JP4450998B2 - フローサイトメトリの全血樹状細胞免疫機能アッセイ - Google Patents
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Description
【０００１】
【関連出願の相互参照】
この出願は１９９８年９月２２日に出願された共通の所有者および同時出願の米国特許出願連続番号第０９／１５８，４０６号の部分的な継続であり、その開示を全体にわたってここに引用により援用する。
【０００２】
【発明の分野】
この発明は血液細胞機能のアッセイに関し、特定的には全血中の樹状細胞機能のアッセイに関する。
【０００３】
【発明の背景】
樹状細胞（ＤＣ）は四半世紀前に末梢リンパ系組織において観察される特徴的な「樹状の」形態によって最初に同定され（スタインマン(Steinman)ら，J. Exp. Med. 137:1142-1162 (1973)）、現在では形態的に多様で広く分布する細胞集団として公知である。今日、これらの多様な細胞はその共通の機能によって集合的に識別される。すなわち、樹状細胞は哺乳動物の免疫系の最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、さまざまな抗原提示細胞の中で唯一１次Ｔリンパ系応答を起こし得ることが示される。
【０００４】
Ｔ細胞の介在する免疫応答を起こすという単一の能力を、活性化したＴ細胞に抗原を提示する強力な能力と組み合わせると、樹状細胞は免疫に基づく療法のための強力な試薬であるとともに、さまざまな免疫の介在する疾患の治療における療法的関与の標的となり得ることを意味する。
【０００５】
たとえばＷＯ９７／２４４３８は、樹状細胞をＴリンパ球およびタンパク質抗原とともにin vitroで共培養することによって、Ｔ細胞のex vivoでの抗原特異的な活性化を起こすための組成物および方法を記載する。活性化されたＴ細胞はin vivoでの抗原特異的な免疫応答をもたらすために投与される。同様にＷＯ９７／２９１８３は、Ｔリンパ球と組換え構造から抗原タンパク質を直接発現するＤＣとを接触させることによってin vitroでＴ細胞を活性化する方法を記載する。ここでも活性化されたＴ細胞を自己注入することが意図される。米国特許第５，７８８，９６３号においては、前立腺癌の治療に対する、ＤＣによるex vivoでのＴ細胞活性化の特定的な適用が記載および請求されている。さらに別のアプローチにおいて、ネマジー（Nemazee）の米国特許第５，６９８，６７９号では、in vivoで樹状細胞を含む標的とする抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原ペプチドをもたらす免疫グロブリン融合タンパク質が記載および請求されている。
【０００６】
樹状細胞は、ＡＩＤＳの病原論および病態生理学においても重要な意味を有する。ＤＣの１つのタイプであるランゲルハンス細胞（ＬＣ）は一般的に、ウィルスへの粘膜露出の後にＨＩＶに感染される主要な細胞タイプであると考えられている。ＤＣはＨＩＶ疾患の初期相において作用するのみならず、慢性相、感染の促進およびＴリンパ球の欠乏においても作用すると考えられている（ゾートワイジ(Zoeteweij)ら, J Biomed Sci 5(4):253-259 (1998)）。リンパ系粘膜におけるＤＣは、疾患の行程におけるウィルス核酸およびビリオンの主要な貯蔵所となり得る（グルアード（Grouard)ら, Curr. Opin. Immunol. 9(4):563-567 (1997);ワイスマン(Weissman)ら, Clin. Microbiol. Rev. 1997 10(2):358-367 (1997)）。ＤＣのＨＩＶ感染を排除するための薬剤に対する医薬候補物質のスクリーニングのためのin vitro法は、スタインマンらの米国特許第５，６２７，０２５号に記載および請求されている。
【０００７】
正常な哺乳動物の免疫応答および免疫病理学におけるその重要性にもかかわらず、ＤＣは研究が困難であり、特にそのネイティブの環境における研究が困難であった。
【０００８】
その困難さの一部は樹状細胞の希少性から生じる。広く分布しているにもかかわらず、ＤＣはリンパ系組織においても乏しく、ヒト末梢血においては有核細胞の約０．３％−０．５％以下しか示されない。
【０００９】
さらに困難なのは、混合された細胞集団からの容易なＤＣのポジティブ免疫選択を許す、ＤＣに特異的な細胞表面マーカがないことである。
【００１０】
