JP2000515892A - 抗微生物剤として水混和性脂質誘導体を含有する栄養剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 病原微生物の感染活性を阻害するために有効な量のモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを含有する栄養組成物を提供する。栄養組成物を対象に補給する段階を含む病原微生物の感染活性の阻害方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗微生物剤として水混和性脂質誘導体を含有する栄養剤 発明の技術分野 本発明は一般に、病原微生物の感染活性に対する阻害活性をもつ物質として水 混和性脂質誘導体を含有する栄養剤の組成と、種々の栄養マトリックスにこれら の物質を配合する方法に関する。発明の背景 ある種の脂質が抗微生物作用をもつことは従来報告されている（Ｋａｂａｒａ ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｉｐｉ ｄｓ，ｅｄ．１９８７及びＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ,Ｖｏｌ．６，Ｊｕｌｙ，１９９５）。抗菌及び抗ウイルス活性をもつと報告さ れている脂質は高親油性であり、２〜４のＨＬＢ値をもち、恐らく感染生物の脂 質エンベロープ又は膜に作用し、生物の透過性を変化させて感染性を低下させる と思われる。 しかし、これらの脂質は高親油性であり、水溶液に溶けないため、予防試験を 実施するのは難しい。溶解度の問題は、エタ ノールやジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非水性溶剤を使用することによ りある程度まで解決することができる（Ｉｓａａｃｓ，ＬｉｔｏｖとＴｈｏｒｍ ａｒ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５）。しか し、このような溶剤はヒト又は動物に使用するのは不適切な場合が多い。例えば 、エタノールとＤＭＳＯは乳児には使用できない。 既存の抗微生物脂質の使用に伴う別の問題は、抗微生物作用がタンパク質の存 在下で阻害又は大幅に低減することである（Ｋａｂａｒａ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，ｅｄ．１９８７ ；及び米国特許第４，００２，７７５号，Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄ ｅｒｉｖａｔａｉｖｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ， １９７７）。このため、このような脂質は経腸栄養剤中に存在するようなタンパ クと併用投与することができない。従って、水性製剤に可溶性であり、抗菌及び 抗ウイルス活性が無傷のタンパクにより悪影響を受けない抗微生物脂質が当該技 術分野で依然として必要とされている。発明の要約 本発明は、病原微生物の感染活性を阻害するために有効な量 の水混和性脂質誘導体を含有する栄養剤を提供する。感染活性とは、特に細菌及 びウイルス活性を意味し、従って、抗微生物とは抗菌と抗ウイルスの両者を意味 する。 好ましい水混和性脂質誘導体はモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エス テルである。モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルはＧＲＡＳ乳化 剤として使用され、ＤＡＴＥＭとして知られているものでもよいし、脂肪酸含量 の９０％以上が単一脂肪酸により占められる同類の新規エステルでもよい。後者 形態のモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを使用する場合には、 脂肪酸成分は好ましくは８〜２４個、より好ましくは約１０〜約２０個の炭素原 子を含む。脂肪酸は飽和、不飽和又はヒドロキシル化されていてもよい。 本発明は更に、該当治療を必要とする対象における病原微生物の感染活性の阻 害方法も提供する。この方法によると、有効量の本発明の栄養剤を対象に投与す る。発明の詳細な説明 Ｉ．栄養剤 本発明は、病原微生物の感染活性を阻害するために有効な量の水混和性脂質誘 導体を含有する栄養剤を提供する。水混和性 脂質誘導体はエステル又はエーテル結合を介して親水性部分に結合した親油性部 分を含む。親油性部分は脂肪酸、モノアシルグリセロール（モノグリセリド）、 ジアシルグリセロール（ジグリセリド）、モノエーテルグリセロール誘導体又は ジエーテルグリセロール誘導体を含む。親水性部分は有機酸、有機アルコール又 はその塩を含む。 １態様において水混和性脂質誘導体は、グリセロール炭素原子の１個又は２個 がアルキル又はアシル基に結合し、残りのグリセロール炭素原子の少なくとも１ 個がエステル結合を介して有機酸に結合したモノ／ジグリセリドである。好適態 様において、有機酸はアセチル基を付けた酒石酸である。この態様によると、水 混和性脂質誘導体はモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルである。 このようなモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとしては、当該 技術分野でＤＡＴＥＭとして知られる食品用ＧＲＡＳ乳化剤がある。ＤＡＴＥＭ はジアセチル酒石酸を食用油、脂肋又は脂肪形成脂肪酸の部分グリセリドと反応 させることにより形成される。ＤＡＴＥＭの製造に用いられるグリセリド源とし ては、大豆油、ヤシ油、ヒマワリ油、牛脂及びモノグ リセリドが挙げられる。ＤＡＴＥＭは市販品としても得られる。 例えば、ＤＡＴＥＭ ＳＯＹ、Ｐａｎｏｄａｎ ＦＤＰ Ｋｏｓｈｅｒ（完全水 素化大豆油から誘導）、ＤＡＴＥＭ ＳＵＮＦ、ＳＤＫ（非水素化ヒマワリ油か ら誘導）、ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２（９０％Ｃ₁₂モノグリセリドから誘導）及びＤＡ ＴＥＭ−Ｃ０８（９０％Ｃ₈モノグリセリドから誘導）がＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎ ｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから市販されている 。 別の態様では、水混和性脂質誘導体は下式Ｉに対応する。 式Ｉ中、Ｒ^A及びＲ^Bの各々は独立して水素、炭素原子数６〜２６のアシル基（ Ｃ₆−Ｃ₂₆アシル）、炭素原子数６〜２６のアルキル基（Ｃ₆−Ｃ₂₆アルキル）又 は無機アニオンであり得る。このようなアニオンの例はハロゲン化物、硝酸、硫 酸及びリン酸である。アシル及びアルキル基は飽和、不飽和又はヒドロキシル化 されていてもよい。好ましくは、アシル及びアルキ ル基は炭素原子数８〜２４、より好ましくは１０〜２０である。Ｒ^AとＲ^Bはグリ セロール主鎖のＣ^A、Ｃ^B又はＣ^C炭素の任意のものと結合することができる。同 様に、有機酸部分（式Ｉでは酒石酸として示す）も、アシル又はアルキル基に結 合していないＣ^A、Ｃ^B又はＣ^C炭素の任意のものと結合することができる。当業 者に自明の通り、酒石酸の代わりに他の有機酸を使用してもよい。Ｒ^C及びＲ^Dの 各々は独立しては飽和、不飽和又はヒドロキシル化されていてもよい炭素原子数 ２〜６のアシル又はアルキル基であり得る。