された複合体が開いた矢じりで印をつけられている。このデータは、同じ結合モチーフであることはわかるが、異なった面間隔（スペーシング）要件を有する、関係する転写因子のファミリーの存在を示唆している。図５は、新規なＤＮＡ／ポリペプチド複合体がｈＣＤ９５サイレンサー領域プローブとエンハンサープローブと共に形成されたことを論証するＥＭＳＡ分析の結果を図示している。この実験の研究から、配列番号７又は３６として同定されるポリヌクレオチドヘプタマーモチーフが転写因子との相互作用を仲介することが示唆された。図６は、１本線プローブ同士が複合体形成に関して競争し、サイレンサー領域における配列番号７又は３６として同定されるヘプタマーモチーフの妨害が、そのプローブが複合体形成に関して野生型サイレンサープローブと競争する能力を脱落させることを論証するＥＭＳＡ分析の結果を図示している。ポリヌクレオチドヘプタマーモチーフは、このように調節抑制機能に関して重要である。プローブ配列の配列番号は、レーンの上に示されている。図７は、ＵＶ−架橋分析の結果を図示している。図７ＡはネズミのＬ９２９細胞からの核の抽出物を二本鎖のｈＣＤ９５エンハンサー領域プローブ（配列番号１）と一緒に使ったＵＶ−架橋を示している。約５９と１１３ｋＤＡの明瞭なＤＮＡ／ポリペプチド複合体、そして約２００〜３００ｋＤａの高分子複合体が同定されている。図７Ｂは、約４７，７７及び１００ｋＤａのＤＮＡ／ポリペプチド複合体を同定するために、ジュルカットとＬ９２９細胞からの核の抽出物を一本鎖のｈＣＤ９５サイレンサー領域プローブ（配列番号２）と一緒に使ったＵＶ− 架橋の結果を示している。図８は、サウスウェスタン分析の結果を図示している。図８Ａは、ジュルカットとラットの真皮乳頭（ｒＤＰ）細胞からの核の抽出物を二本鎖のｈＣＤ９５エンハンサー領域プローブ（配列番号１１）と一緒に用いたサウスウエスタン分析の結果を示している。約１１３ｋＤａ（ジュルカットとｒＤＰに於ける）と約５９ｋＤａ（ｒＤＰに於ける）の明瞭なＤＮＡ／ポリペプチド複合体が同定された。図８Ｂは、ジュルカット細胞からの核の抽出物を一本鎖のサイレンサー領域プローブ（配列番号２）と一緒に用いたサウスウエスタン分析の結果を示している。約４７ｋＤａと１００ｋＤａの明瞭なＤＮＡ／ポリペプチド複合体が同定された。図９は、いろいろのｈＣＤ９５エンハンサー及びサイレンサー領域ポリヌクレオチドを含むＣＡＴレポーター構造物の一時的な移入の結果を示している。ＩＲ２−ｔｋ−ＣＡＴ(配列番号１１)、ｍＩＲ２−ｔｋ−ＣＡＴ(配列番号１９)、ＩＲ１−ｔｋ−ＣＡＴ(配列番号４)、ＩＲ４−ｔｋ−ＣＡＴ（配列番号６）及びＳ１−ｔｋ−ＣＡＴ（配列番号２）として呼称されるものを含む、個々のレポーター構造物が、ｈＣＤ９５エンハンサー及び／又はサイレンサー領域ポリヌクレオチドに関連する構造物名と一緒に図示されている。ＨｅＬａとＣＯＳ−７細胞への一時的な導入の結果はそれぞれＢとＣのレーンに図示されている。ｈＣＤ９５エンハンサーポリヌクレオチドたるものは、サイレンサー領域がない場合にだけ、異形のｔｋプロモーターからの転写を自発的に増強する。これらの結果は、同定されたｈＣＤ９５エンハンサー及びサイレンサー領域のインビボでの機能性を論証している。発明の詳細な説明ヒトのＣＤ９５（ｈＣＤ９５）遺伝子のためのゲノムのクローンが単離され、そしてｈＣＤ９５遺伝子５’−フランキング領域の２．３ｋｂ領域が塩基配列決定された。ｈＣＤ９５ポリヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬデータベースにおいて受託番号Ｘ８７６２５と定められている。ＣＡＴレポーター構造物と一時的な導入を使った初期の機能的分析によって、ｈＣＤ９５遺伝子のヌクレオチド位置− １，７８１と−１，００７の間に存在する転写サイレンサー活性と、ヒトのＣＤ９５遺伝子のヌクレオチド位置−１，００７と−４２５の間に存在する強い転写エンハンサー活性とが、同定された。この実験の研究は、エフ．ルダート（Ｆ．Ｒｕｄｅｒｔ）等、“ヒトのＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）遺伝子におけるサイレンサー、エンハンサー、及び基底プロモーター領域の同定”、ＤＮＡＡＮＤＣＥＬＬＢＩＯＬＯＧＹ、１４巻、１１号、９３１〜９３７頁（１９９５年）に記載されている。更なる機能的な分析によって、エンハンサーとサイレンサー領域の輪郭が更に画かれた。Ｅ１（配列番号１）と名付けられた、転写エンハンサー領域はｈＣＤ９５遺伝子中のヌクレオチド位置−１００７と−９６４の間に存在し、そしてＳ１（配列番号２）と名付けられた、転写サイレンサー領域はｈＣＤ９５遺伝子中のヌクレオチド位置−１０３５と−１００８の間に存在する。これらの領域は、活性化で誘発される細胞死中に、細胞型−特異性の且つ活性化状態依存性の転写調節を仲介する。更なる実験による研究で、幾つかの哺乳類の細胞系統において存在する核の因子の配列固有の結合を仲介し、エンハンサー領域（Ｅ１）に存在する、ヘキサマーの転化された繰返し結合配列（ＩＲ２）（配列番号５）が同定された。個々のヌクレオチド位置の結合への寄与が評価され、そして変質したエンハンサーコンセンサスモチーフ結合配列（配列番号３）が同定された。エンハンサー領域（Ｅ１）コンセンサスモチーフ結合配列の面間隔誘導体（配列番号４と６において同定された）もまた、哺乳類の核の抽出物と新規な複合体を形成した。このデータは、同じエンハンサーモチーフ結合配列であることがわかるが、異なった面間隔要件を有するファミリーの存在を示唆している。エンハンサー領域（Ｅ１）結合配列は、サイレンサー領域の不存在下でのみ異形のＨＳＶチミジンキナーゼ(“ ｔｋ”)プロモーターからの転写を自発的に増強した。このことは調節配列モチーフのインビボの機能性を論証している。ｈＣＤ９５エンハンサー及びサイレンサー領域中にあって、且つ核の因子がこのサイレンサーＳ１領域に結合するのを仲介しうる同一のコピー中に存在する、ヘプタマーモチーフ結合配列（配列番号７と３６）もまた同定された。ＣＤ９５調節ポリヌクレオチドに結合する蛋白質性の転写因子もまた同定されている。ｈＣＤ９５サイレンサープローブ（配列番号２）を用いたＵＶ架橋分析によって、ヒト及びげっ歯類動物の核の抽出物と共に約４７及び７７及び１００ｋＤａの架橋したＤＮＡ／ポリペプチド複合体が示された。ジュルカット細胞の核の抽出物のサウスウエスタンブロットを一本鎖サイレンサープローブで精査した結果として、前記の４７及び１００ｋＤａ複合体は単一核の蛋白質に対応することが教唆された。