JP2000516085A

JP2000516085A - 超気門（Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）阻害剤のためのスクリーン

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Publication number: JP2000516085A
Application number: JP09543090A
Authority: JP
Inventors: エヌ．ハインリッヒ，ジュリア; クルッツ，フェルナンドデラ; キルシュ，ドナルド，アール．
Original assignee: アメリカンシアナミドコンパニー
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2000-12-05
Also published as: EP0912896A4; EP0912896A1; WO1997045737A1; CA2257110A1

Abstract

(57)【要約】本発明は「オーファン」核受容体（つまり、天然のリガンドが知られていない受容体）の阻害剤の同定に関する。本発明はキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の超気門（Ultraspiracle）蛋白質(Usp)と、他の昆虫の種の相同物に関する。本発明は化合物、異型核蛋白質、Usp機能を阻害する他の補助蛋白質の確認方法を提供する。Usp阻害化合物は殺虫剤として有用であり、殺虫剤の開発のための主要化合物である。

Description

【発明の詳細な説明】超気門（Ultraspiracle）阻害剤のためのスクリーン発明の分野本発明は「オーファン」核受容体（“orphan”nuclear receptors）(つまり、天然のリガンドが知られていない受容体)の阻害剤の同定に関する。本発明はキイロシヨウジヨウバエ（Drosophila melanogaster）の超気門（Ultraspiracle）蛋白質(Usp)と、他の昆虫の種の相同物に関する。本発明は化合物、異型核蛋白質、Usp機能を阻害する他の補助蛋白質の確認方法を提供する。Usp阻害化合物は殺虫剤として有用であり、殺虫剤の開発のための主要化合物である。発明の背景キイロシヨウジヨウバエの超気門(Usp)遺伝子はハエの発生の間中必要とされる蛋白質をコードする（Oroら、Develop．115:449，1992）。Usp遺伝子は1齢期と2齢期の間の脱皮期に死んだ変異体の表現型によって最初に確認され、この虫は2組の気門を持っていた（Perrimonら、Genetics 111:23,1985）。この変異体の行動はUspが変態及び成虫原基形成のエクジソン（ecdysone;Ec）反応経路で機能することを示した。その後、Uspがメスの生殖と眼の形態形成でも機能し、ハエのEcに依存する過程及び、Ecに依存しない過程に関与する可能性のあることが発見されている(ガレンら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 74:5099，1977;セグレブス、Rec.Prog.Horm.Res．49:167，1994)。 Usp遺伝子のクローニングによりUspと脊椎動物のレチノイン酸X受容体(RTRs )に配列の相同性があることが分った（DNA結合ドメインに80％の同一性があり、ホルモン結合ドメインには49％の同一性がある）（Henrichら、Nuc.Acids.Res．18; 4143，1990;Sheaら、Genes Dev．4:1128,1990;Oroら、Nature 347:298，1990 ）。この関係はUspの以下の特性の解明へとつながった。(i)Uspは脊椎動物の核受容体の甲状腺ホルモン受容体(TR)、ビタミンＤ受容体(VDR)、ペルオキシソーム増殖活性受容体（PPAR）を二量化するRXRの代わりに機能的に用いることができる(Yaoら、Cell 71:63,1992);(ii)U spはレチノイン酸リガンドと結合や反応することができない（Yao、1992、上述）。(iii)Uspはエクジソン受容体（EcR）と共に異型二量化するので、EcRにエクジソン反応を媒介する能力を与える（Oroら、Develop.115:449，1992，Yaoら、C ell 71:63，1992,Yaoら、Nature 366:476，1993）；(iv)EcR/Usp複合体のエクジソン反応を媒介する能力は、キイロシヨウジヨウバエの他の３つのホルモンオーファン受容体（DHRs）,つまりDHR78,DHR38及びsevenup(svc)によるものである(Z elhofら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10477，1995，Zelhofら、Mol．Cell.Biol ．15:6736，1995，スザーランドら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7966,1995)；( v)DHR38はEcRと競争してUspと共に異型二量化するので、EcR/Usp異型二量体の解離を促進する(Sutherlandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7966,1995)。これらの特性はUsp-RXRシステムが進化的に保護されてきたことと、UspはRXRと同様に異型二量化を多重信号変換経路の機能を調整する機構として使うことができるし、UspとRXRは機能的に別個であることを示す。これらのUspの特性はUspが殺虫剤の重要な目標であることを当然意味する。特に、Uspの昆虫の発生における役割とUspと脊椎動物のRXR蛋白質の違いは、Uspが昆虫の成長制御物質(IGRs)として働き、環境的に安全な化合物の目標となるものであることを意味する（Graf、Parasitology Today 9:471，1993）。したがって、Uspの機能を選択的に阻害する化合物を確認するために有用な合成と方法の技術が必要である。発明の要約本発明は、「オーファン」核受容体の転写活性の媒介物、つまり天然のリガンドが確認されていない受容体の確認方法を提供する。ある面で、本発明はキイロシヨウジヨウバエの超気門蛋白質(Usp)の機能を阻害する化合物を確認するための方法を提供する。その方法は以下を含む： (i)(a)Usp結合パートナーと、 (b)結合パートナーとの機能的複合体を形成することができるUspあるいはその誘導体と、 (c)レポーター遺伝子の発現がUsp-Usp結合パートナー複合体を必要とするレポーター遺伝子と、を含む形質転換した酵母菌細胞を提供し、（ii）テスト化合物の存在下で、形質転換した酵母菌細胞を定温培養してテスト培養を形成し、テスト化合物がない時に対照標準を形成し、（iii）テスト培養と対照標準培養のレポーター遺伝子の発現を観察し、 (iv)対照標準培養と比較してテスト培養の中のレポーター遺伝子の発現を観察できる程度に減らすUspの何らかの化合物の機能を阻害する化合物として明らかにする。好ましい態様においては、UspとmAR/EcR-CDEFを含むUsp結合パートナーを発現するS．cerevisiae細胞を提供する。この細胞はアルギニンパーミアーゼ（CAN1 遺伝子生成物）をコードするDNAに機能的に結合したエクジソン反応要素を含むレポーター遺伝子も含んでいる。そのレポーター遺伝子はUspとmAR/EcR-CDEF間の機能的複合体があるときのみ転写的に活性化され、その結果その細胞はCAN1を発現し、カナバニン（アルギニン類似物）の毒性（成長阻害）作用に影響されやすい。細胞がUsp阻害化合物にさらされる場合、レポーター遺伝子の転写的活性化は止まり、CAN1はもはや発現されず、その細胞はカナバニンの存在下で成長できる。このように、多くの化合物は高処理量の方法でUsp阻害活性のためにスクリーニングできる。一般に、核受容体の転写的活性モジュレーターは、本発明にしたがって受容体とそれと共に異型二量体を形成する結合パートナーとが接触することによって確認されるが、異型二量体はホルモンとは独立して、よく知られたDNA反応要素と相互作用し、その要素を転写的に活性化する。適切なレポーター遺伝子の転写的活性を検査することで、モジュレーターの別個のクラス（例えば化合物、異型受容体、補助蛋白質）が確認できる。図の簡単な説明図１は天然及び組換え核受容体、つまり超気門蛋白質（Usp）、エクジソン受容体(EcR)、咄乳類アンドロゲン受容体（mAR）、アミノ末端を切ったEcRΔA/B、組換キメラの略図である。組換蛋白質は機能的ドメインAからFの標準名称に従って記述され、ドメインCにより配列される。図２は本発明によるUsp阻害剤を確認するための方法の略図である。can1酵母菌株は、3つのプラスミドを含む：エクジソン反応要素（EcRE₂）抑制下でYepcUs pがUspを発現する；YEpmAR/EcR-CDEFがmRA/EcR-CDEFを発現すると、YEpCAN1がカナバニンパーミアーゼ(CAN1)を発現する。図の左手には、UspとmRA/EcR-CDEFの共発現がCAN1の発現となり、カナバニンによる成長抑制を示す。図の右手には、 Uspの阻害剤(I)がカナバニンパーミアーゼの遺伝子発現を阻害し、カナバニンの存在下でも成長可能であることを示す。発明の詳細な説明本発明はキイロシヨウジヨウバエの超気門蛋白質(Usp)の機能を阻害する化合物並びに他の昆虫の種のUsp相同物を確認するための方法と構成を含む。好ましい方法では、(a)Usp結合パートナーと、(b)結合パートナーとの機能的複合体を形成することができるUspあるいはその誘導体と、(c)レポーター遺伝子の発現が Usp-Usp結合パートナー複合体を必要とするレポーター遺伝子と、を含む酵母菌細胞を提供する。酵母菌細胞はUsp機能を阻害する能力を評価するようにテスト化合物がない時に培養され、結果として生ずる培養菌はレポーター遺伝子の発現のために監視される。Usp阻害化合物は、対照培養物（処理されていない培養物と野生型培養物を含む）と比較して、これらの化合物が処理された培養物中のレポーター遺伝子発現を減らしていることが確認される。本発明の方法は、受容体の天然リガンドがわからないとき（つまり‘オーファン’受容体）であっても、核ホルモン受容体の機能を阻害する化合物を確認するのに使うことができる。このことは細胞、好ましくは酵母菌細胞を使うことで達成される。この酵母菌細胞は受容体と適切なレポーター遺伝子を発現し、酵母菌細胞中ではレポーター遺伝子がリガンドと無関係な方法で受容体によって転写的に活性化される。レポーター遺伝子のリガンドに無関係な転写活性に達することが必要な場合、受容体の異型二量化結合パートナーが同じ細胞内で共に発現される。 