Ｒ^C及びＲ^D基の例はアセチル及びス クシニルエステルである。式Ｉの化合物において総脂肪酸含量の９０％以上は単 一脂肪酸の形態である。 Ｒ^A又はＲ^Bの一方のみがアシル基である場合には、分子はモノアシルグリセロ ール（又はモノグリセリド）誘導体である。Ｒ^AとＲ^Bの両方がアシル基である場 合には、分子はジアシルグリセロール（又はジグリセリド）誘導体である。Ｒ^A 又はＲ^Bの一方のみがアルキル基である場合には、分子はモノエーテルグリセロ ール誘導体であり、Ｒ^AとＲ^Bの両方がアルキル基である場合には、分子はジエー テルグリセロール誘導体である。Ｒ^AとＲ^Bは１個のアシル基と１個のアルキル基 でもよい。アシル 基はエステル結合によりグリセロール主鎖に結合しており、アルキル基はエーテ ル結合よりグリセロール主鎖に結合している。 式Ｉの好ましい態様において、Ｒ^AはＣ₈−Ｃ₂₄アシルであり、Ｒ^Bは水素であ り、Ｒ^C及びＲ^Dはいずれもアセチルであり、脂質はモノグリセリドのジアセチル 酒石酸エステルである。 本明細書で使用する「ＤＡＴＥＭ」なる用語は、当該技術分野でＧＲＡＳ乳化 剤として知られており、ＦＤＡ及びＥＥＣにより乳化剤として認可されている脂 質を意味する。これらのＤＡＴＥＭは脂肋酸混合物を含むことを特徴とする。「 モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル」なる用語はＤＡＴＥＭと式 Ｉにより上記に定義した新規脂質を意味する。 モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルは当該技術分野で周知の標 準技術を使用して製造される（例えばＳｃｈｕｓｔｅｒとＡｄａｍｓ，Ｒｅｖ． Ｆｒ.Ｃｏｒｐｓ Ｇｒａｓ，２９（９）：３５７−３６５，１９８１参照）。 食用脂肪のグリセリド又は脂肪酸から製造されるモノ及びジグリセリドのジアセ チル酒石酸エステルは種々の異性体形態で存在し得る（例えばＦｏｏｄ Ｅｍｕ ｌｓｉｏｎｓ，第２版，増補改訂版， ＬａｒｓｓｏｎとＦｒｉｂｅｒｇ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０参照）。従って、式Ｉの脂質は種々の異性体形態で 存在し得る。 別の態様によると、水混和性脂質誘導体は脂肪酸アシルラクチレート又はその 塩等の改質グリセリドである。このような特定ラクチレート（例えばナトリウム ステアロイル−２−ラクチレート）は周知ＧＲＡＳ乳化剤、安定剤及びドウコン ディショナーである。ラクチレートの脂肪酸成分は任意脂肪酸とすることができ 、ステアリン酸に限定されない。ラクチレートの好ましい脂肪酸成分はラウリン 酸である。脂肪酸アシルラクチレートは当該技術分野で周知の標準手順を使用し て製造することができる（例えばその開示内容を参考資料として本明細書の一部 とする米国特許第４，１４６，５４８号参照）。 本発明の栄養剤は特定用途に必要な量の食品主要栄養素、ビタミン及びミネラ ルを含有する。このような成分の量は、製剤を健常乳幼児又は成人に使用するか 、所定の疾病症状（例えば代謝障害）をもつなど特殊要求のある対象に使用する かによって異なる。本発明の栄養剤で使用する成分は半精製又は精製起源のもの であることが当業者に理解されよう。半精製又は精製 とは、天然材料の精製又は合成により製造された物質を意味する。これらの技術 は当該技術分野で周知である（例えばＣｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇ ｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏ ｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ；Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｄｉｅｔａｒｙ Ａｌ ｌｏｗａｎｃｅｓ，第１０版，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９８９参照）。 好ましい態様によると、本発明の栄養剤は乳児用経腸栄養剤である。従って、 本発明の別の側面では、乳児に補給するのに適した栄養剤が提供される。製剤は モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルに加え、乳児の１日栄養必要 量を提供するように意図された量の主要栄養素、ビタミン及びミネラルを含む。 母乳又は乳児用製剤中の抗微生物成分は補給中及び補給後のこれらの成分の吐出 及び吸入の結果として乳児の気道に直接到達し得ることに留意されたい。こうし て気道の粘膜は直接防御を獲得することができる。 主要栄養素は、食用脂肪、炭水化物及びタンパクを含む。食用脂肪の例はココ ナツ油、大豆油並びにモノ及びジグリセリド である。炭水化物の例はグルコース、食用ラクトース及び水解コーンスターチで ある。典型的なタンパク源は大豆タンパク、電気透析乳漿もしくは電気透析スキ ムミルクもしくは乳漿、又はこれらのタンパクの水解物であるが、他のタンパク 源も入手でき、利用できる。これらの主要栄養素はエネルギー基準即ち１カロリ ー当たりの基準で母乳中に存在する量と等価の量を一般に許容されている栄養化 合物の形態で加えることが好ましい。 乳児用製剤はビタミン及びミネラルとして、カルシウム、リン、カリウム、ナ トリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨード、 ビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ複合体を含むことが好ましい。 乳児用製剤は減菌後、即補給（ＲＴＦ）してもよいし、濃縮液又は粉末として 貯蔵してもよい。粉末は上記のような乳児用製剤を噴霧乾燥することにより製造 することができ、濃縮物を再水和することにより製剤を再構成することができる 。乳児用栄養剤は当該技術分野で周知であり、市販されている（例えばＲｏｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ製品Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。 本発明の組成物中のモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル成分の 実際の用量レベルは、特定組成物及び投与方法に所望の予防応答を得るために有 効な量の活性成分が得られるように変えることかできる。従って、選択される用 量レベルは所望の治療効果、投与経路、所望の治療期間及び他の因子に依存する 。 水混和性エステル化誘導体がモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステ ルである好ましい態様では、栄養剤に使用する有効抗微生物量は約１，０００〜 約５，０００ｍｇ／ｌ（μｇ／ｍｌ）である。栄養剤が無傷のタンパクを含む場 合には、より好ましいレベルは約２，０００〜約４，０００ｍｇ／ｌである。栄 養剤がカゼイン等のタンパク水解物を含む場合には、有効な抗菌濃度は約１，５ ００〜約３，０００ｍｇ／ｌである。水混和性エステル化モノ及びジグリセリド 誘導体の量は栄養組成物中に存在する総脂肪の１０％以下とすることが好ましい 。水混和性誘導体は総脂肪の６％以下とすると一層好ましい。栄養剤がタンパク を含む場合には、水混和性脂質とタンパクの重量比は約１：４．２以上である。 ＩＩ．