JP2000513574A

JP2000513574A - カタラーゼ

Info

Publication number: JP2000513574A
Application number: JP10504539A
Authority: JP
Inventors: ロバートソン，ダン，イー．; サンヤル，インドラジット; アドヒカリー，ロバート，エス．
Original assignee: ディベルサコーポレーション
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2000-10-17
Also published as: US20040005655A1; EP0931140A1; WO1998000526A1; AU4271197A; AU722339B2; EP0931140A4; US6410290B1; US5939300A; US6074860A; CA2259540A1

Abstract

(57)【要約】アルカリゲネス（ドゥレイア）(Alcaligenes(Deleya))属およびミクロシラ(Microscilla)属の細菌に由来するカタラーゼ酵素が開示される。これらの酵素は天然または組換え宿主細胞から産生される。これらの酵素は、例えば、グリオキシル酸の製造およびグルコースセンサーにおいて、またコンタクトレンズの洗浄、パルプおよび紙の製造における漂白工程、および乳製品の低温殺菌などの過酸化水素が漂白剤または抗菌剤として用いられるプロセスにおいて、過酸化水素を破壊または検出するために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】カタラーゼ発明の分野本発明は一般に酵素に関するものであり、より具体的にはカタラーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらの使用方法に関する。発明の背景本発明は新たに同定されたポリヌクレオチド、それによってコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および単離に関する。よリ具体的には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは推定上カタラーゼであると同定された。一般に、過酸化水素が副産物であるプロセス、例えば、グリオキシル酸の製造およびグルコースセンサーにおいては、カタラーゼを用いて過酸化水素を破壊または検出することができる。また、過酸化水素が漂白剤または抗菌剤として用いられるプロセス、例えば、コンタクトレンズの洗浄、パルプおよび紙の製造における漂白工程、および乳製品の低温殺菌などでは、カタラーゼを用いて残留過酸化水素を破壊することができる。さらに、このようなカタラーゼは酸化反応、例えば、エポキシ化およびヒドロキシル化などの触媒として用いることができる。発明の概要本発明の１つの態様により、新規な酵素ならびにその活性な断片、類似体および誘導体を提供する。本発明の別の態様により、本発明の酵素ならびにその活性な類似体および断片をコードする単離された核酸分子（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）を提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明の核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を前記酵素の発現を促進する条件下で培養し、そして該酵素を回収することを含む、上記のようなポリペプチドを組換え技法によって産生する方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブを提供する。本発明のさらに別の態様により、そのような酵素またはそれをコードするポリヌクレオチドを科学的研究に関連したin vitroでの目的、例えば、核酸配列のある特定の領域（すなわち保存配列領域）を使用することによって他の生物由来の類似した酵素をコードしている類似配列を同定するためのプローブの作製、などに使用する方法を提供する。本発明のさらに別の態様により、そのようなカタラーゼに対する抗体を提供する。これらの抗体は、種々の生物に由来するライブラリーから同一のカタラーゼ活性または交差反応活性を持ちうるメンバーをスクリーニングするプローブとなる。別の実施態様においては、本発明は、基質を、配列番号７または９に記載のアミノ酸配列から成る群より選択された有効量の酵素と接触させ、それによって酸化反応を触媒することを含む、酸化反応を触媒する方法を提供する。本発明の別の方法は、サンプルを、配列番号７または９に記載のアミノ酸配列を有する有効量の酵素と接触させ、サンプル中の過酸化水素の存在を検出することを含む、サンプル中の過酸化水素の検出および/または破壊を含む。過酸化水素はカタラーゼの基質として作用する。したがって、十分量の本発明のカタラーゼを過酸化水素の含有が疑われるサンプルまたは物質と一緒にすることによって、過酸化水素の検出および／または破壊が達成される。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書の教示から当業者には明らかであろう。図面の簡単な説明以下の図面は本発明の実施態様を説明するものであって、請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定するものではない。図１は、アルカリゲネス（ドゥレイア）・アクアマリナス（Alcaligenes（Del eya）aquamarinus）カタラーゼ64CA2の全長ＤＮＡ配列、およびそれに対応する推定アミノ酸配列を示す。図２は、ミクロシラ・フルベセンス（Microscilla furvescens）カタラーゼ５ 3CA 1の全長ＤＮＡ配列、およびそれに対応する推定アミノ酸配列を示す。好ましい実施態様の詳細な説明以下の記述およびそれに続く実施例の理解を容易にするため、頻繁に用いられる方法および／または用語を説明する。「単離された」という用語は、天然の状態から「人の手によって」変えられたことを意味する。すなわち、もしそれが天然に存在するものであれば、その元の環境から変えられたか取り出されたか、またはその両方である。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその天然の状態で生きている動物中に自然に存在する場合は、「単離されて」いない。しかし、天然の状態の共存している物質から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本明細書で用いるように「単離されて」いる。例えば、ポリヌクレオチドについては、単離されたという用語は、天然でポリヌクレオチドが存在する核酸および細胞から分離されているという意味である。単離の一部として、または単離に続いて、そのようなポリヌクレオチドを、例えば突然変異誘発のため、融合タンパク質を形成するため、および宿主中での増殖または発現のため、他のポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）に結合することができる。単離されたポリヌクレオチドは、単独であれベクター等の他のポリヌクレオチドに結合したものであれ、培養下のまたは完全な生物中の宿主細胞に導入することができる。培養下のまたは完全な生物中の宿主細胞に導入されたそのようなポリヌクレオチドはそれでもまだ、本明細書で用いるように「単離されて」いる。