Uspは1527ヌクレオチドのオープンリーディングフレームによりコードされ、5 5,252ダルトンの分子量を持つ508のアミノ酸からなるポリペプチドである（Henrichら、Nuc.Acids.Res．18:4143，1990,Sheaら、Genes Dev．4:1128 ，1990，Oroら、Nature,347:298，1990）。UspはA/B(transactivation)ドメイン、C（DNA結合/二量化/transactivation）ドメイン、Ｄ（核移行）ドメイン、E（二量化）ドメインを含む核ステロイド受容体族に典型的な明確なドメイン構造を有する。本発明の実施において、Usp誘導体はUsp結合パートナーと共に機能的複合体を形成できるように用いられる。ここで用いる「機能的Usp-Usp結合体パートナー複合体」は同種のDNA転写的活性配列（Usp結合パートナーによって指定される）と生産的に影響し合う複合体である。有用なUsp誘導体は1又は２以上のアミノ酸が野生型配列に付加又は欠失しているか、1又は２以上のアミノ酸が機能的Usp-Uspパートナー複合体形成に影響しない別のアミノ酸に置き換わっているポリペプチドを含むUsp-Usp結合を含む。さらに、本発明の方法は、Usp変異体や誘導体が機能的Usp‐Usp結合パートナー複合体形成能力を保持していることを確認するためにスクリーニングするのに使用できる。 Usp結合パートナーあるいはオーファン受容体はUspあるいは他のオーファン受容体と機能的複合体を形成する天然及び組換えポリペピチドを含む。本発明によると、Usp結合パートナーはエクジソン受容体を無制限に含み、エクジソン受容体はEcR-A,EcR-B1,EcR-B2の3つの異形体（isoform）（Koelleら、Cell 67:59，1 990，タルボットら、Cell 73:1323，1993）と、脊椎動物受容体のTR，VDR，PPAR (Yaoら、Cell 71:63，1992)を含む。有用な結合パートナー誘導体は1又は２以上のアミノ酸が野生型配列に付加あるいは欠失している、あるいは1又は２以上のアミノ酸が機能的Usp-Usp結合パートナー複合体の形成に影響を与えない別のアミノ酸で置き換わっている構造を含む。異なる核受容体蛋白質間のキメラ、たとえばUspなどと結合するキイロシヨウジヨウバエ核蛋白質、ステロイド受容体ポリペプチド族のキイロシヨウジヨウバエでない核受容体蛋白質も含まれる。好ましい態様で、Usp結合パートナーはキメラを含み、キメラは哺乳類アンドロゲン受容体のA/Bドメインと、EcRのC、D、E、Fドメインを含んでいる。本発明を実施するのに有用なレポーター遺伝子は(i)Usp-Usp結合パートナーによって転写的に活性化される遺伝子と、(ii)酵母菌中での発現が簡単に検出できる遺伝子と、を含む。典型的には、1つのレポーター遺伝子は少なくとも操作的に互いに連結する2つのDNA配列構成要素で、(i)プロモーター要素と使用される特定Usp-Usp結合パートナー複合体と反応する要素を含む5'調節領域と、( ii)レポーターポリペプチドをコードする3'蛋白コード領域を有する。これら2つの配列構成要素は付加的に蛋白質合成の開始の役割を果たす配列を含むメッセンジャーRNAの5'非翻訳領域をコードする配列によって分けられる。更に、レポーターポリペプチドの蛋白コード配列はそのポリアデニル化コンセンサス配列、転写終止配列などによる3'末端上の側面に位置する。適切な調節領域の例にはエクジソン反応要素(ERE)、アンドロゲン反応要素(AR E)、ビタミンＤ反応要素(VRER)、レチノイン酸反応要素(RRE)，甲状腺ホルモン反応要素(THRE)，雛鳥のオバルブミン生産段階の転写因子反応要素(C0UP-TE)、ペルオキシソーム増加活性化反応要素(PPAP-RE)が無制限に含まれる。特定の反応要素配列は、結果として生ずる反応要素配列が全体として使われる特定のUsp- Usp結合パートナー複合体により転写的に活性化されるレポーター遺伝子に受容力を与える、つまりレポーター遺伝子が機能的反応要素を有する間は、切り詰められたり、多重結合したり、他の反応要素と結合したり、突然変異を起こしたり、電子対を共有して（convalently）変化したり、レポーターコード化配列の上の方に様々な距離で配列したり、その他操作されている可能性のあることが理解されよう（Mangelsdorfら、Cell 83:841,1995，Danaら、Mol.Endocrinol.8:1193 ,1994）。適切なレポーターポリペプチドの例には大腸菌E.Coli(LacZ)から由来するβ− ガラクトシダーゼ、S.cerevisiae(CAN1)から由来するアルキニンパーミアーゼ、 URA3，LEU2，LYS2，HIS3，HIS4，TRP1，ARG4遺伝子の生成物のようなヌクレオシドとアミノ酸代謝に含まれるポリペプチド、ヒグロマイシン、ツニカマイシン、シクロヘキシミドのような薬剤への抵抗力を与えるポリペプチドや緑色蛍光蛋白質（GFP）が無制限に含まれる（Guthrieら、Meth．Enzymol.Vol.194，1991，プラシェア、Trends Gen.11:320，1995）。レポーター遺伝子の発現（つまり、レポーターポリペプチド合成で表わされるように）は、酵素によるアッセイ、成長アッセイ、免疫学的アッセイ、リガンド結合アッセイ、薬剤耐性アッセイ、蛍光アッセイなどを含む技術的に知られている手段を使って検出できる。好ましくは機能的Usp-Usp結合パートナー複合体がないとき、レポーター遺伝子の転写が起こるが、そのレベルは使われたアッセイ中で検出できないほど低いか、あるいはUsp-Usp結合パートナー複合体があるとき起こる転写からのアッセイが簡単に識別できるか、のどちらかである。Usp-Usp結合パートナー複合体があるときのレポーター遺伝子発現は形質転換した酵母菌細胞にプラスとマイナスの特性を与える。好ましい態様では機能的Usp-Usp結合パートナー複合体と適切なレポーター遺伝子の両方を有する酵母菌は貧弱な生長を示し、生長はUsp機能阻害剤があるとき回復する。本発明の実施において、分子生物学、微生物学、組換えDNA、蛋白生化学における多くの伝統的技術が用いられている。このような技術はよく知られており、例えばサンブルックら、1989、分子クローニング：実験マニュアル、第2刷、Col d Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，DNAクローニング：実際的アプローチ、IとII巻、1985(D.N.Glover編集)、オリゴヌクレオチド合成、1984(M.L.Gate編集)、転写と翻訳、１９８４（HamesとHiggins編集）、分子クローニングの実際的ガイド、シリーズ、酵素における方法(Academic Press，Inc.)、蛋白精製:原理と実際、第2刷(Spring-Verlag，N.Y.)に十分に説明されている。本発明の実施において、適切な組換えクローニングベクターがUsp-Usp結合パートナート同様、レポーター遺伝子を含むDNA配列をコードするDNA配列に導入するために用いられる。このようなベクターは多くの場合クローニングや遺伝子発現の複製システムを、例えば非栄養要求性や抗生物質耐性など、1又は２以上のホストの選択マーカー、及び1又は２以上の発現カセット（expression cassette s）を含むだろう。挿入された配列は標準的方法で合成されるか、あるいは自然の供給源から隔離される。適切なベクターは無制限にYEpとVIpベクターを含む（ Hillら、Yeast 2:163，1986）。酵母菌プロモーターの無制限の例はメタロチオネインプロモーター(CUPI)、トリオス燐酸デヒドロゲナーゼプロモーター(TDH3)、グリセリン酸-3-燐酸キナーゼプロモーター( PGK)、グリセルアルデヒド-3-燐酸脱水素酵素(GAPDH)プロモーター、ガラクトキナーゼプロモーター（PGK）、ガラクトースエピメラーゼプロモーター（galacto epimerase promoter）、アルコール脱水素酵素(ADH)プロモーターを含む。ホストの酵母菌細胞は燐酸カルシウム、リチウム塩、電気穿孔法、スフェロプラス形成を用いる無制限な方法を含む適切な方法で形質転換される（Shermanら、酵母菌遺伝学の方法、Cold Spring Harbor Laboratory，1982）。適切なホスト細胞は制限なくSacchromyces cerevisiaeとSchizosaccharomyses pombeを含む。Usp‐Usp結合パートナーのリガンドに無関係な活動が測定できるすべての細胞は本発明の実施に使用できる。ホスト細胞は様々な型の燐酸化などのcovalent電子対を共有する（covalent）、例えば一時的変異を起こす能力に関して変えられたり、操作したりすることも可能である。（Baiら，Vitamins Horm．51.289，19 95） Uspを含む酵母細胞、Usp-結合パートナー及び適切なレポーター遺伝子はUsp機能を阻害する化合物を明らかにするアッセイにおいて用いられる。典型的には、 UspとUsp結合パートナーが発現され、機能的複合体を形成しその結果レポーターポリペプチドの発現が起こる状況下で細胞は定温培養される。USP、USP結合パートナー、及びレポーターポリペプチドを発現する培養物は、テスト培養物を形成するテスト化合物の存在下及び対照培養物を形成するテスト化合物の非存在下で培養される。十分な時間に適切な状況で、Usp機能と以前に存在したレポーターポリペプチドの代謝回転の阻害準備のために定温培養は続行させる。テスト化合物の定温培養開始から決められた時間に、アッセイは行なわれ、レポーターポリペプチドのレベルと活性が調べられる。培地サンプルとアッセイサンプルに関して、例えば野生型酵母菌と機能的CAN1遺伝生成物を発現する酵母菌は、追加された対照培養物も低温培養され、Usp阻害化合物は対照培養物と比較してテスト培養物中のレポーター遺伝子の発現が減少していることが確認される。理論に拘束されることなく、本発明の方法が明らかにした有用なUsp阻害化合物は以下に示すいずれかを阻害すると考えられる。(a)機能的なUsp-Usp結合パートナー複合体の形成、(b)Usp-Usp結合パートナー複合体との作用物質の相互作用、あるいは(c)天然のUsp-Usp結合パートナー複合体により正常に転写的に活性化される同種のDNA反応要素とUsp-Usp結合パートナー複合体との機能的相互作用。好ましくは、本発明の方法は高い処置量スクリーンに適合されており、単一のアッセイで調べられる非常に多くの化合物の検査を可能にしている。このような阻害化合物は、天然生成物ライブラリーや、発酵ライブラリー（植物や微生物を含む）、組み合わせライブラリー、化合物ファイル、合成化合物ライブラリーなどで見つけられる。