ＤＣを定める表面マーカを同定するための多くの努力は部分的にしか成功していない。その結果、現在ＤＣは複数のマーカパネルによって同定されており、その同定は主にその他の系（すなわちｌｉｎ-細胞など）に対するマーカでの染色がないことに基づくものである。その結果、典型的なＤＣ免疫精製プロトコルは、さまざまな樹状細胞以外の血液系、たとえばリンパ球、単球、顆粒球およびＮＫ系などの細胞をなくすための少なくとも１つの免疫枯渇ステップと、少なくとも１つの免疫強化ステップとを必要とする。この免疫強化ステップは、たとえばＣＤ４+細胞の選択（血液樹状細胞分離キット（Blood Dendritic Cell Isolation Kit）、ミルテニー・バイオテック（Miltenyi Biotec）♯４６８−０１、オーバーン、ＣＡ）を含んでもよく、また代替的または付加的に、ＨＬＡ−ＤＲ発現に対する選択（ガネカー(Ghanekar)ら, J. Immunol. 157:4028-4036 (1996)）を含んでもよい。
【００１１】
しかしこれらの連続的な操作は、ＤＣ細胞の表現型をin vivoで示されるものと実質的に変えてしまうおそれがある。たとえば、扁桃単核細胞の新鮮な調製物中のｌｉｎ-ＨＬＡ−ＤＲ+ＣＤ１２３+樹状細胞は、低レベルのＴ細胞共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、およびＨＬＡ−ＤＱを発現する。加えられたサイトカインの不在下でのこれらの細胞の一晩の培養でも、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを伴う成熟ＤＣ表現型の誘導が十分に起こる（オルエウス(Olweus)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。サイトカイン存在下でのＣＤ３４+樹状細胞前駆体のより長期間の培養は、実質的な表現型の変化をもたらす（コー(Caux)ら, J. Exp. Med. 184:695,1996;オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。
【００１２】
したがって当該技術分野においては、予め免疫精製またはin vitro培養することなく樹状細胞をアッセイするための方法が必要とされている。
【００１３】
ＤＣに対して特異的な細胞表面マーカの不足により、表面免疫表現型マーカは機能的に異なる樹状細胞のサブセットを不完全にしか識別していない可能性がさらに示唆される。たとえば、末梢血樹状細胞はＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３の互いに異なる発現によって識別可能な２つのサブセットに分けられることが示されている。すなわち、一方のサブセットはＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowであり、他方はＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+である（オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。免疫系において樹状細胞が演じる決定的および異なる役割のため、これら２つのサブセットの各々は異なる機能的活性を有するさまざまな細胞型を含むのではないかと論じられている。
【００１４】
したがって当該技術分野においては、細胞表面マーカの発現以外の、またはそれに加えられる表現型の基準を用いた樹状細胞サブセットの識別方法が必要とされている。さらに、ＤＣ機能により直接的に関係し得る基準に基づいてＤＣをサブセット化する方法が必要とされている。
【００１５】
近年いくつかのグループが、精製した樹状細胞を含む高度に精製した血液細胞系におけるサイトカイン発現のフローサイトメトリ分析を可能にする、サイトカインに対して特異的な抗体を用いた細胞の細胞内染色を報告した（ピッカー(Picker)ら, Blood 86(4):1408-1419 (1995);ワルドロップ（Waldrop)ら, J. Clin. Invest. 99:1739-1750 (1997);ガネカー(Ghanekar)ら, J. Immunol. 157:4028-4036 (1996);ド・サン−ビス(de Saint-Vis)ら, J. Immunol. 160:1666-1676 (1998)）。より最近には、スニ(Suni)ら、J. Immunol. 212:89-98 (1998)が、予めＴ細胞を精製しない、抗原刺激したＴリンパ球における細胞内サイトカインおよび細胞表面タンパク質の同時発現に対するアッセイを記載した。共通の所有者および同時出願の米国特許出願番号第０８／７６０，４４７号および０８／８０３，７０２号に類似のアッセイが記載および請求されている。
【００１６】
当該技術分野においては、全血中の精製されないＤＣ細胞によるサイトカイン生成の測定に対する細胞内サイトカインアッセイに適合する方法が必要とされている。
【００１７】
【発明の概要】
この発明は、第１の局面において以下のステップを含む全血中の樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ法を提供することによって、当該技術分野におけるこれらおよびその他の課題を解決する。すなわち、（ａ）全血サンプルを樹状細胞活性化物質と接触させるステップと、（ｂ）サンプルを複数の樹状細胞識別抗体および少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体と接触させるステップと、（ｃ）少なくとも１つの識別可能なＤＣサブセットによるサイトカイン特異的抗体の結合に対するサンプルのフローサイトメトリアッセイを行なうステップとである。