病原微生物の阻害方法 別の側面において、本発明は該当治療を必要とする対象で病原微生物により起 因する感染を阻害する方法も提供する。本方法によると、本発明の栄養組成物を 対象に補給する。このような組成物としては上記に記載したものが好ましい。好 ましい対象は乳児である。 本明細書に開示するように、本発明の製剤は病原微生物の感染活性を阻害する ために使用することができる。本明細書で使用する「阻害」なる用語は治療又は 予防を意味する。病原微生物は原生動物、真菌、寄生虫、細菌又はウイルスであ り得る。栄養剤は上部胃腸管、気道又は耳の感染を阻害するのに特に有効である 。本明細書で使用する「上部胃陽管」なる用語は口、咽喉、食道、胃及び十二指 胴を意味する。本明細書で使用する「気道」なる用語は鼻、鼻腔洞、耳管、中耳 、口、咽喉、気管及び他の気道と肺（肺胞を含む）を意味する。本発明の方法は 鼻、口、鼻腔洞、咽喉、中耳、胃及び肺のウイルス感染を阻害するのに特に有用 である。 本明細書に開示するように、水混和性脂質誘導体は広範なウイルスに起因する 感染に対する殺ウイルス剤である。このよう なウイルスの例はインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｉ型 単純ヘルペスウイルス、水庖性口内炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ Ｖ）及びＲＳウイルス（ＲＳＶ）である。ＲＳＶは乳幼児の急性気道感染の単独 最大原因である。１歳未満の乳児の罹患率が最も高く、重篤である。大半の免疫 正常対象ではＲＳＶ感染は気道粘膜に限られ、細気管支炎、肺炎及び反応性気道 疾患の発症に結び付けられる。免疫機能低下対象におけるＲＳＶ感染は最近まで 乳児高死亡率と他の年齢群の高罹患率に結び付けられている。高齢者で急性呼吸 疾患の発生率が高く死亡数の多い期間を追跡調査すると、２〜３週間以内に多数 のＲＳＶ又はインフルエンザウイルスが分離されたと報告されている（Ｐｅｄｉ ａｔｒｉｃ Ｎｏｔｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ，１９９４）。分析によると、ＲＳＶ は高齢者の罹病及び死亡の原因となるインフルエンザウイルスとして重要である 。 同様に本明細書に開示するように、水混和性脂質誘導体はグラム陽性菌及びグ ラム陰性菌を含む広範な細菌に起因する感染に対して有効な殺菌剤である。この ような細菌の例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈ ｅｌｉｃ ｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、 Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、 Ｐｒｏｖｉｄｅｎｓｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ ｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ及びＥｓ ｃｈｅｒｉｃｉａ属の細菌である。細菌の具体例は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅ ｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．ｂｏｖｉｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇ ｅｎｅｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔ ｉｓ、Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ及びＨ．ｐｙｌｏｒｉである。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）は、通常は鼻咽頭侵入による感染開始後、エアゾール化して気道に伝播す るグラム陽性球菌である。臨床症状は局所及び全身感染であり、中耳炎、肺炎、 敗血症及び髄膜炎が挙げられる（Ｇｅｅｌｅｎ，Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及 びＴｕｏｍａｎｅｎ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９ ３；Ｃｕｎｄｅｌｌ，Ｗｅｉｓｅｒ，Ｓｈｅｎ，Ｙｏｕｎｇ及びＴｕｏｍａｎｅ ｎ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９５）。また、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは小 児科来診の３分の１以上を占める乳幼児の一般重要疾患である中耳炎（ＯＭ）の 単独最大原因である（ＴｈｏｅｎｅとＪｏｈｎｓｏｎ，１９９１；Ｋａｌｅｉｄ ａ，Ｎａｔｉｖｉｏ，Ｃｈａｏ及びＣｏｗｄｅｎ，Ｊｒ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３）。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｉｎｆ ｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）も乳児と低年齢幼児の中耳炎の原 因となることが知られている一般細菌物質である。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐ ｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）は米国の６０歳の人口の５０％（Ｂｌａｓｔｅ ｒ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１９９２） と開発途上国の５歳以下の幼児の９０％（Ｔｈｏｍａｓら，Ｌａｎｃｅｔ，１９ ９２）に感染する微好気性グラム陰性菌である。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは胃炎の主原 因であり、消化性潰瘍の病因に重要な役割を果たし、胃癌の危険因子である。 以下、実施例により本発明の好ましい態様を具体的に説明するが、これによっ て請求の範囲及び明細書を限定するものではない。 実施例１：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するモノ及びジグリセリドのジアセチ ル酒石酸エステルの殺菌効果 殺菌アッセイ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）（６３０３系、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＴＳＡ ＩＩ（５％ヒツジ血液添 加）寒天プレートで一晩培養し、約１８時間後に滅菌ダルベッコリン酸緩衝液（ Ｄ−ＰＢＳ）１０ｍｌを使用して回収した。細菌懸濁液を室温で１５分間５９５ ×ｇで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを滅菌Ｄ−ＰＢＳ２ｍｌに再懸濁し た。再懸濁した懸濁液を２本の滅菌微小遠心バイアルにピペットで分注し、エッ ペンドルフ微小遠心管（８８００×ｇ）を使用して４分間遠心分離した。上清を 捨て、細菌ペレットを滅菌ＰＢＳ２ｍｌに再懸濁した。 