例えば合成ライブラリーはMaybridge Chemical Co.(トレビレット、コーンウオール、英国)、Comgenex（プリンストン、ニュージャージー）、Brandon Associates（メリマック、ニューハンプシャー）、Microsource（ニューミルフォード、コネチカット）から工業的に利用できる。珍しい化学ライブラリーはAldrich Chemical Company，Inc.(ミルウォーキー、ウィスコンシン) から利用できる。代わりになるものとして、細菌、真菌類の菌、植物、動物の抽出物の形の天然化合物のライブラリーはPan Laboratories（ボーゼル、ワシントン）かMycoSearch（ノースカロライナ）などから利用できるが、容易に作り出すこともできる。更に、天然及び合成物ライブラリーと化合物は伝統的な化学的、物理学的、生化学的な手段により容易に変更される(ブロンデールら、TibTech 1 4:60，1996)。本発明によるUsp阻害剤アッセイは多くの別個の種類の溶剤に適応させるのに都合がよいし、そのために多くの供給源からの化合物を調べることができる。本発明の方法で化合物はUsp阻害剤として1度確認されると、生体内と生体外で色々なテストをして更にUsp阻害活性の性質と機構の特性を記述することができる。例えばこの化合物は細胞発現においてUsp阻害活性を調べることができ、U spに加えて、他のUsp結合パートナーとレポーター遺伝子はこの化合物の阻害活性が最初に検出された細胞中に存在していた。化合物のU spとUsp結合パートナーの間の異型二量化複合体形成及び/又はUsp-Usp結合パートナー複合体と適切な反応要素を含むDNAとの間の複合体形成を妨げることができる能力を調べることで生体外で阻害活性テストをすることができる。このことはグリセロール勾配分別、ゲル変動アッセイ、プロテアーゼ保護アッセイなどを用いて行なうことができる。 Usp阻害剤と確認された化合物は有効性、効力、摂取、安定性、商業的な殺虫剤への応用への使用の適合性などを高めるために少し変えることができる。これらの変更は公知の方法を用いて達成され、調べられる。殺虫剤の構成本発明によるUsp阻害化合物は「昆虫成長制御物質」(IGRs)を含む。IGRsは脊椎動物や植物に影響を与えず、昆虫の発生を選択的に阻害する。従って、このような化合物は環境に優しいと期待されるので、殺虫剤としての利用に特に適合していると思われる。本発明の方法を用いて確認されたUsp阻害剤の殺虫剤活性は公知の技術を使って調べられる。例えば確認された各化合物（以下を参照）の処方は、植物に殺虫剤を噴霧して次に昆虫の幼虫をその植物に適用すると、所定の時間の後、幼虫による植物の破壊の割合が測定される。殺虫剤としての使用のために、Usp阻害化合物は生物学的に許容できる担体の中に処方される。適切な生物学的に許容できる担体は燐酸‐緩衝溶液、食塩水、消イオン水などであるが、これらに限定はしない。好ましい生物学的に許容される担体は生理学的または薬理学的にも許容できる担体である。殺虫剤の組成は活性のある薬品の殺虫効果のある量を含む。殺虫効果量は植物や動物へ昆虫が群がることに対する予防の保護を与える本発明の殺虫剤の量であり、動植物への昆虫の群がりを改良または回復させる。この殺虫剤効果量は目標とする昆虫、薬剤、ホストによって異なる。この量は適用量や頻度のマトリックスを設定し，実験単位グループを設定し，グループの比較をしたり、あるいはマトリックスの各点を仮定する、などによって公知の実験方法で決定することができる。農業利用のため、殺虫活性薬剤や組成物は、乳化濃縮物(EC)，懸濁濃縮物 (SC)、水で散布できる顆粒剤(WDG)などのような投与単位型に形成される。薬剤利用のために、殺虫活性剤や組成物はクリーム，軟膏、外用水液、粉末、液体、錠剤、カプセル、スプレーなどの投与単位型を形成する。殺虫剤組成物が投与量単位型に処方される場合、投与単位型は活性薬剤の殺虫効果量を含む。あるいは、複数の投与単位型や複数の投与により活性薬剤の全投与量を投与する場合、投与単位はそのような量より少なくなるであろう。投与単位型は、更に1又は２以上の補形薬、希釈液、錠剤分解物質、潤滑剤、可塑剤、着色料、投与量賦形剤、吸収強化剤、安定剤、殺菌剤なども含むことができる。本発明の殺虫剤と組成物は動植物への昆虫の群がりを防ぎ、処理するのに有用である。予防方法は殺虫剤や組成物の予防効果量を組み込む。予防効果量は昆虫の群がりを予防するのに効果的な量であり、昆虫や薬剤やホストによって異なる。これらの量は上に述べたように公知の方法によって実験的に決めることができる。処置方法は治療上効果的な殺虫剤の量や構造を組み込む。治療上効果的な量とは昆虫の群がりを減らすのに十分な量である。この量は目標とする昆虫、薬剤、ホストに左右され、上に述べたように決めることができる。予防的及び/又は治療的に効果的な量は1回の投与で投与するか、あるいは繰り返して投与することができる。昆虫の群がりが解決すると、治療的投与の後に予防的投与が施される。殺虫剤と組成物は植物に局所的または非局所的に（つまり規則正しく）投与される。局所的な投与は好ましくは植物へのスプレーによるものである。規則的投与は好ましくは葉へ、土へそしてそれに続く植物の根による吸収への投与によって行なわれる。好ましい様態の説明以下の例は制限なく発明を明らかにするものである。実施例１ＵｓｐおよびＵｓｐ結合パートナーのクローニングとリポーター遺伝子の構築Ａ．発現プラスミドの構築ＤＮＡおよび酵母を操作するために用いる方法は当該技術において周知のものである（グスリー（Guthrie）ら、Heth．Enzymol．Vol．194，1991）。核受容体配列の全長のＮ−末端および下記キメラをコードするＤＮＡ配列を、高コピーＹＥｐ酵母発現ベクター（マクドーネル（Mc Donnell）ら、Mol．Cell．Biol．9:3 517，1989;マック(Mak)ら、J．Biol．Chem．264:21613，1989;マック(Mak)ら、R ec．Prog．Horm．Res．49:347，1994）中の７６アミノ酸ユビキチン（Ｕｂｉ）のアミノ末端に対する枠内で融合した。酵母中に各プラスミドをトランスフェクションすることにより、組換え融合タンパクを発現させ、これを内因性プロテアーゼにより切断し、図１に示した成熟核タンパクまたはキメラを遊離させる。ＹＥｐｃＵｓｐプラスミドの構築は、Ｕｓｐ遺伝子をｐＣＦＩプラスミド（シーア（Shea）ら、Genes Dev．4:1128，1990）中で２つのＰＣＲフラグメントとして増幅し、これらをＹＥｐｃＭＣＳのＥａｇＩ部位および多重クローニング部位のＤｒａIII部位に挿入することにより実施した。Ｕｓｐの５'側半分を、５'末端にＥａｇＩを含むセンスプライマー５'−ACTTC ACGGCCGATGGACAACTGCGACCAGGACGCCA−３'および３'末端にＢｓｓＨ IIを含むアンチセンスプライマー５'−CACCTGGGCAAAGTGCGGCATCAT−３'で増幅した。Ｕｓｐの３'側半分を、５'末端にＢｓｓＨ II部位を含むセンスプライマー５'−CAAACA GCTCTTCCAGATGGTCGA−３'および３'末端にDra III部位を含むアンチセンスプライマー５'−ACTACTCAAACAGTGCTACTCCAGTTTCATCGCCAGGCC−３'で増幅した。２つのＰＣＲフラグメントおよびＹＥｐｃｍｃｓをＥａｇＩおよびDra III部位で切断し、混合、結合してＹＥｐｃＵＳＰを得た。ＹＥｐｃＵＳＰにおいては、銅応答性酵母メタロチオネイン・プロモーター（ＣＵＰ１）がＵｓｐの発現を制御し、ロイシン（ＬＥＵ）が選択可能なマーカーである。ＹＥｐＥｃＲＢ１プラスミドは３工程で作製した。第１工程においては、ＹＥｐを二重鎖リンカーの付加によりＡｆｌ II−ＫｐｎＩで修飾し、ＹＥｐＢｓｐＥＩを得た。該二重鎖リンカーは、で示され、５'末端、すなわち、ユビキチンのカルボキシル末端６アミノ酸を表す配列であるＥｃＲ遺伝子の５'配列Ａｆｌ II部位から最初のＥｃｏＮＩ部位まで、およびＢｓｐＥＩ部位と３'末端のＫｐｎＩ部位の双方から成る。第２工程においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フラグメントは、鋳型としてＥｃＲ−１７（コエル(Koelle)ら、Cell 67:59，1990）を含むｐＭＫＩプラスミドおよび５'末端にＢｓｐＥＩを含むセンスプライマー５'−AGGAGATCTGGGACGTTCATGC CAT−３'と、プライマーとして３'末端ＢｓｐＥＩおよびＭｌｕＩ部位を含むアンチセンスプライマー５'−TAAACGCGTTCCGGACTATGCAGTCGTCGAGTGCTCCGACTTAAC− ３'を用いて得た。得られたフラグメントはｐＭＫ１のＢｇｌＩ−ＭｌｕＩ部位に挿入し、ｐＭＫ−ＥｃＲを得た。第３工程では、ｐＭＫ−ＥｃＲを先ずＢｓｐＥＩで、次いでＥｃｏＮＩで消化し、消化物を１％アガロース・ゲル上で分画し、ＥｃＲの２．５ｋｂフラグメントを切除し、ゲル精製してＹＥｐＢｓｐＥのＥｃｏＮＩおよびＢｓｐＢＩ部位に挿入し、ＹＥｐＥｃＲを得た。ＹＥｐＥｃＲでは、ＥｃＲの発現が酵母構成的プロモーター・トリオースリン酸デヒドロケナーゼ（ＴＤＨ３）により制御され、トリプトファン（ＴＲＰ）が選択可能なマーカーである。プラスミドＹＥｐＥｃＲ−ＡおよびＹＥｐＥｃＲ−Ｂ２は、ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１からＡｆｌ IIおよびＡｓｃＩフラグメントを切除し、その場所に、ＥｃＲ− ＡおよびＥｃＲ−Ｂ２のユニーク配列以外は当初のものと一致するＰＣＲフラグメントを挿入することにより作製した。鋳型はそれそれｐＷＴ５７およびＷＴ５６（タルボット（Talbot）ら、Cell，73:1323．1993）であった。センスプライマーはそれぞれ５'−CTTGTCTTAAGACTAAGAGGTGGCATGGATACTTGTGGATTAGT−３'および５'−CTTGTCT TAAGACTAAGAGGTGGCATGTTGACGACGAGTGGACA−３'であった。アンチセンスプライマー５'−GCACTCCTGACACTTTCGCCTCAT−３'を両方の反応に用いた。ＹＥｐＥΔｃＲＡＡ／Ｂプラスミドは、ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１からＴＤＨ３プロモーター、Ｕｂｉ遺伝子およびＥｃＲΔＡ／Ｂを含むＢａｍＨＩおよびＢｓｐＥＩフラグメントを切除し、それをＴＤＨ３プロモーター、Ｕｂｉ遺伝子含有フラグメントおよび新規ＤｒａIII部位の双方で置換えることにより作製した。Ｄｒa III部位は最近接ＢｓｐＥＩ部位から更に９塩基下流のＥｃＲΔＡ／Ｂに帰着した。