なぜなら、これらのポリヌクレオチドは天然に存在するときの形態また環境にないからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは培地組成物（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを例えば細胞中に導入するための溶液、または化学反応または酵素反応のための天然には存在しない組成物または溶液）等の組成物の形で存在してもよく、そしてその中で本明細書で用いる意味で「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのままであってもよい。「連結(ligation)」という用語は、２個以上のポリヌクレオチド（これらは大抵の場合、２本鎖ＤＮＡである）の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する。連結法は当分野で周知であり、連結プロトコールは、例えばSamb rookら，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第２版，Cold Springs Har bor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)等の標準的実験マニュアルおよび参考文献に記載されている。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡセグメントを意味する。これはコード領域の前および後ろにある領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間にある介在配列（イントロン）も含む。ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を１つのｍＲＮＡに転写すると、あるコード配列は別のコード配列に「機能しうる形で連結」される。次に、このｍＲＮＡは、両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する１つのポリペプチドに翻訳される。発現された配列がプロセシングされて最終的に所望のタンパク質を産生する限り、コード配列は相互に連続している必要はない。「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技法によって産生された、すなわち、所望の酵素をコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞から産生された酵素を意味する。「合成」酵素とは、化学合成によって調製された酵素を意味する。特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」、または特定の酵素を「コードするヌクレオチド配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた時に転写されて酵素に翻訳されるＤＮＡ配列である。「プラスミド」は、大文字および／または数字を前および／または後ろに付けた小文字の「ｐ」で示される。本明細書における出発プラスミドは、市販されているプラスミド、または公衆が無制限に入手できるプラスミドであるか、あるいは、入手可能なプラスミドから公表された方法に従って構築することが可能である。さらに、本明細書に記載のプラスミドと等価のプラスミドが当分野で公知であり、当業者には明らかである。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡ内の特定の配列にのみ作用する制限酵素を用いたＤＮＡの触媒的開裂を意味する。本明細書に用いた種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の要件は当業者に知られているものを使用した。分析上の目的には、典型的には１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片が約２単位の酵素と共に約20μｌの緩衝液中で使用される。プラスミド構築用のＤＮＡ断片の単離のためには、典型的には20〜250単位の酵素を用いてより大容量の緩衝液中で5〜50μｇのＤＮＡを消化する。特定の制限酵素に対する適切な緩衝液、および基質の量は製造業者によって明記されている。37℃で約１時間というインキュベーション時間が通常用いられるが、製造業者の指示によって変えることができる。消化後、反応液を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、所望の断片を単離する。 Goeddelら，Nucleic Acids Res.，8:4057(1980)が記述する８％ポリアクリルアミドゲルを用いて、切断した断片のサイズによる分離を実施する。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成したものであってよい１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸基を持たず、したがってキナーゼの存在下でATPを用いてリン酸基を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに結合しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていない断片に連結する。「連結(ligation)」という用語は、２つの２本鎖核酸断片の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する(Maniatis，T．ら，前出，p．146)。別途記載しない限り、連結は公知の緩衝液および条件を用いて、ほぼ等モル量の連結すべきＤＮＡ断片0.5μｇあたり10単位のT4 ＤＮＡリガーゼ（以下「リガーゼ」と称する）を用いて達成することができる。別途記載しないかぎり、形質転換はSambrookおよびManiatis，Molecular Clon ing:A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，1989に記述されているように実施した。本明細書の１つの態様により、図１（配列番号７）に示す推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本明細書の別な態様により、図２（配列番号９）に示す推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）を提供する。本明細書の別の態様により、本発明の酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の酵素をコードするＤＮＡを含むゲノムクローンは寄託されている。American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Ro ckville，maryland 20852，USAに寄託したので、寄託物にはATCC寄託番号が付されている。上記の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件に従ってなされた。上記クローンは、特許の発行後に取消し不能に（無限定または無条件で）公衆に分譲されるであろう。この寄託は単に当業者への便宜として提供されているものであって、35U.S.C.§112によって寄託が必要であるということを認めるものではない。もし本明細書の配列の記載との間に何らかの矛盾があった場合は、寄託物に含まれるポリヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の方が正しい。