JP2000511276A

JP2000511276A - 造血始原細胞の識別方法

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Publication number: JP2000511276A
Application number: JP07517041A
Authority: JP
Inventors: ウルヴェウス，ヨハンナ; ルン−ヨハンセン，フリティヨフ; テレスタッペン，レオン・ウェー
Original assignee: ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Priority date: 1993-11-04
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2000-08-29
Also published as: DE69428518T2; US6555324B1; DE69428518D1; EP0679256B1; WO1995012813A1; EP0679256A1; EP0679256A4

Abstract

(57)【要約】ヒト始原細胞（即ち、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺）上でさまざまな細胞接着分子および成長因子受容体の発現を調べた。ひとつ以上のこれら分子および受容体の発現における特定の変化は、分化決定された非系列から特定の系列への細胞の進行に関連する。これら分子および／または受容体に関するひとつ以上のマーカーをＣＤ３４およびＣＤ３８に関するマーカーと共に用いることにより、異なった始原細胞集団各々の同定および単離が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】造血始原細胞の識別方法産業上の利用分野本発明は、フローサイトメトリーの分野およびさまざまな細胞種を識別するための蛍光標識マーカーの使用に関するが、より特定すれば、本発明は、フローサイトメトリー手段を用いて、蛍光標識されたモノクローナル抗体で標識された造血始原細胞間を識別する方法に関する。発明の背景米国特許第４，７１４，６８０号においてシビン（Ｃｉｖｉｎ）は、成熟リンパ系細胞および骨髄性細胞を実質的に含まない多能性リンパ系造血細胞の集団を記載した。シビンは、これらの細胞上に存在する抗原ＭＹ−１０およびそれに対する抗体（同じ名称）も記載した。これらの細胞は、正常成人骨髄中の全細胞の約１％をなし、且つ通常は、全能性幹細胞、多能性幹細胞、および後者の細胞の支配を伴う系列の、分化の方向が決定付けられている細胞の混合物からなる。それ以来、ヒト白血球抗原に関する国際ワークショップにより、ＭＹ−１０は「ＣＤ３４」と表示されるクラスターに分類されてきた。抗−ＣＤ３４モノクローナル抗体は、ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社（ＢＤＩＳ社、ＳａｎＪｏｓｅ，カリフォルニア）等の多くの供給源から市販されている。ＣＤ３４⁺集団の細胞中のほとんどの細胞は分化方向の決定付けられている（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）系列であるから、多くの研究者は分化方向の決定付けられている非系列細胞から系列細胞を識別するための試みにおいてさまざまな手段を用いてきた。例えば、ローケン（Ｌｏｋｅｎ）ら（Ｂｌｏｏｄ，７０：１３１６（１９８７））は、フローサイトメトリーおよび光散乱と免疫蛍光染色の組み合わせを用いて、Ｂリンパ球のさまざまな段階の成熟を同定した。細胞種に含まれるほとんどの成熟細胞からほとんどの未成熟細胞に至る研究により、ローケン（Ｌｏｋｅｎ）、テルスタペン（Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ）および彼らの共同研究者は、特定の抗原が細胞の成熟段階において発現されるが未成熟細胞上では発現されす、より未成熟な細胞で発現される別の抗原の発現が成熟とともに消失することを示した。彼らは、異なる成熟レベルにおける細胞が異なる光散乱特性を示すことも示した。Ｂｌｏｏｄ，７７：１２１８（１９９１）において、テルスタペンは、ＣＤ３４⁺およびＣＤ３８^-であった細胞集団がヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）に富むことを示した。ＨＳＣは、限定された自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）が可能であり、且つ２つの本質的始原細胞（即ち、骨髄系始原細胞とリンパ系始原細胞）への分化が可能な細胞であると規定される。（本明細書において、「骨髄系」始原細胞は、単球、顆粒球および巨核球を生じる細胞を含むが赤血球系列の細胞を生じることができる細胞を除外する。したがって、「リンパ系」始原細胞は、赤血球系列内の範囲の細胞を生じる始原細胞のみである。）テルスタペンらは、この表現型を有する細胞集団は限定された自己再生が可能であり、且つ２つの本質的始原細胞への分化が可能であったことを示した。この分野の他の研究者と同様に、テルスタペンらはこの表現型の細胞がＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ３３またはＣＤ７１を発現しなかったことを報告した。