再挿入フラグメントは２つのＰＣＲフラグメントから作製し、第１ＰＣＲ反応では、ＹＥｐｅｃｒのＴＤＨ₃−Ｕｂｉ部分を、ＢａｍＨＩ部位を５'末端に含むセンスプライマー５'-ATGTGTCAGAGGTTTTCACCG−３'およびＤｒａIII部位を３' 末端に含むアンチセンスプライマー５'−TCATCACACGTGGTTGGCCAAGACAAG−３'により増幅した。第２ＰＣＲ反応では、ＥｃＲからＢｓｐＥＩまでの部位のＡ／Ｂドメイン下流配列を、５'末端にＤｒａIII部位を含むアンチセンスプライマー５ '−TCATCACACCACGTGGAGCTGTGCCTGGTTTGCGGCGAC−３'およびＢａｍＨＩ部位を３' 末端に含むアンチセンスプライマー５'−CTCTCTTCAACCCACCAAAGGCCA−３'により増幅した。６種のキメラ（図１）を作製するために、ＹＥｐｍＡＲ５プラスミド（マック（Mak）ら、Rec．Prog．Horm．Res．49:347，1994）およびＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１またはＹＥｐＥｃＲΔＡ／Ｂプラスミドのいずれかを使用した。キメラの命名はＮ−末端ドメインに寄与する核受容体で始まり、２つの核受容体間の結合を意味する斜線「＼」が続き、第二核受容体および寄与するドメインの名で終わる。すべてのＤＮＡ塩基番号はＥｃＲ（コエル（Koelle）ら、Cell，67:59，1990）およびｍＡＲ（ヒー（He）ら、Biochem．Bioph．Res．Comm．171:697，1990）の遺伝子配列に用いる番号に基づいており、それ故に、塩基番号１はＯＲＦの開始コドンのＡではない。ＯＲＦのＡＴＧにおいてＡの＋１を得るには、ＥｃＲ配列から１０６７を引き、ｍＡＲ配列から３２を引く。第１キメラＹＥｐＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥは２工程で作製した。先ず、ＥｃＲＢ１遺伝子をＳａｃＩおよびＢｓｐＥＩで消化して２１５１〜３７０６の塩基を切除し、Ａ／ＢおよびＣ領域およびＤ領域の１／３を維持した。次いで、センスプライマー５'−CATCATGAGCTCTCGTAAGCTGAAGAAACTTGGAAATCT−３'およびアンチセンスプライマー５'−CATCTTCTCCGGATCACTGTGTGTGGAAATAGATGGGCT−３'を用い（ｍＡＲ５遺伝子を鋳型として）、領域ＤおよびＥを提示する１８５６〜２７３２塩基から成るアンドロゲン受容体遺伝子を増幅し、ＳａｃＩおよびＢｓｐＥＩ末端を有する０．９ｋｂフラグメントを得た。それぞれの制限酵素で消化した後、ｍＡＲフラグメントを、予め調製したＹＥｐＥｃＲのＳａｃＩおよびＢｓｐＥＩ部位にクローン化した。第２キメラＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦは、ＹＥｐＥｃＲＢ１のＳａｃＩおよびＢｓｐＥＩ部位にそれぞれ挿入したＤｒａIIIおよびＢｓｓＨ IIリンカーにより作製した。生成したプラスミドをＤｒａIIIおよびＢｓｓＨ IIで切断し、Ｄ領域の２／３およびＥおよびＦ領域の全部をコードする２１５１〜３７０６塩基から成る１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを遊離させた。このフラグメントを単離し、ｍＡＲの３３〜１８５０塩基を含むＹＥｐｍＡＲ５（マック（Mak）ら、R ec．Prog．Horm．Res．49:347，1994）にクローン化した。両方の部位は切断されたｍＡＲの３'末端に存在する。発現生成したタンパクはｍＡＲのＡ，ＢおよびＣ領域およびＥｃＲのＤ，ＥおよびＦ領域を含んでいる。第３キメラＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＥＦは、ＥｃＲＢ１の２３５８〜２３０６塩基を、センスプライマー５'−CATGATCACACAGTGCAG0ATGTATGAGCAGCCATCT−３' およびアンチセンスプライマー５'−GATCTAGCGCGCCTATGCAGTCGTCGAGTGCTCCGA− ３'で増幅し、ＥｃＲのＥおよびＦ領域をコードし、ＤｒａIIIおよびＢｓｓＨ I I末端をそれぞれ含む１．３ｋｂのフラグメントを得る。このＰＣＲ生成物を適当な酵素により消化し、それをＹＥｐｍＡＲ６のＤｒａIIIおよびＢｓｓＨ II部位にクローン化した。ＹＥｐｍＡＲ６は切断したｍＡＲ遺伝子の３３〜２０７２塩基を含み、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ領域をコードするアンドロケン受容体の一部を発現する。第４キメラＹＥｐＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥは、第３キメラ（ＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−Ｅ＆Ｆ）に対する手法に従いクローン化した。但し、ＥｃＲ遺伝子用に用いたアンチセンスプライマーは５'−GATCTAGCGCGCCTAAAGGTGCGACTGGACCGATGG−３' であった。この様にして、２３５８〜３０５７塩基を含み、ＥｃＲのＥおよびＦ領域のみをコードする０．６ｋｂのフラグメントを得た。第５キメラＹＥｐｍＡＲ−Ｄ＼ＥｃＲ−ＤＥＦは、第２キメラ（ＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦ）に対する手法に従いクローン化した。但し、この場合（ＥｃＲのＤ，ＥおよびＦ領域をコードする）２１５１〜３７０６塩基からの１．８ｋｂフラグメントをＹＥｐｍＡＲ６のＤｒａIIIおよびＢｓｓＨ II部位にクローン化した。第６キメラＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦは、ＹＥｐＥｃＲΔＡ／ＢのＤｒａ III部位に、ＹＥｐｍＡＲから作製したＰＣＲ産物を挿入することにより作製した。該ＰＣＲ産物の作製には、最初の翻訳開始ＡＴＧ部位からｍＡＲ遺伝子に続く５'末端Ｄｒａ III部位を含むセンスプライマー５'−TCATCACACCACGTGATGGA GGTGCAGTTAGGGCTGGGA−３'、およびA／BドメインｍＡＲ遺伝子の配列に沿う３' 末端Ｄｒａ III部位をコードするアンチセンスプライマー５'−TCATCACACGTGGTG GGTCTTCTGGGGTGGAAAGTAATA−３'を用いた。プラスミドＹＥｐＶ３はマクドネル（HcDonnell）ら（Md．Cell Biol．9:3517 ，1989）により開示されており、プラスミドＹＥｐＲＸＲαはマック（Mak）ら（Gene，145:129，1994）により開示されている。ＵｓｐおよびＲＸＲαの発現は銅応答性酵母メタロチオネイン・プロモーター（ＣＵＰ１）により促進され、その選択可能マーカーはそれぞれロイシン（ＬＥＵ２）およびトリプトファン（ＴＲＰ１）である。ＥＣＲ，キメラおよびＶＤＲの発現は酵母構成性トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）により制御され、トリプトフアン（ＴＲＰ１）は選択可能マーカーとして作用する。Ｂ．リポーター・プラスミドの構築Ｕｓｐリポーター・プラスミドＹＥｐ− ＵｓｐＲＥ₂−ＬａｃＺはＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺにおいて、ＥｃＲ応答因子（ＥｃＲＥ₂）を推定上のＵｓｐ応答因子（ＵｓｐＲＥ₂）の２コピーと置換えることにより構築した。ＵｓｐＲＥ₂はコリオンｓ１５プロモーター（シー（Shea）ら、Genes Dev．4 :1128，1990；クーリー・クリスチャンソン（Khoury Christianson）ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:11503，1992）の−６４ないし−４４の配列に相当し,オリゴヌクレオチド対の５'−TCGAGTAGGTCACGTAAATGTCCA−３'および３'−CA TCCAGTGCATTTACAGGTCCGAGCT−５'を合成することにより構築した。これらは各配列、すなわち、ＸｈｏＩ部位に対する５ヌクレオチドの５'ないし３'末端を有し、推定上のＵｓｐ結合部位の２１塩基および１個のシトシンが続いてＸｈｏＩ突出部を完成させる。ＥｃＲ応答リポーター・プラスミド（コエル(Koelle)ら、Cell 67:59，1990）ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺは記載（マック（Mak）ら、J．Biol．Chem.，264:21 613，1989）のとおりに作製したが、このものはドロソフィラ（Drosophila）熱ショックプロモーター２７（ｈｓｐ２７）のＲｃＲＥを２コピー含んでいた。このコピーはｐＣ２のＸｈｏＩ部位およびＥ．ｃｏｌｉＬａｃＺ（ＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺ）の構造遺伝子に融合した酵母イソ−１−シトクロムｃプロモーター（ＣＹＣ１）の上流に挿入されたものであり、選択可能マーカーとしてＵＲＡ３を有する（マック（Mak）ら、J．Biol．Chem.，264:21613，1989）。ＥｃＲＥ２は２種のオリゴヌクレオチド、すなわち、５'−TCGAGGACAAGTGCATTGAACCTGTCTCCCGGG C−３'および３'−CTGTTCACGTAACTTGGGAACAGAGGGCCCGAGCT−５'を合成することにより構築したが、このヌクレオチドはｈｓｐ２７の２３塩基を含んでおり、ＳｍａＩ部位に続いて、５'末端で両立し得るＸｈｏＩ突出部の４つのヌクレオチドで終わっている。該オリゴヌクレオチドはキナーゼ分解し、一緒にアニールし、リポーターベクターｐＣ２に連結反応させた。該ベクターｐＣ２は予めＸｈｏＩで消化し、仔ウシ腸内アルカリホスファターゼで脱リン酸化したものである。ＵｓｐＲＥ₂およびＥｃＲＥ₂の両方をＳｍａＩでの消化に付すと、それらがＸｈｏＩ部位に挿入されていることが判明し、ＤＮＡ配列分析（セケナーゼ・キット、ストレートジーン）に付すと、該因子が２コピー存在することを確認し得た。ＹＥｐ−ＶＤＲＥ₂リポーター・プラスミドはＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺからＸｈｏＩフラグメントを切除し、ヒト・オステオカルシン・プロモーター（ｈＯＣ）に存在する２５塩基対配列２コピーを再挿入することにより作製した。なお、該ｈＯＣは下記オリゴヌクレオチド対から調製したものである。ｍＡＲ応答性リポーター・プラスミドＹＲｐＡ₂はマック（Mak）ら、Recent P rog．Horm．Res.，49:347，1994に開示されている。