細菌数は一般に１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／μＬであった。各試験物 質と対照１８０μＬを滅菌微小遠心バイアルに加えた後、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ懸濁液２０μＬ（９部乳児用製剤：１部細菌懸濁液）を加えた。各バイアル を混合し、 ３７℃で１時間インキュベートした。次に、各試験物質１００μＬをＴＳＡ Ｉ Ｉ寒天にプレーティングし、接種材料を寒天表面に広げた。 初期細菌懸濁液を１０^-4、１０^-5、１０^-6、１０^-7及び１０^-8の最終希釈率ま で連続希釈することにより接種材料を定量し、ＴＳＡ ＩＩ寒天にプレーティン グした。次にプレートを転倒し、３７℃／ＣＯ₂５％インキュベーターで１８〜 ２４時間インキュベートした。各プレートの細菌増殖を増殖対非増殖として記録 した。一部のアッセイでは製剤−細菌懸濁液比を６．６部乳児用製剤対３．３部 細菌懸濁液に変え、アッセイの最終タンパク濃度を１３．５ｍｇ／ｍＬから９． ９ｍｇ／ｍＬに変えた。 試験物質 モノグリセリドＣ１２：０は、Ｃ１２：０のモノエステルを最低９０％含むも のをＧｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄａｎｉｓｃｏから入手した 。ＤＡＴＥＭ ＳＯＹ，Ｐａｎｏｄａｎ ＦＤＰ ＫｏｓｈｅｒはＤａｎｉｓｃ ｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手し た。これは完全水素化大豆油から誘導される（Ｕ．Ｓ． ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭＳＵＮＦ,ＳＤＫは Ｄａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏ ｎから入手した。ＳＤＫは非水素化ヒマワリ油から誘導される（Ｕ．Ｓ．ＤＡＴ ＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２はＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓから入手し、９０％Ｃ１２モノグリセリドから誘導さ れる。ＤＡＴＥＭ−Ｃ０８はＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓから入手 し、Ｈｕｌｌｉｓ Ａｍｅｒｉｃａから入手した９０％Ｃ８モノグリセリドから 誘導される。 これらの試験の結果を下表１及び２に要約する。 S．pneumoniae接種材料は６．８ｌｏｇ₁₀であった。 表１及び２のデータが示すように、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステ ルは水性経腸製剤中でＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ殺菌剤として有効である。デー タは更に、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの殺菌作用がタンパク質 の存在下で維持されることも示す。低タンパク濃度（９．９ｍｇ／ｍｌ）で試験 したモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの各々はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅに対して有意殺菌活性を示した。Ｃ₁₂モノグリセリドから製造したＤＡＴＥ Ｍ−Ｃ１２のみは６．８ｌｏｇ₁₀の接種材料で乳児用製剤中に通常存在するタン パク濃度で殺菌活性を示した。動物試験 ２種のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株(夫々５．７２及び４．７４ｌｏｇ₁₀接種 材料用量のＳｐ ＤＢ３１とＳｐ ＤＢ４０)の一方を含む種々の試料を新生（ ２４時間齢）ラット（各群１０匹）に接種した。これらの混合物は鼻腔内接種前 に３７℃で１時間インキュベートした。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ接種から２４ 時間後にラットの鼻咽頭洗浄液を採取し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ集団を分析 した。３種の異なる試料、即ち対照としてＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＲＴＦ単 独、基本対照に３６５０ｍｇ／Ｌ ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２を加えたもの、及びＤＡ ＴＥＭ−Ｃ１２（１８２５ｍｇ／Ｌ）とヒマワリモノグリセリド（５０００ｍｇ ／Ｌ）を加えたものを試験した。これらのｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を下表３に 要約する。 表３のデータが示すように、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルは単 独でＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染のｉｎ ｖｉｖｏ抑制に有効であり、ＤＡＴ ＥＭ−Ｃ１２とモノグリセリドを併用すると最大の殺菌活性が得られた。 実施例２：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対するモノ及びジ グリセリドのジアセチル酒石酸エステルの殺菌効果 上記実施例１に記載した手順を使用して、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの殺菌効果をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験 した。これらの試験の結果を下表４に要約する。 表４のデータが示すように、モノグリセリドのジアセチル酒 石酸エステルはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する有効な殺菌剤である。更に、 ９０％Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＲＴＦ製剤を使用すると、モノグリセリドの ジアセチル酒石酸エステルはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して不活性であるこ とが判明した。 実施例３：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｖｌｏｒｉに対するモノ及びジグリセ リドのジアセチル酒石酸エステルの殺菌効果 下記手順を使用してＨ．ｐｙｌｏｒｉに対するモノグリセリドのジアセチル酒 石酸エステルの殺菌効果をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験した。 一連の濃度の試験化合物をＨ．ｐｙｌｏｒｉ培地に加えることによりＭＩＣ（ 最小発育阻止濃度）を測定した。３７℃で５日間インキュベーション後、培地の 不透明度によりＨ．ｐｙｌｏｒｉ増殖を判定した。５０％Ｓｉｍｉｌａｃ（登録 商標）を使用した場合には、ＭＩＣは測定できなかった。試験化合物をＨ．ｐｙ ｌｏｒｉ培地に加え、３７℃で４時間インキュベートすることにより、ＭＢＣ（ 最小殺菌濃度）を測定した。混合物のアリコートをＨ．