これに従い、１９９２年６月８日に出願された係属中の同じ出願人による米国特許出願番号０７／８９５，４９１号において、テルスタペンと彼の共同研究者は、表現型ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／ＨＬＡ−ＤＲ⁺を有するより豊富なヒト細胞集団を記載した。この研究に加えて、他の研究者は細胞接着分子のＨＳＣ富裕集団への効果を試験した。例えば、シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）らは、始原細胞に関係する特定の骨髄幹細胞上でのＶＣＡＭ−１の発現を記載した。Ｂｌｏｏｄ，８０：３８８（１９９２）を参照されたい。同様に、オガワ（Ｂｌｏｏｄ，８１：２８４４（１９９３））は、始原細胞への異なる成長因子の擬作用（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄｅｆｆｅｃｔ）を記載した。上記研究の間およびウオグナム（Ｗｏｇｎｕｍ）ら（Ｂｌｏｏｄ，７６：６９７（１９９０）およびウドムサクディ（Ｕｄｏｍｓａｋｄｉ）ら（Ｂｌｏｏｄ，８０：２５１３（１９９２））において、系列の分化決定細胞から非系列の分化決定細胞を識別すること、系列内の成熟段階の識別、または特定の極めて選択的なマーカー（例えば、ＥＰＯ）の使用に焦点を絞って特定の始原系列を同定したが、特定の系列の分化の方向を決定する始原細胞間を識別するために高感度測定手段を用いた系統的研究はなされていない。発明の概要本発明は、骨髄系、リンパ系および赤血球系始原細胞に分化決定されるヒト系列を識別するための方法からなる。ＨＳＣに関して富裕な細胞はＣＤ３４、ＣＤ３８およびＨＬＡ−ＤＲ抗原に特異的なマーカー（例えば、モノクローナル抗体、その断片、またはそれらに由来する組換え結合蛋白質）を用いて同定される。これらの細胞はＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／ＨＬＡ−ＤＲ⁺である。これらの細胞は均一なレベルの幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）、Ｌｕｅ８（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｅ,．ＣＤ５ＯおよびCＤ５２も発現する。低レベルの顆粒球／単球コロニー刺激性因子受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲ）、ｇｐ１３０／ＩＬ−６Ｒ（インターロイキン−６受容体のｇｐ１３０のサブユニット）、ＩＬ−６ＲおよびＦａｓＡｇはこの表現型の細胞上に発現されるが、ＩＬ−７Ｒは全く発現されない。赤血球、骨髄またはリンパ系列に分化決定される始原細胞は、ＣＤ３４に関するマーカー、ＣＤ３８に関するマーカーおよび細胞接着分子に特異的なひとつ以上のマーカーおよび／またはヒト細胞表面上に発現されるサイトカイン受容体を用いて同定されうる。始原細胞はＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺である。リンパ系列に分化決定される始原細胞はＩＬ−７Ｒのデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）発現、ＦａｓＡｇ、ＣＤ４９ｅおよびＣＤ５２の発現の低下、そしてＳＣＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０／ＩＬ−６Ｒ、Ｌｅｕ８、ＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４およびＣＤ５０の発現の低下を示した。赤血球系列に分化決定される始原細胞は、Ｌ−セレクチンの完全な消失およびＩＬ−６Ｒ、ＣＤ１８、ＣＤ４８、ＣＤ５０およびＣＤ５２の発現の低下を示した。骨髄系列に分化決定される始原細胞は、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、Ｆａｓ、Ａｇ、ＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４８およびＣＤ４９ｅの発現の増加およびＳＣＦＲ、Ｌ−セレクチンおよびＣＤ５２の発現の低下を示した。この情報を用いて、赤血球系列に分化決定されるそれら細胞のみを単離しようとするならば、例えばＣＤ３４、ＣＤ３８およびＩＬ−７Ｒ抗体を混合して各々のマーカーの陽性発現を探すであろう。骨髄分化決始原細胞のみを探すためには、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＩＬ−６Ｒ抗体を混合してこれらのマーカーの陽性発現を探すであろう。赤血球であるかもしれないそれら骨髄始原細胞を除外するために、ＩＬ−６Ｒ⁺且つＩＬ−７Ｒ^-のそれら始原細胞に関して選択するであろう。所望の系列および／または表現型の細胞を同定および／または単離するためのひとつの手段はフローサイトメトリーからなる。細胞ソーターおよび細胞分析機は、ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社（ＢＤＩＳ社、ＳａｎＪｏｓｅ，カリフォルニア）からＦＡＣＳ（商標名）の名前で市販されているもの等、多くの供給源から市販されている。フローサイトメトリーの一般的な原理およびフローサイトメトリーに伴う蛍光マーカーの使用法は、ヘルツェンベルグら（Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，２３４：１０８（１９７６））に記載されている。