一本鎖サイレンサープローブ（配列番号２）に対し補足的であるが、プローブＤＮＡ鎖（配列番号１３）に対応する競争体ではない、ヘプタマー含有サイレンサー配列プローブ競争体（配列番号１２）が、４７及び１００ｋＤａ種の結合に関して競争した。このことは、サイレンサーＤＮＡ／ポリペプチド複合体が一本鎖ＤＮＡと好ましく、或いは排他的に形成されること、及び結合領域での、或いは結合領域近くでのＤＮＡの２本鎖がサイレンサーの複合体形成を阻害すること、を教唆するＥＭＳＡ実験からの結果と関係している。この補足的な競争体（配列番号１２）は、サイレンサー結合部位（配列番号７）を含み、且つ一本鎖サイレンサープローブ（配列番号２）と直接競争するか、又は２本鎖形成によってサイレンサー因子結合を阻害する。エンハンサープローブ（配列番号１）とネズミの細胞抽出物を用いたＵＶ−架橋分析は、約１１３ｋＤａ及び５９ｋＤａの分子量を有する架橋したＤＮＡ／ポリペプチド複合体、及び約２００〜３００ｋＤａの架橋した高分子ＤＮＡ／ポリヌクレオチド複合体を同定した。本発明は、以下のような実験のプロトコルと調節ポリヌクレオチド及び転写因子を同定する結果とに言及することによって説明される。この実験のプロトコルと結果は、本明細書と請求の範囲を支持するものであって、請求の範囲に記載した発明をいかなる方法においても制限するように解釈されてはならない。ｈＣＤ９５調節ポリヌクレオチドの同定ヒトのＣＤ９５に関するゲノムのクローンを単離することと配列決定をすること胎盤からのヒトのゲノムのファージライブラリーのクローン（５×１０⁵）がｈＣＤ９５（ＥＭＢＬデータベース、受託番号ｘ８７６２５）のコード領域に対応するｃＤＮＡプローブでもって選択された。λファージが大腸菌タップ９０（Ｅ．ｃｏｌｉＴａｐ９０）上で生育させられ、且つハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎ⁺ナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でレプリカ平板法が適用された。ＤＮＡの変性と定着の後、フィルターが４０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＮａＤｏｄＳＯ₄、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｓ、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５、２ｍＭＥＤＴＡ、２００μｇ変性したサケの精子ＤＮＡの中において、ランダムに感作されたプローブでもって４２℃で一晩中ハイブリッド化された。フィルターは、２×ＳＳＰＥ／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄中において６５℃で洗浄された。ポジティブファージクローンがオートラジオグラフィーの後、単離され、そしてＣＤ９５プローブを用いて２度、プラーク精製された。精製されたファージＤＮＡの部分的なＨｉｎｄ III分解物からの３．７−ｋｂＨｉｎｄ III断片が、ｈＣＤ９５ｃＤＮＡ（イトウ（Ｉｔｏｈ）等、“ヒトの細胞表面抗原ファス（ｆａｓ）に関するｃＤＮＡによってコード化されたポリペプチドはアポトーシスを仲介しうる”、Ｃｅｌｌ６６：２３３〜２４３頁、１９９１年）における位置−２０５から−１８４に対応するオリゴヌクレオチドＦＲ２５７（配列番号８）を使ったサウザーン分析によって同定され、そしてｐＢＳＳＫIＩ⁺（ストラタジーン）中でサブクローン化され、且つ部分的に配列決定された。この配列は、³²Ｐ標識のプライマーか、又は蛍光標識のジデオキシヌクレオチドのどちらかと、型式３７３Ａ自動配列決定機（アプライドバイオシステムズ）を使ったＰＣＲサイクル塩基配列決定法によって決定された。初期のヒトのＣＤ９５遺伝子レポーター構造物のクローン化位置−１７８１と−４２５の間にあるヒトのＣＤ９５遺伝子の５’−の脇に存在する領域の５’削除のパネルが、上に述べたゲノムのｈＣＤ９５クローンからＰＣＲ増幅によって発生させられた。数種のレポーター構造物が、レポータープラスミドｐＢＬＣＡＴ８⁺（クライン−ヒットパス（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ）等、“１３ｂｐパリンドロームは機能的エストロゲン感受性要素であり、そしてエストロゲン受容体と特異的に相互作用をする”、ＮｕｃｌｅｉｅＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６、６４７〜６６３頁、１９８８年）中で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の前においてｈＣＤ９５遺伝子の選択されたセグメントをクローン化することによってつくられた。−１７８１／−６７−ｔｋ−ＣＡＴは、始めにＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩ−消化されたｐＢＬＣＡＴ８⁺のＨｉｎｄ III部位に１．７−ｋｂＨｉｎｄ III−ＳａｃI I断片を固定し、それからＳａｃ IIとＢａｍＨＩ部位をうめ、連結することによって構成された。−１００７／−１−ｔｋ−ＣＡＴと−１００７／−１−ＣＡＴは、それぞれＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩ−及びＨｉｎｄ III／Ｂｇ／II−消化されたｐＢＬＣＡＴ８⁺中に、Ｈｉｎｄ III／ＢｇＩ II−消化されたＰＣＲ断片（プライマーＦＲ２８３：配列番号９とＦＲ２９０：配列番号１０）を挿入することによって発生させた。−１７８１／−１−ＣＡＴは、−１００７／−１− ＣＡＴからの４２５−ｂｐＰｓｔＩ−Ｂｇ／II断片をｐｓｔＩ／Ｂｇ／II消化された−１７８１／−６７−ｔｋ−ＣＡＴヘクローン化することによって構成された。−１７８１／−６７−ＣＡＴは、−１７８１／−６７−ｔｋ−ＣＡＴをＰｓｔＩ／Ｂｇ／IIで切断し、末端をうめ、そしてベクターを再び結合することによって構成された。−４２５／−１−ＣＡＴは、Ｈｉｎｄ III／ＰｓｔＩで消化し、末端をうめ、そして残りのベクターの再結合によって、−１００７／−１−ＣＡＴから誘導された。ＰＣＲの条件は、５０ｐモルの各プライマー、各々２００μＭｄＮＴＰｓ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、及び２．５ユットのＴａｑポリメラーゼ（ボエーリンガー(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ))であった。