上記の寄託物を作製、使用または販売するためには許可が必要とされるが、そのような許可はここでは与えられない。本発明のポリヌクレオチドは、そもそも２つの供給源に由来するゲノム遺伝子ライブラリーから回収されたものである。第１の供給源アルカリゲネス（デラヤ）・アクアマリヌスはβ-プロテオバクテリア(β-Proteobacteria)である。これは26℃およびpH7.2で最適に増殖するグラム陰性の杆菌である。第２の供給源ミクロシラ・フルベセンスは、サモアから単離されたサイトファーガ目(Cytophaga les)の細菌である。これは30℃およびpH7.0で最適に増殖する、滑走運動性を有するグラム陰性の杆菌である。アルカリゲネス（デラヤ）・アクアマリヌスについては、本発明者らが現在知っている最も近いアミノ酸配列同一性を有するタンパク質はミクロシラ・フルベセンスカタラーゼ(59.5%タンパク質同一性;60%ＤＮＡ同一性）である。次に近いのは、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)カタラーゼ(KatG)で、54%のタンパク質同一性を有する。ミクロシラ・フルベセンスについては、本発明者らが現在知っている最も近いアミノ酸配列同一性を有するタンパク質はバチラス・ステアロサーモフィラス(B acillus stearothermophilas)のカタラーゼＩであり、これは69%のアミノ酸同一性を有する。したがって、ポリヌクレオチドおよびそれによってコードされる酵素は、それらが単離された生物によって同定される。それらは以下時々「64CA2」（図１および配列番号６および７）および「53CA1」（図２および配列番号８および９）と称する。本発明の酵素をコードする核酸分子を単離する１つの手段は、天然の、または人為的に設計されたプローブを用いて、当分野で認められた方法（例えば、Curr ent Protocols in Molecular Biology，Ausubel F．M．ら(編)，Green Publishi ng Company Assoc.およびJohn Wiley Interscience，New York，1989，1992参照）によって遺伝子ライブラリーをプローブすることである。配列番号６および８のポリヌクレオチド、またはそれらの断片（少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含む）は特に有用なプローブであることが、当業者によって認められるであろう。この目的にとって特に有用な他のプローブは、配列番号６および８の配列のハイブリダイズ可能な断片（すなわち、少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含む）である。本明細書に開示する特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列については、低度にストリンジェンシーまたは中程度にストリンジェンシーな条件下、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施することができる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの一例としては、固定化した変性核酸を含むポリマー膜を、先ず0.9M NaCl、5.0mM NaH₂PO₄、pH7.0、5.0mM Na₂ EDTA、0.5%SDS、10Xデンハート溶液、および0.5mg/mlポリリボアデニル酸からなる溶液中で45℃で30分間プレハイブリダイズさせる。次に、約2 X 10⁷cpm（比活性4-9 X 10⁸cpm/ug)の³²Pで末端を標識したオリゴヌクレオチドプローブを溶液に添加する。12〜16時間インキュベートした後、上記の膜を0.5%SDS含有1X SET （150mM NaCl，20mM Tris塩酸塩，pH7.8，1mM Na₂EDTA）中で30分間室温で洗浄し、次に新鮮な1X SET中でオリゴヌクレオチドプローブの融解温度（Ｔ_m）より10℃下の温度で30分間洗浄する。次に、ハイブリダイゼーションシグナルの検出のため、膜をオートラジオグラフィー用フィルムに暴露する。ストリンジェントな条件とは、配列間に少なくとも90%の同一性、好ましくは9 5%の同一性、そして最も好ましくは97%の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。さらに、100bps(塩基対)配列の長さ95bps の断片は、それが由来する1090bps配列と95%の同一性をもつことが理解される。 J.Sambrookら，Molecular Cloning;A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring s Harbor Laboratory（1989）(参考としてその全体をここに組み入れる)を参照されたい。また、100bps配列の長さ95bpsの断片は、それが由来する100bps配列と95%の同一性をもつことが理解される。本明細書に用いる場合、例えばBLASTNによって適切に整列させた時に、第１配列の塩基と別の配列の塩基との間に少なくとも70%、そして好ましくは少なくとも80%または90%の同一性があるならば、第１のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列は別のＤＮＡ（ＲＮＡ）配列と少なくとも70%、そして好ましくは少なくとも80%同一である。本明細書は、標準ポリヌクレオチド(reference polynucleotide)と異なっているがその相違が外に現れない(silent)ポリヌクレオチド（例えば、該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列が同一である）に関する。本発明はまた、標準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および端部の切断を引き起こすヌクレオチド変化に関する。本発明の好ましい態様においては、これらのポリペプチドは標準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同一の生物学的作用を保持する。本発明のポリヌクレオチドは、上記の同定された生物由来のゲノム遺伝子ライブラリーから回収された。ゲノムライブラリーは、λ ZAP IIクローニングベクター(Stratagene Cloning Systems)から作製された。これらのライブラリーについてマス切り出し(mass excision)を実施して、pBluescriptファージミド中にライブラリーを作製した。以下に記述するプロトコール／方法にしたがってライブラリーを作製し、切り出しを実施した。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡの形態であってよい。ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であってよく、１本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってよい。成熟酵素をコードするコード配列は図１〜２（配列番号６及び８）に示すコード配列と同一であってもよいし、または、遺伝暗号の重複（redundancy）または縮重の結果、図１〜２（配列番号６及び８）と同一の成熟酵素をコードする異なったコード配列であってもよい。