米国特許第４，７２７，０２０号も参照されたい。この方法においては、識別可能な放射スペクトルを有する染料に結合されたモノクローナル抗体が用いられる。有用な染料は、ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ），フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド（モリキュラープローブズ社）、ＣＹ−５（バイオロジカルディテクションシステムズ社）、ペリジニンクロロフィル蛋白質複合体（ＰｅｒＣＰ）およびそれらの縦列複合体を含む。望ましいことではあるが、各々の染料は同様な励起極大を有する必要はない。米国特許第４，５２０，１１０号、４，５４２，１０４号および４，８７６，１９０号を参照されたい。所望の表現型を有する細胞を単離するための他の手段は、細胞をトラップする物質のマトリックスを含むカラムを包含する。このマトリックスは、スチールウールのように磁気化することができ、且つ抗体に結合した磁気ビーズと混合されて使用できる物質からなりうる。そのような装置を通した標識細胞の連続通過により、所望の表現型が達成できる。そのような装置はミルテニ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）バイオテックＧｍｂＨ社によりＭＡＣＳの商品名で市販されている。別法として、マトリックスはビオチン、およびアビジンに結合した抗体からなってよい。再び、標識細胞の連続通過を用いるはずである。そのような装置はセルプロ社から市販されている。米国特許第５，２１５，９２７号、第５，２２５，３５３号および第５，２４０，８５６号；国際公開番号９１／０９１４１号；およびカトー（Ｋａｔｏ）ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１４：３８４（１９９３）を参照されたい。ＨＳＣを含むヒト細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄、胸腺、脾臓または肝臓から得ることができる。源は同種異系ドナーによるかまたは自己由来であってよい。これらの源に由来する細胞は治療のための用途を有する。特に、ひとつ以上の所望の系列の始原細胞は骨髄または末梢血に移植されるために単離できる。同種異系ドナーまたは患者から得られた細胞は、予め細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）をしてもしなくても得ることができるが、インビボにおいてＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦを用いる。得られたら、細胞は直ちに使用することができ、あるいはＳＣＦまたはＧＭ−ＣＳＦのような成長因子の使用によりエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）で拡張するか、または後の使用のために保存することができる。細胞はさまざまな環境において用いることができる。例えば、白血病患者には感染を予防するために血小板を提供することは治療の間の重要なことである。血小板を提供するために、骨髄始原細胞はそのまままたは拡張されて投与されうる。ＨＩＶ⁺患者においては、枯渇したＣＤ４⁺および／またはＣＤ８⁺リンパ球に代えてＴ細胞が投与されうる。図面の説明図１は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＨＬＡ −ＤＲＦＩＴＣで標識された胎児骨髄細胞の一連の３つのドットプロットからなり、ＡはＰｅｒＣＰのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットてあり、Ｂはトランスフォームされた直交光散乱対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＣはＦＩＴＣのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットを示す。図２は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ１９ＰＥで標識された胎児骨髄細胞の一連の３つのドットプロットからなり、ＡはＰｅｒＣＰのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、Ｂはトランスフォームされた直交光散乱対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＣはＰＥのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットを示す。矢印は成熟の方向を示す。図３は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−Ｄ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ１５ＰＥで標識された胎児骨髄細胞の一連の３つのドットプロットからなり、ＡはＰｅｒＣＰのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、Ｂはトランスフォームされた直交光散乱対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＣはＰＥのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットを示す。