【００１８】
好ましい実施例において、活性化はタンパク質分泌の阻害剤の存在下で行なわれ、細胞の浸透の後に細胞内でサイトカインが検出される。よって特に好ましい実施例においては、樹状細胞活性化物質の接触ステップはブレフェルディンＡの存在下で行なわれ、抗体接触ステップ自身も以下のステップを順に含む。すなわち、（ｂ１）サンプルに複数の樹状細胞識別抗体を加えるステップと、（ｂ２）サンプル中の赤血球を溶解させるステップと、（ｂ３）サンプル中の有核細胞を浸透させるステップと、（ｂ４）サンプルに少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体を加えるステップとである。
【００１９】
樹状細胞識別抗体は複数の非ＤＣ系−特異的抗体を含んでもよい。このような場合、非ＤＣ系−特異的抗体の各々は同一の蛍光体に結合（conjugate）していることが特に好ましい。複数の非ＤＣ系特異的抗体を用いるとき、樹状細胞識別抗体はＨＬＡ−ＤＲに対して特異的な抗体をさらに含む。
【００２０】
好ましい実施例において、樹状細胞のサブセットは識別可能にラベルされる。この実施例において、樹状細胞識別抗体は異なる樹状細胞サブセットの表面に異なる態様で結合する少なくとも１つの抗体を含む。この実施例においては、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１２３に対して特異的な抗体を用いることが特に好ましい。
【００２１】
ＤＣの機能は、そのサイトカイン発現パターンと、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）の分化／活性化マーカ（ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＣＤ８３、ＣＤ２５）の動的制御とによって特徴付けることができる。よってこの発明は第２の局面において、以下のステップを含む、全血における樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ法を提供する。すなわち、（ａ）全血サンプルを樹状細胞活性化物質と接触させるステップと、（ｂ）サンプルに複数の樹状細胞識別抗体と、樹状細胞の活性化を示す樹状細胞表面マーカに対して特異的な少なくとも１つの抗体とを加えるステップと、（ｃ）少なくとも１つの識別可能なＤＣサブセットによる、樹状細胞表面活性化マーカに対して特異的な前記抗体の結合に対して前記サンプルをフローサイトメトリアッセイするステップとである。樹状細胞表面活性化マーカは、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）の分化／活性化マーカ（ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＣＤ８３、ＣＤ２５）からなる群より有用に選択される。
【００２２】
この発明の前述およびその他の目的および利益は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。図面を通じて、類似の参照記号は類似の部分を表わす。
【００２３】
【詳細な説明】
ここに記載する発明が完全に理解されるために、以下の詳細な説明を示す。この説明には以下の用語を用いる。
【００２４】
「全血」とは、哺乳動物から採取した後に実質的に分画されない液体血液サンプルを意図するものである。つまり、血液採取の後に分画を行なうと、その分画によって樹状細胞の割合が全有核細胞の約５％未満、好ましくは１−４％未満、最も好ましくは１％未満まで上昇したためである。
【００２５】
「抗体」は、ここに記載するフローサイトメトリ法においてマーカとして有用な、抗体もしくは抗体遺伝子に由来するか、または由来可能なすべての製品を含む。「抗体」は特に天然抗体、抗体断片、抗体誘導体、ならびに遺伝子工学的に作られた抗体、抗体断片、および抗体誘導体を含む。
【００２６】
「樹状細胞識別抗体」は、単独または他の抗体と組合せて樹状細胞の同定を促進するために用い得るあらゆる抗体を含み、よってそれは非ＤＣ系によって提示されるエピトープに対して特異的な抗体を含み、またポジティブ免疫同定のために有用であることが判明している、ＤＣによって提示される構造に結合する抗体をさらに含む。
【００２７】
「系ネガティブ（Lineage negative）」は「ｌｉｎ-」とも略され、非樹状リンパ球または造血細胞系の特徴として知られる細胞表面マーカの不在を表わす。「不在」とは、フローサイトメトリアッセイなどの免疫アッセイにおいて測定される際の表面発現のレベルが、バックグラウンドと顕著に異ならないことを意図するものである。