カナバニン（canavanine，ＣＡＮ１）応答性リポーターＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１はＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺからＬａｃＺ含有ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部分を切除し、ＣＡＮ１のＰＣＲ産物を再挿入することにより構築した。ＰＣＲ反応は鋳型として野生型酵母株Ｓ２８８ＣからのゲノムＤＮＡおよびＣＡＮ１の配列に従って調製したプライマー（ホフマン（Hoffmann）、J．Biol．Chem.，260 :11831，1985）を含んでいた。センスプライマ−５'−GTGCTCGGATCCATGACAAA TTCAAAAGAAGACG−３'はＢａｍＨＩ部位をコード化してＣＡＮ１の５'末端に繋がっており、アンチセンスプライマー５'−TGGTGGGAGCTCCTATGCTACAACATTCC−３' はＣＡＮ１の３'末端をコード化してＳａｃＩ部位に繋がっている。Ｃ．酵母株プラスミドＹＥｐＵｓｐ−ＬａｃＺはＳ．セレビシエ（S．cerevisiae）株ＢＪ２１６８で使用した。該株は遺伝子型Ｍａｔα leu2 trpI ura3-52prb1-1122 pep4-3 prc1-407 gal2を有する。プラスミドＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１,ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺおよびＹＲｐＡ₂はｃａｎ１削除Ｓ．セレビシエ酵母株ＣＧＹ４４（ＤＣ４５）で使用した。該株は遺伝子型Ｍａｔα stel1-Δ１ his4-519 leu2 trp1 can1-101を有する。実施例２酵母Ｕｓｐ−Ｕｓｐ結合パートナー複合体によるベーターガラクトシダーゼ・リポーター遺伝子の転写活性化下記実験はＳ．セレビシエでの転写を活性化するＵｓｐ−Ｕｓｐ結合パートナー複合体の能力を定量するために実施した。方法Ｕｓｐ，Ｕｓｐ結合パートナーおよびリポーター遺伝子をコード化する発現プラスミドを上記実施例１と同様に構築し、酵母に形質転換した。必要な場合には、酵母を予め１０μＭムリステロンＡまたは１μＭテストステロンで前処理した。細胞質ゾル抽出物を調製するために、遠心分離により細胞を採取し、水で２度洗浄して、Ｚバッファー（６０ｍＭ Na₂HPO₄，４０mM NaH₂PO₄，１０mM KCl、１ mM MgSO₄，５０mM β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０）に再懸濁した。細胞を０．５ｍｍガラスビーズ（ブラウン・インストルーメント）で５サイクルのボルテックス処理（各１分）溶解し、次いで氷上１分間インキュベートした。溶解物を高速遠沈に付して粒状物と上清分画を分離した。ブラッドフォード（Brad ford）アッセイ（バイオラッド）により定量した上清（細胞質ゾル抽出物）のタンパク濃度は概ね５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。 β−ガラクトシダーゼ活性を、Ｚバッファー８００μｌおよび細胞質ゾル抽出物５〜２０μｇを含む１ｍｌの反応物中で測定した。反応混合物を２８℃で１０分間予備インキュベートし、その後、Ｏ−ニトロフェニルガラクトピラノシド２００μｌ（４ｍｇ／ｍｌ水）を添加し、更に１０分間インキュベーションを続けた。１Ｍ炭酸ナトリウム５００μｌを加えて反応を停止した。最後に、分光光度計により４２０ｎｍでの反応物の吸光度を測定し、測定値をタンパク１ｍｇ当たりのミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位に変換した。結果ドロソフィラ（Drosophila）濾胞特異コリオン遺伝子ｓ１５のヌクレオチド− ６４および−４４がＵｓｐに対するシス−結合因子として機能するか否かをテストするために、この配列の二重コピーを近位プロモーター因子およびＬａｃＺ遺伝子を含むリポータープラスミドに挿入し、得られるリポータープラスミドＹＥｐＵｓｐＲＥ₂−ＬａｃＺをβ−ガラクトシダーゼ発現に対してテストした。表１はリポータープラスミドＹＥｐＵｓｐＲＥ₂−ＬａｃＺを含むＢＪ２１６８酵母からの細胞質ゾル抽出物のすべてが、検出不可レベル（それぞれ０ＭＵ／ｍｇと比較して１５００ＭＵ／ｍｇの範囲）の対照プラスミドＹＥｐｃＬａｃＺを有するものと比較して、有意な同等レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を示したことを示す。ＹＥｐｃＵｓｐにおいて銅応答性メタロチオネイン・プロモーター（ＣＵＰ１）銅プロモーターからＵｓｐの発現を誘発するＣｕ²⁺の存在は効果がなかった。この結果はＹＥｐＵｓｐＲＥ₂−ＬａｃＺプラスミドが構成的に活性であり、Ｕｓｐの存在により更に誘発されるものではないことを示している。従って、このリポーター構築物はＵｓｐ活性をアッセイするために使用することはできなかった。表１ＥｃＲ−ＡまたはＥｃＲ−Ｂ２の転写活性をリポータープラスミドＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺを用いテストした。ＥｃＲのイソ型はＮ−末端配列が異なっている。従って、ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１プラスミドはドメイン交換により修飾され、ＹＥｐＥｃＲ−ＡプラスミドおよびＹＥｐＥｃＲ−Ｂ２プラスミドを生じる。酵母株をプラスミドの適切な組合わせにより形質転換し、β−ガラクトシダーゼ活性につきテストした。表２はＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺを含む細胞質ゾル抽出物がＵｓｐの存在または不存在下で、β−ガラクトシダーゼ活性が検出不可であったか、あるいは無意味なレベルにあったかを示す。これらのレベルは０ないし１３２ＭＵ／ｍｇの範囲にあり、その平均値（５８）を基礎活性と定義し、活性の比誘発を定量するのに用いた。ＹＥｐＥｃＲＥ₂ −ＬａｃＺに加えてＥｃＲイソ型を含む細胞質ゾル抽出物は有意なレベルのβ− ガラクトシダーゼ活性を示し、そのレベルはＵｓｐの共発現によりＥｃＲ−Ｂ１およびＥｃＲ−Ａ含有細胞に対して更に増大した。酵母株をＥｃアゴニスト・ムリステロンＡ（ＭｕｒＡ）で前処理しても効果はなかった。ＥｃＲ−Ｂ１の転写活性を４倍、すなわち、４１０３±７０９ＭＵ／ｍｇから１８００７±１９６７ＭＵ／ｍｇに増大するＵｓｐの能力は、有意なＵｓｐ特異応答を提供する。しかし、ＥｃＲのＵｓｐ−非依存活性は寒天プレート基本アッセイにおいて使用した場合には高すぎた。表２＊すべての実験で基礎平均値は５８である。この３種のイソ型はそのＡ／Ｂドメインのカルボキシル末端３６アミノ酸を共有し、そのＮ−端では異なる配列を有していて、ＥｃＲ−Ｂ１，ＥｃＲ−ＡおよびＥｃＲ−Ｂ２に対してそれぞれ２２６、１９７および１７アミノ酸から構成されている。また、結果はＥｃＲ構築活性のレベル（それぞれ４１０３±７０９Ｍｕ／ｍｇ，２５２３±７１０ＭＵ／ｍｇ，および４８０±１５０ＭＵ／ｍｇ）およびＵｓｐによるその増強（４．４±０．３、３．０±１．５、および０．９± １．５−倍誘発）の双方において低下を示している。このことはＥｃＲイソ型のＮ−末端ドメインがその非依存性構築活性並びにＵｓｐによる誘発性の双方を決めていることを示唆する。このことを基にして、ＥｃＲ−Ｂ１のＮ−末端を除去して、このドメインが転写活性に本質的なものであるか否かを決定した。ＥｃＲ−Ｂ１とｍＡＲとの間の多数のキメラを作製して、低い基礎活性と顕著なＵｓｐ−誘発活性を示すＥｃＲの１形態を得た。ＥｃＲのすべての形態は、ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１プラスミドのＥｃＲ配列をＹＥｐｍＡＲに存在するｍＡＲからの対応配列と置換して修飾することにより作製した。この研究に用いた核受容体の図式を図１に示す。これらはＵｓｐ，ＥｃＲ−Ｂ１，ｍＡＲ，およびＥｃＲ−Ｂ１とｍＡＲの誘導体であり、これらは以下のものを包含する。１）Ｎ−末端もしくはＡ／Ｂドメインを切除したＥｃＲ（ＥｃＲΔＡ／Ｂ），２）それ自身のＡ／Ｂ，ＣおよびＤドメインの一部をｍＡＲから誘導されるドメインＤおよびドメインＥの残余部分と共に含有するＥｃＲ（ＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥ），３）ドメインＡ／ＢおよびＣがｍＡＲ由来のものであり、Ｄ，ＥおよびＦがＥｃＲからのものであるＥｃＲ（ｍＡＲ＼ｅｃｒ −ＤＥＦ），４）ドメインＤがまたｍＡＲからのものであることを除き、ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦに類似のＥｃＲ（ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＥＦ）、５）ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＥＦに類似であるが、ドメインＦを欠如するＥｃＲ（ｍＡＲ＼ＥｃＲ−Ｅ）、６）ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦに類似ではあるが、ｍＡＲからのドメインＤが保持されているＥｃＲ（ｍＡＲ−Ｄ＼ＥｃＲ−ＤＥＦ）、および７）ｍＡＲのＡ／ＢドメインがＥｃＲのＡ／Ｂドメインと置換されているＥｃＲ（ｍＡＲ＼ＥｃＲ −ＣＤＥＦ）。酵母抽出物にはｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦキメラを除き、組換えタンパクが高レベルで発現されていることがウエスターン・ブロットにおいて確認された（データ未開示）。適切なリポータープラスミドと共にＥｃＲの各形態を含み、Ｕｓｐを含有あるいは欠如する細胞質ゾル抽出物につき、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。表３は媒体またはステロイド（１０μＭムリステロンＡ（ＭｕｒＡ）または１μＭテストステロン）のいずれかで前処理した細胞について得られた結果を示す。Ｅドメインが一般にステロイド／核受容体のリガンド結合ドメインであるので、ＥｃＲから誘導されたドメインＥをもつ核受容体含有の酵母細胞は１０μＭのＭｕｒＡに応答すると期待されるが、一方、ｍＡＲからのドメインＥ含有細胞は１μテストステロンに応答すると期待される。更に、ドメインＣはシス−ＤＮＡ結合ドメインを特定し、リポーター遺伝子はキメラ受容体に存在するドメインＣの由来に基づき選択された。