JP2000512626A

JP2000512626A - 細胞分裂阻止性ステロール

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Publication number: JP2000512626A
Application number: JP09542238A
Authority: JP
Inventors: アクセルソン，マグヌス; ラーション，オレ
Original assignee: Medivir AB
Current assignee: Medivir AB
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2000-09-26
Also published as: CA2255677A1; WO1997045440A1; AU3112297A; NZ332776A; EP0906331A1; AU716389B2; IL127039A0; SE9602100D0

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）（式中、Ｘは直鎖または分岐鎖のヒドロキシ置換Ｃ₁−Ｃ₁₅炭化水素鎖である）で示される化合物は、急速に増殖する細胞および黒色腫などの癌に付随する状態の治療において有用性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞分裂阻止性ステロール本発明は、ステロイド核中のオキソ基および共役二重結合および側鎖中のヒドロキシル基を有するコレステロール誘導体の細胞増殖のインヒビターおよび／または異常細胞の死亡のインデューサーとしての使用に関する。国際特許出願第ＷＯ９６／２８１７５号には、化合物２７ヒドロキシコレステロール：の抗癌剤、とりわけ転移性の肝臓癌、結腸癌および乳癌に対する抗癌剤としての使用が記載されている。この化合物は、天然のコレステロールと同様にΔ⁵、すなわちステロイドＢ環の５位炭素と６位炭素との間に不飽和結合を有する。しかしながら、ザンダー（Zander）らはJ.Chem.Research（Ｓ）１９７７２１９において、対応の２５−ヒドロキシル化Δ⁵類似体が肝細胞アッセイにおいて細胞分裂阻止活性を有しないことを示唆している。ＷＯ９６／２８１７５号は２５、２６または２７アミノコレステロールなどの該化合物のある種の類似体を広く示唆しているが、Δ⁴誘導体、すなわちステロイドＡ環中の４位炭素と５位炭素との間の不飽和結合を有する化合物は開示していない。細胞分裂阻止活性を有する他のΔ⁵コレステロールとしては、式：で示される７β−ヒドロキシコレステロールが挙げられ、これはクウォク−ピン・チャン（Kwok−Ping Cheng）ら（J.Chem.Research（Ｓ）１９７７、２１７）およびヒエッター（Hietter）ら（Cancer Biochem Biophys １９８６ vol.９、７５〜８３頁）により記載されているように漢方薬ボンビックス・クム・ボトライト（Bombyx cum botryte）、蚕の真菌侵入（fungal infestation of silk wor m）、の一成分として最初に記載された。国際特許出願第ＷＯ９１１１４５２号にはかかる化合物の３β−ヒドロキシでのグリコシル化が記載されており、ロング（Rong）ら（Acad.Sc.パリ１９８５、３００シリーズIII、８９〜９４）は対応するビス−ヘミサクシネートを記載している。ムーグ（Moog）ら（Biochimie １９９１７３（１０）１３２１〜６頁）は、種々の刺激に対するリンパ球の応答を強く抑制するΔ⁵化合物７,２５−ジヒドロキシコレステロール：の免疫抑制効果を探求している。活性はプロテインキナーゼＣおよび細胞膜中へのジヒドロキシコレステロールの導入に関係していると思われる。明らかに遊離のΔ⁵オキシステロールは生きた動物において腫瘍増殖を抑制しないが、ムーグら（Anticancer Res １３（４）９５３〜８（１９９３））およびジ・ムーグ（J i,Moog）ら（Canc.Biochem．Biophys．１１（１）４５〜４７（１９９０））はピリミジンヌクレオシドを有する７β,２５−ジヒドロキシコレステロールのリン酸ジエステルが細胞分裂阻止に有用であると報告している。しかしながら、類似のヌクレオシド−コレステロールエステルが核酸合成レベルで働くとのジの観察は、ステロイド対（viz a viz）ヌクレオシドによる細胞毒性への貢献を決定するのを困難にしている。分岐不飽和側鎖を有するΔ⁵化合物７β−ヒドロキシコレステロールの類似体は、７−ヒドロキシ基を欠くΔ⁵類似体におけるある種のヒドロキシル化不飽和側鎖がそうであるように、ナガノ（Nagano）らにより（J.Chem.Res.（Ｓ）１９７７、２１８）高濃度（３３μｇ／ｍｌ）でのラット肝細胞毒性が示唆されている。この著作にはまたΔ⁴化合物：（二重結合はステロールの異なる環中に存在する）が３３μｇ／ｍｌの比較的高濃度で穏やかな細胞分裂阻止活性を有することも記載されている。本発明者らは、ヒドロキシル化側鎖とともに３−ケト基およびΔ⁴に共役二重結合を有する化合物が、従来の化合物に比べて何倍も効力の高い細胞分裂阻止活性を有することを見出した。本発明の第一の側面によれば、式Ｉ：（式中、Ｘは直鎖または分岐鎖のヒドロキシ置換Ｃ₁−Ｃ₁₅炭化水素鎖である）で示される化合物が医薬に使用するために提供される。本発明の範囲内の好ましい化合物は、式ＩＡ：（式中、Ｒ'およびＲ"の一方はＯＨであり、他方はＨである）を有する。式Ｉの特に好ましい化合物としては、７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３ −オン、７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７β,２７ −ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンが挙げられる。エナンシオマー７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンはこれまで文献に記載されておらず、それゆえ、本発明のさらなる側面は該化合物を好ましくは実質的に純粋な形態、たとえば＞７５％、好ましくは＞９０％および最も好ましくは＞９５％の鏡像体純度で提供する。本発明はさらに、好ましくは式ＩＡの本発明の化合物を生理学的に許容しうる希釈剤または薬理学的担体とともに含む医薬組成物を提供する。本発明の有利な側面には、種々の癌やウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞などの急速に増殖する細胞に関連すろ状態を治療するための医薬を調製するために上記一群の化合物を使用することが含まれる。代表的な癌（ウイルスによりトランスフォーメーションされるものでもされないものであってもよい）としては、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌および腺細胞癌が挙げられる。他の応用分野は、乾癬、正常な表皮代謝回転の制御不能の疾患である。表皮細胞の有糸分裂の増加は、表皮の肥大および不完全なケラチン痂（keratin scales）となる。それゆえ、本発明はまた、式Ｉまたはより好ましくは式ＩＡの化合物の有効量をそれを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、急速に増殖する細胞に関連する状態の治療方法をも提供する。本発明の好ましい側面は、上記化合物の医薬の調製またはヒトもしくは動物における乳癌または結腸癌の治療方法への使用を提供する。本発明の特に好ましい側面は、上記一群の化合物の医薬の調製または悪性黒色腫細胞の治療方法への使用を提供する。本発明の化合物には、ステロイドの技術分野で知られている対応する薬理学的に許容しうる誘導体も含まれ、該誘導体はインビボで式Ｉの各化合物を放出する。適当な誘導体としては、ヒドロキシ基のエーテルおよびエステルおよび／またはオキソ基の誘導体が挙げられる。代表的なエステルおよびエーテルとしては、たとえば上記ＷＯ９１１１４５２号に記載されているようなグリコシド、およびビス−ヘミスクシネート、リン酸エステル、グリコシドリン酸エステル、シリルエーテル、酢酸エステル、ギ酸エステルおよび他の脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エステル、グルクロニド、ホスホジエステル、シクロデキストリン、たとえば２−ヒドロキシ−β−シクロデキストリンなどステロイドの技術分野で知られているものが挙げられる。他の誘導体としては、対応オキシムおよび薬理学的に許容しうる塩が挙げられる。以下に一層詳細に示すように、本発明の化合物は細胞内代謝に供され、かかる活性な代謝産物もまた本発明の範囲に含まれる。たとえば、７,２５−ジヒドロキシコレスト−４−エン−３−オンは対応するコレステン酸（cholestenoic aci d）に代謝される。それゆえ、上記特定の適応症のためにかかる活性な代謝産物をヒトを含む哺乳動物に投与することは本発明の一つの側面とみなされる。本発明の医薬製剤の性質は処置しようとする疾患に依存し、下記実施例は限定を意図するものではない。本発明の化合物は、経口投与のためにはカプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、散剤、液剤、懸濁剤または乳剤などの固形または液体の剤型に製剤化される。本発明の化合物は、非経口投与のためには、薬理学的担体（水、アルコール、油および他の許容しうる有機溶媒などの滅菌液体であってよい）を含む生理学的に許容しうる希釈剤中の該化合物の溶液、懸濁液または乳濁液に界面活性剤および他の薬理学的に許容しうるアジュバントを添加してまたは添加せずに注射用投与剤として投与してよい。本発明の化合物はまた、活性成分の除放を可能にする仕方で製剤化しうるデポ注射剤またはインプラント製剤の形態でも投与しうる。局所投与のためには本発明の化合物は軟膏（unguent）、クリーム、軟膏（oin tment）またはローションの形態で投与しうる。つぎに本発明を一例として図面を参照しながら以下にさらに記載する。図１は、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）コレステロールおよび線維芽細胞の主要な自己酸化生成物の代謝および強力なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼサプレッサーの生成の簡略スキームの概要である。ステロイドの名称は表Ｉに掲げてある。加水分解およびエステル化（示していない）に加えて、ステロールの主要な反応は、Ｉ、２７−ヒドロキシル化、II、７α−ヒドロキシル化；III、５−二重結合の異性化を伴う３−酸化；およびIV、２７−カルボキシ基への酸化である。加水分解したＬＤＬコレステロールはこれら反応を介して代謝される（黒塗りの矢印）。７β−ヒドロキシ基のケトンへの酸化（Ｖ）もまた観察される。マイナーな反応は破線の矢印で示す。ステロールの２５−ヒドロキシル化による７α, ２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの生成（示していない）は特定の条件下で観察された。反応Ｉ、IIおよびIIIはウイルスによりトランスフォーメーションした線維芽細胞において妨害され、ＬＤＬコレステロールおよびコレステロールの自己酸化生成物によるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの不完全な抑制を示した。トランスフォーメーションした細胞においても見かけ上正常な抑制作用を有するステロール代謝産物は枠内に示してある。図２は、トランスフォーメーションした線維芽細胞においてもＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの強力なサプレッサーである３つの天然に存在するコレステロール誘導体の構造を示す。ステロール、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン −３−オン（Ｉ）、７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（II ）、および２７−ヒドロキシ−７−オキソコレステロール（III）は、ヒト線維芽細胞においてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを抑制するのにさらなる代謝を必要とするとは思われなかった。これらステロールに共通するのは、ステロイド核中の共役二重結合とともにオキソ基および側鎖中の遠位ヒドロキシル基の存在である。これらステロールは、その見かけ上の構造的類似性が対比されるような仕方で描いてある。比較のために２７−ヒドロキシル化３β−ヒドロキシ−５α−コレスト−８（１４）−エン−１５−オン（IV）も示してある。図３は、正常線維芽細胞をリポタンパク質とともにインキュベートした後に培地から単離した中性オキシステロールのガスクロマトグラフィー−マススペクトルＧＣ／ＭＳ分析を示す。正常ヒト線維芽細胞（タンパク質含量１．１ｍｇ、皿サイズ：１４３ｃｍ²）を１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）（コレステロール濃度：１.