【００２８】
「樹状細胞活性化物質」とは、樹状細胞によるサイトカイン、ケモカインまたは検出可能な細胞表面タンパク質の発現を誘導またはアップレギュレートできるあらゆる物質のことである。
【００２９】
残りの用語はすべてフローサイトメトリ技術分野における通常の意味を有し、それらは特に、オーメロッド(Ormerod)（編集）の「フローサイトメトリ：実用的アプローチ（Flow Cytometry:A Practical Approach）」（Oxford Univ. Press (1997)）と、ジャロゼスキ(Jaroszeski)ら（編集）の「フローサイトメトリプロトコル(Flow Cytometry Protocols）」（Methods in Molecular Biology No. 91, Humana Press (1997)）と、「実用フローサイトメトリ（Practical Flow Cytometry）」の第３版（Wiley-Liss (1995)）とに示される。
【００３０】
樹状細胞（ＤＣ）は記憶Ｔ細胞および免疫記憶のない細胞に対して抗原を捕捉、処理および提示し、哺乳動物の免疫応答における中枢的役割を果たしている。ＤＣ機能の理解は、哺乳動物の免疫機能のあらゆる詳細な理解にとって重要である。しかし過去における樹状細胞の機能研究は、集合的に樹状細胞と命名された細胞の機能的多様性によって妨げられてきた。
【００３１】
たとえば末梢血樹状細胞の研究は２０年もの間、末梢血の樹状細胞が細胞表面の免疫表現型によって識別可能な２つの互いに排他的なサブセットに分けられるという事実に気づかないまま行なわれていた（トーマスら, J. Immunol. 153:4016 (1994);オドアティー(O'Doherty)ら, Immunology 82:487-493 (1994);オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。どちらのサブセットも高レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、その他の系に特徴的なマーカ（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＣＤ５６）を欠く。このサブセットは、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３の発現が異なることによって互いに識別される。すなわち一方のサブセットはＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowであり、他方はＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+である（オドアティーら, Immunology 82:487-493 (1994);オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997);ウィルマンら,「フローサイトメトリによって示される末梢血樹状細胞(Peripheral Blood Dendritic Cells Revealed by Flow Cytometry」(Becton-Dickinson Application Note 3)(1998)）。
【００３２】
この２つの末梢血ＤＣサブセットは、最初は偶然の細胞表面の相違によって識別されたが、現在では機能的に異なることが示されている。たとえば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞の刺激では、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣサブセットはＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+サブセットよりも強力であることが公知である。またここに新たに示すとおり、ＣＤ１１ｃ+サブセットのみが、サイトカイン生成のアップレギュレーションおよびＴ細胞共刺激分子の表面発現の増加を伴うＤＣ活性化物質に応答する。
【００３３】
ＤＣを最初に識別してから末梢血が免疫表現型的および機能的に別のＤＣサブセットを含むことを最初に示すまでに２０年かかったということは、表面表現型の分類が樹状細胞の機能的多様性を完全に捕らえるためには不十分であることを示すものである。
【００３４】
この発明は、末梢血樹状細胞をそのＤＣ活性化物質に対する機能的応答の相違に基づいて説明および識別できるようにする。この発明はさらに、最小限の実験的介在によって、樹状細胞の公知の表現型の柔軟性によって結果を混乱させることなくこれらの機能的応答を測定できるようにする。
【００３５】
図１はこの発明の基本的な方法を概略的に示すものである。全血のサンプルはまずＤＣ活性化物質とともにインキュベートされる。図面中にはＬＰＳを例示する。
【００３６】