すなわち、ＥｃＲからのドメインＣを有するキメラはＹＥｐ−ＥｃＲＥ₂−ＬａｃＺでテストし、ｍＡＲからのドメインＣを有するキメラはＹＲｐＡ₂−ＬａｃＺでテストした。表３マウス・アンドロゲン受容体応答因子でテストした受容体ＮＤ*定量せずこれら実験の結果は、ＥｃＲに存在する高転写活性をＵｓｐによる有意な誘発が検出可能であるように低下させることができることを示している。ＥｃＲからＡ／Ｂドメインを除去するとＥｃＲΔＡ／Ｂとなり、これは構成的活性を保持し、Ｕｓｐが存在しても影響を受けないかあるいは抑制される（それそれ、１６００±２６５ＭＵ／ｍｇおよび１０１８±１８５ＭＵ／ｍｇ）。このプロフィールはＥｃＲ−Ｂ２のプロフィールに似ている。ｍＡＲからのＡ／ＢドメインをＥｃＲΔＡ／Ｂに付加してｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦを形成させると、検出可能な活性は示さないが、Ｕｓｐにより誘発性となる（１０８２±１４７ＭＵ／ｍｇと比較して９８±７５）。ｍＡＲのＮ−末端からの寄与を増大させ、ＣドメインまたはＤドメインを包含させると、それぞれ、ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦとｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＥＦとｍＡＲ−Ｄ＼ＥｃＲ−ＤＥＦとなる。これらは約３００Ｍｕ／ｍｇという同様の低い構成的活性を有する。Ｕｓｐを上記キメラと共発現させると第１キメラの活性を低下させ、他の３種は約２０００ＭＵ／ｍｇに誘導する。ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＤＥＦは誘発できないが、ｍＡＲ−Ｄ＼ＥｃＲ−ＤＥＦは誘発し得るということは、ｍＡＲからのＤ領域がＤＮＡ結合ドメインの機能にとって重要な領域であることを示唆している。この推測は以前に先端切除ｍＡＲで認めた観察結果と一致している。ｍＡＲ＼ＥｃＲ−Ｅ（Ｆドメイン欠如）が誘発性であることはｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＥＦ（Ｆドメイン存在）に似ており、この状況でＦドメインはＵｓｐ機能に寄与していないことを示唆している。ＥｃＲのＮ−末端Ａ／ＢおよびＣドメインをｍＡＲに置換するとキメラＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥとなり、これは基礎活性が低く、Ｕｓｐ誘発性である。ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦが示す低基礎活性は、結果として高い標準偏差となり、幅広い比活性化値となる。しかし、ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦでのこの変動にも拘わらず、すべての誘発可能なＥｃＲ型に対してＵｓｐ存在下での比誘発はむしろ近似していて、５〜１０倍の範囲内にある（すなわち、ｍＡＲ＼ＥｃＲ− ＣＤＥＦではその範囲が１５±１０ないし６２．０±５０にあり、テストステロンで予め刺激したＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥを包含しない他のものでは６．０±１．４ないし９．２±０．６である）。これらの結果が示唆することは、Ｕｓｐの誘発性にはＡ／Ｂドメインの存在が必要であり、ｍＡＲおよびＥｃＲのＡ／Ｂはその機能にとって互いに交換可能であることである。これらの結果はまた、ＥｃＲのいずれもがＵｓｐの存在、不存在に拘わらずＭｕｒＡに応答しないことを示している。これに対して、ＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥは５４１±３６７ＭＵ／ｍｇないし７９６６±１４６７ＭＵ／ｍｇの範囲、あるいは１７．６±８．４７倍の増加率でテストステロンにより誘発可能であることを示している。ＥｃＲ＼ｍＡＲ− ＤＥによりここで得られた基礎レベルおよびホルモン誘発レベルは、完全なｍＡＲについて報告されたレベルに近似している。従って、ｍＡＲはＥｃＲのＡ／Ｂドメインを用いるのに、その逆の状態よりもより適している。Ｕｓｐ存在下でのテストステロンによるＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥの誘発は僅かに高いように思われる（７９６６± １４６７ＭＵ／ｍｇないし１０，７６３±１５７７ＭＵ／ｍｇ）。このさらなる効果はテストステロンおよびＵｓｐによる誘発が独立して引き出されることを示唆している。ｍＡＲ／ＥｃＲ−ＣＤＥＦキメラの低基礎活性もまた、それが他のキメラに関係するＥｃＲの大部分を含むという理由で選択した。実施例３Ｕｓｐ阻害化合物のスクリーニング法原理：カナバニン／アルギニン・パーミアーゼ（ＣＡＮ１）はアルギニンに対する膜輸送体であり、毒性のアルギニン類似体、カナバニン（canavanine）の唯一の浸入手段である(ホフマン（Hoffmann）、J．Biol．Chem.，260:11831，1985 )。ＣＡＮ１含有酵母は適当濃度のカナバニンが存在すると生育できないが、ｃａｎ１除去酵母では抵抗性で生育し得る。その感受性はＣＡＮ１ｃａｎ１細胞が感受性であるために半優性である（ブローチ（Broach）ら、Gene 8:121，1979）。この性質は変異株とクローン化遺伝子単離のための選択マーカーとして開発されたものである。以下の実験は誘発可能なリポーター遺伝子としてのＣＡＮ１の用途につき記載する。これらの実験では、ＣＡＮ１を絶対宿主としてのｃａｎ１酵母株のＥｃＲＥ₂−リポーター遺伝子ＬａｃＺと置換え、カナバニンは生育培地に含有させる。その結果、ＵｓｐおよびｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦ双方が酵母株中に存在するときは、いずれか一方が欠損あるいは単独である場合に比べて、細胞の生育が減少する。図２は細胞の生育救済をモニターするための転写制御ＣＡＮ１システムおよびこのシステムの実用化を図式化したものである。この図式が示すのは、ＹＥｐｃＵｓｐ，ＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦ（「ＹＥｐＣＨ８」と命名）およびＹＥｐＥｃＲＥ−ＣＡＮ１を移入したｃａｎ１酵母細胞はそのプラズマ膜上にカナバニンパーミアーゼを、また、細胞内にはカナバニンを蓄積させ、細胞毒性に誘導することである（パネルＡ）。しかし、Ｕｓｐ転写に対するインヒビター（Ｉ）が存在すると、ＣＡＮ１の発現が阻害され（Ｘ），細胞成長が起こる（パネルＢ）。Ｉ．材料と方法Ａ．原液１０Ｘ濃度のアミノ酸不含酵母窒素基礎培地（ＹＮＢ）（ディフコ）を調製するに当たり、その６７ｇを１リットルに溶かし、その後滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。ゴールド濃縮液（Ｇ−ｔｒｐ，−ｌｅｕ，−ｕｒａ，−ａｒｇ）は以下の成分を含んでいた。アデニン硫酸塩１２０ｍｇＬ−ヒスチジン１２０ｍｇＬ−メチオニン１２０ｍｇＬ−チロシン１８０ｍｇＬ−イソロイシン１８０ｍｇＬ−リジン・ＨＣｌ１８０ｍｇＬ−フェニルアラニン３００ｍｇＬ−グルタミン酸６００ｍｇＬ−アスパラギン酸６００ｍｇＬ−バリン９００ｍｇＬ−スレオニン１２００ｍｇＬ−セリン２２５０ｍｇこれらの成分をＨ₂Ｏ１．１リットルに溶解した。数滴の１０Ｎ−ＮａＯＨを加えてアミノ酸を完全溶解した後、その溶液を滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。硫酸銅（ＣｕＳＯ₄）（シグマ・カタログ＃Ｃ−１２９７）１００ｍＭ溶液を調製するに当たり、その１．６ｇをｄＨ₂Ｏ１００ｍｌに溶カル、滅菌濾過し、遮光下室温にて保存した。カナバニン原液（Ｃａｎ）（シグマ・カタログ＃Ｃ−９７５８）を調製するに当たり、その１００ｍｇを１ｍｌに溶かし、滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。アルギニン原液（Ａｒｇ）を調製するに当たり、その１００ｍｇを１ｍｌに溶かし、滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。Ｂ．ゴールド培地の調製液体培地は以下の成分を含有していた。デキストロース１２ｇ１０ＸＹＮＢ６０ｍｌゴールド濃縮液１１０ｍｌ硫酸銅（ＩＩ）６００μｌｄＨ₂Ｏ４３０ｍｌ各成分を総量６００ｍｌに溶解し、その溶液を滅菌濾過し、４℃にて貯蔵した。寒天培地は以下の成分を含有していた。デキストロース１２ｇバクト・アガー１２ｇｄＨ₂Ｏ４３０ｍｌ上記成分を混合し、２０分間オートクレーブ処理し、その後、以下の試薬を総量６００ｍｌに添加した。１０ＸＹＮＢ６０ｍｌゴールド濃縮液１１０ｍｌ硫酸銅（ＩＩ）６００μｌ５０℃の水浴中で少なくとも２０分間冷却した後、カナバニン原液３００μｌを加え、混合した。ＩＩ．方法酵母株ＣＧＹ４４：ＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＹＥｐｃＵＳＰ／ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１を液状ゴールド培地５ｍｌ中、３０℃で振盪し、個々のクローンから一夜生育させた。一夜培養物２００μｌ量を液状ゴールド培地５０ｍｌに移し、３０℃で一夜振盪した。培養物のＯＤ₆₀₀を測定した（約１．０）。ＯＤ₆₀₀＝１の細胞６ｍｌ量を取り出し、予め５０℃に冷却したゴールド混合培地寒天と混合した。混合物を大きなスミロン（Ｓｕｍｉｌｏｎ）スクリーニング皿に注いだ。寒天が固化した後、テストサンプルをプレート上に載せた。陽性コントロールとして、５０および１００μｇのアルギニンを含む１／４インチフィルターディスクを使用した。該プレートを３０℃インキュベーター中で一夜培養し、翌日にそのプレートを分析した。１６時間培養後、アルギニンディスクは目視可能な生育ゾーンを示した（２４時間後には更に活発な生育を示した）。 III．結果Ａ．アッセイ変動一定の実験内および繰り返し試行での再現性をテストするために、該アッセイを３週間の期間内に独立に５回実施した。各実験では新たに生育した酵母細胞および新たに調製した培地を使用した。表４に掲げたサンプル含有フィルターディスクを各プレート上でアッセイした。アルギニン含有ディスクのみが生育ゾーンを生じるが、その大きさは１００μｇのアルキニンで最大ゾーンとなり、１０μ ｇで最小ゾーンを生じた。表４Ｂ．検出限界ウルトラスピラクルに対するアンタゴニストは未知である。代替物としては、アルギニン（アルギニン・パーミアーゼによる搬送をカナバニンと共に特異的に遂行する）が酵母を救済し得る化合物の最小濃度を決めるために使用された。