矢印は成熟の方向を示す。図４は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ７１ＦＩＴＣで標識された胎児骨髄細胞の一連の３つのドットプロットからなり、ＡはＰｅｒＣＰのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、Ｂはトランスフォームされた直交光散乱対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＣはＦＩＴＣのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットを示す。矢印は成熟の方向を示す。図５は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび無関係なＩｇＧ₁ ＰＥで標識された胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなり、ＡはＰＥのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＢはＰＥ蛍光のｌｏｇ対トランスフォームされた直交光散乱のプロットであり、そしてＣは段階「１」の細胞からリンパ系細胞（Ｌ）、骨髄（ＧＭ）および赤血球（Ｅ）分化決定の段階「２」の始原細胞の成熟の段階の函数としてＰＥ蛍光のｌｏｇを表す。図６は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＩＬ− ７ＲＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図７は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＦａｓＡｇＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図８は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＳＣＦＲＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図９は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＧＭ− ＣＳＦＲＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１０は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ｇｐ１３０／ＩＬ−６ＲＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１１は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗-ＩＬ６ＲＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１２は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ１８ＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１３は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ４４ＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１４は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗-ＣＤ４８ＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１５は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ４９ｅＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１６は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ５０ＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１７は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣおよび抗−ＣＤ５２ＰＥで標識された、図５と同様の、胎児骨髄細胞の一連の２つのドットプロットおよび１つのグラフからなる。図１８は、抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣ、抗−ＣＤ３３ＰＥおよび抗−ＨＬＡ−ＤＲＦＩＴＣで標識された胎児骨髄細胞の一連の６つのドットプロットからなり、ＡはＰＥ蛍光のｌｏｇ対トランスフォームされた直交光散乱のプロットであり、ＢはＰＥのｌｏｇ対ＰｅｒＣＰ蛍光のｌｏｇのプロットであり、Ｃはトランスフォームされた前方光散乱対直交光散乱のプロットであり、ＥはＰＥのｌｏｇ対ＦＩＴＣ蛍光のｌｏｇのプロットであり、そしてＦはＰＥのｌｏｇ対ＡＰＣ蛍光のｌｏｇのプロットであるが、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／ＨＬＡ−ＤＲ⁺細胞は緑に発色し、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／ＨＬＡ−ＤＲ^- 細胞は赤に発色し、骨髄分化決定細胞は灰色に発色し、そしてリンパ分化決定細胞は黄色に発色する。