２ｍＭ）を含有する１０ｍｌの培地とともに２４時間インキュベートし、ついでＧＣ／ＭＳによる分析のため培地を採取した。オキシステロールのトリメチルシリルエーテルのフラグメントイオン流クロマトグラム特性を、分析の間に２時間毎に採取したマススペクトルからコンピューターにより構築し、図示の目的のためにイオンの強度（ｍ／ｚ）を適当な約数で乗じた。数字で示した主要なステロールは表Ｉに掲げてある。等量の培地約０.２ｍｌを、メチルシリコーン（methyl silicone）をコーティングした２５ｍ−ヒューズド（fused）シリカカラムを収容したフィニガン（Finnigan）ＳＳＱ７１０装置に注入し、オーブンの温度を１８５℃から２８０℃まで５℃×分^-1の速度でプログラムした。図４は、正常ヒト線維芽細胞の培地から単離した³Ｈ−標識した７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ− ４−コレステン酸のＨＰＬＣ分析に関する。細胞を［³Ｈ］オレイン酸コレステリルで標識したＬＤＬ（４％ＦＣＳ）とともに６８時間インキュベートし、ついで培地をＨＰＬＣによる分析のために採取した。実験の詳細については以下の「一般的方法」および表IVを参照のこと。注入後、ＨＰＬＣカラム溶出液の画分をシンチレーションバイアル中に１５〜６０分間隔で回収し、ついで放射能を決定した。図示の目的のため、非標識７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン− ３−オン（上端のクロマトグラムに示す結果）または７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸（メチルエステル誘導体として、下端のクロマトグラム）を生成物とともに注入したところ、これら化合物のピークはＵＶクロマトグラムにおいて認められる。ＵＶ検出器に連結したシリカ（リクロスパー（LiChrosp er））のカラムを移動相としてのヘキサン／イソプロピルアルコール（９０：１０）とともに用い、流速は１.０ｍｌ×分^-1であった。図５は、正常ヒト線維芽細胞（○）およびウイルスによりトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞（●）におけるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬの作用を示す。線維芽細胞中のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性は、種々の濃度のＦＣＳを含有する培地とともに２４時間インキュベートした後に決定した。ＦＣＳの不在下では培地は１０％ＬＤＳ（リポタンパク質欠失血清）を含有していた。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地で２４時間プレインキュベートした。ＦＣＳおよびＬＤＳ中のコレステロール濃度は、それぞれ１.２ｍＭおよび０.１ｍＭであった。正常細胞およびトランスフォーメーションした細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの対照活性は、それぞれ７２％および１０１ピコモル／分／ｍｇタンパク質であった。図６は、正常ヒト線維芽細胞における７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（▲）、２７−ヒドロキシ−７−オキソコレステロール（●）および７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（■）のＬＤＬ誘発産生、並びにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制（○）の時間応答曲線を示す。細胞（タンパク質含量：１.７ｍｇ、皿サイズ：１４３ｃｍ²）を１０％ＦＣＳを含有する培地（１５ｍｌ）とともにインキュベートし、所定の時間に回収した。ＦＣＳ中のコレステロール濃度は１.２ｍＭであった。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含量する培地中で２４時間プレインキュベートした（表IIIをも参照）。比較のため、２７−ヒドロキシコレステロールの産生（△）をも示す。つぎに、本発明を以下の限定されない実施例により説明する。一般的方法使用したステロイドは以下のようにして入手した：ジオスゲニン(Diosgenin）（（２５Ｒ）−５−スピロステン−３β−オール）はシグマ（米国）から入手し、２７−酸素化ステロイドの合成の出発物質として用いた（アルナチャラム（Ar unachalam）ら（１９８１）J.Org.Chem.vol.４６、２９６６〜２９６８；フィーザー（Fieser）ら（１９６７）有機合成の試薬、１０５９頁、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク；ショーダ（Shoda）ら（１９９３）Steroids 、vol.５８、１１９〜１２５）。さらに、対応２７−ヒドロキシステロイドについて記載されているように（上記ショーダら）、５−コレステン−３β,７α,２５−トリオールを２５−ヒドロキシコレステロールの３−酢酸エステル、２５− トリメチルシリルエーテル誘導体から加水分解後に調製し、このステロイドをさらに７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンに酸化した。他のステロイドは以前の研究（アクセルソン（Axelson）ら（１９９５）J.Lipid Res.v ol.３６、２９０〜２９８）に用いられたものであり、本発明者らはこの文献をこれら化合物をいかにして得たかの開示として言及する。正常ヒト線維芽細胞（細胞株ＧＭ０８３３３）はＮｉＧＭＳ、コリエル・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（Corriel Institute for Medi cal Research）（カムデン、ニュージャージー）から入手し、ＳＶ４０でトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞９０−ＶＡＩＶはスタイン（Stein）博士（ユニバーシティー・オブ・コロラド、ブールダー、コロラド）の好意により贈呈されたものであった。ヒト結腸癌（ＷｉＤｒ）、乳癌（ＭＤＡ２３１）、および悪性黒色腫（ＳＫ−ＭＥＬ−２）細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞株の増殖は、湿潤インキュベーター中に３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ₂ 雰囲気に保持した組織培養フラスコ中、単層で行わせ、必須および非必須アミノ酸および１０％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＭＤＡ２１３）かまたは最小イーグル培地（他の細胞）のいずれかで培養した。実験目的のため、細胞を皿中で培養した。細胞を５,０００細胞／ｃｍ²の密度で植え込んだ。実験を４８〜７２時間後に開始し、この時点で細胞密度は約２０,０００／ｃｍ²に達していた。コレステロールまたはオキシステロールの代謝を調べる場合、正常またはウイルスによりトランスフォーメーションした線維芽細胞（５７〜１４３ｃｍ²の皿中の細胞数３〜６×１０⁶）をまず１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートし、ついで４〜１０％ＦＣＳ（³Ｈ− 標識したコレステロールまたはオレイン酸コレステリルとともにまたはなしで）を含有する７〜１０ｍｌの培地とともに３〜６８時間インキュベートするか、または１０％ＬＤＳ中のオキシステロールとともに２４〜４８時間インキュベートした。対照の細胞も同様にしてインキュベートしたが、１５分間のみであった。正常およびトランスフォーメーションした線維芽細胞に対するシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ケトコナゾール、およびオキシステロールの作用を、０〜１０％ＦＣＳおよび１０〜０％ＬＤＳを含有する細胞培地中、それぞれ１０〜３０μＭ、３０μＭおよび０.１２μＭの濃度で試験した。これら物質を新たに調製したエタノール溶液中にてインキュベーション培地に加えると培地のエタノール濃度は０.１〜０.５％となった。対照の細胞も同様にしてインキュベートしたが、ＣｓＡ、ケトコナゾール、またはオキシステロールなしで行った。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を決定するときの皿のサイズおよび容量は、それぞれ２０ｃｍ²および５ｍｌであり、インキュベーションは３〜２４時間、２回ずつ行った。各ステロールを２〜５の別々の実験にて試験した。ついでＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性の決定をすでに記載されたようにして行った（アクセルソンら（１９９５）J.Biol.Chem.２７０、１５１０２、カベニー（Cavenee）ら（１９８１）、J.Biol.Chem.２５６、２６７５およびエドワーズ（Edwards,P.A.）ら（１９７９）J.Lipids Res.２０、４０）。インキュベーション培地および細胞中に存在するオキシステロールの抽出および精製手順は、本質的に以前に記載されたものと同じであった（アクセルソン１９９５上掲）。親油性アニオン交換樹脂から中性オキシステロール画分を回収した後、より強い酸（硫酸ステロイドを含む）を含む画分を７２％水性メタノール中の０.５Ｍ酢酸カリウム／水酸化カリウム、見かけのｐＨ１０.０で溶出する前に、遊離のカルボキシル基を有するステロイドを含む画分を９５％水性メタノール中の０.１５Ｍ酢酸で溶出した（アクセルソンら、J.Biol.Chem．（１９９１）２６６、１７７７０）。オキシステロールのトリメチルシリルエーテルおよびステロイド酸のメチルエステルトリメチルシリルエーテル誘導体を、アクセルソン１９９５上掲の記載に従ってガスクロマトグラフィーマススペクトル分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析した。上記グループ分画および精製の前または後に、³Ｈ−標識コレステロール、オレイン酸コレステリルおよび２５−ヒドロキシコレステロールおよび／またはその放射性代謝産物をＨＰＬＣにより分析した。³Ｈ−標識したコレステロールおよびコレステリルエステルを、ヘキサン／イソプロピルアルコール、９８：２（ｖ／ｖ）を移動相として用いた直相（straight−phase）ＨＰＬＣにより分離する前に、インキュベーション培地とイソプロピルアルコールおよびヘキサンの混合物の小さなアリコートから、または細胞とエタノールおよび水の混合物から抽出した（アクセルソン１９９５上掲）。ＨＰＬＣ溶離液から適当な画分をバイアル中に回収し、ついでシンチレーションカウンティングにより放射能を決定した。［³Ｈ］コレステロールまたは［³Ｈ］オレイン酸コレステリルの放射性の中性または酸性代謝産物を上記と同様にして培地および細胞から単離し、ついでＨＰＬＣにより特徴付けした：この目的のため、３つのＨＰＬＣシステムを以下の順序で用いた。逆相ＨＰＬＣを、ポンプ（コンスタメトリック（Constametric） III）および２２０ｎｍまたは２４０ｎｍにセットした可変波長検出器（ＬＤＣ／ミントン・ロイ（ＬＤＣ／Minton Roy）、リビエラビーチ、フロリダからのスペクトラモニター（Spectra Monitor）Ｄ）および１００μｌループを有するレオダイン（Rheodyne）モデル７１２５インジェクターを用いたリクロスファーのカラム（２５０×４ｍｍ、ハイバー（Hibar）、１００ＲＰ−１８、５μｍ、メルク、ダルムシュタットドイツ）にて行った。中性の代謝産物に用いた移動相はメタノール／エタノール／水、８０：２０：１０（容量ベース、流速１ｍｌ× 分^-1）の混合物であり、０分と１１分との間（画分１；極性の代謝産物、たとえば７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを含有、保持時間約４. ５分）および１１分と１４分の間（画分２；７α−ヒドロキシ−４−コレステン −３−オンおよび２７−ヒドロキシコレステロールを含有、保持時間それぞれ１１.５分および１２.５分）に画分を回収した。ついで、画分１中のステロールの分離のためまたはステロイド酸（メチルエステル誘導体として）の分離のために移動相を８５％水性メタノール（流速１ｍｌ×分^-1 ）に変えた。前者の場合、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（保持時間約８.５分）を含有する溶離液の画分が８.０分と９.０分との間に回収され、後者の場合、７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸（保持時間約１２分）を含有する溶離液の画分が１１.０分と１３.０分との間に回収された。