樹状細胞活性化物質とのインキュベーションは、サンプル中に存在するさまざまなＤＣサブセットの異なる表現型応答を起こす役割をする。すなわちこれらの相違を測定することによって、別の方法では識別不能であり得るＤＣサブセットを区別できる。異なる活性化物質は異なる応答のセットを生成するため、さらに詳細な区別が可能となる。図１およびここに報告する実験においては、ＬＰＳなどの広範囲および多面発現性の効果を有するＤＣ活性化物質を用いてこの発明を例示するが、より細かい特異性を有する活性化物質も有用であることが示されるであろう。
【００３７】
樹状細胞活性化物質とのインキュベーションは、刺激のないときに検出可能なサイトカインを生成しない末梢血樹状細胞によるさまざまなサイトカインの生成のアップレギュレーションに対して特に異なって示される。ゴルジ複合体を分解するブレフェルディンＡ（“ＢＦＡ”）存在下での活性化ステップを行なうことにより（オープンショー(Openshaw)ら, J. EXp. Med. 182:1357 (1995);チャーディン(Chardin)およびマコーミック(McCormick), Cell 97:153 (1999)）、細胞分泌経路を通じたタンパク質輸送を阻害し、サイトカインタンパク質が細胞中に蓄積して、アッセイのその後のステップにおいてフローサイトメトリによる検出が可能となる。モネンシンなどの同等の分泌阻害剤を用いることによって、同様の結果が得られる。
【００３８】
活性化物質およびＢＦＡの存在下でインキュベートした後、細胞の表面を蛍光体に結合された抗体によって染色する。
【００３９】
この表面染色ステップは、抗体の第１のクラスとして、複数の樹状細胞識別抗体を含む。樹状細胞識別抗体は単独またはその他の抗体と組合せて樹状細胞の識別を促進するために用い得るあらゆる抗体である。よってこのステップにおいて用いられる抗体は、
（１）非樹状細胞に優先的に結合する抗体と、（２）ＤＣの同定に有用な樹状細胞表面構造に結合する抗体とを含んでもよい。
【００４０】
こうした第１のカテゴリに対して、同一の蛍光体でラベルされた系特異的な抗体のカクテルを用いることが有利であり得る。商業的に入手可能なこうしたカクテルの１つは、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリ・システムによるｌｉｎ１ ＦＩＴＣ系カクテル（ＢＤＩＳ、サンホセ、ＣＡ、カタログ番号３４０５４６）であり、これはＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６に対して特異的な抗体の混合物を含み、各々の抗体はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合される。カクテル中の抗体は共同してリンパ球、単球、好酸球および好中球を染色するが、樹状細胞は染色しない。よってラベルされたサンプル中のＤＣはＦＩＴＣ-またはＦＩＴＣlowクラスに集合する。このｌｉｎ１カクテルは、抗体の濃度および結合の度合いを滴定して、抗体が結合するさまざまな非ＤＣ系の細胞から同等の強度の蛍光信号を与えるようにしているために特に有利である。
【００４１】
樹状細胞識別抗体の第２のカテゴリに関しては、樹状細胞を単独でポジティブに同定する表面マーカがまだ存在しない。このようなＤＣ特異的表面構造が同定されたときには、それに対する抗体をプロトコルのこの段階において単独で用いてもよい。しかし現在は、ＤＣ識別抗体の第２のカテゴリにおける抗体、すなわち樹状細胞表面構造に積極的に結合する抗体を使用するためには、第１のカテゴリからのＤＣ識別抗体、すなわち非樹状系を同定する抗体を付加的に用いることが必要である。
【００４２】
逆に、ＤＣ識別抗体の第１のカテゴリからの抗体、すなわち非樹状細胞に優先的に結合する抗体は現在のところ、第２のカテゴリからの少なくとも１つの抗体なしに用いることはできない。好塩基球はｌｉｎ-ＣＤ１２３highＣＤ１１ｃ+だがＨＬＡ−ＤＲ-であり、このアッセイにおいて非樹状細胞に優先的に結合する抗体（カテゴリ１）を用いるときには抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体も用いることが必要である。
【００４３】
第１および第２の両方のカテゴリの樹状細胞識別抗体を用いるとき、２つのカテゴリの抗体はフローサイトメトリにおいて識別可能な蛍光体によって優先的にラベルされる。
【００４４】
表面染色ステップは、第２の広いクラスとして、公知の樹状細胞サブセットを識別する抗体を任意に含んでもよい。ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１２３に対して特異的な抗体は、互いに排他的な末梢血ＤＣサブセットを定めることが公知であるため、特に有用であることが示される。用いる蛍光体はフローサイトメトリで識別可能であるべきである。よってその後のアッセイにおいて細胞内染色に用いられる抗体がフィコエリトリン（ＰＥ）でラベルされるとき、典型的な表面染色スキームはたとえば、ｌｉｎ１ ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、およびＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（この命名法において、抗体はその特異性とそれに続く蛍光体とによって同定される）などを含む。