増幅が９４℃１分間、５５℃１分間及び７２℃１．５分間の３０サイクルで行われた。追加のヒトのＣＤ９５遺伝子レポーター構造物のクローン化 −１７８１から−４２５の間の位置にあるヒトのＣＤ９５遺伝子の５’−の脇に存在する領域の５’削除の追加パネルが、上記の遺伝子のｈＣＤ９５クローンからＰＣＲ増幅によって発生させられ、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターに欠けるレポータープラスミドｐＢＬＣＡＴ８⁺中でＣＡＴ遺伝子の前でクローン化された。以下のようなＣＡＴレポーター構造物がクローン化された： −１７８１／−１−ＣＡＴ；−１６８７／−１−ＣＡＴ；−１５１３／−１−ＣＡＴ；−１３４０／−１−ＣＡＴ；−１２９９／−１−ＣＡＴ；−１２６１／− １−ＣＡＴ；−１２１９／−１−ＣＡＴ；−１１７５／−１−ＣＡＴ；−１１１５／−１−ＣＡＴ；−１０７１／−１−ＣＡＴ；−１０３５／−１−ＣＡＴ；− １００７／−１−ＣＡＴ；−９６３／−１−ＣＡＴ；−９２４／−１−ＣＡＴ； − ８７４／−１−ＣＡＴ；−８０２／−１−ＣＡＴ；−６０６／−１−ＣＡＴ；及び−４２５／−１−ＣＡＴ。削除構造物が、付属したＢｇ／II部位をもった、配列番号９において同定される固定された下流のプライマーと、Ｈｉｎｄ III部位を含む以下のようなそれぞれ上流のプライマーとを用いてＰＣＲ増幅によって発生させられた：Ｈｉｎｄ III／Ｂｇ／II−消化されたＰＣＲ断片が、ゲル精製され、ｐＢＬＣＡＴ８⁺の対応部位にクローン化された。−１７８１／−１−ＣＡＴ、−１００７／−１−ＣＡＴ及び−４２５／−１−ＣＡＴレポーター構造物の構成が上記に記載されている。付加構造物が、配列番号４，６，１１，１９、又は配列番号２に対応した５’伸長をもった同じ配列を有する２本鎖のオリゴヌクレオチドであって、これらのオリゴヌクレオチドの大部分は、またＨｉｎｄ III適合５’張出しを含むものを、Ｈｉｎｄ III−消化されたｐＢＬＣＡＴ８⁺に結合させることによって発生させられた。全ての構造物は、自動配列決定機（アプライドバイオシステムズ）を用いた配列決定により確認された。ＣＡＴレポーター構造物の一時的導入ＣＯＳ−７（シノモロガスサルのじん臓）及びＨｅＬａ（ヒトの頚管癌）細胞が５％牛胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、及びＢ− メルカプトエタノール（２−ＭＥ）で補充された、標準ダルベコ（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ）の修飾されたイーグル（Ｅａｇｌｅ）の培地（ＤＭＥＭ）中で培養された。５×１０⁵細胞が１０−ｃｍのプラスチック製の培養皿（ファルコン）中で、導入前２４時間、培養された。細胞がＣａＰＯ₄法によって、５ｕｇの上記初期および追加のレポータープラスミド、細胞内制御として１．５ｕｇのβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）発現ベクターｐＣＨ１１０（ファーマシア）、及びキャリヤーＤＮＡとして８ｕｇのｐＢＳ（ストラタジーン）でもって導入された。導入から１８時間後に、細胞が１回ＤＭＥＭで洗浄され、新鮮な培養培地が添加された。この細胞が更に２４時間、培養された。その後、細胞は、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ中て集菌され、スパンダウンされ、２５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１５％クリセロール中に再懸濁され、そして抽出物が冷凍と溶解を繰返すことによって調製された。β−Ｇａｌ発現に関して標準化された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）分析が、ゼレント（Ｚｅｌｅｎｔ）等、“クローン化及びネズミのα，βレチノイン酸受容体及び皮膚中に優先的に発現される新規な受容体γ”、Ｎａｔｕｒｅ３３９：７１５〜７１７頁（１９８９年）に記載されているうよに、０．５ｍＭアセチルＣｏＡ（ボエーリンガー(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ)）及び０．２μＣｉ〔¹⁴Ｃ〕クロラムフェニコール（ｓｐ．ａｃｔ．５４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、アマーシャム(Ａｍｅｒｓｈａｍ)）を用いてなされた。反応産生物はＣＨＣｌ₃ ／メタノール（９５：５）中で薄層クロマトグラフィーによって分離された。ＣＤ９５遺伝子配列の機能分析上記記載のＣＡＴレポーター構造物が、一時的移入効能検査においてｈＣＤ９５遺伝子の５’−フランキングに存在する領域を機能的に分析するために使用された。ｔｋプロモーターに欠けるｐＢＬＣＡＴ8⁺（これを１とする）と比較した、ＣＡＴ転化の百分率と平均ヒダ刺激が、ＣＯＳ−７及びＨｅＬａ細胞への初期のレポーター構造物の導入に関して以下に示されている。テストされた最大の構造物（−１７８１／−１−ＣＡＴ）は、ＣＯＳ−７及びＨｅＬａ細胞において非常に弱い活性だけを示した。その３’末端のところに６７−ｂｐ欠失をもつ同じ構造物（−１７８１／−６７−ＣＡＴ）はＣＯＳ−７細胞に於ける−１７８１／−１−ＣＡＴとほとんど同じ応答を与え、ＨｅＬａ細胞において約２倍の増加を与えた。異形のＨＳＶｔｋプロモーターと一緒にテストされたときには、同じ断片（−１７８１／−６７−ｔｋ−ＣＡＴ）は、ＣＯＳ−７及びＨｅＬａ細胞の両方に於いてこのｔｋプロモーターだけで観測された値に比べて、更なる転写活性を全く示さなかった。しかしながら、 −１７８１／−１−ＣＡＴの５’−末端での７６４ｂｐ（−１００７／−１−ＣＡＴ）の切断は転写活性をＣＯＳ−７及びＨｅＬａ細胞におけるバックグランド水準より上に、それぞれ１９倍と６０倍増大させた。同様のアップレギュレーションが両方の細胞系統に於いて、ｔｋプロモーターを含有する同一の構造物（− １００７／−１−ｔｋ−ＣＡＴ）についてみられた。これらのデータは、サイレンサーがヒトのＣＤ９５遺伝子の５’−の脇のところに存在する領域において、 −１，７８１位と−１，００７位との間にあることを示唆している。レポーター −１００７／−１−ＣＡＴの５’末端における５８２ｂｐの更なる切断は、その構造物についてみられた強い活性を著しく減少させたが、−４２５／−１−ＣＡＴは−１７８１／−１−ＣＡＴ及び−１７８１／−６７−ＣＡＴについて観測された値より上の基底プロモーター活性を維持した。