ｐｙｌｏｒｉ培地にプレ ーティングした。殺菌増殖を終点とした。 これらの試験の結果を下表５に要約する。 表５のデータが示すように、細菌培地及びＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）におけ るＤＡＴＥＭ−Ｃ１２のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）とＭＢＣ（最小殺菌濃度） は、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルがＨ．ｐｙｌｏｒｉの発育を阻 止するのに強力な化合物であることを示している。データは更に、Ｓｉｍｉｌａ ｃ（登録商標）がＨ．ｐｙｌｏｒｉに対するＤＡＴＥＭ−Ｃ１２の殺菌活性に影 響を与えないことも示す。 実施例４：ＨＥｐ−２細胞におけるＲＳウイルス感染の水性溶剤中水混和性脂質 誘導体による阻害 ＨＥｐ−２（ヒト咽頭上皮癌細胞）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ）から入手した。ＨＥ ｐ−２細胞を９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ． ）に細胞１０，０００個／ウェルの密度で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ ）を補充したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地で培養した。単層がコンフ ルエントになるまでＨＥｐ−２プレートを５％ＣＯ₂：９５％空気の大気中で加 湿インキュベーターで３７℃で２日間インキュベートした。所望の最終濃度の２ 倍に調製したＲＳＶストックと試料を等容量でプレミックスし、２〜８℃で１時 間インキュベートした。ウイルスストックは、ウイルス阻害剤を含まない対照ウ ェルで約９０％の細胞死を生じるように調製した。無血清最少必須培地で予め洗 浄したＨＥｐ−２単層を含むウェルに１００μＬのウイルス／試料混合物を加え た。プレインキュベーション混合物を細胞単層に２時間吸収させた後、捨て、無 血清最少必須培地に交換した。細胞／ウイルスプレートを３７℃で４日間インキ ュベートした後、ウイルスにより誘導された細胞変性効果を定量した。 ウイルス接種材料にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料の２０％溶 液１００μＬを加えることにより、細胞生存率を各ウェルでスペクトロフォトメ トリーにより定量した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料は増殖培地の代謝還元を測 定する酸化／還元色指示薬を使用して生細胞の代謝活性を測定する。細胞代謝活 性は青から赤への変色により示される。５７０ｎｍから６００ｎｍ波長を差し引 く二重終点フォーマットを使用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｅ ｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）プレートリーダーで、３７℃で４時間インキュベート したプレートを読み取った。細胞生存百分率は試料のウイルス阻害百分率に直接 相関する。各ウェルの細胞生存百分率はウイルス細胞を含まない対照を基準にし て計算した。４個のウェルの反復を使用して各試料を試験した。ウイルスの存在 下及び不在下で試験物質を含まない対照ウイルスは８個のウェルの反復で試験し た。 試験物質 非水素化ヒマワリ油のモノグリセリドは、アッセイによるとヒマワリ油から誘 導されるモノエステル９０％を含有し、７.０％グリセロールモノパルミテート Ｃ１６：０、４．５％グリセロールモノステアレートＣ１８：０、１８．７％グ リセロールモノオレエートＣ１８：１、６７．５％グリセロールモノリノレ エートＣ１８：２の脂肪酸分布をもつＭｙｖｅｒｏｌ １８−９２蒸留グリセロ ールモノリノレエートとしてＥａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。 モノグリセリドＣ１２：０は最低９０％のＣ１２：０モノエステルを含むものを Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄａｎｉｓｃｏから入手した。Ｄ ＡＴＥＭ ＳＯＹ，Ｐａｎｏｄａｎ ＦＤＰ ＫｏｓｈｅｒはＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｇｒｉｎｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手した。こ れは完全水素化大豆油から誘導される（Ｕ．Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭ ＰＡＬＭ，Ｍｙｖａｔｅｍ ３５はＥａｓｔｍａ ｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した。これは完全水素化ヤシ油から誘導 される（Ｕ．Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭ ＳＵＮＦ，ＳＤＫはＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅ ｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手した。ＳＤＫは非水素化ヒマワリ油から誘導され る(Ｕ．Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ)。ＤＡＴＥＭ ＢＥＥ ＦはＨｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．から入手し、完全水素化牛脂から誘導される（Ｅ ＵＲＯＰＥＡＮ ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。 ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２はＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓから入手し、９ ０％Ｃ₁₂モノグリセリドから誘導される。ＤＡＴＥＭ−ＣＯ８はＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓから入手し、Ｈｕｌｌｉｓ Ａｍｅｒｉｃａから入手 した９０％Ｃ₈モノグリセリドから誘導される。 種々の形態の乳児用栄養剤（Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標））に試験化合物を加 えることにより種々の試験物質を調製した。試料を手で震盪した後、２５８°Ｆ の最低生成物温度と６以上のＦ₀でＳｔｅｒｉｔｏｒｔ連続滅菌器シミュレータ ー（ＦＭＣ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して滅菌した 。Ｓｔｅｒｉｔｏｒｔシステムは勾配水予熱、飽和水蒸気加熱及び勾配水冷を順 次使用する。全サイクルは連続撹拌下に実施した。（抗ＲＳＶ活性を含むことが 従来認められている）カラゲナンを製剤から除去し、試験物質を試験できるよう にした。プレインキュベーション混合物を細胞単層に２時間吸収させた後、捨て 、無血清最少必須培地に交換した。これらの細胞培養試験の結果を下表６に要約 する。 