【００４５】
表面染色の後、サンプル中の赤血球が溶解され、次いで有核細胞が浸透される。これら２つのステップは、ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液およびＦＡＣＳ溶解溶液（順にＢＤＩＳカタログ番号３４０４５７および３４９２０２）などの商業的に入手可能な試薬を用いて、製造者の案内に従って達成されてもよい。
【００４６】
浸透に続き、細胞はサイトカインに対して特異的な、蛍光体に結合された抗体を用いて細胞内で染色される。サイトカイン特異的抗体に結合される蛍光体は、フローサイトメトリアッセイにおいて、表面染色に用いられたあらゆる蛍光体から識別可能であることが好ましい。
【００４７】
細胞内染色の後、細胞は洗浄され、次いで複数の蛍光体を同時に励起および検出できることが好ましいフローサイトメータを用いて分析される。
【００４８】
図１においては、サイトカイン発現の変化を検出するために用いるアッセイといくつかの面で異なる、樹状細胞活性化物質マーカの表面発現の変化を検出するためのアッセイは示さない。
【００４９】
こうしたアッセイにおいては、全血中の樹状細胞の活性化はブレフェルディンＡなどの分泌阻害剤の不在下で行なわれる。このことによって、あらゆるこうしたサンプルにおける細胞内サイトカイン発現の同時測定を防ぐ。
【００５０】
活性化物質の存在下でインキュベートした後、細胞の表面を蛍光体と結合した抗体によって染色する。このステップにおいては前述のとおり、複数の樹状細胞識別抗体が、公知の樹状細胞サブセットを識別する抗体を任意に伴って用いられる。
【００５１】
しかしこれに加えて、第３のクラスの表面染色抗体が用いられる。これらの抗体は表面構造、典型的には樹状細胞活性化物質との先行インキュベーションによってその発現が変化するようなタンパク質を認識する。たとえば末梢血樹状細胞の活性化は、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを起こすことが公知である（オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12551-12556 (1997)）。よって表面染色ステップは所望により、これらの抗原の１つまたはそれ以上に対して特異的な抗体を含んでもよい。最近の報告では、ＣＤ８３およびＣＭＲＦ−４４が血液およびリンパ系組織からの活性化または培養されたＤＣにおいて高レベルで発現される細胞表面マーカとして同定されたため、これらのマーカに対して特異的な抗体を用いることも有利であり得る。このクラスの抗体を用いるときには、フローサイトメトリにおいて前述の抗体から識別可能な蛍光体と典型的に結合される。よって典型的な表面染色スキームはたとえば、ｌｉｎ１ ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ、およびＰＥでラベルされたＤＣ表面活性化抗原に対して特異的な抗体などを含む。
【００５２】
表面染色の後、サンプル中の赤血球は溶解され、細胞は洗浄されて、複数の蛍光体の同時励起および検出が可能であることが好ましいフローサイトメータを用いて分析される。
【００５３】
以下の例示的な例および図２−８においてさらに詳述するとおり、正常なボランティアの全血サンプルの樹状細胞機能をアッセイした。調製物はリポ多糖（“ＬＰＳ”）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（“ＰＭＡ”）およびイオノマイシン（“Ｉ”）（合わせて“ＰＭＡ＋Ｉ”）、またはＣＤ４０−架橋のいずれかによって、各々３７℃において４時間活性化した。活性化物質として試みたがサイトカイン生成を誘発しなかった物質、すなわちＰＨＡ、ＣＤ２／２Ｒ（ＢＤＩＳカタログ番号３４０３６６）、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）、ＣＭＶ、およびＣＤ４９ｄの架橋については報告しない。ＣＤ４０の架橋は表面抗原発現を変化させたが、サイトカイン生成は誘発できなかった。
【００５４】
表１に、１つまたはそれ以上の実験においてアッセイし、実験において用いたＤＣ活性化物質に従ってさらに分類したサイトカインの一覧を示す。プラス（“＋”）は１つまたはそれ以上の実験においてそれぞれのサイトカインの発現が評価されたことを示し、マイナス（“−”）はそれぞれのサイトカインの発現が評価されなかったことを示す。表１は発現のレベルを報告するものではなく、それは続く表２に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