これらの結果は、ｈＣＤ９５遺伝子の５’−フランキングに存在する領域にある−１，００７と−４２５の間にエンハンサーが存在することを論証しており、そしてｈＣＤ９５調節領域の最初の４２５ｂＰに於いて基底プロモーター活性を示した。基底プロモーター活性はｔｋプロモーターのそれに匹敵する基準に到達した。このように、ｈＣＤ９５プロモーターが比較的強いとみなされた。更なるＣＡＴレポーター構造物の一時的移入による、ｈＣＤ９５遺伝子の５’ −の脇のところに存在する領域の機能的分析が図１に図示されている。個々のレポーター構造物が、ｈＣＤ９５遺伝子のサブクローン化された領域のヌクレオチド位置に関係した構造物名と共に図示されている。ＨｅＬａ及びＣＯＳ−７細胞への一時的な移入の結果は、それそれＢとＣのレーンに図示されている。薄層クロマトグラムが、それそれのレポーター構造物から発現したＣＡＴ酵素の水準によって発生したアセチル化¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール置換体の量を示しており、ここでスポットの強度は転写の活性化の水準と互いに関連している。これらのデータは、ＣＤ９５プロモーターからの転写を増強する（Ｅ１；−１００７から −９６４）又は抑制する（Ｓ１；−１０３５から−１００８）ｈＣＤ９５遺伝子における領域を更に描写している。移入分析からの結果から、ＨＳＶｔｋプロモーターのそれに類似した転写活性を有するＣＤ９５基底プロモーター（−４２５／−１−ＣＡＴ）についてみられるよりも、約３倍少ないレベルにＣＤ９５サイレンサーが転写を抑制することが暗示される。ＣＤ９５エンハンサーは、ＣＤ９５基底プロモーターからの転写を約２〜４倍、そしてＨＳＶｔｋプロモーターからの転写を約５〜１０倍、その細胞の型に依存して増大させる。更なる調節ポリヌクレオチドの描写が転写因子の同定と関連づけて以下に記載される。ｈＣＤ９５転写開始部位の決定プライマー伸長分析ジュルカット細胞、ラットの肺細胞、及びラットの小腸細胞からの全ＲＮＡが、コムツインスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサクチ（Ｓａｃｃｈｉ）、“ 酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出物によるＲＮＡ単離の単一工程法”、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ、１６２；１５６〜１５９貞、１９８７年に従って抽出された。その後の全工程は、ジエチルピロカーボネート処理したＨ₂Ｏを使って遂行された。プライマーアニーリングに関しては、１０μｇの全ＲＮＡが５ｐモルのγ−³²Ｐで標識されたプライマーＦＲ２５７（配列番号８、３×１０⁵ｃｐｍ）と一緒に、ハイブリッド化緩衝液（１５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．３、１ｍＭＥＤＴＡ）中で、１５μｌの全体積において６５℃で５分間保温され、そしてこの混合物はそれからゆっくりと１．５時間かけて、室温にまで冷やされた。この混合物に、３０μ ｌのプライマー伸長緩衝液〔３０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．３、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、８ｍＭＤＴＴ、０．２２ｍｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ、２２０μＭｄＮＴＰｓ、２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素(ＢＲＬ)〕が添加され、逆転写が４２℃で１時間行われた。それから、１０５μｌのＲＮＡse分解緩衝液〔２０μｇ／ｍｌのＤＮaseなしのＲＮaseＡ(ＢＲＬ)、１００μｇ／ｍｌの音波破砕したサケの精子ＤＮＡ(シグマ(Ｓｉｇｍａ))、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７.５、１ｍＭＥＤＴＡ〕が添加され、更にその後、３７℃で１５分間分解が行われた。３Ｍ酢酸ナトリウム１５μｌが添加され、試料がフェノール／ＣＨＣｌ₃で抽出された。そしてＤＮＡがエタノールで沈殿させられた。伸長産生物はホルムアミド充填緩衝液中に再懸濁させ、熱変性させ、そして６％塩基配列決定法用ゲル上で分離された。転写開始部位の同定ジュルカット細胞において、多重推定転写開始部位がｈＣＤ９５遺伝子上に− ５４から−１２８（図２Ａ，Ｂ、レーン１）までに群らがって同定された。これらは５’ＲＡＣＥＰＣＲを使ってヒトの脾臓で検出される（ベールマン（Ｂｅｈｒｍａｎ）等、“ヒトのＡＰＯ−１遺伝子の構造”、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３０５７〜３０６２頁、１９９４年）転写開始部位の大部分とマッチしている。実質上同じ伸長産生物がラットの肺（図２Ａ，Ｂ、レーン２）から抽出されたＲＮＡと一緒に得られ、ｈＣＤ９５に於けるＡＴＧを測定するプライマーＦＲ２５７（配列番号８）がラットのＣＤ９５ｍＲＮＡにハイブリッド化しうることを示しており、そして或る開始部位がヒトとラットのＣＤ９５遺伝子中で保護されていることを示唆している。ラットの小腸からのＲＮＡが使用されたときは、ジュルカット細胞やラットの肺には見られなかった更なる伸長産生物が得られた(図２Ａ，Ｂ、レーン３)。これらの新しい推定の開始部位の幾つかは、ヒトのＴ−細胞系統ＣＥＭ−６及びＭｏｌｔ−４（チェン（Ｃｈｅｎｇ）等、“ ヒトのファス遺伝子の特徴”、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１２３９〜１２４５頁、１９９５年）において、プライマー伸長分析をまた使用して同定されたｈＣＤ９５遺伝子開始部位に対して極く接近して存在する。調節ｈＣＤ９５ポリヌクレオチドに結合する転写因子の同定電気泳動移動度分析（ＥＭＳＡ）プロトコル核の抽出物が、抗生物質と５％牛胎児血清で補充されたＲＰＭＩ１６４０培地の中で生育されたジュルカット（ヒトのＴリンパ球細胞）とＭＰ−１（ヒトのＥＢＶ−転換Ｂ細胞）から調製された。