表６のデータは希釈細胞培地中乳児用製剤とウイルスの１：１混合物を使用し て得た。これらのデータから明らかなように、モノグリセリドのジアセチル酒石 酸エステルはタンパクを含有する乳児用栄養剤中で有意な抗ＲＳＶ活性をもつ。 抗ＲＳＶ活性が無希釈乳児用製剤で消滅しないことを確かめるために、細胞培地 の代わりにウイルスを乳児用製剤で直接希釈し、上述のようにウイルス中和アッ セイを行う追加試験を実施した。Ｃ₈モノグリセリドから誘導されるものを除く 全てのモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルは乳児用製剤で活性を維持し た。 種々の形態のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの抗ＲＳＶ活性を比 較するために、種々の油を使用することにより脂肪酸鎖の長さと飽和度の異なる ４形態のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを製造するようにＤＡＴＥ Ｍ製造業者に依頼した。これらのモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル形 態は、ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２：０、ＤＡＴＥＭ−ＰＡＬＭ ＯＩＬ、ＤＡＴＥＭ− ＳＵＮＦＬＯＷＥＲ ＯＩＬ及びＤＡＴＥＭ−ＳＯＹであった。各形態のモノグ リセリドのジアセチル酒石酸エステルを各々Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）と混合 し、ＲＳＶ感染性に対する活性を上述のように測定した。これらの試験の結果を 下表７に要約する。 表７のデータが示すように、種々の脂肪から製造したモノグリセリドのジアセ チル酒石酸エステルはいずれも乳児用製剤中でＲＳＶ感染に対する阻害活性をも つ。 実施例５：コットンラットのＲＳＶ感染のｉｎ ｖｉｖｏ予防 コットンラットはＲＳＶ研究動物モデルとして約２０年来使用されている。コ ットンラットはＲＳＶに感染した乳児に観察されると同様の肺病変をもつ（Ｐｒ ｉｎｃｅら，１９７８）。また、ＲＳＶワクチン接種したコットンラットをＲＳ Ｖに暴露すると、乳児と同様の重度組織損傷を生じる（Ｐｒｉｎｃｅら，１９８ ６）。静脈内投与ＲＳＶ−ＩｇＧが予防効果を発現するためには≧１：１００濃 度の力価に達する必要があることもわかっている（Ｐｒｉｎｃｅら，１９８５） 。乳児で同一血清濃度のＲＳＶ−ＩｇＧは防御性である（Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓら ，１９９３，１９９５）。これらの類似により、ＦＤＡはコットンラットをＲＳ Ｖ研究に適切なモデルとして推奨している。 ＲＳＶを鼻及び肺に反復感染させるために、高いＲＳＶ用量（１０⁴ｐｆｕ／ 匹）を全動物に鼻腔内接種した。接種材料（１００μＬ）はＲＳＶストック溶液 ５０μＬと試験物質５０μＬから構成した。カラゲナン、大豆レシチン又はＭｙ ｖｅｒｏｌ （改質Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）又はＭ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標））を含 まない乳児用製剤に、試験物質としてモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステ ル、モノグリセリド（ＭＧ）及びカラゲナンを夫々懸濁した。更に、無傷のタン パクをカゼイン水解物（Ａｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））で置き換えた乳児用 製剤も試験した。全動物に全実験期間にわたって普通齧歯類飼料を与えた。ＲＳ Ｖ攻撃から４日後に全動物を殺した。肺及び鼻組織を取り出し、ＲＳＶ力価を測 定した。正の対照として５％ＲＳＶ−ＩｇＧを常に使用した。各実験で負の対照 群（ＲＳＶ攻撃前後に無処理）も使用した。負の対照群からの肺及び鼻組織にお けるＲＳＶ力価はデータを評価するために安定して高レベルでなければならない 。また、実験データを評価するために、正の対照群からの肺及び鼻組織での非常 に低いＲＳＶ力価も使用した。これらの試験の結果を下表８に要約する。 表８のデータが示すように、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルはＲ ＳＶ感染をｉｎ ｖｉｖｏ阻害する。データは更に、モノグリセリドのジアセチ ル酒石酸エステルとＭＧが相乗作用してＲＳＶ活性を阻害することも示す。水中 又は油中でモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとＭＧをプレミックスし ても抗ＲＳＶ活性は変化しない。モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルは 無傷のタンパクの存在下（Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標））及び不在下（Ａｌｉｍ ｅｎｔｕｍ（登録商標））のいずれでも乳児栄養剤における有効な殺ウイルス剤 である。 実施例６：水性溶剤中の水混和性脂質誘導体によるＨＥｐ−２細胞のＲＳＶ感染 の阻害 ヒト咽頭上皮癌細胞ＨＥｐ−２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。９６穴 プレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）に細胞１０，００ ０個／ウェルの密度でＨＥｐ−２を播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補 充したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地で培養した。単層がコンフルエン トになるまでＨＥｐ−２プレートを５％ ＣＯ₂：９５％空気の大気中で加湿インキュベーターで３７℃で２日間インキュ ベートした。所望の最終濃度の２倍に調製したＲＳＶストックと試料を等容量で プレミツクスし、２〜８℃で１時間インキュベートした。ウイルスストックは、 ウイルス阻害剤を含まない対照ウエルで約９０％の細胞死を生じるように調製し た。無血清最少必須培地で予め洗浄したＨＥｐ−２単層を含むウェルに１００μ Ｌのウイルス／試料混合物を加えた。細胞／ウイルスプレートを３７℃で４日間 インキュベートした後、ウイルスにより誘導された細胞変性効果を定量した。 ウイルス接種材料にＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料の２０％溶液１００μＬを加 えることにより、細胞生存率を各ウェルでスペクトロフォトメトリーにより定量 した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ染料は増殖培地の代謝還元を測定する酸化／還元 色指示薬を使用して生細胞の代謝活性を測定する。細胞代謝活性は青から赤への 変色により示される。５７０ｎｍから６００ｎｍ波長を差し引く二重終点フォー マットを使用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ，ＣＡ）プレートリーダーで、３７℃で４時間インキュベートしたプレートを読 み取った。細胞生存百分率は試料のウイルス阻害百分率に直接相関 する。