図１〜２（配列番号７および９）の成熟酵素をコードするボリヌクレオチドは、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコード配列およびリーダー配列またはプロタンパク質(pro protein)配列等の付加的コード配列；成熟酵素のコード配列（および場合により付加的コード配列）並びにイントロンまたは成熟酵素のコード配列の５’および／または３’非コード配列等の非コード配列である。したがって、「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語は、酵素のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに付加的コード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、図１〜２（配列番号７および９）の推定アミノ酸配列を有する酵素の断片、類似体および誘導体をコードする、上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。上記ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する該ポリヌクレオチドの対立遺伝子の変異体であっても、または天然に存在しない該ポリヌクレオチドの変異体であってもよい。したがって、本発明は図１〜２（配列番号７および９）に示す同一の成熟酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびに図１〜２（配列番号７および９）の酵素の断片、誘導体または類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。そのようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体を含む。上に記述したように、上記ポリヌクレオチドは図１〜２（配列番号６および８）に示すコード配列の天然に存在する対立遺伝子の変異体であるコード配列を有していてもよい。当分野で公知のように、対立遺伝子の変異体とは、コードされた酵素の機能が実質的に変化せずに、１以上のヌクレオチドが置換、欠失または付加したポリヌクレオチド配列の別形態(alternate form)である。また、部位特異的な、あるいは他の進化戦略（evolution strategy）を用いて、機能における重大な変化をもたらしうる非常に些細な変化をＤＮＡ配列に引き起こすことができる。本発明の全長遺伝子の断片をｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いて、全長ＤＮＡを単離し、そしてその遺伝子に対して高い配列類似性を有する、または類似の生物活性を有する他のＤＮＡを単離することができる。この種類のプローブは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、そしてより好ましくは30塩基を有し、そして、例えば少なくとも50以上の塩基を含んでいてもよい。実際、少なくとも150塩基まで、またはそれ以上の塩基を有するこの種類のプローブは好ましく使用できる。このプローブは、全長転写物に対応するＤＮＡクローン、ならびに調節／プロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同定するためにも使用できる。スクリーニングの例としては、公知のＤＮＡ配列を用いて遺伝子のコード領域を単離してオリゴヌクレオチドプローブを合成することが挙げられる。本発明の遺伝子または遺伝子配列の一部に相補的または同一の配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定する。そのようなプローブは、プローブの同定を容易にするため、分析的に検出可能な試薬を用いて標識可能であり、そしてそのように標識されるのが好ましいこともまた認められるであろう。有用な試薬は、放射能、蛍光色素、または検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素を含むが、それらだけに限定されない。したがって、プローブは他の供給源からＤＮＡの相補的コピーを単離するのに、または関連する配列についてそのような供給源をスクリーニングするのに有用である。本発明はさらに、配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、そしてより好ましくは少なくとも95%の同一性がある、本明細書でここまでに記述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。（上に示したように、例えば、70%の同一性とはそのような定義の内に100bpポリヌクレオチドから取った70bps断片を含む）。本発明は特に、ストリンジェントな条件下で本明細書でここまでに記述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書に用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に少なくとも95 %、好ましくは97%の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書でここまでに記述したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜２（配列番号６および８）のＤＮＡによってコードされる成熟酵素と実質的に同一な生物学的機能または活性を保持する酵素をコードする。ハイブリダイセーションの場合の同一性に言及するならば、当分野で公知のように、そのような同一性とは２つのポリヌクレオチドセグメントの相補性を言う。または、ポリヌクレオチドは、本明細書のポリヌクレオチドの任意の部分にハイブリダイズし、その部分に上記のような同一性を有し、そして活性を保持していても保持していなくてもよい、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有してもよい。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドの回収のために配列番号６および８のポリヌクレオチドに対するプローブとして、または診断用プローブとして、またはＰＣＲプライマーとして使用できる。したがって、本明細書は配列番号７および９の酵素をコードするポリヌクレオチドに少なくとも70%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、そしてより好ましくは少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチド、およびその断片に関する。上記断片は、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、より好ましくは少なくとも50塩基、そして最も好ましくは少なくとも150までの塩基またはそれ以上の塩基を有し、そしてこれらの断片は本発明のポリヌクレオチドの任意の部分に少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、そして最も好ましくは少なくとも97%同一である。本発明はさらに、図１〜９（配列番号28〜36）に記載の推定アミノ酸配列を有する酵素、ならびにそのような酵素の断片、類似体および誘導体に関する。図１〜９（配列番号28〜36）の酵素に言及している場合、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、それらの酵素と本質的に同一の生物学的機能または活性を保持する酵素を意味する。