また、これらはアンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）とフォーラー(Ｆａｌｌｅｒ)、“限定された数の哺乳類細胞からのＤＮＡ−結合蛋白質の抽出のための迅速な微量調製技術”、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１９巻９号、１９９１年の方法に従って、抗生物質と５％牛胎児血清で補充されたＤＭＥＭ培地中での１０％ＣＯ₂の下で生長したＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１（ＣＯＳ−７誘導体）及びＬ９２９（ネズミの線維芽細胞）から調製された。他に指示されなければ、結合反応は５μｇの核の抽出物（結合反応において４０ｍＭＮａＣｌの等しい添加を与えるように調整された)、１５０ｍＭ（又は１００ｍＭ）ＫＣｌ、２μｇの特異的でない競争体ＤＮＡ（指示されたようなポリ〔ｄ(１−Ｃ)〕又はポリ〔ｄ(Ａ−Ｔ)〕、１２％グリセロール、１２ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．９、４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、２０ｆモルの〔γ −³²Ｐ〕ＡＴＰ−標識プローブ（指示されるように２本鎖又は１本鎖）を含んだ。指定された量の競争体オリゴヌクレオチドが核の抽出物の添加前に加えられ、この反応が室温で３０分間保温された。３μｌの充填緩衝液（１２％グリセロール、１２ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．９、４ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９、１ｍＭＥＤＴＡＮ、１ｍＭジチオトレイトール、０．１％ブロモフェノールブルー）が添加され、この反応物は予備泳動された（１５０Ｖで２時間）非変性４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド、３０：１）上に充填されていた。このゲルは５０ｎＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、３８０ｍＭグリシン、２ｍＭＥＤＴＡ中て１５０Ｖ（一定圧力）において、水冷しながら泳動された。ゲルは乾燥され１〜４日間オートラジオグラフにかけられた。この分析及びその変形は、“標準ＥＭＳＡ分析プロトコル”としてこれに言及されている。ｈＣＤ９５エンハンサー領域に結合する転写因子の同定Ｅ１２本鎖プローブ（Ｅ１プローブ、配列番号１１）とジュルカット細胞の核の抽出物を用いたＥＭＳＡ分析から、配列番号５で同定され、Ｅ１中に存在する、ヘキサマーの転化された繰返しヌクレオチドが核の因子の配列の特異的な結合を仲介することが明らかになった。実験結果が図３に示されている。ここにおいて転写因子として呼ばれる、核の因子とともに形成された明瞭なＤＮＡ／ポリヌクレオチド複合体が、矢と矢じりで印されている。配列番号５として同定されるエンハンサー領域ヘキサマーの転化した繰返し（ＩＲ２）に結合する転写因子がまた、ネズミのＬ９２９細胞や、ＨｅＬａ、ＭＰ−１、ＣＯＳ−７を含む他の霊長類動物やげっ歯類動物の細胞やラットの真皮乳頭（γＤＰ）細胞中にも存在する。野性型エンハンサープローブ（配列番号１、図３を参照）と一緒にＥＭＳＡ分析において、それぞれのレーン（配列番号１１の誘導体）の上に指し示された１本鎖ヌクレオチド置換を含む５０倍モル過剰の２本鎖競争体オリゴヌクレオチドを使った、配列番号５として同定されるエンハンサー領域ヘキサマーの転化された繰返しの突然変異体の選択は結合に関して個々のヌクレオチドの重要性を確認しており、そして配列番号３において同定される変質ＥｌコンセンサスモチーフをｈＣＤ９５エンハンサー領域（Ｅｌ）結合部位として定義している。ＥＭＳＡ分析においてネズミのＬ９２９細胞からの核の抽出物を使って、エンハンサー領域結合部位ＩＲ２複合体とは異った、新しいＤＮＡ／ポリペプチド複合体の配列特異の形成が、１ｂｐ（ＩＲ１；配列番号４）と４ｂｐ（ＩＲ４；配列番号６）によって間隔をあけたエンハンサー領域配列モチーフでもって論証された。実験結果が図４に示されている。エンハンサープローブ（ＩＲ２；配列番号１１）を含む、ヘキサマーの転化した繰返し（配列番号５）に結合する核の転写因子によって形成される複合体が矢及び矢じりによって印されている。開いた矢じりは、エンハンサー領域の間隔をとった誘導体（ＩＲ１；配列番号４とＩＲ４；配列番号６）によって形成される複合体の存在を示している。エンハンサー領域ＩＲ１，ＩＲ２及びＩＲ４要素は、配列特異の方法においてそれぞれのＤＮＡ／ポリペプチド複合体の形成に関して交叉競争した。これらの結果は、同じＣＤ９５エンハンサー領域結合モチーフであると認識されるか異なった間隔をあける要件を有する関連した転写因子のファミリーの存在を示唆している。コンカタマー化されたエンハンサー（配列番号１１）配列が、シング（Ｓｉｎｇｈ）等、“認識部位プローブを使った配列特異のＤＮＡ結合蛋白質の分子クローニング”、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７(３)、２５２〜２６１頁（１９８９年）に発表された方法に従って、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを選択するためのプローブとして使用された。ＨｅＬａ発現ライブラリーを選択するために一本鎖３ｘＥ１（３ｘ配列番号１１）プローブを使って、以下のようなＤＮＡ−結合蛋白質をコード化するクローンが単離された；ヒトのＹＢ−１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０)；及びヒトのｈｎＲＮＰＤ(ＥＭＢＬ受託番号Ｄ５５６７２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１０１及びＱ１４１０３)。ｈＣＤ９５サイレンサー領域に結合する転写因子の同定新規なＤＮＡ／ポリペプチド複合体が、サイレンサー領域プローフ（配列番号２）を用いて、そしてＥＭＳＡ分析において非特異性の競争体ＤＮＡとしてポリｄＩｄＣの替りにポリｄＡｄＴを用いるときにはエンハンサー領域ＩＲ２プローブ（配列番号１１）を用いて形成された。その結果が、図５にレーンの上に示されたサイレンサープローブの同定と新規な複合体を指し示す二つの矢じりとともに示されている。この因子はまた、一本鎖のサイレンサープローブに結合し、或いは一本鎖のサイレンサー及びエンハンサープローブによって競争させられた。更に、ＥＭＳＡ分析が、配列番号２と１４〜１８を有するサイレンサープローブを用いて、図６に説明されている。