表２は、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで刺激され、全血中でアッセイされた、ＣＤ１１ｃ+およびＣＤ１１ｃ-樹状細胞サブセットの機能応答を示す。サイトカイン発現は平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定し、表面分子発現の変化は活性化サンプル対対照サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合として測定する。
【００５７】
【表２】
【００５８】
これらの実験の結果、非常に驚くべきことに、ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+サブセットはどのＤＣ活性化物質を用いても試験されたサイトカインのいずれも生成できないことが示された。表面抗原発現の変化をアッセイすると、このサブセットはＰＭＡ＋Ｉ活性化の際にＣＤ２５発現の明瞭なアップレギュレーションを示した。すなわちＣＤ２５のアップレギュレーションは、調べた刺激物質のすべてに対してＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+ＤＣにおいて観察された唯一の明確な応答であった。
【００５９】
それとは著しく対照的に、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣは、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで刺激されたときにサイトカイン発現の容易に測定される変化を示した。
【００６０】
ＬＰＳの刺激によって、ＣＤ１１ｃ+細胞は高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ−１βと、低レベルのＩＬ−６、ＩＬ−１ＲＡおよびＩＬ−８と，わずかなレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１ａとを生成した。ＬＰＳに対するこの応答は驚くべきものである。つまり、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣはＣＤ１４-であり、ＣＤ１４は主要なＬＰＳ受容体である。ＬＰＳは第２の受容体、おそらくはＣＤ１１ｃ自身を通じて付加的に作用すると考えられる。この仮説と一致して、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｃのどちらも欠くＣＤ１１ｃ-ＤＣは細胞内サイトカイン発現の増加を伴うＬＰＳ刺激に応答できない。さらにこの仮説と一致して、ＣＤ１４+ＣＤ１１ｃ+単球はＣＤ１４-ＣＤ１１ｃ+ＤＣよりもかなり強力にＬＰＳ刺激に応答し（図７Ａ）、ＰＭＡ＋Ｉに対する応答の顕著な増加は示さない（図７Ｂ）。
【００６１】
図８に、ＣＤ１１ｃ+ＤＣのＬＰＳに対する応答の動力学をさらに示す。最初にＴＮＦαが生成され、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が続く。活性化の約４時間後にＣＤ８０は強くアップレギュレートされる。
【００６２】
ＰＭＡ＋Ｉ活性化により、ＣＤ１１ｃ+細胞はＩＬ−８およびＩＬ−１βと、より低いが明らかなレベルのＩＬ−１ＲＡおよびＴＮＦαと、わずかな量のＩＬ−１αとを生成し、ＩＬ−６は検出できなかった。
【００６３】
このように、さまざまな活性化物質に対するＣＤ１１ｃ+ＤＣサブセットのサイトカイン応答の違いを容易に観察できた。これらの違いの中で主要なのは、ＬＰＳで刺激された際のＩＬ−６の一意の発現と、ＩＬ−８およびＴＮＦαの相対的発現の変化とである。
【００６４】
全血中でＣＤ１１ｃ+ＤＣを活性化することによって、アクセサリー分子の発現も増加する。ＬＰＳ活性化はＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを起こす。Ｔ細胞共刺激分子、特にＣＤ８０は最強の信号を与えた。ＰＭＡ＋ＩはＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを起こす。ＣＤ２５およびＣＤ４０の最小限の増加が観察された。
【００６５】
ＣＤ４０の架橋を介する活性化により、ＣＤ８６およびＣＤ８０のレベルが増加し、ＨＬＡ−ＤＲの最小限のアップレギュレーションが起こった。
【００６６】
これらのデータは、以下の実験例にさらに詳細に示すとおり、末梢血ＤＣサブセットをそのＤＣ活性化物質に応答したサイトカインおよび／または細胞表面タンパク質の生成の相違によって全血中で容易に識別できることを示すものである。
【００６７】
さらに、ＤＣ活性化物質に応答することが観察される樹状細胞が属するサブセット（ＣＤ１１ｃ+）は、こうした応答が見られないサブセット（ＣＤ１１ｃ-）よりも強力にＴ細胞を活性化することが公知であるため、この発明の方法において測定されたパラメータ、すなわちサイトカイン生成および表面活性化抗原のアップレギュレーションはＤＣ機能と直接かかわることが、このデータからさらに示される。