したがって類似体は、プロタンパク質部分の開裂によって活性化されて活性な成熟酵素を生じることが可能なプロタンパク質を含む。本発明の酵素は組換え酵素、天然の酵素、または合成酵素であってよいが、好ましくは組換え酵素である。図１〜２（配列番号７および９）の酵素の断片、誘導体または類似体は、(i) １個以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基によって置換されており（好ましくは保存的アミノ酸残基によって）、そしてそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされていてもされていなくてもよく、または(ii)１個以上のアミノ酸残基が置換基を含み、または(iii)成熟酵素が別の化合物、例えば、該酵素の半減期を増大させる化合物（ポリエチレングリコール等）と融合されており、または(iv)リーダーまたは分泌配列、または成熟酵素の精製に使用される配列、またはプロタンパク質配列、等の付加的アミノ酸が成熟酵素に融合していてもよい。そのような断片、誘導体または類似体は、本明細書の教示に照らすと当業者の技術の範囲内にあると思われる。本発明の酵素及びポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均質（homogeneity）なるまで精製される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に作製された宿主細胞、および組換え技法による本発明の酵素の産生に関する。宿主細胞は、例えば発現ベクター等のクローニングベクターであってよい本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に作製される（遺伝子導入または形質転換またはトランスフェクションされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、等の形態であってよい。作製された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明の遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された常用の栄養培地で培養することができる。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技法によって酵素を産生するために用いることができる。したがって、例えば、酵素を発現するための種々の発現ベクターの任意のものの中にこのポリヌクレオチドを含ませることができる。そのようなベクターは、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列を含む。例えば、SV40 の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せ由来のベクター；ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス等のウイルスＤＮＡが挙げられる。しかし、宿主中で複製可能で生存可能である限り、他の任意のベクターも使用することができる。種々の方法によって適切なＤＮＡ配列をベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は公知の方法によって適切な制限酵素部位に挿入される。そのような方法は当業者の技術の範囲内にあると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成に関する適切な発現制御配列（プロモーター）に機能しうるように連結される。そのようなプロモーターの代表的な例としては、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrp、λファージPＬプロモーター、および原核または真核細胞あるいはそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターをも含む。また、ベクターは発現を増幅するための適切な配列も含むことができる。さらに、発現ベクターは好ましくは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型上の特徴を提供する１以上の選択マーカー遺伝子を含む。これらの特徴とは、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌においてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性、等である。上記の適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、宿主が目的のタンパク質を発現するのを可能とすることができる。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス(Streptomyces) 、枯草菌(Bacillus subtilis)等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)S2およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9等の昆虫細胞；CHO、CO Sまたはボウエス(Bowes)黒色腫、等の動物細胞；アデノウイルス；植物細胞、等が挙げられる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示に照らすと当業者の技術の範囲内であると思われる。より具体的には、本発明は、上に広く記述した１以上の配列を含む組換え構築物をも含む。この構築物は、本発明の配列を挿入したベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）を前向き、または逆向きに含む。本発明の好ましい態様においては、この構築物はさらに、例えば、上記配列に機能しうるように連結されたプロモーターを含む調節配列を含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、市販されている。以下のベクターが例として挙げられる：細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II KS(Stratag ene)，ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia);真核細胞性:pXTl、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40(Pharmacia)。しかし、宿主中で複製可能で生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に名前を挙げる細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、apt、ラムダP R、PLおよびtrpプロモーターを含む。真核細胞性プロモーターは、CMV前初期、H SVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTRsおよびマウスメタロチオネインプロモーターを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分当業者の水準内にある。