ついで、これら画分および画分２（７α−ヒドロキシ−４−コレステン −３−オンおよび２７−ヒドロキシコレステロールを含有）を直相ＨＰＬＣにより再分析した。後者のＨＰＬＣは上記と同様の装置を用いて行ったが、リビエラビーチ（ハイバー、Ｓｉ１００、５μＭ、メルク）のカラム（２５０×４ｍｍ）を用いた。移動相は、画分２（７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび２７−ヒドロキシコレステロールの保持時間は、それぞれ約８分および９分）を分析するときはヘキサン／イソプロピルアルコール、９４：６（ｖ／ｖ）であり、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンまたは７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸メチルエステルを含有する画分を分析するときは同９０：１０（ｖ／ｖ）であった。流速はすべての場合に１.０ｍｌ× 分^-1であった。後者の分析におけるＨＰＬＣ溶離液をシンチレーションバイアル中に１５〜６０分間隔で回収し、シンチレーション液を加えた後に放射能を決定した。培地および細胞中の２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールを抽出後にＨＰＬＣにより分析した。培地をエタノールで抽出し、遠心分離および上澄み液の除去後、ペレットをエタノール／イソプロピルアルコール、１：１（ｖ／ｖ）で再抽出した。抽出物を混合し、ついで溶媒を蒸発させた。非極性化合物をヘキサン中に溶解し、除去後、固体残渣を６０％水性メタノール中に溶解し、これをオクタデシルシラン結合シリカ（プレパラティブＣ₁₈：ウォルターズ・アソシエーツ（Walters Associates Inc.）、ミルフォード、マサチューセッツ）のカラム（１.５×０.８ｃｍ）に通し、回収した。ついで、溶出液中のメタノールを真空除去し、水性溶液を同じカラム上で再抽出した。カラムを水洗した後、吸着したステロイド（極性代謝産物）をメタノール／クロロホルム、１：１（ｖ／ｖ）で溶出し、ヘキサン画分中に存在する非極性代謝産物と混合した。ついで、この混合抽出物を、逆相ＨＰＬＣ（移動相；メタノール／エタノール／水、８０：２０：１０（ｖ／ｖ））または直相ＨＰＬＣ（移動相：ヘキサン／イソプロピルアルコール、９７：３（ｖ／ｖ））による分析に供する前に、蒸発乾固し、メタノールまたはヘキサン／イソプロピルアルコール、９０：１０（ｖ／ｖ）中に溶解した。実施例１ヒト線維芽細胞での酸素化コレステロール誘導体の生成表Ｉは、正常ヒト線維芽細胞とともにインキュベートした後の培地（１０％ＦＣＳを含有）から中性および酸性画分において同定された酸素化コレステロール誘導体およびそれぞれトリメチルシリルエーテルおよびメチルエステルトリメチルシリルエーテル誘導体としてのガスクロマトグラフィー／マススペクトル分析特性を示す。 ^aＣ、コレステロール；ＣＡ、コレスタノエート（cholestanoate）；上付き文字は二重結合の位置を示す；ギリシャ文字はヒドロキシル基の立体配置を示す。^b ＲＩ、保持係数（Retention Index）、コバッツ（Kovats）、架橋メチルシリコーンでコーティングしたヒューズドシリカキャピラリーカラム上。^c ｍ／ｚ値が２００〜３００を越える荷電イオンの強度は一層軽いフラグメントのものに比べて上昇した；ベースピークをイタリックで示す；ｍ／ｚ、質量／荷電。^d 仮の表示、入手できない参照化合物。^e 図３に列挙したピーク。表IIは、リポタンパク質とともにインキュベートしたときの正常ヒト線維芽細胞およびウイルスでトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞でのオキシステロールの産生を示す。中性および酸性の酸素化コレステロール誘導体の量は、線維芽細胞とともに４８時間インキュベートした後に１０％ＦＣＳ（コレステロール濃度１.２ｍＭ）を含有する培地（１０ｍｌ）中で決定した。０.２５時間インキュベートした細胞は対照とした。 ^a略語およびステロイド名については表Ｉを参照。^b 中央値：範囲として表示、＜＝検出限界またはそれ以下の量^c 正常線維芽細胞およびウイルスでトランスフォーメーションした線維芽細胞のタンパク質含量はそれぞれ０.６ｍｇおよび１.４ｍｇであった。インキュベーション皿のサイズは５７ｃｍ²であった。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。^d ｎ＝インキュベーションの回数^e インキュベーションの間または試料精製の間のコレステロールの自己酸化によっても生成しうる。図３は、正常線維芽細胞をリポタンパク質とともにインキュベートした後に培地から単離した中性Ｃ²⁷−ステロイドのＧＣ／ＭＳ分析を示す。表Ｉからわかるように、正常線維芽細胞をリポタンパク質（１０％ＦＣＳを含有する培地）とともに２８〜４８時間インキュベートしたときに１３の中性Ｃ₂₇ ステロイドおよび５の酸性Ｃ₂₇ステロイドが培地中に認められた。同定は誘導体のＧＣ保持係数およびマススペクトルに基づいて行い、これを真性のステロイドのものと比較した。これらステロイドのほとんどは、Ｃ−７および側鎖の両方にさらに酸素基を有していた。細胞抽出物中にはこれ以上ステロイドは同定されず、コレステロールの自己酸化産物（上記参照）を例外として細胞抽出物中のオキシステロイドの量は低くほんとんど検出不能（培地中のものの＜１０〜２０％）であった。このため、細胞中のオキシステロールは他に断らない限り通常、分析しなかった。正常な線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞をリポタンパク質とともにインキュベートした後の定量的な結果は表IIに認めることができる。ＬＤＬコレステロールから生成される２７−ヒドロキシコレステロール（アクセルソン）に加えて、３つの他の２７−ヒドロキシル化ステロールの量もまた正常線維芽細胞とともにインキュベートしたときに１０〜２０倍増加した。これらステロールは、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、２７−ヒドロキシ−７−オキソコレステロールおよび７β,２７−ジヒドロキシコレステロールであった。実際、これらのうちの前者は生成された主要なオキシステロールであった。対応のＣ₂₇−酸の量もまた増加した（約５〜１０倍）。また、２５−ヒドロキシコレステロールおよび７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンも増加したが、前者の量はかなり変動し、このステロールの一部はコレステロールの自己酸化により生成されることを示していた。７α−ヒドロキシコレステロールの量の減少も認められ、インキュベーションの間にこのステロールが消費されることを示していた。その他のステロイドの量は対照の量と同等であり、ＦＣＳを培地に加えたときにＦＣＳ中に存在することを示唆していた。トランスフォーメーションした線維芽細胞では遥かに少量のオキシステロールが生成された（表II）。たとえば、２７−ヒドロキシコレステロールの量は約２倍しか増加せず、他の２７−ヒドロキシル化ステロールは培地中で殆ど検出されなかった。７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの量のみが有意に増加したが（このことは正常な線維芽細胞には当てはまらなかった）、これはその潜在的な前駆体である７α−ヒドロキシコレステロールの量の減少と関連しているかもしれない。これらの結果は、トランスフォーメーションした線維芽細胞ではステロールの２７−ヒドロキシル化が妨害されていることを示している。表IIIに示すように、オキシステロールをその細胞産生の経時変化についても調べた。表IIIは正常線維芽細胞をリポタンパク質とともにインキュベートしたときのオキシステロールの産生の時間−応答を示す。中性の酸素化コレステロール誘導体の量を、正常ヒト線維芽細胞（タンパク質含量１.７ｍｇ、皿サイズ１４３ｃｍ²）とともに０.２５時間インキュベートした後に１０％ＦＣＳ（コレステロール濃度１.２ｍＭ）を含有する培地（１５ｍｌ）中で決定した。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地で２４時間プレインキュベートした。 ^a略語およびステロイド名については表Ｉを参照。^b インキュベーションの間または試料精製の間のコレステロールの自己酸化によっても生成しうる。表IIIに示すように、正常ヒト線維芽細胞の種々の長さの時間のインキュベーションは２７−ヒドロキシル化ステロールの生成がリポタンパク質への暴露から３〜８時間後に開始されることを示した。２５−ヒドロキシル化ステロールの産生は最初の２４時間以内には観察されなかった。７α−ヒドロキシコレステロールの量の減少がインキュベーションの８時間後に認められた。実施例２ＬＤＬコレステロールおよび７−酸素化ステロールの正常線維芽細胞での代謝細胞株、細胞培養の条件、オキシステロールおよびステロイド酸の分析およびＨＰＬＣ手順は実施例１と同様であった。７α−ヒドロキシコレステロール、７β−ヒドロキシコレステロールおよび７ −オキソコレステロールの代謝を、これらステロール（５ナノモル）を１０％ＬＤＳを含有する培地（１０ｍｌ）中で正常ヒト線維芽細胞（タンパク質含量約０ .５ｍｇ、皿サイズ５７ｃｍ²）とともに２４時間または４８時間インキュベートすることにより調べた。パーセント表示した値は観察された代謝産物の分布を示す。７α−ヒドロキシコレステロールをインキュベートすると（２４時間）、認められた主要な代謝産物は７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（５７％）および７α,２７−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（４３％）であった（酸は分析されなかった）。７α,２７−ヒドロキシコレステロールは少量しか認められず（０.５％）、７α−ヒドロキシコレステロールの７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンへの酸化／異性化が２７−ヒドロキシル化に先行することを示唆していた。対応する酵素活性が線維芽細胞において以前に認められている（スクリード（Skrede）ら（１９８６）J.Clin.Invest.７８、７２９）。７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを線維芽細胞とともに４８時間インキュベートすると、ステロイドは７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（３７％）および７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸（６３％）に広範に変換された。少量の２５−ヒドロキシル化７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（０.５％）もまた認められた。これら結果は、７α−ヒドロキシコレステロールが正常線維芽細胞により７α−ヒドロキシ−４ −コレステン−５− オン、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸に変換されうることを示しており、このことがＦＣＳとともにインキュベートする間の培地中でのこれら代謝産物の出現および７α−ヒドロキシコレステロールの消失を説明できた（表II）。７β−ヒドロキシコレステロールの代謝は７α−ヒドロキシコレステロールの代謝とは異なっていた。このステロールを正常線維芽細胞とともに２４時間インキュベートしたとき、主要な代謝産物は７β,２７−ジヒドロキシコレステロール（１％）および３β,７β−ジヒドロキシ−５−コレステン酸（６２％）であった。さらに、７β−ヒドロキシコレステロールのかなりの部分（約１／３）が７−オキソコレステロール（２０％）、２７−ヒドロキシ−７−オキソコレステロール（１％）および３β−ヒドロキシ−７−オキソ−５−コレステン酸（１４％）に変換された。７β−ヒドロキシ基の酸化はまた７β,２７−ジヒドロキシコレステロールをインキュベートしたときにも起こった。驚くべきことに、７β−ヒドロキシコレステロールの対応３−オキソ−Δ⁴誘導体への変換は観察されなかったが、これはＦＣＳとともに線維芽細胞をインキュベートした後の培地中の７β−ヒドロキシル化３−オキソ−Δ⁴ステロイドの不在と一致していた（表Ｉ）。このことは、従来の７β−ヒドロキシコレステロール誘導体がインビボで本発明の化合物の効果を模倣することができないことを示唆している。７−オキソコレステロールを正常線維芽細胞とともにインキュベートすると２７−ヒドロキシ−７−オキソコレステロール（５５％）および対応Ｃ₂₇−酸（３５％）の生成という結果となった。少量が７β−ヒドロキシコレステロールに変換されたが（１０％）、７α−ヒドロキシル産物への変換は観察されなかった。それゆえ、７−位と２７−位の両方に酸素基を有するＣ₂₇ −ステロイドの正常線維芽細胞による生成は、コレステロールの自己酸化生成物の培地中の存在によるものであり得た。