種々濃度のアルギニン（１，２，５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，２００，４００および８００μｇ）をフィルターディスク上に置いた。１０μｇおよびそれ以上を含有するディスク周辺に生育ゾーンが目視できた。従って、スクリーニングの感度はアルギニン１０μｇである。しかし、ウルトラスピラクルに特異的なインヒビターはもっと低い限界を有すると思われる。表５はカナバニンおよびアルギニンそれぞれをスポットしたフィルターディスク周辺での細胞生育およびカナバニンの不存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）での生育につき、縮小（Ａ）あるいは拡大（Ｂ）した直径で定量化したものを示す。表５ＡＢ＊ＮＤ：検出不可ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦ、ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１およびＵｓｐ含有酵母細胞は、検出可能な阻害ゾーンを示さないＵｓｐ不含相応細胞に比べて、生育阻害のより大きなゾーンを生じることによりカナバニン（フィルターディスクにスポット）の存在に応答する（パネルＡ，Ｕｓｐ欄対ベクター欄）。これらの結果はディスク上のカナバニン５０μｇでゾーンの大きさが２７ｍｍに達したことを示す。この値は最高値に近く、多分拡散の限界である。その理由はカナバニンを１００μｇに倍増してもゾーンの拡大は３１ｍｍが限界だからである。ＹＥｐｅｃＲＥ₂−ＣＡＮ１およびＵｓｐ含有酵母細胞を更に制御してもゾーンは示さなかった。その逆のアッセイは対応する結果を生じた。ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦ、ＵｓｐおよびＣＡＮ１を発現する細胞をカナバニン含有培地上で生育させるとき、ディスク上アルギニンの存在は細胞を救済する（パネルＢ）。救済にはアルギニンおよびカナバニンの濃度が直接関係しており、カナバニン濃度が増大するにつれて、救済ゾーンを拡大させるためにより多くのアルギニンが必要となる。寒天培地中のカナバニンが５０μｇ／ｍｌでは、ディスク上１０μｇのアルギニンは１０ｍｍの小さなゾーンを生じるが、アルギニン１００μｇでは２２ｍｍのより大きなゾーンを与えた。カナバニンに対するゾーン毒性またはアルギニンによる救済は生育の１６時間後に最も顕著となり、次いでそれが背景の生育に放散していく。寒天中のカナバニン量が１ｍｇまで増加しても、完全な系をもつ酵母株の成長は妨げなかった。これに対し、野生型細胞の成長は２μｇ／ｍｌのカナバニンにより完全に抑制される。この違いは、工学株には野生株でのアルギニンパーミアーゼの少ないものが存在することに由来すると思われる。リポータープラスミドの誘発は上記表３に示すように非常に低いレベルである。第二に、細胞を殺すためには最少数のアルギニンパーミアーゼが要求される。工学株が分裂するとき、リポータープラスミドの分化分離はカナバニン感受性を与えるパーミアーゼのレベルが余りにも低い娘細胞を生じる。これらの理由は、ＣＡＮ１／ｃａｎ１二倍体細胞が中庸の感受性を示すことから、カナバニンに対する感受性は半優性であるとする報告された性質と矛盾しない。Ｃ．醗酵培地の適合性アッセイに際しての醗酵した新鮮真菌培地の効果は、２０μｌの各ブロスもしくは培地ブランクを含むフィルターディスクをテストプレート上に置くことにより決定した。対照として、１００μｇのアルギニンを含むブランク培地もテストした。表６に結果を示すように、テストした９種の培地（Ａ１，ＡＡ，Ｂ，Ｆ−１，Ｂ，Ｌ−１，ＦＭ７，ＦＭ２，およびＦＭ３については現在パール・リバーで使用している培地コードを参照する）は、それらが培養醗酵したか否かに拘わらずスクリーニングに影響しなかった。表６上記の系は合成化合物および天然物についての高処理能力スクリーニング方式において実施されている。救済の百分比は０．０１％である。非特異的なリードを除くために、推定上のリードを２μｇ／ｍｌカナバニン中で育成した野生型ＣＡＮ１株についてテストした。もし救済が起こるなら、リードは廃棄する。もしそうでなければ、それは保持され、評価を受ける。非特異的なリードは抗真菌化合物ニスタチン、アルギニンパーミアーゼを阻害する化合物、およびトリプトファンを包含し、これらは選択可能なマーカーとしてのＴＲＰ１を有するＹＥｐｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦプラスミド欠失の原因となった。この観察はＥｃＲとＵｓｐの共発現が細胞死にとって必須のものであることを示している可能性がある。推定上リードの特異性を決めるための更なる二次スクリーニングのために、ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ１，ＹＥｐＥｃＲ−Ａ，ＹＥｐＥｃＲ−Ｂ２，またはＹＥｐＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥのいずれか、およびＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１を含有する株を、ＹＥｐｃＵｓｐの存在もしくは不存在下に用いた。カナバニンに対するそれらの感受性を表７に示す。ＥｃＲイソ型はすべて１００μｇのカナバニン含有フィルターディスクの周囲に非生育ゾーン（それぞれ、３４，１７、および１７ｍｍ）を生じ、それらが不存在の場合（１２ｍｍ）に対比し得る。Ｕｓｐはそれ自身効果を持たないが（１２ｍｍゾーン）、３種のＥｃＲイソ型すべてを増強した（それぞれ、４２，３４、および２５ｍｍのゾーンを形成した）。ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦおよびＵｓｐを発現する酵母細胞は２７ｎＭの生育停止ゾーンを生じた。Ｕｓｐの存在もしくは不存在下にＥｃＲ＼ｍＡＲ−ＤＥを含有する細胞は非感受性であった。しかし、テストステロンの存在下、それらは３６ｎＭのゾーンを生じた。ＥｃＲΔＡ／Ｂ含有細胞は非感受性であり、Ｕｓｐの共発現も効果がなかった。これらの結果は、この場合Ｕｓｐが明らかにＥｃＲ−Ｂ２イソ型を増強するということを除き、β−ガラクトシダーゼの結果（表２および３）と矛盾しない。更にこれらの結果は、これらの株がリードを確認するための二次スクリーニングとして用い得ることを示している。更にこれらが示唆することは、β−ガラクトシダーゼアッセイに比較したカナバニンアッセイがやや非定量的ではあるが、より感受性であること、すなわち、ＥｃＲ−Ｂ２はＥｃＲ−Ａのようにカナバニンに対して相当の感受性を示すが（１７ｍｍゾーン）、一方、β−ガラクトシダーゼの発現誘発が弱く（それぞれ、４８０±１５０対６６９４±３１８７；表２）、Ｕｓｐ存在下でのＥｃＲ−Ｂ２は、不存在下に比べてカナバニンに対して有意に感受性の増大を示すこと（それぞれ、２５ｍｍ対１７ｍｍゾーン）、しかし、β−ガラクトシダーゼアッセイでの同じ状態では余り明確ではない（Ｕｓｐ存在による誘発は０．９±１．５、表２）ことである。表７Ａ ¹１２ｍｍを表す；²未処理および³テストステロン処理細胞結果は２つの独立したクローンの平均であり、２またはそれ以上の独立した実験からのものである。Ｂ．カナバニン感受性−非生育ゾーンＣ．β−ガラクトシダーゼ活性−ＬａｃＺ誘発Ｅ．ＲＸＲαおよびＵｓｐは酵母中で相互交換し得ないＲＸＲαは酵母中での結合およびトランス活性化においてＵｓｐと置換し得るので、ＲＸＲαをＵｓｐと置換することが推定上のリードを確認するために有用であるか否かをテストするために実験した。この実験は先ずカナバニンアッセイを用いて行い（表７、パネルＢ）、β−ガラクトシダーゼアッセイを用いて確認した（表７、パネルＣ）。この結果は、ＲＸＲαはＮ−末端切除ＥｃＲ（ＥｃＲ ΔＡ／Ｂ）をトランス活性化するが、キメラ受容体ｍＡＲ／ＥｃＲ−ＣＤＥＦについては活性化しないことを示す。これはＵｓｐの逆で、ＵｓｐはＥｃＲΔＡ／Ｂを活性化しないが、ｍＡＲ／ＥｃＲ−ＣＤＥＦを活性化する。ＵｓｐまたはＲＸＲαのいずれかの存在下または不存在下、ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１含有酵母はカナバニンに対し感受性を示さない、すなわち、１００μｇのカナバニンをスポットしたフィルターディスクの周囲に有意なゾーンを示さなかった（それぞれ、１５，１３、および１２ｍｍ）。ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１およびＥｃＲΔＡ／Ｂ含有の酵母は非生育のゾーン（２２ｍｍ）を示し、更にＵｓｐが存在しても影響を受けない（２０ｍｍ）が、ＲＸＲαが存在すると拡大する（２９ｍｍ）。これに対し、ＹＥｐＥｃＲＥ₂−ＣＡＮ１およびｍＡＲ／ＥｃＲ−ＣＤＥＦ含有の酵母はカナバニンに対して非感受性を示し、ＲＸＲαが存在しても影響を受けない（１５ｍｍゾーン）が、更にＵｓｐが存在するとより大きなゾーンを生じる（２６ｍｍ）。 β−ガラクトシダーゼを蓄積する際にも同じ様式が見られる。ＹＥｐＥｃＲＥ₂ −ＬａｃＺを単独であるいはＵｓｐまたはＲＸＲαのいずれかと共に含有する酵母から調製した細胞質ゾル抽出物は有意なレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を蓄積しない。更にＥｃＲΔＡ／Ｂが存在するとリポーター遺伝子の基礎活性化に至り（２０８５±５０９ＭＵ／ｍｇ）、これはＵｓｐの存在により影響されないか、むしろ抑制される（１３５０±２９１ＭＵ／ｍｇ）が、ＲＸＲαが存在しても増大しない（４３２０±１２３０ＭＵ／ｍｇ）。この逆はｍＡＲ／ＥｃＲ− ＣＤＥＦで真実であり、そのもの単独あるいはＲＸＲαの存在によっては影響を受けない（それぞれ、８３±２５ＭＵ／ｍｇおよび２３８±９４ＭＵ／ｍｇ）が、Ｕｓｐの存在下では増大する（７２６±２４６ＭＵ／ｍｇ）。要約すると、ＲＸＲαおよびＵｓｐは互いに交換可能ではないが、これらを含む株はアッセイにより同定したリード化合物の特異性を評価するために用いることができる。あるいは、ＲＸＲαは酵母中のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）をトランス活性化すると報告されているので、我々はＵｓｐが当該株を活性化するに際してＲＸＲ αと置換し得るか否かを決めようとして、カナバニンの感受性を決定した。予備的定量のために、我々はリポーター遺伝子としてＬａｃＺをもつプラスミドを使用した。ＶＤＲに代わると報告されたＨＲＥであるｈＯＣから誘導される２５塩基対配列の二重コピーをリポータープラスミドに挿入し、得られるリポータープラスミドＹＥｐＶＤＲＲＥ₂−ＬａｃＺを適当な酵母株中でテストした。