それぞれのＤＮＡ／ポリペプチド複合体が、サイレンサー領域ヘプタマー配列を含む一本鎖サイレンサー領域プローブ（配列番号１２）と共に形成され、このプローブの補充物（配列番号１３）と共に形成されたのではないことから、Ｓ１とＥ１領域における同一のコピー中に存在するサイレンサー領域ヘプタマーモチーフ（配列番号７又は３６）が転写因子との相互作用を仲介すると思われる。サイレンサー領域にヘプタマーモチーフの中断を有し、配列番号１５〜１８において同定される、全ヘプタマーモチーフより少なく含む両ＤＮＡ鎖からのサイレンサー領域プローブが野性型Ｓ１プローブと複合体形成を争う能力に関して非常におとろえたことを示した。コンカタマー化されたサイレンサー（配列番号２）配列が、シング等、“認識部位プローブを使った配列特異のＤＮＡ結合蛋白質の分子クローニング”、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７(３)、２５２〜２６１頁（１９８９年）に発表された方法に従って、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを選択するためのプローブとして使用された。ＨｅＬａ及びラットの真皮乳頭発現ライブラリーを選択するための一本鎖３ＸＳ１（３ｘ配列番号２）プローブを用いて、以下のようなＤＮＡ−結合蛋白質をコード化するクローンが単離された：ヒトのＹＢ−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０）；ラットのＹＢ −１(ＥＭＢＬ受託番号Ｍ５７２９９；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ２２５６８)；ラットのＰｕｒα(配列番号：３８，３９，４１及び４２)；及び新規なラットＰｕｒαのような蛋白質(配列番号４０と４３)。ＹＢ−１がＣＤ９５サイレンサー複合体の成分であることを確認するために、マクドナルド（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ）等、“転写調節蛋白質、ＹＢ−１がＤＲＡプロモーターにおける一本鎖領域をプロモートする”、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ .，２７０(８)：３５２７〜３５３３頁（１９９５年）に記載のスーパー・シフト手法を使って、ＹＢ−１抗体が核の抽出物とサイレンサー調節配列（配列番号２）とともに保温された。この抗体と一緒にした保温は、ＹＢ−１がサイレンサー複合体の成分であることを示すスーパー・シフトを引き起こした。ＵＶ架橋によるサイレンサー／エンハンサー領域に関する転写因子の特徴ＵＶ架橋がミヤモト(Ｍｉｙａｍｏｔｏ)等、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２５４、６３３〜６４１頁（１９９５年）に記載されているように、本質的に遂行された。長さにおいて４４と２８の塩基のオリゴヌクレオチドが、上記のＥＭＳＡ反応におけるように末端標識をつけられた。二本鎖ＤＮＡプローブが、末端標識をつけたオリゴヌクレオチドをアニーリングし、且つ〔γ−³²Ｐ〕ｄＡＴＰ、〔γ−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ、〔γ−³²Ｐ〕ｄＧＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及びクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）(ミヤモト等(１９９５年)）を用いる５−ブロモ− ２’ｄＵＴＰで充填することによって調製された。標準ＥＭＳＡ結合反応が平底微量滴定プレートにおいて４０ｍｌの全体積中で、４０ｆｍｏｌのプローブと１０μｇの核抽出物＋／−４ｐｍｏｌの競争体ＤＮＡでもって行われた。このプレートをサランナップで覆い、氷の上に置いた。この反応物が、照明器具が微量滴定プレートから５ｃｍ以内にあるように、３０５ｎｍのＵＶトランスイルミネーターを逆にすることによって６０分間照射された。この反応物はそれから２つに分割された。１つのアリコートが前述の４％非変性ゲル上で泳動され、そして第２のアリコートが¹⁴Ｃで標識を付けたプロテイン・マーカーと一緒に１０％減じたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動された。このゲルは乾燥され、それから１〜３日間、強化スクリーンのついたオートラジオグラフィーを施された。末端標識を付けた一本鎖Ｓ１プローブ（配列番号２）を使った図７Ｂに示されたＵＶ−架橋分析の結果から、ジュルカット及びＬ９２９細胞中の約４７，７７及び１００ｋＤａの架橋したＤＮＡ／ポリペプチド複合体の存在が明らかにされた。１本鎖のＳ１プローブ（配列番号２）をもったジュルカット細胞核抽出物のサウスウエスターンブロットをプローブした結果から、４７ｋＤａ及び１００ｋＤａ複合体は単一核蛋白質に対応することが示唆された。図７Ａに示される、２本鎖Ｅｌプローブ（配列番号１）とのＵＶ−架橋から、Ｌ９２９細胞中に約５９ｋＤａ、１１３ｋＤａの架橋したＤＮＡ／ポリペプチド複合体と、約２００〜３００ｋＤａの高分子複合体の存在が明らかにされた。サウスウエスターン分析によるサイレンサー／エンハンサー領域の転写因子の特徴づけ上記のように調製された、ジュルカット、Ｌ９２９及びラットの真皮乳頭（γ ＤＰ）細胞からの核の抽出物２０〜４０μｇが、¹⁴Ｃで標識を付けたプロテイン・マーカーでもって、８〜１０％減じたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけられた。このゲルは、リー(Ｌｉ)、Ｍ．とデシデリオ(Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ)、Ｓ.，付録１、“転写因子：実際的なアプローチ”（Ｄ．Ｓ．ラッチマン(Ｌａｔｃｈｍａｎ)、編集）ＩＲＬプレス、オクスフォード、１８７〜１９６頁（１９９３年）に記載されているように、０．２ｍｍのニトロセルロース・フィルターにエレクトロブロットするに先立ってトランスファ緩衝液に予め浸された。ニトロセルロース・フィルターは２．５％（ｗ／ｖ）乾燥ミルクパウダー、２５ｍＭＨｅｐｅｓ(ｐＨ８)、１ｍＭＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ中で４℃ １８時間、ブロックされた。