しかしながら、このことは７α,２７− ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ −４−コレステン酸が２７−ヒドロキシコレステロールにも由来する可能性を排除するものではなかった。ヒト線維芽細胞による２７−ヒドロキシコレステロールの７α−ヒドロキシル化は本願出願人によって最初に認められ（アクセルソンら（１９９５）J.Lipid Res.３６、２９０）、その後、これら細胞において一般的に起こることがわかった（ツァング（Zhang）ら（１９９５）Biochem.Biophys .Acta.１２５６、３５３）。生成物７α,２７−ジヒドロキシコレステロールは細胞中で７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび対応酸に広範に変換される。ＬＤＬコレステロールが（２７−ヒドロキシコレステロールを経て）７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよびその酸に変換され得るか否かを決定するため、７α−ヒドロキシコレステロール（これは培地がリポタンパク質を含有する場合に常に存在する）の貢献を考慮する必要があった。このことは以下の実験により可能となった。ＦＣＳ中のＬＤＬおよび他のリポタンパク質をまずオレイン酸［³Ｈ］コレステリルで標識し、ついでステロール２７−ヒドロキシラーゼの選択的インヒビターであるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の存在下および不在下で正常線維芽細胞とともにインキュベートした（アクセルソン１９９５上掲、プリンスン（Princen）ら（１９９１）Biochem.J.２７５、５０１、ダルベック−シェーベルク（Dalback−Sjaberg）ら（１９９３）Biochem.J.２９３、２０３）。このようにしてリポタンパク質を標識したとき、オレイン酸［³ Ｈ］コレステリルの細胞による取り込みがＬＬＤ受容体−依存プロセス（すなわち、ＬＤＬの生理学的取り込み（アクセルソン１９９５上掲））にのみ基づくものである。インキュベーション後、放射性２７−ヒドロキシコレステロール、７ α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４ −コレステン酸をＨＰＬＣにより分析した。７α−ヒドロキシコレステロールの直接の代謝産物である³Ｈ−標識７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンもまた決定した。³Ｈ−標識７α−ヒドロキシコレステロール（遊離またはエステル化された）が培地中に存在すると、ＣｓＡの存在下ではＣｓＡがさらなる代謝を妨害するのでその３−酸化代謝産物が蓄積することが予想された（上記参照）。ＣｓＡの不在下では代謝産物の量は７α−ヒドロキシコレステロールから７ α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよびその酸への貢献を反映するであろう。明らかに、ＣｓＡの存在下では２７−ヒドロキシル化された化合物の生成は本質的に予想されなかった（図１をも参照）。比較のため、線維芽細胞はまた、細胞による取り込みがＬＤＬ受容体に全く依存しない［³Ｈ］コレステロールで標識したリポタンパク質とともにインキュベートした。これらインキュベーションの結果を表IVにまとめて掲げてある。表IVは正常線維芽細胞でのオレイン酸［³Ｈ］コレステリルからの放射性代謝産物の生成を示している。³Ｈ−標識した２７−ヒドロキシコレステロール、７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４− コレステン酸の量を、オレイン酸［³Ｈ］コレステリルかまたは［³Ｈ］コレステロールで標識したＬＤＬ（４％ＦＣＳ；コレステロール濃度、１.２ｍＭ）を含有する培地（１０ｍｌ）とともに正常線維芽細胞（タンパク質含量、０.７ｍｇ；皿サイズ、５７ｃｍ²）を６８時間インキュベートした後の培地および細胞中で決定した。ステロールの２７−ヒドロキシル化をシクロスポリンＡ（ＣｓＡ、１０μＭ）により妨害したときに、³Ｈ−標識７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの蓄積はインキュベーションの間に培地中で自己酸化された［³Ｈ］コレステロールまたはオレイン酸［³Ｈ］コレステリル（すなわち、遊離またはエステル化された７α−ヒドロキシコレステロール）の存在を示していた。 ^a略語およびステロイド名については表Ｉを参照。^b 値は培地および細胞中に認められた量の合計である；＜＝検出レベルの量またはそれ以下。^c ＦＣＳをオレイン酸［³Ｈ］コレステリル（４８×１０⁶ｄｐｍ）または［³Ｈ］コレステロール（４９×１０⁶ｄｐｍ）とともにプレインキュベートした。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。オレイン酸［³Ｈ］コレステリルとともにインキュベートした後に、２７−ヒドロキシコレステロールに加えて７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン− ３−オンおよび７α−３−オキソ−４−コレステン酸が³Ｈ−標識化合物として認められた。これら代謝産物のＨＰＬＣ分析を示す（図４）。ＣｓＡを用いた対応インキュベーションにおいて放射性７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３− オンの蓄積は観察されなかったので（表IV）、オレイン酸［³Ｈ］コレステリルの自己酸化（７α−ヒドロキシル化）はインキュベーションの間に生じなかった。［³Ｈ］コレステロールを用いたインキュベーションでは、２７−ヒドロキシコレステロールの量はオレイン酸［³Ｈ］コレステリルよりも低かったが、大量の７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３− オンおよび対応酸が認められた。しかしながら、［³Ｈ］コレステロールおよびＣｓＡとともにインキュベートすると³Ｈ−標識７α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの有意の蓄積となり、２７−酸素化代謝産物の大部分が自己酸化された［³Ｈ］コレステロール（７α−ヒドロキシコレステロール）から生成されたものであることを示唆していた。オレイン酸［³Ｈ］コレステリルと［³Ｈ］コレステロールとにおける酸素に対する化学的安定性の差異は驚くべきであるが、それらを水／メタノール環境下の空気および熱に２４時間暴露することにより確認した。オレイン酸［³Ｈ］コレステリルの自己酸化産物は検出されなかったが（＜０.１％）、［³Ｈ］コレステロールの約２％が自己酸化された。それゆえ、これら結果は、正常ヒト線維芽細胞においてＬＤＬコレステリルエステルが加水分解され、２７−ヒドロキシコレステロールに変換され、ついでこれが７α− ヒドロキシル化され７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ−３−オキソ−４−コレステン酸に酸化されることを示している。後者は、線維芽細胞におけるこの拡張されたＬＤＬ経路の主要な最終代謝産物であると思われる。実施例３トランスフォーメーションした線維芽細胞でのＬＤＬコレステロールおよび側鎖ヒドロキシル化ステロールの代謝細胞株、細胞培養の条件、オキシステロールおよびステロイド酸の分析およびＨＰＬＣ手順は実施例１と同様であった。正常線維芽細胞とは対照的に、トランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞をリポタンパク質とともにインキュベートした後に少量の２７−酸素化ステロールしか培地中に検出されなかった（表II）。７α−ヒドロキシ−４−コレステン −３−オンの量の増大はステロールの２７−ヒドロキシル化がこれら細胞で妨害されることを示しうるが（上記参照）、培地中の２７−ヒドロキシル化ステロールの欠如はまたＬＤＬの細胞による取り込みの減少あるいは結合体（たとえば、脂肪酸エステルまたは硫酸エステル）の生成の増大にも基づきうる。表Ｖは、正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞を放射性コレステロールまたはオレイン酸コレステリルで標識したリポタンパク質とともに４８時間インキュベートした後の³Ｈ−標識コレステロールおよびコレステリルエステルの分布を示す。正常線維芽細胞およびウイルスによりトランスフォーメーションした線維芽細胞を［³Ｈ］コレステロールまたはオレイン酸［³Ｈ］コレステリルで標識したリポタンパク質（１０％ＦＣＳ）を含有する培地中で４８時間インキュベートした後の放射能の分布。ＦＣＳ中の非標識コレステロールの全濃度は１.２ｍＭであった。０.２５時間のインキュベーションは対照とした。 ^a正常線維芽細胞およびウイルスによりトランスフォーメーションした線維芽細胞のタンパク質含量は、それぞれ０.６ｍｇおよび１.４ｍｇであった。インキュベーション皿のサイズは５７ｃｍ²であった。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。これらインキュベーションの結果はまた表IIにも示してある。^b インキュベーション培地への添加：培地に添加した［³Ｈ］コレステロールおよびオレイン酸［³Ｈ］コレステリルの量は、それぞれ２２.８×１０⁶ｄｐｍおよび１８.９×１０６^dｐｍであった。ステロールをＦＣＳとともに２０℃で１６時間プレインキュベートした。^c 回収した放射能のパーセント。添加した放射能の回収合計は＞９０％であった。^d Ｃ／ＦＣＳ：ＦＣＳ中の［³Ｈ］コレステロール、ＣＯ／ＦＣＳ：ＦＣＳ中のオレイン酸［³Ｈ］コレステリル。同じインキュベーションからのオキシステロール産生の結果は表IIに示してある。表Ｖからわかるように、正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞での［³Ｈ］コレステロールの細胞による取り込みおよび保持（細胞含量）は、それぞれ約１６％および２２％であった。約４％が両細胞型によりエステル化された。オレイン酸［³Ｈ］コレステリルとともにインキュベートした後、大部分は細胞内で加水分解されたが、該化合物の保持は正常細胞では約１１％、トランスフォーメーションした細胞では１５％であった。細胞からの加水分解されたＬＤＬコレステロールの流出のため、それぞれ約９％および３５％の加水分解［³Ｈ］コレステロールもまた正常線維芽細胞の培地およびトランスフォーメーションした線維芽細胞の培地中に存在した（アクセルソン１９９５上掲、フィールディング（Fielding）ら、１９９５、J.Lipid Res.３６、２１１〜２２８）。正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした細胞でのオレイン酸［³Ｈ］コレステリルとのインキュベーションにおける細胞含量およびコレステロールの流出は、それぞれ１９％（３２％／ｍｇタンパク質）および５０％（３６％／ｍｇタンパク質）であった。これらの結果は、細胞のタンパク質含量を考慮に入れた場合にもＬＤＬの取り込み（オレイン酸［³Ｈ］コレステリルの取り込みにより反映される）はトランスフォーメーションした細胞において減少せずおそらく増加していることを示している。それゆえ、トランスフォーメーションした線維芽細胞による２７−ヒドロキシル化ステロールの生成の減少（表II）はＬＤＬの取り込みの減少によるものではなかった。トランスフォーメーションした線維芽細胞の培地での２７−ヒドロキシコレステロールおよび他の２７−ヒドロキシル化ステロールの欠乏が代謝または結合体形成（conjugation）の増大（Ｃ₂₇−酸の生成以外）によるものかどうかを決定するため、２５−ヒドロキシコレステロールの代謝を調べた。このステロールを２７−ヒドロキシコレステロールの代わりに選択した主な理由は、２５ −ヒドロキシコレステロールが³Ｈ−標識形で入手でき、それゆえ主要な代謝産物および結合体を追跡でき検出を免れることがないからであった。これらステロールの構造上の類似性のため（ともに３β−ヒドロキシ−Δ⁵構造および側鎖中の一つのヒドロキシル基を有する）、その細胞での取り扱いは同様であると予想された（２５−ヒドロキシ基はカルボン酸に酸化されえないことを除いて）。表 VIは正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞での２５− ［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールの代謝を示す。とりわけ、表VIは、³Ｈ−標識および非標識２５−ヒドロキシコレステロールおよびＬＤＳ（コレステロール濃度０.１ｍＭ）を含有する培地で正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞を４８時間インキュベートした後に回収された放射能の分布を示す。０.２５時間のインキュベーションは対照とした。 ^a培地（１０％ＬＤＳを含有する１０ｍｌ）に添加した³Ｈ−標識および非標識２５−ヒドロキシコレステロールの量は、それぞれ１.４×１０⁶ｄｐｍおよび１. ２ナノモルであった。