表８に提示した結果は、ＲＸＲαとｈＶＤＲ双方を含有する酵母株の細胞質ゾル抽出物が、いずれかの受容体のみを含有する株よりもより強いβ−ガラクトシダーゼ活性、すなわち、それぞれ１３２０±５０ＭＵ／ｍｇ、５２０±３６０ＭＵ／ｍｇ、９６±９ＭＵ／ｍｇを有することを示すが、ＵｓｐとｈＶＤＲを含有するものはＵｓｐのみを含有する細胞と略同じレベル、すなわち、それぞれ４７３±１１０ＭＵ／ｍｇおよび５２０±０ＭＵ／ｍｇを有する。興味深いことに、リポーターのみをもつ細胞は１７５±５９ＭＵ／ｍｇのβ−ガラクトシダーゼ活性を有し、Ｕｓｐ単独でこのリポータープラスミドにより検出し得る転写活性を有することを示唆している。表６従って、これは核受容体にとってのヘテロ二量体パートナーとしてＲＸＲαおよびＵｓｐが相互交換し得ない酵母を用いる第二の観察である。ＥｃＲΔＡ／ＢおよびＶＤＲが何を共通に持つかを考えるとき、顕著な類似性は、ＥｃＲΔＡ／ＢがＡ／Ｂドメインをもたず、ＶＤＲは非常に小さなもの（高々２１アミノ酸）しかもたないということである。この観察はＥｃＲ−Ｂ２およびＵｓｐを用いて得た結果と矛盾しない。Ｆ．一組の天然物のスクリーニング既知の多様な活性を有する一組の天然物（６，５００サンプル）につき、各化合物１０〜２０μｇを９６穴レプリカプレートによる寒天テストプレートに移し、アッセイした。３つの化合物が生育ゾーンに囲まれた致死ゾーンを生じ、有力なリード化合物であると判定した。Ｇ．ＤＩＶＰＩＫ化合物のスクリーニングＤＩＶＰＩＫコレクション（種々の化学的分類を代表する化学化合物の収集物）中の６５９２サンプルを５〜１０μｇの量でスクリーニングした。明らかに陽性のものは検出されなかった。しかし、５つの化合物が該４種の化合物に類似の生育ゾーンに囲まれた致死ゾーンを生じた。これらの予備的ヒット品を更に二次スクリーニングに掛け、該化合物が同じ表現型を再生するかテストした。これらのヒット品はアルギニンパーミアーゼを阻害したが、ウルトラスピラクルは阻害しなかったので、陽性として得点されなかった。従って、ＤＩＶＰＩＫコレクションの化合物には特異的にウルトラスピラクルを阻害するものが見出されなかった。Ｈ．合成ライブラリーのスクリーニング合成ライブラリー中の３８，０００サンプル以上について本発明方法を用いスクリーニングした。上述のすべての特許、特許出願、物品、刊行物、および試験方法はそれらをことごとく参照することにより、その結果として具体化される。本発明の多くの改変はそれ自身、上記の詳細な説明の記載に照らして当業者に示唆を与えるだろう。そのような明白な改変は本発明においてすべて企図した範囲内のものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者キルシュ，ドナルド，アール. アメリカ合衆国ニュージャージー州 08540、プリンストン、ターハンロード 152

Claims

【特許請求の範囲】１．キイロシヨウジヨウバエ超気門（Drosophila melanogaster）蛋白（Ｕｓｐ）の機能を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)，（ｂ）および（ｃ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、（a）Ｕｓｐ結合パートナー、（ｂ）該結合パートナーと機能的複合体を形成し得るＵｓｐまたはその誘導体、および（ｃ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現には該Ｕｓｐ−Ｕｓｐ結合パートナー複合体を必要とするもの、 (ii)該形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させること、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む、前記方法。２．更に、 (iv)Ｕｓｐの機能を阻害する化合物として、該テスト培養物中で該リポーター遺伝子の発現を該対照培養物に比較して減少させる化合物を同定することを含む、請求項１に記載の方法。３．キイロシヨウジヨウバエ超気門（Drosophila melanogaster）蛋白（Ｕｓｐ）の機能を阻害する化合物を同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)，（ｂ）および（ｃ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、 (a)Ｕｓｐ結合パートナー、（ｂ）該結合パートナーと機能的複合体を形成し得るＵｓｐまたはその誘導体、および（ｃ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現には該Ｕｓｐ−Ｕｓｐ結合パートナー複合体を必要とするもの、 (ii)該形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させこと、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターし、該テスト培養物中で該リポーター遺伝子の発現を該対照培養物に比較して減少させる化合物を検出することを含む、前記方法。４．Ｕｓｐ結合パートナーが、Ｕｓｐを有する機能的複合体に存在するときのみリポーター遺伝子の発現を刺激する、請求項１に記載の方法。５．酵母が、Ｓ．セレビシエ（S．cerevisiae）およびＳ．ポンベ（S．pombe）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。６．Ｕｓｐ結合パートナーが、ｍＡＲ＼ＥｃＲ−ＣＤＥＦを含む、請求項１に記載の方法。７．リポーター遺伝子が、エクジソン−応答性転写活性化配列に操作可能状態で結合したＳ．セレビシエ（S．cerevisiae）から誘導されるＣＡＮ１をコードするＤＮＡを含む、請求項６に記載の方法。８．Ｕｓｐ結合パートナーが、ビタミンＤ受容体、レチノイン酸受容体、エクジソン受容体、甲状腺ホルモン受容体、ペルオキシソーム増殖体活性化受容体、およびＤＨＲ３８からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。９．リポーター遺伝子が、エクジソン応答因子、アンドロゲン応答因子、ビタミンＤ応答因子、レチノイン酸応答因子、ペルオキシソーム増殖体応答因子、およびその機能的誘導体からなる群より選択されたＤＮＡ配列に操作可能状態で結合したＳ．セレビシエ（S．cerevisiae）から誘導されるＣＡＮ１をコードするＤＮＡを含む、請求項８に記載の方法。１０．モニターを下記工程、すなわち、 (i)テスト培養物および対照培養物を、該対照培養物が有意な生育を示す条件下でカナバニンに接触させ、そして (ii)該対照培養物の生育に比較して、生育が阻害されているテスト培養物を検出することにより達成することを特徴とする、請求項７に記載の方法。１１．オーファン受容体の転写活性メディエイタを同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)および（ｂ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、（a）該受容体、および（ｂ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現がリガンド非依存的方法で該受容体により活性化されるもの、 (ii)該形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させ、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む、前記方法。１２．更に、 (iv)受容体の転写活性を仲介する化合物として、テスト培養物中でリポーター遺伝子の発現を対照培養物に比較して変化させる化合物を同定することを含む、請求項１１に記載の方法。１３．オーファン受容体の転写活性メディエイタを同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)および（ｂ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、（a）該受容体、および（ｂ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現がリガンド非依存的方法で該受容体により活性化されるもの、 (ii)該形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させること、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターし、該テスト培養物中で該リポーター遺伝子の発現を該対照培養物に比較して変化させる化合物を同定することを含む、前記方法。１４．オーファン受容体の転写活性メディエイタを同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)、（ｂ）および（ｃ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、（a）受容体、（ｂ）該受容体の結合パートナーであって、該結合パートナーが該受容体と複合体を形成するもの、および（ｃ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現がリガンド非依存的方法で該受容体結合パートナー複合体により活性化されるもの、 (ii)形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させること、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む、前記方法。１５．更に、 (iv)受容体の転写活性を仲介する化合物として、対照培養物に比較して培養する化合物を同定することを含む、請求項１４に記載の方法。１６．オーファン受容体の転写活性メディエイタを同定する方法であって、該方法が次の工程、即ち、 (i)下記(a)、（ｂ）および（ｃ）を含む形質転換酵母細胞を供給すること、（a）受容体、（ｂ）該受容体の結合パートナーであって、該結合パートナーが該受容体と複合体を形成するもの、および（ｃ）リポーター遺伝子であって、そのリポーター遺伝子の発現がリガンド非依存的方法で該受容体結合パートナー複合体により活性化されるもの、 (ii)該形質転換酵母細胞をテスト化合物の存在下に培養してテスト培養物を形成させること、およびテスト化合物の不存在下に培養して対照培養物を形成させること、そして (iii)該テスト培養物および対照培養物中の該リポーター遺伝子の発現をモニターし、該テスト培養物中で該リポーター遺伝子の発現を該対照培養物に比較して変化させる化合物を同定することを含む、前記方法。