これらのフィルターは、ＳＷ−結合緩衝液(１２％（ｖ／ｖ）グリセロール、１２ｍＭＨｅｐｅｓ(ｐＨ８)、４ｍＭＴｒｉｓ− ＨＣｌ(ｐＨ８)、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＫＣｌ)、１ｐｍｏｌ／ｍｌ³²Ｐで標識を付けたＤＮＡプローブ(上記のように末端標識された、又は充填された)、１０μｇ／ｍｌ非特異的競争体ＤＮＡ(即ち、ポリ〔ｄｌ−ｄＣ〕又はポリ〔ｄＡ−ｄＴ〕)及び＋／−１００ｐｍｏｌ／ｍｌ競争体ＤＮＡ中で、６０分室温においてハイブリッド化された。これらのフィルターは、増感スクリーンと一緒に３日間オートラジオグラフィーにかける前に４℃で４×７分間ＳＷ−結合緩衝液で洗浄された。二本鎖エンハンサー・プローブ（配列番号１１）を使った、ジュルカットとｒＤＰの核の抽出物についてのサウスウエスターン分析結果が図８Ａに図示される。これらの結果は、２本鎖エンハンサープローブが結合する約５９ｋＤａ（ｒＤＰ）と１１３ｋＤａ(ジュルカットとｒＤＰ)の分子量を有する蛋白種の存在を立証している。１本鎖サイレンサープローブ（配列番号２）を使った、ジュルカットの核の抽出物についてのサウスウエスターン分析の結果が図８Ｂに図示される。これらの結果は１本線サイレンサープローブが結合する、約４７ｋＤａ及び１００ｋＤａの分子量を有する蛋白質種の存在を立証している。これらの蛋白質へのサイレンサープローブの結合は、プローブ鎖に補完的な、ヘプタマー（配列番号７）−含有競争体（配列番号１２）(プローブ鎖に対応する同等の競争体（配列番号１３）ではない)の存在下では非常に減じられるか、又は存在しない。これらのサウスウエスターンの結果は、上記のプローブと競争体について得られたＵＶ−架橋及びＥＭＳＡの結果と矛盾しない。転写因子の機能的分析ＣＤ９５サイレンサー(配列番号２)、エンハンサー（配列番号１１）及びプロモーター断片（配列番号２７）がレポーター・プラスミドｐＢＬＣＡＴ８⁺中で、ＨＳＶｔｋプロモーターとＣＡＴ遺伝子の前でクローン化された。ＹＢ−１、Ｐｕｒα、Ｐｕｒαのような、及びｈｎＲＮＰＤ蛋白質をコード化する構造物がベクターｐＣＤＮＡ３にクローン化された。これらの構造物は、ＣＤ９５プロモーター−ＣＡＴレポーター構造物の両方とともにＨｅＬａ細胞において過剰発現された。センスＹＢ−１の過剰発現がＣＤ９５プロモーターの転写を７倍抑制し、アンチセンスＹＢ−１の発現はＣＤ９５プロモーターの転写を２倍増強した。センスＰｕｒαの過剰発現は、ＣＤ９５プロモーターの転写を４倍抑制し、アンチセンスＰｕｒαの発現はＣＤ９５プロモーターの転写を１．５倍増強した。このことは、ＹＢ−１とＰｕｒαの両方かインビボにおいてＣＤ９５プロモーターの抑制に役割を演じていることを示唆している。ｈｎＲＮＰＤ蛋白質をコード化する構造物も、ベクターｐＣＤＮＡ３中でクローン化された。この構造物は、上記したＣＤ９５プロモーター−ＣＡＴレポーター構造物とともにＨｅＬａ細胞中で過剰発現された。サイレンサー／ＤＮＡとエンハンサー／ＤＮＡ複合体のＥＭＳＡ分析上記のプロトコルを使ったＥＭＳＡゲル移動度分析がサイレンサー／ＤＮＡ（配列番号２）及びエンハンサー／ＤＮＡ（配列番号１１）複合体の幾つかの特徴を決定した。サイレンサー／ＤＮＡ及びエンハンサー／ＤＮＡ複合体の半減期は、約１時間である。エンハンサー／ＤＮＡ複合体は３００ｍＭ未満のＫＣｌ中においてのみ安定であり、そしてエンハンサー／ＤＮＡ複合体の形成には二価のカチオンの存在が必要であった。３０％のサイレンサー／ＤＮＡ複合体が２ＭＫＣｌ中において安定であった。サイレンサー／ＤＮＡ複合体の形成には、二価のカチオンの存在が必要でなかった。そして、サイレンサー／ＤＮＡ錯体は、ＡＴＰ依存蛋白質を含んでいる。これらの実験結果は、サイレンサー／ＤＮＡ複合体は非常に安定であり、そしてエンハンサー／ＤＮＡ複合体は遙かに、安定性に乏しいことを示す。このことは、予想されるインビボ活性と矛盾していない。即ち、サイレンサー／ＤＮＡ複合体は、殆どの時間、形成されＣＤ９５の発現が抑制される。ＡＴＰ依存性は、転写因子が結合する一本鎖立体配座を提供するように、ＣＤ９５サイレンサー調節領域をほぐす（ｕｎｗｉｎｄ）ためにＡＴＰが使用されることを示唆している。ｈＣＤ９５サイレンサー及びエンハンサー領域のプロモータ関連とは独立した機能の論証ＣＤ９５エンハンサー結合部位配列ＩＲ１(配列番号４)、ＩＲ２ (配列番号１１)、変異したＩＲ２(配列番号１９)、及びＩＲ４（配列番号６）が、レポータープラスミドｐＢＬＣＡＴ８⁺において、ＨＳＶ tkプロモーター及びＣＡＴ遺伝子の前で、上流のサイレンサー領域（配列番号２）を伴って、又は伴わないで、クローン化された。Ｓ１／ｍＩＲ２−tk−ＣＡＴ構造物はｍＩＲ２領域に追加の塩基を有し、配列番号３５に於いて記述される。レポーター構造物及び、ＨｅＬａ（Ｂ）及びＣＯＳ−７（Ｃ）細胞へのこれらのＣＡＴレポーター構造物の一時的導入検定の結果が、図９に示されている。この実験結果は、ＩＲ１，ＩＲ２及びＩＲ４におけるエンハンサー領域要素が、サイレンサー領域ポリヌクレオチドの存在下ではなく、その不存在下においてだけ、異形のプロモーターからいろいろの程度に転写を自発的に増強したことを示している。そして、このことは、同定されたサイレンサー及びエンハンサーポリヌクレオチド配列のインビボの機能性を論証している。ここで参照した全ての文献および他のマテリアルは、その全体において参照して本明細書の記載の一部となす。以上の本明細書において本発明が、いくつかの好ましい実施態様に関係して記載されており、また多くの詳細な説明が図示の目的で記述されているけれども、本発明が更なる他の実施態様についても適用可能であり、且つここに詳細に記載された事項は、本発明の基本原理から離れることなしに、種々変更されうることは当業者にとって明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/705 // Ｃ０７Ｋ 14/705 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１−６，１１，１２，１４，３６及び３７からなるグループから選ばれる単離されたポリヌクレオチド。２．請求項１のポリヌクレオチドに対し少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。３．ｃＤＮＡ分子である請求項２のポリヌクレオチド。４．ゲノムＤＮＡ分子である請求項２のポリヌクレオチド。５．全体的に又は部分的に化学合成されたポリヌクレオチドである請求項２のポリヌクレオチド。６．アンチセンス配向している請求項２のポリヌクレオチド。７．ポリペプチド転写因子に結合してＣＤ９５遺伝子の転写を調節する複合体を形成できる請求項２のポリヌクレオチド。