さらなる実施態様において、本発明は上記の構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞等の高等真核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または細菌細胞等の原核細胞であることができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって実施することができる(Dav is，L．Dibner，M．Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，1986) 。宿主細胞中の構築物を従来の方法で用いて、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生させることができる。または、本発明の酵素は従来のペプチド合成によって合成的に作製することができる。適切なプロモーターの制御下にある哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中に成熟タンパク質を発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を生産するために、無細胞翻訳系を採用することもできる。原核または真核宿主と共に使用する適切なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning;A Laboratory Manual，第２版，Cold Springs Harbor，N.Y．(1989)（参考としてその開示をここに組み入れる）に記述されている。本発明の酵素をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーとは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約10から300bpの、ＤＮＡのシス作動性エレメントである。エンハンサーの例は、複製起点の後期側100から270bpに存在するSV40エンハンサー、サイトメガルウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマウイルスエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、及び宿主細胞の形質転換を可能とする選択可能マーカー(例えばＥ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerev isiae TRP1遺伝子)、並びに高度に発現された遺伝子から得られ、下流の構造配列の転写を起こすプロモーターを含む。そのようなプロモーターはとりわけ3-ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ)等の解糖系酵素、a-因子、酸性ホスファターゼ、熱ショックタンパク質等をコードするオペロンから得られる。前記異種構造配列は、翻訳開始及び終結配列、及び好ましくは翻訳された酵素の分泌を起こすことができるリーダー配列と共に適当な相において組立てられる。任意にこの異種配列は、所望の特性、例えば発現された組換え産物を安定化しあるいは精製を容易にするＮ-末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードすることができる。細菌の使用のための有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを有する作動可能読取り相にある適当な翻訳開始及び終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築する。ベクターは1以上の表現型選択可能マーカー及び複製起点を含み、ベクターの維持を確実にし、所望の場合には宿主中での増幅を提供する。形質転換のための適当な前核生物宿主としては、E．coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、及びPseu domonas、Streptomyces及びStaphylococcus属の各種の種を挙げることができるが、その他のものも使用することができる。限定的なものではないが、代表的な例として、細菌の使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ＡＴＣＣ37017)の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドから得られる選択可能マーカー及び細菌複製起点を含むものとすることができる。そのような市販のベクターとしては、例えば、 pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)及びpGEM1(Promega Bio tec，Madison，WI，USA)が挙げられる。これらのpBR322「バックボーン」部分は適当なプロモーター及び発現されるべき構造配列と組合せられる。適当な宿主株を形質転換し、宿主株を適当な細胞密度に増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段(例えば温度変化あるいは化学的誘導)により誘導し、細胞をさらなる期間の間培養する。細胞は典型的には遠心分離により回収し、物理的あるいは化学的手段により破壊し、得られる粗抽出物を保持し、さらに精製する。タンパク質の発現に使用する微生物細胞は、あらゆる都合の良い方法、例えば凍結-解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、あるいは細胞溶解剤の使用などにより破壊することができ、そのような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞培養系を組換えタンパク質の発現に使用できる。哺乳動物発現系の例としては、Gluzman，Cell，23:175(1981)により記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ-7系、適合するベクターを発現することができるその他の細胞系、例えばＣ127、3Ｔ3、ＣＨＯ、HeLa、およびＢＨＫ細胞系などが挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサー、並びに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終結配列、及び5'フランキング非転写配列を含む。ＳＶ40 スプライスから得られるＤＮＡ配列及びポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。酵素は、硫酸アンモニウムあるいはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンあるいはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー等のような方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。必要によりタンパク質再折り畳みステップを使用して成熟タンパク質の構造を完成させることができる。最後に最終精製ステップとして高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を使用することができる。本発明の酵素は、天然の精製物、もしくは化学的合成法の生成物であることができ、または前核もしくは真核生物宿主(例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞等)から組換え法により製造されたものであることができる。