各ウェルの細胞生存百分率はウイルス細胞を含まない対照を基準にして計 算した。４個のウェルの反復を使用して各試料を試験した。ウイルスの存在下及 び不在下で試験物質を含まない対照ウイルスは８個のウェルの反復で試験した。 試験物質 非水素化ヒマワリ油のモノグリセリドは、アッセイによるとヒマワリ油から誘 導されるモノエステル９０％を含有し、７.０％グリセロールモノパルミテート Ｃ１６：０、４．５％グリセロールモノステアレートＣ１８：０、１８．７％グ リセロールモノオレエートＣ１８：１、６７．５％グリセロールモノリノレエー トＣ１８：２の脂肪酸分布をもつＭｙｖｅｒｏｌ １８−９２蒸留グリセロール モノリノレエートとしてＥａｓｔｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。モノ グリセリドＣ１２：０は最低９０％のＣ１２：０モノエステルを含むものをＧｒ ｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｄａｎｉｓｃｏから入手した。ＤＡＴ ＥＭ ＳＯＹ，Ｐａｎｏｄａｎ ＦＤＰ ＫｏｓｈｅｒはＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎ ｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手した。これ は完全水素化大豆油から誘導される（Ｕ．Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡ ＴＩＯ ＮＳ）。ＤＡＴＥＭ ＰＡＬＭ，Ｍｙｖａｔｅｍ ３５はＥａｓｔｍａｎ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した。これは完全水素化ヤシ油から誘導される（ Ｕ．Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭ ＳＵＮＦ ，ＳＤＫはＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉ ｖｉｓｉｏｎから入手した。ＳＤＫは非水素化ヒマワリ油から誘導される(Ｕ． Ｓ．ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ)。ＤＡＴＥＭ ＢＥＥＦはＨ ｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．から入手し、完全水素化牛脂から誘導される（ＥＵＲＯ ＰＥＡＮ ＤＡＴＥＭ ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ）。ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２ 及びＤＡＴＥＭ−Ｃ０８は夫々９０％Ｃ₁₂モノグリセリド及び９０％Ｃ₈モノグ リセリドから誘導される。これらの２種のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エ ステルはＲｏｓｓｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの特注によりＤａｎｉｓｃｏ Ｉｎｇｒｅｄｉｅ ｎｔｓ，Ｇｒｉｎｓｔｅｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎに製造依頼した。 試験化合物をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に加えることにより種々の試験物質を調 製した。試料を手で震盪した後、２５８°Ｆの 最低生成物温度と６以上のＦ₀でＳｔｅｒｉｔｏｒｔ連続滅菌器シミュレーター （ＦＭＣ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して滅菌した。 Ｓｔｅｒｉｔｏｒｔシステムは勾配水予熱、飽和水蒸気加熱及び勾配水冷を順次 使用する。全サイクルは連続撹拌下に実施した。ＰＢＳ中モノグリセリドのジア セチル酒石酸エステルを使用した細胞培養試験の結果を表９に要約する。 表９のデータが示すように、非水素化ヒマワリ油から誘導したモノグリセリド Ｃ₁₈、モノグリセリドＣ₁₂及び数種の起源から誘導したモノグリセリドのジアセ チル酒石酸エステルはいずれも哺乳動物細胞のＲＳＶ感染を用量依存的に阻害す る。 モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルと親油性モノグリセリド（ＭＧ） とカラゲナンの相乗抗ウイルス効果を測定する追加試験も行った。これらの試験 はＬＬＣ−ＭＫＣ細胞と希釈剤としてＰＢＳを使用して実施した。これらの試験 の結果を下表１０に要約する。ＲＳＶ阻害アッセイでは、試験材料（抗体又は他 の生物活性化合物）がサル腎細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）のヒトＲＳウイルス（ＲＳ Ｖ）感染を阻害する能力を半定量的に測定する。感染した細胞をイムノペルオキ シダーゼ法により同定し、計数する。方法はマイクロタイターフォーマットで実 施し、以下に要約する。 アカゲザル腎細胞ＬＬＣ−ＭＫ２はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎児血清を補充したイーグ ル改変必須培地（ＥＤＭＥ）で培養した。ＲＳＶ感染アッセイでは、フィブロネ クチンで処理したマイクロタイタープレートにＬＬＣ−ＭＫ２細胞を ５０００個／ウェルの密度で播種し、３〜４日間インキュベートした後、感染性 低下アッセイで使用した。アッセイ日にストックＲＳＶを細胞培地（ＭＥＭ）で １０〜２０，０００感染細胞単位（ＩＣＵ）／ｍＬまで希釈し、等容量（２００ μＬ）の適当な濃度の連続希釈試料調製物に加えた。次いで、希釈した試料とウ イルスの混合物を４℃で２時間インキュベートした後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に加 えた。ウイルス−試料接種材料をマイクロタイタープレートに加える前に培地を 取り出し、単層をＥＭＥＭで１回濯いだ。全試料−ウイルス希釈液を３個のウェ ルで試験した。ウイルス−試料接種材料混合物を加湿ＣＯ₂インキュベーターで ３７℃で２時間ＬＬＣ−ＭＫ２単層に吸着させた。インキュベーション後、ＥＭ ＥＭ１５０μＬを全ウェルに加え、プレートをＣＯ₂インキュベーターで３７℃ で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を取り出し、単層 を冷エタノール（７０％、次いで１００％）で固定した。固定後、マイクロタイ タープレートを２００μＬ／ウェルのダルベッコＰＢＳで１回濯ぎ、希釈ウシ抗 ＲＳＶ抗体（２００μＬ）を全ウェルに加えた。室温で３０分間インキュベート し、ＰＢＳ／０．５％鶏卵アルブミン（ＰＢＳ／ＣＥＡ）で３回濯 いだ後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ウシＩｇＧを全ウェルに加え、室温で３ ０分間インキュベートした。次いでマイクロタイタープレートをＰＢＳ／ＣＥＡ で３回濯ぎ、ジアミノベンザジン基質を加え、２０分間インキュベートした。そ の後、プレートを上述のようにＰＢＳ／ＣＥＡで濯ぎ、倒立顕微鏡を使用してウ ェル当たりの染色ＲＳＶ感染細胞（ＩＣ）数を調べた。３個のウェルのＩＣ数を ウイルス対照ウェルのＩＣ数（平均９）と比較し、阻害百分率（ＰＩ）を計算し た［ＰＩ＝１．