正常線維芽細胞およびウイルスによりトランスフォーメーションした線維芽細胞のタンパク質含量は、それぞれ０.６ｍｇおよび１.４ｍｇであった。インキュベーシヨン皿のサイズは５７ｃｍ²であった。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。^b 数字は回収した放射能の％を示す。全回収は添加した放射能の約９０％であった。^c 移動相としてヘキサン／イソプロピルアルコール（９７：３）および１ｍｌ× 分^-1の流速を用いた直相ＨＰＬＣでの保持時間は３.５〜４.０分であった。脂肪酸でエステル化した２５−ヒドロキシコレステロールとして仮に同定した。^d 移動相としてメタノール／エタノール／水（８０：２０：１０）および１ｍｌ ×分^-1の流速を用いた逆相ＨＰＬＣでの保持時間は３.０〜４.５分であった。この画分において、７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンをガスクロマトグラフィー−マススペクトルにより同定し、その量は放射能から計算したものと同様であった。^e 他の放射性化合物をも含むが、それぞれ全回収の１％未満である。２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールに加えて、２つの主要な放射性代謝産物、すなわち極性のもの一つと非極性のもの一つがＨＰＬＣにより認められた。他の代謝産物はそれぞれ回収した放射能の１％未満を構成した。７α−ヒドロキシ基を有しない酸化された２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロール（すなわち、２５−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、下記参照）に対応する放射能は観察されなかった。本発明者らはまた、弱酸（たとえば、遊離カルボキシル基を有するもの）または強酸（たとえば、グルクロニドまたはモノ硫酸またはジ硫酸エステル）（陰イオン交換クロマトグラフィーによる抽出物から単離された）を含有する画分中に放射能を検出しなかった（＜１％）。極性代謝産物および誘導体を含有するＨＰＬＣ溶離液の画分を回収後、ＧＣ／ＭＳにより７α,２５ −ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンと同定した（ツァング上掲）。非極性代謝産物は直相ＨＰＬＣにより２５−ヒドロキシコレステロールの３−酢酸誘導体の保持時間（保持時間４.９分）と同様の保持時間（３.７分）を有していた（遊離の２５−ヒドロキシコレステロールの保持時間は１１.８分であった）。それゆえ、２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールの脂肪酸エステルとして仮に特徴付けた。このことは、該非極性代謝産物をメタノール溶液中の穏やかなアルカリで処理した後に遊離の２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールを回収することにより支持された。明らかに表VIは、これら２つの細胞株の間で２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールの取り扱いに大きな差異があることを明らかにしている。完全な２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールは主として細胞中で認められた（正常細胞では３２％、トランスフォーメーションした細胞では５０％）。２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールの大部分（約４３％；７１％／ｍｇタンパク質）は正常細胞（６２）により７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン −３−オンに変換されたが、トランスフォーメーションした細胞では遥かに低かった（約３％；２％／ｍｇタンパク質）。このステロールは主として培地中で回収された。一方、２５−［³Ｈ］ヒドロキシコレステロールのエステル化は、エステル量は比較的小さかったが（約７％）トランスフォーメーションした細胞においてのみ認められた。これら結果は、２５−ヒドロキシコレステロールは正常細胞およびトランスフォーメーションした細胞の両者により容易に取り込まれるが、正常細胞では該ステロールが広範に７α−ヒドロキシル化されるのに対し、この反応はトランスフォーメーションした細胞では妨害されることを示している。これら結果はまた、トランスフォーメーションした細胞での２７−ヒドロキシコレステロールの見かけの欠乏が結合体生成の低下によるよりもむしろ生成の低下によるものであることを示唆していた。なぜなら、わずかに少量の類似ステロール、２５−ヒドロキシコレステロールしかエステル化されず、他のいずれの結合体も認められなかったからである、これらの観察の後、正常細胞およびトランスフォーメーションした細胞での３ β，７α−ジヒドロキシ−Δ⁵ステロイドの３−オキソ−Δ⁴ステロイドへの酸化／異性化の割合をも調べた。それゆえ、７α,２７−ジヒドロキシコレステロール（１.２ナノモル）を１０％ＬＤＳを含有する培地（１０ｍｌ）中で正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞（タンパク質含量はそれぞれ０.４ｍｇおよび１.１ｍｇ、皿のサイズは５７ｃｍ²）とともに４８時間インキュベートし、ついで代謝産物をＧＣ／ＭＳにより分析した。１５分間のインキュベーションは対照とした。この分析は、このステロールが細胞により容易に取り込まれることを示した。なぜなら約１％しか培地中に残留しなかったからである。正常細胞の培地では、それぞれ約２６％および３９％が７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α−ヒドロキシ −３−オキソ−４−コレステン酸として回収された。トランスフォーメーションした細胞での対応する値は、２８％および１９％であった。トランスフォーメーションした細胞では痕跡量（約１％）が３β，７α−ジヒドロキシ−５−コレステン酸に変換された。７−オキソ−、７β−ヒドロキシ−、または他の代謝産物は認められなかった。それゆえ、ほとんど同量の７α,２７−ジヒドロキシコレステロールが正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞により酸化された。しかしながら、インキュベートした細胞数（細胞のタンパク質含量）を考慮に入れると、トランスフォーメーションした細胞における酸化の割合は正常細胞の約２５％と計算された。これら研究は、２７−および７α−ヒドロキシル化酵素の見かけの活性が正常線維芽細胞に比べてトランスフォーメーションした線維芽細胞において遥かに低いが（細胞のタンパク質含量またはＬＤＬの取り込みに対して補正したときに正常活性の＜２％と評価される）、３β−ヒドロキシ−Δ⁵ステロールの酸化を触媒する酵素はあまり影響を受けないことを示している。実施例４：正常ヒト線維芽細胞およびトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬおよびオキシステロールの作用ＮｉＧＭＳ、コリエル・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチからの正常ヒト線維芽細胞（細胞株ＧＭ０８３３３）およびＳＶ−４０ウイルスによりトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞（９０−ＶＡＶＩ）（スタイン博士（ユニバーシティー・オブ・コロラド、ブールダー、コロラド）の好意により贈呈された）を、湿潤インキュベーター中に９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃に保持した組織培養フラスコ中で単層で増殖させた。細胞を必須アミノ酸および非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデンから）を添加したダルベッコ最小イーグル培地で培養した。ついで、細胞を皿（２０ｃｍ²）に５,０００細胞／ｃｍ²の密度で植え込み、培地（５ｍｌ）は１０％ＦＣＳを含有していた。実験を４８〜７２時間後に開始し、この時点で約２０,０００／ｃｍ²の細胞密度が達成された（細胞はまたインキュベーションの終了時点でほぼ集密的（subconfl uent）であった）。ついで、ＬＤＬ（０.５〜８％ＦＣＳ；コレステロール濃度、１．２ｍＭ）およびオキシステロール（０.１２μＭの濃度にて試験）をインキュベーション培地に添加する前に（後者は新たに調製したエタノール溶液中）すべての細胞をＦＣＳをＣａｂ−Ｏ−Ｓｉｌで処理することにより調製した（ウェインスタイン（Ｗｅinstein）（１９７９）Circulation ５４、補遺II５９）１０％リポタンパク質欠失血清を含有する培地（５ｍｌ）で２４時間インキュベートした。ついで培地のエタノール濃度は０.２％となった。対照の細胞は同様にインキュベートしたがステロールなしで行った。２４時間のインキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝食塩水で２回濯ぎ、カバンス（Cavance）ら、１９８１、J.Biol.Chem.２５６、２６７５に記載されているように細胞のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性のアッセイのために回収した。簡単に説明すると、細胞溶解液を２００ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭジチオトレイトール、４０ｍＭグルコース−６−リン酸、５ｍＭＮＡＤＰＨおよび５単位／ｍｌのグルコース−６− リン酸デヒドロゲナーゼ中でインキュベートした。３７℃で１５分間プレインキュベーションした後、０.９ナノモル／Ｌ［１４Ｃ］ＨＭＧ −ＣｏＡ（５７ｍＣｉ／ミリモル）および非標識ＨＭＧ−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡの最終濃度は１００μＭであった）を３７℃での６０分間のインキュベーションのために加えた。各試料の最終反応容量は６０μＬであった。５μＬの５ＭＨＣｌ（これはまた生成したメバロン酸をラクトン化させる）を加えて反応を停止させた。既知量の［３Ｈ］メバロノラクトン（内部標準）を添加した後、一つのアリコートをイオン交換クロマトグラフィーにより［１４Ｃ］ＨＭＧ−ＣｏＡから［１４Ｃ］メバロノラクトンを分離するために用い（エドワーズ（Edwards）ら、１９７７、J.Lipid Res.２０、４０）、一つのアリコートをタンパク質含量の分光光度的決定のために用いた。［３Ｈ］−および［１４Ｃ］−放射能を、クエンチング（quenching）およびスピルオーバー（spill−over）のための自動補正プログラムを備えたシンチレーションカウンター（ベックマンＬＳ５０００ＴＡ）により分析した。表VIIは、正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬおよびオキシステロールの作用を示す。とりわけ、表VIIは、正常ヒト線維芽細胞およびウイルスによりトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬ（０.５〜８％ＦＣＳ；コレステロール濃度１.２ｍＭ）およびオキシステロール（１０％ＬＤＳを含有する培地中に０.１２μＭ）の作用を示す。ＨＭＧ −ＣｏＡレダクターゼの活性は、線維芽細胞を２４時間インキュベートした後に決定した。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。 ^a略語およびステロイド名については表Ｉを参照。^b 正常ヒト線維芽細胞で観察された代謝。２７−ヒドロキシル化、７α−ヒドロキシル化およびステロールの５−二重結合の異性化を伴う３−酸化を触媒する酵素の活性は、腫瘍−トランスフォーメーションした線維芽細胞で低下することが示された。^c 対照の％。正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性は、それぞれ５８および９６ピコモル／分／ｍｇタンパク質であった。^d ＬＤＬおよびオキシステロールにより誘発されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制の度合いの正常線維芽細胞とトランスフォーメーションした線維芽細胞とでの差異種々のオキシステロールの細胞内産生を正常線維芽細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞で観察されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制と関連付けることにより、およびステロールを代謝する酵素のインヒビターを用いることにより、以下のことが明らかとなった：１．