組換え生産法に使用する宿主により、本発明の酵素はグリコシル化されたものまたはグリコシル化されていないものとなり得る。本発明の酵素は、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでもよく含まなくてもよい。本発明の配列に対応する酵素に対して生成される抗体は、該酵素を動物に直接注射するか、該酵素を動物、好ましくはヒトではない動物に投与することにより得られる。そのようにして得られた抗体は酵素自体に結合する。このようにして、酵素の断片のみをコードする配列を使用しても、天然の酵素全体に結合する抗体を生成することができる。そのような抗体は、該酵素を発現する細胞から該酵素を単離するのに使用することができる。本明細書で使用する用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子、並びにエンドグルカナーゼポリペプチドのエピトープに結合できる免疫グロブリン分子の断片、例えばFab、Fab'、(Fab')₂、Fv、及びＳＣＡ断片等をいう。これらの抗体断片は、それが得られた抗体の抗原(例えばエンドグルカナーゼ抗原)に選択的に結合するいくらかの能力を保持し、当分野で周知であり(上述のHarlow及びLaneを参照)、さらに後述するような方法を使用して製造することができる。（１）Fab断片は抗体分子の一価の抗原結合断片からなり、酵素パパインによる全抗体分子の消化によりそのままの軽鎖及び重鎖の部分からなる断片を生成することにより製造することができる。（２）抗体分子のFab'断片は、全抗体分子をペプシンにより消化し、その後還元してそのままの軽鎖及び重鎖の部分からなる分子を生成することにより製造することができる。このように処理された抗体分子あたり２つのFab'断片が得られる。（３）抗体の(Fab')₂断片は、全抗体分子を酵素ペプシンにより消化し、その後還元しないことにより得られる。(Fab')₂断片は2つのFab'断片の二量体であり、ジスルフィド結合により一体にされているものである。（４）Fv断片は、2つの鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子工学的に製造された断片と定義される。（５）単鎖抗体(ＳＣＡ)は、適当なフレキシブルポリペプチドリンカーにより結合された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子工学的に製造された単鎖分子である。本発明において使用する用語「エピトープ」は、例えばエンドグルカナーゼポリペプチド等の抗原上の抗原決定基であり、例えばエンドグルカナーゼ特異的抗体等の抗体のパラトープが結合するものをいう。抗原決定基は通常は分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸あるいは糖側鎖からなり、特異的な三次元構造上の特徴及び特異的な荷電の特徴を有し得る。モノクローナル抗体の製造については、連続的な細胞系培養により製造される抗体を提供するあらゆる方法が使用できる。その例としては、ハイブリドーマ法 (Kohler及びMilstein，Nature，256:495-497，1975)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozborら、Immunology Today 4:72，1983)、及びヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶ-ハイブリドーマ法(Coleら、Monoclonal Antib odies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.77-96，1985)等を挙げることができる。単鎖抗体の製造について記載された方法(米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性酵素生成物に対する単鎖抗体の製造に使用することができる。また、トランスジェニックマウスを使用して本発明の免疫原性酵素生成物に対するヒト化抗体を発現させることができる。本発明の酵素に対して生成された抗体は、その他の生物あるいはサンプルからの同様な酵素のスクリーニングに使用することができる。そのようなスクリーニング法は当分野で知られており、例えばそのようなスクリーニングアッセイの一つはSambrook及びManiatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2ndRd. ）vol．2:Section 8.49，Cold Spring Harbor Laboratory，1989に記載されている。この文献は参考としてその全体を本明細書に援用する。本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでないと理解されたい。割合及び量は特に明記しない限り全て重量によるものである。実施例１発現遺伝子バンクの製造 Hay及びShortの方法(Hay，Ｂ及びShort，J.，JStrategies，5:16，1992)に従い、E.coliカタラーゼ陰性宿主株ＣＡＴ500に、pBluescriptプラスミド中のAlca ligenes（Deleya）aquamarinusからのＤＮＡの剪断片を含むファージ溶液を感染させ、アンピシリン(100〜g/ｍＬ)、メチシリン(80〜g/ｍＬ)及びカナマイシン( 100〜g/ｍＬ)を含むＬＢを含む寒天上にプレート化した。得られたコロニーを滅菌した爪楊枝で取ったものを使用して、96-ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに単独で接種した。ウェルは100〜g/ｍＬアンピシリン、80〜g/ｍＬメチシリンを含む250μＬのＳＯＢ培地(ＳＯＢ Amp/Meth/Kan)を含むものとした。細胞を振盪することなく37℃で一晩増殖させた。これにより「供給遺伝子バンク」が生成され、このようにして得られた供給遺伝子バンクの各ウェルはE．coli細胞の保存培養物を含み、それぞれ単独のＤＮＡ挿入物を有するpBluescriptプラスミドを含むものとなった。Microscilla furvescensからカタラーゼをスクリーニングするために同じプロトコルを適用した。実施例２カタラーゼ活性のスクリーニング供給遺伝子バンクのプレートを使用して、各ウェルが200μＬのＳＯＢ Amp/Me th/Kanを含む単一のプレートに多重接種した（「濃縮プレート」）。このステップは、1％漂白剤、水、イソプロパノール、各接種の間の風乾滅菌サイクルを使用し、Beckman BiomekのHigh Density Replicating Tool(ＨＤＲＴ)を使用して行った。従って濃縮プレートの各ウエルは、各供給ライブラリープレートからの４種の異なるpBluescriptクローンを含んでいた。そのような濃縮プレートを9個調製し、37℃で16時間増殖させた。 100μＬの一晩培養物をウェルあたり100μＬのHepesを含む白いポリフィルトロニックアッセイプレートに移した。過酸化水素の0.03％溶液を5％ Triton中で調製し、この溶液を20μＬ各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。1時間後、50μＬの120ｍＭ 3-(p-ヒドロキシフェニル)-プロピオン酸及び1単位の西洋ワサビペルオキシダーゼを各ウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。