発明の詳細な説明胎児の骨髄は、在胎齢１６−２２週の堕胎子から得て、医学研究におけるヒト対象の使用に基づいたスタンフォード大学医学センターの研究機関調査会議のガイドラインにしたがって用いられた。赤血球は上記のとおりに溶解し、そして細胞懸濁液を洗浄した。細胞は、最初に、所望の成長因子受容体または所望の細胞接着分子に関するモノクローナル抗体マーカーで２０分間の試験あたり０．１μ ｇにて染色し、次に、細胞を洗浄した。次に、ヒツジの抗マウスＩｇＰＥ抗体を第２段階の試薬として用い、そして洗浄した。３０％のマウス血清でブロックした後、細胞を同時に抗−ＣＤ３４ＰｅｒＣＰ、抗−ＣＤ３８ＡＰＣ、抗− ＣＤ３３ＰＥおよび抗−ＨＬＡ−ＤＲＦＩＴＣ（または骨髄始原細胞を赤血球始原細胞から識別する実験には抗−ＣＤ７１ＦＩＴＣ）で２０分間の試験あたり０．１μｇにて染色した。次に細胞を洗浄した後に、０．５％パラホルムアルデヒドにより固定した。本明細害にて用いたすべての抗体はひとつ以上の源、例えはＢＤＩＳ社、イムノテック社（Ｓ．Ａ．）、アマク（Ａｍａｃ）社（Ｄａｋｏ）から市販されており、および／またはヒト白血球抗原に関する国際ワークショップにより記載および集められてきた。ヒト細胞上の低密度抗原を同定するために、ＦＡＣＳｃａｎブランドのフローサイトメトリーを修飾して２０μ秒の間隔で流れる細胞を下記の順序で照射する３っのレーザーを有するようにした：ＦＩＴＣおよびＰｅｒＣＰを励起する４８８ｎｍのアルゴンレーザー：ＡＰＣを励起する６３３ｎｍのネオンレーザー；および、ＰＥを励起する５３２ｎｍのＹＡＧレーザー。後者のレーザーはＰＥを励起することにより、４８８ｎｍにおける励起からの結果よりも約６倍バックグラウンド（即ち、自己蛍光）に対して高いシグナルを生じる。フローサイトメーター分析は、光散乱およびＣＤ３４⁺細胞に関して設定されたゲートを用いてＬｙｓｉｓ（商標名）２．０データ取得ソフトウエア（ＢＤＩＳ社）を用いた同じ装置上で実施した。前方光散乱、直交光散乱、および３つの蛍光シグナルは各々の事象に関して測定され、そして約１０，０００の事象がリストモードデータファイルに蓄積された。リストモードデータファイルの分析はＰＡＩＮＴ−Ａ−ＧＡＴＥ（商標名）ソフトウエア（ＢＤＩＳ社）を用いて実施した。（米国特許第４，８４５，６５３号を参照されたい。）直交光散乱のデータは米国特許第５，２２４，０５８号に開示された方法によりトランスフォームされた。図１Ａを参照すると、ＨＳＣに富んだ非系列の分化が決定つけられたヒト細胞が示される。これらの細胞はＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-である。図１Ｂにおいては、これらの細胞は低いレベルの直交光散乱を有することが示される。図１Ｃにおいては、ＨＬＡ−ＤＲの発現が示される。テルスタペンらの同一出願人による係属出願に記載されているとおり、これらの細胞もＨＬＡ−ＤＲ⁺である。さまざまな成長因子受容体および細胞接着分子の始原細胞上での発現の相対レベルを測定するために、３つの始原細胞各々を規定するためのデータ分析ゲートを設定しなければならない。ＣＤ３８およびトランスフォームされた直交光散乱を用いてリンパ始原細胞ゲートを確立した。図２−３を参照すると、ヒト細胞のＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺集団内のリンパおよび骨髄始原細胞は以下のとおりに同定された。ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ１９またはＣＤ１５を胎児細胞に加えた。リンパ系細胞は、低い直交光散乱を有するものとして図２Ｂに示される。図３Ｂと比較する。これらのゲートの正当性を確認するために、細胞はＣＤ１５またはＣＤ１９のいずれかにより染色した。リンパのゲートの中で、細胞の９４％はＣＤ１９⁺であったが、ＣＤ１５はこれらの細胞上に出現しないらしかった。図２Ｃを参照されたい。骨髄のゲートの中で、細胞の７％未満がＣＤ１９⁺であり、３０％がＣＤ１５⁺であった。図３Ｃを参照されたい。赤血球始原細胞を同定するために、ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ７１を用いて、別の実験を行った。リンパ系細胞はリンパのゲートを用いることにより除外された。骨髄始原細胞および赤血球始原細胞は、ＣＤ３８対トランスフォームされた直交光散乱を基に識別不可能であったが（図４Ｂを参照されたい）、ＣＤ７１の発現は、後者の明らかなＣＤ７１によりこれらの集団を識別した、前者はＣＤ７１をぼんやりと発現した。図４Ｃを参照されたい。３つの始原細胞集団各々から細胞を分析するための確立されたゲートの使用により、ヒト胎児細胞（データを示す、あるいは成人細胞のデータは示さない）はＰＥ標識アイソトープ対照、細胞接着分子マーカーまたは成長因子受容体マーカーを用いて別々に染色された。図５は、ＰＥの染色対ＣＤ３８の発現（図５Ａ）および対トランスフォームされた直交光散乱（図５Ｂ）を示す。図５Ｃは、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-（即ち、段階１）からＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺（即ち、段階２）への細胞の進行としての３つの始原細胞種各々の上でのＰＥの発色を示す。