ＬＤＬコレステロールおよび多くのオキシステロール（２７−ヒドロキシコレステロール、３β−ヒドロキシ−５α−コレスト−８（１４）−エン−１５ −オン、およびコレステロールの自己酸化産物である２５−ヒドロキシコレステロール、７−オキソーコレステロール、７α−ヒドロキシコレステロールおよび７β−ヒドロキシコレステロールを含む）（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの強力なサプレッサーと考えられてきた）はすべて、生物学的に活性になる前に代謝されなければならないと思われる。２．対照的に、これらの代謝産物である７α,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、３β,２７−ジヒドロキシ−５−コレステン−７−オンおよび７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（および、おそらく３ β,２７−ジヒドロキシ−５α−コレスト−８（１４）−エン−１５−オン）は活性となるためにさらなる代謝を必要としない、すなわちＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの真のサプレッサーであると思われる。３．上記化合物のうち、一つはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制が顕著に一層強力であった。それゆえ、本発明の他の側面は、化合物３β,２７−ジヒドロキシ−５−コレステン−７−オンを好ましくは実質的に純粋な形態、たとえば＞７５％、好ましくは＞９０％の純度およびさらに好ましくは＞９５％の鏡像体的純度にて提供することにある。本発明のこの側面はまた、該化合物および／またはコレステノエート（cholestenoate）などのその活性代謝産物の医薬における用途をも提供する。好ましい用途は、細胞またはヒトを含む哺乳動物でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性を抑制するための医薬の製造におけるものである。本発明のこの側面の代表例としては、血清コレステロールおよび／またはコレステロールの生合成を低減させるためにヒトまたは哺乳動物に該化合物を投与することが挙げられる。４．これら構造を有するある種のステロールもまた、乳癌、結腸癌および悪性黒色腫細胞を含む他のヒト新生物細胞（これらはすべてＬＤＬに対する制御応答が欠損している）においてＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制を示す。このことは実施例５に示す。実施例５：ヒト悪性細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬおよびオキシステロールの作用アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国からのヒト乳癌（ＭＤＡ２３１）、結腸癌（ＷｉＤｒ）および悪性黒色腫（ＳＫ−ＭＥＬ−２）細胞株を、湿潤インキュベーター中に９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃に保持した組織培養フラスコ中で単層で増殖させ、必須アミノ酸および非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデンから）を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＭＤＡ２３１）かまたは最小イーグル培地（他の細胞）のいずれかで培養した。ついで、細胞を皿（２０ｃｍ²）に５，０００細胞／ｃｍ²の密度で植え込み、培地（５ｍｌ）は１０％ＦＣＳを含有していた。実験を４８〜７２時間後に開始し、この時点で約２０,０００／ｃｍ²の細胞密度が達成された（細胞はまたインキュベーションの終了時点でほぼ集密的であった）。ついで、ＬＤＬ（２％ＦＣＳ；コレステロール濃度、１.２ｍＭ）およびオキシステロール（０.１２μＭの濃度にて試験）をインキュベーション培地に添加する前に（後者は新たに調製したエタノール溶液中）すべての細胞をＦＣＳをＣａｂ−Ｏ−Ｓｉｌで処理することにより調製した（ウェインスタイン上掲）１０％リポタンパク質欠失血清を含有する培地（５ｍｌ）で２４時間インキュベートした。ついで培地のエタノール濃度は０.２％となった。対照の細胞は同様にインキュベートしたがステロールなしで行った。２４時間のインキュベーションの後、細胞をリン酸緩衝食塩水で２回濯ぎ、記載されているように（カベネル（Ca venel）上掲）細胞のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性のアッセイのために回収した。簡単に説明すると、細胞溶解液を２００ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭジチオトレイトール、４０ｍＭグルコース−６−リン酸、５ｍＭＮＡＤＰＨおよび５単位／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ中でインキュベートした。３７℃で１５分間プレインキュベーションした後、０.９ナノモル／Ｌ［１４Ｃ］ＨＭＧ−ＣｏＡ（５７ｍＣｉ／ミリモル）および非標識ＨＭＧ−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡの最終濃度は１００μＭであった）を３７℃での６０分間のインキュベーションのために加えた。各試料の最終反応容量は６０μＬであった。５μＬの５ＭＨＣｌ（これはまた生成したメバロン酸をラクトン化させる）を加えて反応を停止させた。既知量の［３Ｈ］メバロノラクトン（内部標準）を添加した後、一つのアリコートをイオン交換クロマトグラフィーにより［１４Ｃ］ＨＭＧ−ＣｏＡから［１４Ｃ］メバロノラクトンを分離するために用い（エドワーズ上掲）、一つのアリコートをタンパク質含量の分光光度的決定のために用いた。［３Ｈ］−および［１４Ｃ］−放射能を、クエンチングおよびスピルオーバーのための自動補正プログラムを備えたシンチレーションカウンター（ベックマンＬＳ５０００ＴＡ）により分析した。表VIIIは、ヒト悪性細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬおよびオキシステロールの作用を示す。とりわけ、表VIIIは、２４時間インキュベートした後の乳癌および結腸癌細胞株および悪性黒色腫細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対するＬＤＬ（２％ＦＣＳ；コレステロール濃度１．２ｍＭ）および選択されたオキシステロール（１０％ＬＤＳを含有する培地中に０.１２ μＭ）の作用を示す。細胞はすべて１０％ＬＤＳを含有する培地中で２４時間プレインキュベートした。比較のため、トランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞に対する対応する値もまた示した。 ^aＣ、コレスタン；上つき数字は二重結合の位置を示す；ギリシャ文字はヒドロキシル基の立体配置を示す。^b 比較のため、腫瘍トランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞の値をも示す（実施例４参照）。正常線維芽細胞の対応する値は１８〜３８％であった。^c 乳癌細胞、結腸癌細胞、悪性黒色腫細胞およびトランスフォーメーションした線維芽細胞でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性は、それぞれ５９、１２０、１３７および８６ピコモル／分／ｍｇタンパク質であった。^d 試験せずこれら結果は、このタイプの化合物がステロール代謝酵素の低い活性を有するものを含む、種々の異なる細胞においてコレステロール産生の強力なサプレッサーであることを示している。このことは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼサプレッサーとして用いられてきた他のほとんどのオキシステロールとは対照的である。腫瘍細胞と同様、マクロファージなどの正常細胞は、コレステロールや側鎖のヒドロキシル化された３β−ヒドロキシ−５−ステロールからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼサプレッサーの生成に必要な７α−ヒドロキシル化酵素を明らかに欠いている。これら細胞は血管壁に置かれたときにアテローム性動脈硬化症斑の発生において重要な役割を果たしていると思われる。アテローム性動脈硬化症の発生のメカニズムの詳細は明らかではないが、エステル化されたコレステロールの血管壁細胞中の過剰な蓄積が特に重要であると思われている。このことと関連して本発明者らはこの一群のステロールが細胞でのコレステロールのエステル化（側鎖がヒドロキシル化された３β−ヒドロキシ−Δ５−ステロール（たとえば、２５−ヒドロキシコレステロール）により駆動されると思われる反応）を刺激するとの証拠を見出していない。さらに、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの競合阻害剤（コンパクチンやロバスタチン（メビノリン））を用いた高コレステロール血症やアテローム性動脈硬化症の従来の薬理学的治療とは対照的に、上記ステロールは細胞表面上のＬＤＬ受容体の数を抑制することによりＬＤＬ−コレステロールの細胞による取り込みをも低減させる。このことは実施例６に示す。実施例６：正常ヒト線維芽細胞のＬＤＬ受容体に対するオキシステロールの作用ＮｉＧＭＳ、コリエル・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（カムデン、ニュージャージー）からの正常ヒト線維芽細胞（細胞株ＧＭ０８３３３）を、湿潤インキュベーター中に９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気で３７ ℃に保持した組織培養フラスコ中で単層で増殖させた。細胞を必須アミノ酸および非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデンから）を添加したダルベッコ最小イーグル培地で培養した。ついで、細胞を同培地中、５０ｃｍ²皿に６,０００細胞／ｃｍ²の密度で植え込んだ。実験を９６時間後に開始し、この時点で約２０,０００／ｃｍ²の細胞密度が達成された（細胞はまたインキュベーションの終了時点でほぼ集密的であった）。ついで、細胞のＬＤＬ受容体活性に対するステロールの作用（高親和性の割合＝ＬＤＬの受容体を介した分解）を試験した。細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、ＦＣＳをＣａｂ−Ｏ−Ｓｉｌで処理することにより調製した（ウェインスタイン上掲）１０％リポタンパク質欠失血清（ＬＤＳ）（この血清を用いた場合には細胞増殖はマイナスの影響を受けなかった）を含有する培地（５ｍｌ）でインキュベートした。ついで、ステロール２４−ヒドロキシ−４ −コレステン−３−オン、２５−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび２７−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを新たに調製したエタノール溶液中のインキュベーション培地に加え（濃度１．１μＭ）、ついで培地のエタノール濃度は０.２％となった。対照の細胞には同量のエタノールを加えたが、ステロールは加えなかった。１９時間のインキュベーションの後、５０μｇの１２５Ｉ−標識ＬＤＬ（比活性１５０〜３８０ｃｐｍ／ｎｇタンパク質、ランガー（La nger）らの記載（１９７２、J.Clin.Invest.５１、１５２８）に従ってＮａ¹²⁵ Ｉ（アマーシャム（Amersham）から、比活性＞３５０Ｃｉ／モル）から調製、遊離のヨウ化物として１％未満の放射能を含有）を培地に加え、インキュベーションをさらに４時間続けた。ついで、¹²⁵Ｉ−標識ＬＤＬの細胞による分解をインキュベーション培地での酸可溶性放射能の生成から決定した（ビトール（Vitols）ら、１９８４、Blood ６３、１１８６）。インキュベーションはすべて２回行った。対照細胞での１２５Ｉ−標識ＬＤＬの分解は１０５〜１０９ｎｇ／時×ｍｇ細胞タンパク質であることがわかった。２４−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、２５−ヒドロキシ−４−コレステン−３ −オンおよび２７−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンで処理した細胞の対応する値は、それぞれ４０〜４１、５８〜５９および６２〜６９ｎｇ／時×ｍｇ細胞タンパク質であった。このことは、これらステロールが使用した条件下で細胞のＬＤＬ−受容体活性を約５０％低減させたことを示している。細胞増殖はメバロン酸エステルの産生に依存することが知られているので、強力なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼサプレッサーの「新規な」一群を含む種々のオキシステロールの正常ヒト線維芽細胞および腫瘍トランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞の増殖および生存性に対する作用をも試験した。