０−［試料ウェル当たりの平均ＩＣ／ウイルス対照ウェル当たり の平均ＩＣ］］。各マイクロタイタープレートで正の対照調製物（ウシ及びＲＳ Ｖ血清）を試験した。表１０に示すように、ＲＳＶ感染細胞数の５０％減少（Ｉ Ｃ₅₀）を生じる試験材料の濃度（μｇ／ｍｌ）としてＲＳＶ阻害試験の結果を報 告する。 表１０のデータが示すように、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルと ＭＧ又はモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとカラゲナンを併用すると 、抗ＲＳＶ活性が増した。モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルはＰＢＳ 系中のＭＧの均質分布を増進し、その結果として相乗作用が得られると予想され る。 種々の形態のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルの抗ＲＳＶ活性を比 較するために、種々の油を使用することにより脂肪酸鎖の長さと飽和度の異なる ５形態のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを製造するようにＤＡＴＥ Ｍ製造業者に依頼した。これらのモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル形 態は、ＤＡＴＥＭ−Ｃ１２：０、ＤＡＴＥＭ−ＰＡＬＭ ＯＩＬ、ＤＡＴＥＭ− ＢＥＥＦ ＴＡＬＬＯＷ、ＤＡＴＥＭ−ＳＵＮＦＬＯＷＥＲ ＯＩＬ及びＤＡＴ ＥＭ−ＳＯＹであった。各形態のモノグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを 各々ＰＢＳに混合し、ＲＳＶ感染性に対する活性を上述のように測定した。これ らの試験の結果を下表１１に要約する。 表１１のデータが示すように、種々の脂肪から製造したモノグリセリドのジア セチル酒石酸エステルはいずれもＲＳＶ感染に対する阻害活性をもつ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/22 Ａ６１Ｐ 31/22 (72)発明者 メイザー，テリー・ビー アメリカ合衆国、オハイオ・43068、レイ ノルズバーグ、ラウンデイレイ・ロード・ ノース・6897 (72)発明者 ヒルテイー，ミロ・デユアン アメリカ合衆国、オハイオ・43081、ウエ スタービル、オールド・ステイト・ロー ド・9984 (72)発明者 グズマン―ハーテイー，メリンダ アメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハ ンナ、ローレル・リツジ・ドライブ・659 (72)発明者 リー，テレサ・シユー―リン・ワイ アメリカ合衆国、オハイオ・43220、コロ ンバス、リタマリー・ドライブ・3959 (72)発明者 ボウマン，タミー・マリー アメリカ合衆国、オハイオ・43056、ニユ ーアーク、ブルー・ジエイ・ロード・ 13049 (72)発明者 ラム，ジル・エム アメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハ ンナ、ラクーン・ドライブ・4524 (72)発明者 リユ，チン―チヨウ アメリカ合衆国、オハイオ・43082、ウエ スタービル、バーンズ・ドライブ・ノー ス・462

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．病原微生物の感染活性を阻害するために有効な量のモノ及びジグリセリドの ジアセチル酒石酸エステルと、食品主要栄養素を含む栄養組成物。 ２．モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルが大豆油、ヤシ油、ヒマ ワリ油、牛脂又は他の食用油源から得られる請求項１に記載の組成物。 ３．モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルが式Ｉ： （式中、Ｒ^AはＣ₈−Ｃ₂₄脂肪酸であり、Ｒ^BはＨ又はＣ₈−Ｃ₂₄脂肪酸であり、Ｒ^C 及びＲ^Dはアセチルであり、総脂肪酸含量の９０％以上は単一脂肪酸の形態であ る）に対応する請求項１に記載の組成物。 ４．Ｒ^AがＣ₁₀−Ｃ₂₀脂肪酸である請求項３に記載の組成物。 ５．Ｒ^AがＣ₁₂−Ｃ₁₈脂肪酸である請求項３に記載の組成物。 ６．Ｒ^AがＣ₁₂脂肪酸である請求項３に記載の組成物。 ７．Ｃ₈−Ｃ₂₄脂肪酸が飽和、不飽和又はヒドロキシル化されている請求項３に 記載の組成物。 ８．食品主要栄養素が乳児補給用に調剤されている請求項１に記載の組成物。 ９．主要栄養素がココナツ油、大豆油、モノ及びジグリセリド、グルコース、食 用ラクトース、電気透析乳漿、電気透析スキムミルク、乳漿、大豆タンパク及び これらのタンパク水解物の１種以上を含む請求項８に記載の組成物。 １０．モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルとタンパクの比（重量 ／重量）が１：４．２以上である請求項９に記載の組成物。 １１．液体形態である請求項１に記載の組成物。 １２．固体形態である請求項１に記載の組成物。 １３．ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＢ複合体の１種以上を更に含む請求項１に記 載の組成物。 １４．対象の病原微生物感染の阻害方法であって、微生物の感染活性を阻害する ために有効な量のモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルを含む製剤 を対象に補給することを特 徴とする前記方法。 １５．病原微生物がインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、Ｉ 型単純ヘルペスウイルス、水庖性口内炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（Ｈ ＩＶ）及びＲＳウイルス（ＲＳＶ）から構成される群から選択されるウイルスで ある請求項１４に記載の方法。 １６．ウイルスがＲＳウイルスである請求項１５に記載の方法。 １７．病原生物がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＨ ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒから構成される属から選択される細菌である請求項１４ に記載の方法。 １８．モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルが大豆油、ヤシ油、ヒ マワリ油、牛脂又は他の食用油源から得られる請求項１４に記載の方法。 １９．モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステルが式Ｉ： （式中、Ｒ^AはＣ₈−Ｃ₂₄脂肪酸であり、Ｒ^BはＨ又はＣ₈−Ｃ₂₄脂肪酸であり、Ｒ^C 及びＲ^Dはアセチルであり、総脂肪酸含量の９０％以上は単一脂肪酸の形態であ る）に対応する請求項１４に記載の方法。 ２０．Ｒ^AがＣ₁₀−Ｃ₂₀脂肪酸である請求項１９に記載の方法。 ２１．Ｒ^AがＣ₁₂−Ｃ₁₈脂肪酸である請求項１９に記載の方法。 ２２．Ｃ₈−Ｃ₂₄脂肪酸が飽和、不飽和又はヒドロキシル化されている請求項１ ９に記載の方法。 ２３．前記製剤が脂肪、タンパク及び炭水化物を更に含む栄養剤である請求項１ ４に記載の方法。