８．請求項１のポリヌクレオチドの任意の８ヌクレオチド隣接部分に対し少なくとも９０％の同一性を有するＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド。９．５ヌクレオチド又はそれより少ない置換、欠失又は付加によって請求項１のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド。１０．請求項２のポリヌクレオチドとともにＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成できる、単離されたポリペプチド転写因子。１１．転写因子とＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を調節できる、単離されたポリヌクレオチド。１２．転写因子と、約４７、７７又は１００ｋＤａの分子量を有するＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってそのＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を抑制できる、請求項１１による単離されたポリヌクレオチド。１３．転写因子と、約５９、１１３又は２００〜３００ｋＤａの分子量を有するＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってそのＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を増強できる、請求項１１による単離されたポリヌクレオチド。１４.ポリヌクレオチドとＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってそのＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を調節する、単離された転写因子。１５．ポリヌクレオチドと、約４７、７７又は１１０ｋＤａの分子量を有するＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってそのＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を抑制できる請求項１４の単離された転写因子。１６．ポリヌクレオチドと、約５９、１１３又は２００〜３００ｋＤａの分子量を有するＤＮＡ／ポリペプチド複合体を形成でき、それによってそのＤＮＡ／ポリペプチド複合体がＣＤ９５遺伝子のコードする部分の転写を増強できる請求項１４の単離された転写因子。１７．配列番号３８、３９及び４０からなる群から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。１８．請求項１７のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチド。１９．配列番号４１、４２又は４３において同定されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。２０．請求項２又は１８のＤＮＡ配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。２１．ヒトＹＢ−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｐ１６９９０）の低温ショック領域に対し少なくとも９５％の同一性を有する低温ショック領域を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することを含んでなるアポトーシスによる細胞死を調節する方法。２２．ヒトＰｕｒα（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ９６６８４：ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ００５７７）に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することを含んでなるアポトーシスによる細胞死を調節する方法。２３．請求項１８のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することを含んでなるアポトーシスによる細胞死を調節する方法。２４．ヒトｈｎＲＮＰＤ（ＥＭＢＬ受託番号Ｄ５５６７２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１０１及びＱ１４１０３）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドと結合するのを調節することを含んでなるアポトーシスによる細胞死を調節する方法。２５．ヒトＹＢ−１（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ２４０７０；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番ＵＰ１６９９０）の低温ショック領域に対し少なくとも９５％の同一性を有する低温ショック領域を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することによってＣＤ９５発現を調節する方法。２６．ヒトＰｕｒα（ＥＭＢＬ受託番号Ｍ９６６８４；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ００５７７）に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することによってＣＤ９５発現を調節する方法。２７．請求項１８のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドに対し少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することによってＣＤ９５発現を調節する方法。２８．ヒトｈｎＲＮＰＤ（ＥＭＢＬ受託番号Ｄ５５６７２；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号Ｑ１４１０１とＱ１４１０３）に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドが、請求項２のポリヌクレオチドに結合するのを調節することによってＣＤ９５発現を調節する方法。