上記実施例に記載のステロールに加えて７β−ヒドロキシ基を有する幾つかのステロールも試験に含めた。これらステロールはコレステロールの潜在的な代謝産物であるが、これらの多くは線維芽細胞で検出可能な量では産生されなかった（たとえば、７β −ヒドロキシ−３−オキソ−Δ⁴構造を有するステロール）。しかしながら、本発明者らは以前に、単離したヒト肝臓ミトコンドリアとともにインキュベートしたときに対応する７α−ヒドロキシステロールから７β−ヒドロキシステロールが生成しうることを示している（ショーダ（Shoda）（１９９３）Hepatology １７、３９５）。ヒト線維芽細胞の増殖および生存性に対するオキシステロールの作用を実施例７に示す。使用したオキシステロールの濃度は、オキシステロールの細胞増殖抑制または毒性の他のほとんどの研究（スミス（Smith）ら（１９８９）Free Radi cal Biology ＆ Medicine、７、２８５）において用いられているものに比べて意識的にかなり低くした（１／５〜１／１０）。これは、本発明者らが細胞膜に非特異的な障害を起こして（セバニアン（Sevanian）（１９８６）Fd.Chem.Toxic.２４、１１０３）（オキシステロールは膜中のコレステロールと置き換わりうる）細胞死に至らしめることを望まなかったからであった。実際、使用した１.２５μＭという濃度は細胞上のＬＤＬ−受容体の抑制に必要なものと同様であった（実施例３参照）。実施例７：正常ヒト線維芽細胞および腫瘍トランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞の増殖および生存性に対するオキシステロールの作用正常ヒト線維芽細胞（細胞株ＧＭ０８３３３）およびＳＶ−４０ウイルスによりトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞（９０−ＶＡＶＩ）を、湿潤インキュベーター中に９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃に保持した組織培養フラスコ中で単層で増殖させ、必須アミノ酸および非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ最小イーグル培地で培養した。ついで、細胞を植え込んだ２４〜４８時間後に実験を開始し、この時点で約１０ ,０００／ｃｍ²の細胞密度が達成された（細胞はまたインキュベーションの終了時点でほぼ集密的であった）。ついで、オキシステロール（１.２５μＭおよび２.５μＭの濃度にて試験）を新たに調製したエタノール溶液中のインキュベーション培地に添加する前に、すべての細胞を血清を欠く培地で２４時間インキュベートした。ついで培地のエタノール濃度は０.５〜１.０％となった。対照の細胞は同量のエタノールでインキュベートしたがステロールなしで行った。４８時間（ステロール濃度２.５μＭ）または７２時間（ステロール濃度１.２５μＭ）インキュベートした後に皿の所定範囲の細胞数を光学顕微鏡でカウントすることにより細胞の増殖を記録し、細胞死は単層培養中の細胞の剥離または溶解として顕微鏡により認めた。 ^aＣ、コレスタン；上つきの数字は二重結合の位置を示す；ギリシャ文字はヒドロキシル基の立体配置を示す。^b 培地中のステロールの濃度^c インキュベーション時間^d 実験開始時の細胞数との関連での生存細胞数（％にて）^e トランスフォーメーションした線維芽細胞に対するステロールの一貫しない作用（他の実験で認められた）上記から以下のことが明らかである：１．腫瘍トランスフォーメーションした線維芽細胞は正常細胞に比べてオキシステロールにより選択的に影響を受け、その結果、前者の細胞の細胞増殖の停止のみならず細胞死をも招いた。正常細胞に対する影響は比較的小さかった。２．７−ヒドロキシル化ステロールは、この位置にヒドロキシル基を有しないかまたはオキソ基を有するステロールよりも効力が大きかった。驚くべきことに、後者のグループには強力なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼサプレッサーである２５−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、２７−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび３β,２７−ジヒドロキシ−５−コレステン−７−オンも含まれており、細胞死がＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの抑制を主たる要因として誘発されるものではないことを示唆していた。３．側鎖にヒドロキシ基を有するステロールは、かかる基を有しない対応ステロールよりも効力が大きかった。４．トランスフォーメーションした細胞での細胞死の非常に強力なインデューサーは、側鎖にヒドロキシル基を有する７−ヒドロキシ−Δ⁴−ステロール（すなわち、７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７β,２７−ジヒドロキシ−４− コレステン−３−オン）であった。このグループに属するステロールの一つである７α,27−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンは他のステロールに比べて本アッセイにおいて効力が小さかった。おそらく、これはトランスフォーメーションした線維芽細胞による一層速やかな代謝（対応Ｃ２７−酸に変換された）によるものであった。５．側鎖にヒドロキシル基を有する７−ヒドロキシ−Δ⁴−ステロールの強い致死作用は、腫瘍トランスフォーメーションした線維芽細胞に限られず、実施例８に示すように他のヒト悪性細胞においても認められた（７β,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンについて試験した）。実施例８：ヒト悪性細胞の増殖および生存性に対する７β,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの作用アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、米国からのヒト結腸癌（ＷｉＤｒ）および悪性黒色腫（ＳＫＭＥＬ−２）細胞株およびＳＶ−４０ウイルスによりトランスフォーメーションしたヒト線維芽細胞（９０−ＶＡＶＩ）（スタイン博士（ユニバーシティー・オブ・コロラド、ブールダー、コロラド、米国）の好意により贈呈されたもの）を、湿潤インキュベーター中に９５％空気／５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃に保持した組織培養フラスコ中で単層で増殖させ、必須アミノ酸および非必須アミノ酸および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデンから）を添加したダルベッコ最小イーグル培地で培養した。細胞を、１０％ＦＣｓを含有する培地（２ｍｌ）中、９ｃｍ²皿に５,０００細胞／ｃｍ²の密度で植え込んだ。２４〜４８時間後に実験を開始し、この時点で約１０,０００／ｃｍ²の細胞密度が達成された（細胞はまたインキュベーションの終了時点でほぼ集密的であった）。ついで、７β,２７ −ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（および比較のため５−コレステン −３β,７β,２７−トリオール）（２.５μＭの濃度にて試験）を新たに調製したエタノール溶液中のインキュベーション培地に添加する前に、すべての細胞を血清を欠く培地（２ｍｌ）で２４時間インキュベートした。ついで培地のエタノール濃度は１.０％となった。対照の細胞は同容量のエタノールを用いてインキュベートしたがステロールなしで行った。２４時間および４８時間インキュベートした後、皿の所定範囲中の細胞数を光学顕微鏡でカウントすることにより細胞の増殖を記録し、細胞死は単層培養での細胞の剥離または溶解として顕微鏡にて認識した。 ^aＣ、コレスタン；上つきの数字は二重結合の位置を示す；ギリシャ文字はヒドロキシル基の立体配置を示す。_b インキュベーション時間^c 実験開始時の細胞数との関連での生存細胞数（％にて）上記結果は、本発明の化合物がヒト結腸細胞および悪性黒色腫細胞の両者において細胞死の強力なインデューサーであることを明らかに示している。ここで悪性黒色腫が化学療法に極めて耐性の癌の一種であることに注意すべきである。これらステロールの高い効力および毒性の選択性のため、これらステロールは上記で試験したものに加えて種々の癌疾患の治療に非常に有用であることが期待できる。さらに、これらステロールの細胞増殖に対する作用のため、特にこれらステロールを局所投与しうる場合に、異常に急速に増殖する非腫瘍性の細胞により引き起こされる疾患および乾癬の治療にも有用であるに違いないことが期待できる。実施例９７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの合成（ａ）酢酸２５−ヒドロキシコレステロールの調製この酢酸エステルは、超音波処理の前にピリジン（０.５ｍｌ）を加えた２ｍｇの市販の乾燥２５−ヒドロキシコレステロール（シグマ）から調製する。０. ５ｍｌの無水酢酸を加え、得られた混合物を再度超音波処理に供する。反応混合物を室温で２.５時間静置し、５ｍｌのＨ₂Ｏで反応停止させ、１５分間静置する。３ｍｌの酢酸エチルを加え、混合物を撹拌し、超音波処理に供し、ついで数分遠心分離にかける。水性相（底部の相）を新たな容器に移し、取って置く。酢酸エチル相に３ｍｌのＨ₂Ｏを加え、混合物を振盪／超音波処理／遠心分離し、容器にデカントする。この手順を繰り返して水性相３×３ｍｌを得る。（ｂ）トリメチルシリル化得られた酢酸エチル相を少量の酢酸エチルで新たな容器中に濯ぎ、吹き付け乾燥する。生成物を０.５ｍｌのピリジン／ヘキサメチルジシラン／トリメチルクロロシラザン、３：２：１に供し、これを６０℃で３０分間反応させることにより２５ヒドロキシ基のトリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）を調製する。生成物を吹き付け乾燥し、ヘキサン中に溶解し、超音波処理し、少量のヘキサンとともに２５ｍｌ容のフローレンスフラスコに移す。（ｃ）ＴＢＢ酸化得られた生成物を以下のようにしてＴＢＢ酸化に供する：ヘキサン相を吹き付け乾燥し、１.５ｍｌの濃酢酸に溶解し、超音波処理する。１.５ｍｇの臭化銅II、１０μｌのＴＢＢ（過安息香酸ｔ−ブチル）および撹拌ビーズを加え、Ｎ₂下、１００℃で５分間反応させた。生成物を冷却し、分別漏斗に移した。フラスコを５ｍｌのＨ₂Ｏ、ついで４０ｍｌのヘキサンで漏斗中に濯ぐ。混合物を撹拌し、水性相を廃棄する。５ｍｌの５％ＮａＨＣＯ₃を加え、生成物を撹拌しながら気体を蒸発させる。重炭酸相を廃棄する。後者の工程を繰り返す。生成物を５ｍｌのＨ₂Ｏで２回洗浄する。ｐＨは中性でなければならない。ヘキサン相をフローレンスフラスコに移し、吹き付け乾燥する。（ｄ）加水分解得られた生成物を以下のようにして加水分解する：メタノール中の５％ＫＯＨ（５ｍｌ）を加え、超音波処理し、混合物を水浴中、５０℃で穏やかに撹拌しながら１時間インキュベートする。５ｍｌのＨ₂Ｏを混合して反応を停止させ、生成物を濃酢酸でｐＨ約７に中和する。生成物を１０ｍｌのＨ₂Ｏで濯いだＣ１８カラム（ＯＤＳシリカ）（１.５×０.８ｃｍ）に供する。生成物を８ｍｌのメタノールで溶出し、蒸発させ、１ｍｌのメタノール中に溶解する。１０μｌをＧＬＣのために保持する。（ｅ）精製得られた生成物を蒸発させ、３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル１：１に溶解した後、ユニシル（Unisil）カラム（クラークソン・ケム（Clarkson Chem Co.）、ウィリアムスポート、ペンシルベニア、米国）（メッシュ２００〜３２５、３× ０.８ｃｍ、ヘキサン中に充填、５ｍｌのヘキサン／酢酸エチル１：１で洗浄）で精製する。以下の１１の画分を回収する：１生成物（３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル１：１）＆さらに３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル１：１２,３２×３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル４０：６０４,５２×３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル３０：７０６,７２×３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル２０：８０８,９２×３ｍｌのヘキサン／酢酸エチル１０：９０１０６ｍｌの酢酸エチル１１６ｍｌのメタノールフラスコをすべての画分で濯ぎ、画分を蒸発させ、０.５ｍｌのメタノールに溶解する。２０μｌをＧＬＣのために保持する。残りをＧＬＣ分析まで−７０℃ で貯蔵する。画分４および５は５−コレステン−３β,７β,２５トリオールを含有する。画分６、７および８は５−コレステン−３β,７α,２５トリオールを含有する。