次に、図６−１７は、用いられた他のマーカー各々に関する結果を示す。これらの後者の図面のうちで興味深いのは、細胞接着分子に関するものであり、即ち、（１）リンパの分化決定がＣＤ４９ｅおよびＣＤ５２の高い制御（または増加した発現）、およびＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４およびＣＤ５０の低い制御（または低下した発現）に関連しており（図１２−１７Ｃ、図１８）；（２）赤血球の分化決定がＣＤ１８、ＣＤ４８、ＣＤ５０およびＣＤ５２の低い制御に関連しており、そして（３）骨髄の分化決定がＣＤ１８、ＣＤ４４、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｅおよびＣＤ５０の増加した発現およびＣＤ５２の低い制御に関連していることである。赤血球始原細胞と骨髄始原細胞は、ＣＤ１８およびＣＤ４８の発現を基にすると最も明確に識別できた。成長因子受容体に関しては、リンパの分化決定はＩＬ−７Ｒのデノボ発現、およびＦａｓＡｇの高い制御、およびＳＣＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０／ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−１０Ｒの低い制御に関連している。図６− １１Ｃを参照されたい。赤血球の分化決定はＩＬ−６Ｒ、ＣＤ１８、ＣＤ４８、ＣＤ５０およびＣＤ５２の低下した発現と関連している。骨髄の分化決定は、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、ＦａｓＡｇ、ＣＤ１８、ＣＤ４４、ＣＤ４８およびＣＤ４９ｅの増加した発現、およびＳＣＦＲおよびＣＤ５２の低下した発現と関連している。したがって、ＩＬ−７Ｒの発現はリンパ始原細胞を同定するために有用であり、ＩＬ−６Ｒの発現は骨髄の始原細胞を同定するために有用である。ＩＬ−７ＲおよびＩＬ−６Ｒ両者の発現の不在は赤血球始原細胞の同定に有用である。したがって、始原細胞を同定および／または単離するための方法は、別々の始原細胞集団を単離および同定するためにひとつ以上の細胞接着分子および／または成長因子受容体の発現を組み合わせることにより達成される。本明細書に言及されたすべての出版物および特許出願は発明の属する分野の当業者のレベルを示す。すべての出版物および特許出願は個々の出版物および特許出願が特定的且つ個々に引用により取り込まれるように、同様に引用により本明細書の一部をなす。請求の範囲の精神または範囲から離れることなく多くの変更および修飾が本発明になされうることは、当業者には理解されることであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者テレスタッペン，レオン・ウェーアメリカ合衆国カリフォルニア州パロ・アルト，コロラド・プレイス 1048

Claims

【特許請求の範囲】１．リンパ始原細胞、赤血球始原細胞および骨髄始原細胞からなるヒト始原細胞の内のひとつ以上を同定するための方法であって、その際、ＣＤ３４に関するマーカー、ＣＤ３８に関するマーカーおよび細胞接着分子および／または成長因子受容体に関するひとつ以上のマーカーにより上記集団を含むヒト細胞のサンプルを標識する工程、および各々のマーカーの発現に基づいて上記集団を同定する工程からなる、上記同定方法。２．最後の工程をフローサイトメトリー手段により実施する、請求項１記載の方法。３．マーカーが蛍光標識モノクローナル抗体からなる、請求項１記載の方法。４．細胞接着分子が、Ｌ−セレクチン、ＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９、ＣＤ５０およびＣＤ５２からなる群から選択される、請求項１記載の方法。５．成長因子受容体が、ＳＣＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０／ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−７Ｒからなる群から選択される、請求項１記載の方法。６．リンパ始原細胞、赤血球始原細胞および骨髄始原細胞からなるヒト始原細胞の内のひとつ以上を単離するための方法であって、その際、ＣＤ３４に関するマーカー、ＣＤ３８に関するマーカーおよび細胞接着分子および／または成長因子受容体に関するひとつ以上のマーカーにより上記集団を含むヒト細胞のサンプルを標識する工程、および各々のマーカーの発現に基づいて上記集団を単離する工程からなる、上記単離方法。７．最後の工程をフローサイトメトリー手段により実施する、請求項６記載の方法。８．マーカーが蛍光標識モノクローナル抗体からなる、請求項６記載の方法。９．細胞接着分子が、Ｌ−セレクチン、ＣＤ１８、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９、ＣＤ５０およびＣＤ５２からなる群から選択される、請求項６記載の方法。１０．成長因子受容体が、ＳＣＦＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０／ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−７Ｒからなる群から選択される、請求項６記載の方法。１１．請求項６記載の方法により調製されたヒト始原細胞の単離された集団。