反応を停止するため、50μＬの1Ｍのトリス-塩基を各ウェルに加えた。ウェルを蛍光計上で320ｎｍで励起し、404ｎｍで読み取った。低い値が陽性のカタラーゼヒットを表す。実施例３活性クローンの単離及び精製活性を有する個々のクローンを単離するため、供給遺伝子バンクプレートを解凍し、個々のウェルをＳＯＢ Amp/Meth/Kanを含む新たなプレートにそれぞれ接種するのに使用した。上記のようにプレートを37℃でインキュベートして細胞を増殖させ、活性を上記したようにアッセイした。供給プレートから活性なウェルが同定されたら、供給プレートからの細胞をLB/Amp/Meth/Kanを含む寒天上にストリークし、37℃で一晩増殖させて独立したコロニーを得た。8個の独立したコロニーを滅菌爪楊枝で取り、96-マイクロタイタープレートのウェルにそれぞれ単独で接種するのに使用した。ウェルは250ｐＬのＳＯＢ Amp/Meth/Kanを含むものとした。細胞を振盪することなく37℃で一晩増殖させた。各ウェルから100μ Ｌのアリコートを取り、上記したようにアッセイした。最も活性の高いクローンを同定し、残りの150μＬの培養物を使用してＬＢ/Amp/Meth/Kanを含む寒天プレート上にストリークした。8個の独立したコロニーを上記のように取り、増殖させ、アッセイした。最も活性の高いクローンを使用してＬＢ/Amp/Meth/Kanの3ｍＬの培養物に接種し、一晩増殖させた。培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定に使用した。実施例４カタラーゼの発現本発明の酵素をコードするＤＮＡ、配列番号7及び9を、最初に該ＤＮＡを含む pBluescriptベクターから本明細書に記載したプライマーを使用してＰＣＲ法により増幅した。そして増幅された配列を、プライマー配列の下に一覧したそれぞれのpQEベクター中に挿入し、本明細書に記載したプロトコルに従い酵素を発現させた。サブクローニングに使用した5'及び3'オリゴヌクレオチドプライマー配列並びにそれぞれの遺伝子のベクターは以下の通りである。示した制限酵素部位は各遺伝子について示した細菌発現ベクター(Qiagen，Inc ．Chatsworth，CA)上の制限酵素部位に対応する。pQETベクターは抗生物質耐性( Ampr)、細菌複製起点(ori)、ＩＰＴＧ-調節可能プロモーターオペレーター(Ｐ/ Ｏ)、リボソーム結合部位(ＲＢＳ)、6-Hisタグ及び制限酵素部位をコードする。 pQETベクターを示した制限酵素で消化した。増幅した配列を各pQETベクター中に連結し、ＲＢＳをコードする配列と共にフレーム単位で挿入した。天然の停止コドンを導入したので前記遺伝子はベクターのHisタグに融合しなかった。次いで連結混合物を使用してE．coli株UM255tpREP4(Qiagen，Inc.)をエレクトロポレーションにより形質転換した。ＵＭ255/pREP4はプラスミドpREP4の複数のコピーを含み、これはlaclリプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。形質転換体をＬＢプレート上で増殖するその能力により同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により確認した。所望の構築物を含むクローンを、Amp(100ｕμ/ｍｌ) 及びKan(25ｕμ/ｍｌ)の両方を補充したＬＢ培地中で液体培養で一晩増殖させた (Ｏ/Ｎ)。Ｏ/Ｎ培養物を使用して1:100〜1:250の比率の大規模培養に接種した。細胞を0.4〜0.6の光学密度600(Ｏ.Ｄ.⁶⁰⁰)まで増殖させた。その後ＩＰＴＧ(イソプロピル-Ｂ-Ｄ-チオガラクトピラノシド)を１ｍＭの最終濃度で添加した。ＩＰＴＧはlaclリプレッサーを不活性化することによりＰ/Ｏの透明化を誘導し、遺伝子発現を増加させる。細胞をさらに3〜4時間増殖させた。その後細胞を遠心分離により回収した。上記したプライマー配列も上記したハイブリダイゼーション法により沈殿した物質から目的の遺伝子を単離するのに使用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者アドヒカリー，ロバート，エス. アメリカ合衆国 08003 ニュージャージー州，チェリーヒル，ホフマンアベニュー 11

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なカタラーゼ。２．請求項１に記載のカタラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド配列。３．以下のものより成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド：ａ）配列番号６または配列番号８；ｂ）ＴがＵであってもよい配列番号６または配列番号８；ｃ）ａ）およびｂ）に相補的な核酸配列；およびｄ）長さが少なくとも15塩基であり、かつ配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列をそれぞれコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズする、ａ）、ｂ）またはｃ）の断片。４．ポリヌクレオチドが原核生物から単離される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。５．請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。６．ベクターがプラスミドである、請求項５に記載のベクター。７．ベクターがウイルスに由来する、請求項５に記載のベクター。８．請求項５に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。９．細胞が原核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 10．請求項１に記載のポリペプチドに結合する抗体。 11．抗体がポリクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。 12．抗体がモノクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。 13．以下のものから成る群より選択されるメンバーを含む酵素：ａ）配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む酵素；およびｂ）ａ）の酵素の少なくとも30個のアミノ酸残基を含む酵素。 14．請求項８に記載の宿主細胞を核酸の発現を可能とする条件下で培養すること、及び該核酸によってコードされる酵素を単離することを含む、酵素の生産方法。 15．ベクターに含まれるＤＮＡによってコードされるポリペプチドを細胞が発現するように、該細胞を請求項５に記載のベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションすることを含む、細胞の作製方法。 16．基質を、配列番号７または配列番号９に記載のアミノ酸配列から成る群より選択された有効量の酵素と接触させ、それによって酸化反応を触媒することを含む、酸化反応を触媒する方法。 17．サンプルを、配列番号７または配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する有効量の酵素と接触させ、サンプル中の過酸化水素の存在を検出することを含む、サンプル中の過酸化水素を検出または破壊する方法。