（ｆ）コレステロールオキシダーゼによる酸化コレステロールオキシダーゼ（Ｃ−１５１２、シグマ）を用いて以下のようにして３β−ヒドロキシ基を酸化し、５−二重結合を異性化する。画分４および５を０.５ｍｌのイソプロパノールに溶解する。６ｍｌの０.５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.０および５単位のコレステロールオキシダーゼを加える。混合物を３７℃ で穏やかに撹拌しながら３時間インキュベートする。ついで、９ｍｌのメタノールで反応を停止させ、Ｃ１８カラム（１.５×０.８ｃｍ）に供する。溶出液をプールし、Ｈ₂Ｏ（約６ｍｌ）が残留するまで蒸発させる。１ｍｌのメタノールを加え、混合後、生成物を同Ｃ１８カラムに再度供する。生成物が通過し終わったら、カラムを１０ｍｌのＨ₂Ｏ（２＋２＋６）で濯ぎ、８ｍｌのメタノールでフラスコに直接溶出した。生成物を蒸発させ、メタノールを用いて試験管に移し、蒸発させ、０.５ｍｌのエタノールに溶解する。２０μｌをＧＬＣおよびＧＳ／ＭＳのために保持する。（ｇ）ＨＰＬＣ精製ついで、得られた７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンおよび７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンを、８５％メタノール、２４０ｎｍのＵＶ検出器、７βアノマーについての保持時間７.３分および７αアノマーについての保持時間７.８分での逆相ＨＰＬＣ（カラム：リクロスパー、２５０×４ｍｍ、ハイバー、１００ＲＰ−１８、５μ、メルク）により精製する。溶離液をフローレンスフラスコに回収し、蒸発させ、メタノールを用いて試験管に移し、蒸発させ、０.５ｍｌのエタノールに溶解する。２０μｌをＧＬＣおよびＧＣ／ＭＳのために保持する。実施例１０７β,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの調製Ａ．２７−ヒドロキシコレステロールの調製（ａ）ジオスゲニンのクレメンゼン還元を、６０ｇの亜鉛粉末（filings）、４. ５ｇの塩化水銀II、３.０ｍｌの濃ＨＣｌおよび７５ｍｌのＨ₂Ｏから調製したばかりの亜鉛アマルガムを用いて行う。混合物をマルチネック丸底フラスコ中で５分間撹拌し、デカントする。２００ｍｌのエタノールおよび１.２ｇのジオスゲニン（シグマ）を加え、還流する。４５分間かけて６０ｍｌの濃ＨＣｌを滴下し、ついで１５分間還流を続ける。混合物を静置して室温に冷却する。１.５Ｌの氷冷水を滴下し、反応液を冷蔵下に約１時間静置する。ついで水を濾去し、乾燥塊をフローレンスフラスコに移す。３０ｍｌのジエチルエーテルを加え、反応液を室温で１０分間撹拌する。エーテルを濾去し、塊を小さな蒸発フラスコに移し、少量の温水を用いて最少量の酢酸エチルに溶解する。結晶化をまず室温で開始し、後に冷室で一夜行ってテトラヒドロジオスゲニン（１６β，２７−ジヒドロキシコレステロール）を得る。（ｂ）クロム酸化生成物を４バッチにて以下のようにして酸化する。２２.５ｍｌの氷酢酸中の１２５ｍｇのテトラヒドロジオスゲニンおよび０.６２ｇのＮａＡｃの撹拌混合物に、０.１ｍｌのＨ₂Ｏおよび０.２ｍｌの酢酸中の２０ｍｇの三酸化クロムを滴下する。反応を２５℃で１８時間続ける。ついで、数滴のメタノールを加えて過剰の試薬を破壊する。混合物を２５ｍｌの冷水で希釈し、４０ｍｌのＭｅＣｌ₂で抽出する。塩化メチレン相を約１０ｍｌのＨ₂Ｏで濯ぎ、ついでｐＨ紙で中性になるまで５％重炭酸ナトリウムおよびＨ₂Ｏで濯ぐ。ＭｅＣｌ₂をスプーン１杯の水不含Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、ＭｅＣｌ₂相をフローレンスフラスコに濾取し、蒸発させる。ＧＬＣ試料を保持する。残留する生成物を１／５のアリコートにて３０％酢酸エチル／ＴＭＰ（トリメチルペンタン）中のシリコンカラム８×０.８ｃｍに供する。画分は以下のものを含む：５×１０ｍｌ３０％酢酸エチル／ＴＭＰ１０×５ｍｌ４０％酢酸エチル／ＴＭＰ各画分の約０.１％をＧＬＣによりアッセイし、１６−ケト−２７−ヒドロキシコレステロールを含有する画分をプールする（一般に４０％混合物の画分３〜６）。（ｃ）16−ケト−２７−ヒドロキシコレステロールの還元工程（ｂ）で得られた生成物（１７０ｍｇ）を小さなフローレンスフラスコに移し、３.５ｍｌのトリエチレングリコール中の０.１１ｇのＫＯＨ、０.１ｍｌのヒドラジンおよび数個の撹拌ビーズを加える。混合物を１５分間還流し、ついで１時間冷蔵する。混合物を１５ｍｌの０．５ＭＨＣｌに滴下し、濾過し、氷冷水で濯ぐ。乾燥物質を小さな蒸発フラスコに移し、酢酸エチルで再結晶する。純度をＧＬＣ＆ＧＣ／ＭＳによりアッセイする。収量：７５ｍｇの２７−ヒドロキシコレステロール、結晶として４５ｍｇ。Ｂ．７β,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンの調製（ａ）工程Ａの酢酸エステルを、５ｍｌのＨ₂Ｏで反応を停止させる他は実施例９の工程（ａ）と同様にして調製する。実施例９のＴＭＳ工程（ｂ）は省略する。（ｂ）得られた酢酸エチル相を吹き付け乾燥し、５００μｌの濃酢酸および２００μｌのＮａ₂ＣｒＯ₄を添加することによりＮａ₂ＣｒＯ₄酸化に供する。この反応をマグネチックスターラーを用いて室温で一夜行う。換気フード中の氷浴中に置いた反応容器に３ｍｌのＨ₂Ｏを注意深く加えることにより酸化を停止させる。混合物を１５分間静置し、１ＭＮａＯＨを用いてｐＨ７の中性にする。（ｃ）得られた生成物を吹き付け乾燥し、１ｍｌの乾燥エタノール（新しく開封した瓶から）中に溶解した後に３ｍｇのＮａＢＨ₄で還元する。反応を超音波浴中で30分間行い、ついで室温で約１.５時間行う。１００ｍｌのアセトンおよび３ｍｌのＨ₂Ｏで反応を停止させる。生成物を５ｍｌのＨ₂Ｏで濯いだＣ１８カラムに供する。生成物を８ｍｌのメタノール（２＋２＋４ｍｌ）でフローレンスフラスコ中に溶出する。５０μｌをＴＭＳおよびＧＬＣによりアッセイする。（ｄ）得られた生成物を蒸発乾固し、０.３ｍｌのイソプロパノールを加えることにより加水分解し、超音波処理し、ついで３ｍｌのメタノールを加える。２５９ｍｌの１２.５ＭＮａＯＨを加え、混合し、超音波処理する。生成物を水浴中、５０℃で２時間インキュベートする。６ｍｌのＨ₂Ｏと混合することにより反応を停止させる。生成物を濃酢酸でｐＨ７の中性にし、ついで濯いだＣ１８カラムに供する。４つの画分は以下のものを含む：１生成物２丸底フラスコ＆超音波処理による１０ｍｌのＨ₂Ｏ（２＋２＋６ｍｌ）３５ｍｌの３０％メタノール（do.）４生成物を１０ｍｌのメタノールで溶出（do.）５０μｌをＴＭＳおよびＧＬＣによりアッセイする。（ｅ）生成物の残りを実施例８工程ｄの記載と同様にしてユニシルカラムで精製し、その際、５０μｌのチェック試料をＴＭＳ処理後のＧＬＣによりアッセイする。画分６は５−コレステン−３β,７β,２７トリオールを含有し、画分８は５−コレステン−３β,７α,２７トリオールを含有する。（ｅ）工程（ｄ）からの画分６を実施例９工程（ｅ）の記載と同様にしてコレステロールオキシダーゼにより酸化し、得られた７β,２７−ジヒドロキシ−４− コレステン−３−オンを実施例９の記載と同様にしてＨＰＬＣにより精製する。保持時間は８.７分である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１２月５日（１９９７．１２．５）【補正内容】請求の範囲１．式Ｉ：（式中、Ｘは直鎖または分岐鎖のヒドロキシ置換Ｃ₁−Ｃ₁₅炭化水素鎖である）で示される、医薬に使用するための化合物。２．式ＩＡ：（式中、Ｒ'およびＲ"の一方はＯＨで他方はＨである）で示される、医薬に使用するための化合物。３．７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。４．７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。５．７β，２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。６．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項２に記載の化合物の使用。７．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項６に記載の使用。８．該癌が黒色腫を含む請求項６に記載の使用。９．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癖などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項３に記載の化合物の使用。１０．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項９に記載の使用。１１．該癌が黒色腫を含む請求項９に記載の使用。１２．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項４に記載の化合物の使用。１３．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項１２に記載の使用。１４．該癌が黒色腫を含む請求項１２に記載の使用。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月１９日（１９９８．６．１９）【補正内容】経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項６に記載の使用。８．該癌が黒色腫を含む請求項６に記載の使用。９．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項３に記載の化合物の使用。１０．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項９に記載の使用。１１．該癌が黒色腫を含む請求項９に記載の使用。１２，癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項４に記載の化合物の使用。１３．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項１２に記載の使用。１４．該癌が黒色腫を含む請求項１２に記載の使用。１５．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションし哺噛乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項５に記載の化合物の使用。１６．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項１５に記載の使用。１７．該癌が黒色腫を含む請求項１５に記載の使用。１８．７５％を越える鏡像体的純度の形態のエナンシオマー７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン。１９．生理学的に許容しうる希釈剤または薬理学的担体とともに請求項２から５のいずれか１に記載の化合物を含む、癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬組成物。２０．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。２１．該癌が黒色腫を含む請求項１９に記載の医薬組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：（式中、Ｘは直鎖または分岐鎖のヒドロキシ置換Ｃ₁−Ｃ₁₅炭化水素鎖である）で示される、医薬に使用するための化合物。２．式ＩＡ：（式中、Ｒ'およびＲ"の一方はＯＨで他方はＨである）で示される、医薬に使用するための化合物。３．７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。４．７α,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。５．７β,２７−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オンである、請求項２に記載の医薬に使用するための化合物。６．癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬の製造における請求項１から５のいずれか一つに記載の化合物の使用。７．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項６に記載の使用。８．該癌が黒色腫を含む請求項６に記載の使用。９．実質的に純粋な形態のエナンシオマー７β,２５−ジヒドロキシ−４−コレステン−３−オン。１０．生理学的に許容しうる希釈剤または薬理学的担体とともに請求項１から５のいずれか一つに記載の化合物を含む、癌、ウイルスによりトランスフォーメーションした哺乳動物細胞または乾癬などの急速に増殖する細胞に付随する状態の治療用医薬組成物。１１．該癌が、軟組織肉腫などの肉腫、白血病などの骨髄増殖性の腫瘍、神経膠芽細胞腫、膵臓癌、卵巣癌、腺細胞癌、結腸癌または乳癌を含む、請求項９に記載の医薬組成物。１２．該癌が黒色腫を含む請求項９に記載の医薬組成物。