【００６８】
血液中のＤＣの頻度が低いこと、および活性化したＤＣは装置に付着する傾向があることから、以前は臨床的に適切な大きさの血液サンプルにおいてはほとんどの事象がアッセイ不可能であると示唆されていたため、先行するＤＣ精製なしに全血におけるＤＣ機能の測定を可能にするこの発明の簡便性は予期されていなかった。
【００６９】
先行するＤＣ精製なしに全血中のＤＣ機能を測定できることは、顕著な利点を提案する。
【００７０】
手順の見地からいうと、この発明の方法はすべてのＤＣ精製スキームに伴う細胞の損失をなくし、感受性を増加させ、システムの偏りの可能性を減少させる。加えて、この発明の方法によって影響される摂動が最小限であるため、実験的介在による表現型の変化の機会が減少する。またフローサイトメトリアッセイにおいて、この発明の方法はバルクベースではなく細胞ごとのＤＣ機能の評価を可能にするため、精密な区別が可能となる。
【００７１】
この発明によって新たに入手可能となったデータの見地からいうと、この発明の方法によって、初めて全血におけるＤＣ機能の容易かつ迅速な評価が可能となった。
【００７２】
ヒトの患者に適用すると、この発明の方法は免疫機能アッセイの既存のリストに加えられるＤＣ機能の測定を可能にし、現在こうした既存の免疫機能テストを用いている臨床状況における有用性が見出される。たとえばこの発明の方法は単独で、またはＣＤ４+Ｔリンパ球レベルのフローサイトメトリ定量とともに、ＡＩＤＳ進行の臨床的段階付けにおいて有利に用い得る。またこの発明の方法は単独で、または既存のアッセイとともに、後天的ではなく先天的な免疫不全症候群における免疫機能の評価、および治療における免疫抑制または免疫除去に続く免疫能力の評価において用いられてもよい。臨床範囲の他方端においては、この発明の方法は単独で、または既存のアッセイとともに、さまざまな形の免疫過敏症、アレルギーの臨床的評価、または複数の硬化症、リュウマチ様関節炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の臨床的評価において有利に用い得るであろう。
【００７３】
全血中のＤＣ機能の研究を可能にすることにより、この発明の方法はまた、血液の中で循環する薬剤がＤＣ機能に及ぼすであろう影響の簡単な評価をも可能にする。特にこのアッセイは、意図的にまたは偶然にＤＣ機能に影響を及ぼす薬剤の、ＤＣ機能への特定的な影響の評価を可能にする。
【００７４】
こうして、実験哺乳類のＤＣ機能の測定に適用する場合、それが異系、同系、またはトランスジェニックであっても、この発明の方法は薬剤のin vivoでのＤＣ機能に及ぼす影響をテストすることを可能にし、免疫調節的な効果を望ましく実証する薬剤の選択、またはそのような効果を特定的に欠く薬剤の選択を可能にする。
【００７５】
人体に適用する場合、この発明の方法は、現存の免疫機能アッセイに対する補完物として、患者の血液内で循環する薬品のＤＣ機能に及ぼす意図的なまたは偶然の影響の簡単な評価を可能にする。たとえば、この発明の方法を用いて免疫抑制剤の監視と滴定とを補助してもよい。この発明は、サイトカイン、ケモキネシスまたは増殖因子の機能を排除するか、低下調節するか、でなければ干渉する免疫抑制剤の監視および滴定に特に有用であることを立証する。反対に、この発明の方法はまた、多発性硬化症の治療におけるインターフェロンの投与、骨髄切断後の増殖因子の投与などを含む療法のような、肯定的な（affirmative）サイトカイン療法の効果を監視することにも特に有用であることをも立証する。
【００７６】
この発明の方法を用いて、無関係の臨床的目標を達成するための薬剤の、免疫調節的な副作用を監視することも可能である。
【００７７】
この発明の方法は、ＤＣ細胞を含む療法自体の実験的および臨床的評価に特に好適である。こうして、この発明の方法を用いて、自己樹状細胞をin vitroでの操作の後に投与する療法、移植を容易にするためにin vitroでまたは免疫抑制を達成もしくは耐性を誘導するためにin vivoで、樹状細胞が切断の対象となる療法、または樹状細胞が全般的なまたは特定的な免疫機能を向上させることを目標とする療法の、計画、評価および監視が可能である。
【００７８】
血液が採取されたときに末梢血内を循環するのが認められる樹状細胞は、この発明の方法でアッセイされるのだが、１つまたはそれ以上の細胞系の成熟において、一時的な窓（temporal window）から採取されることが理解されるであろう。すなわち、離散的な系ごとに、細胞は成熟プロセスの特定的な局面の間、優先的に循環する。しかしながら、この発明の方法のいずれのステップもＤＣ成熟の特定の局面に限られるものではない。こうして、この方法は自発的に循環するＤＣ前駆体にコミットされるＣＤ３４+にも、または薬理学的な介入などにより動かされるＣＤ３４+ＤＣ前駆体にも等しく適用し得る。
【００７９】
この発明は以下の例を参照することにより、よりよく理解されるであろうが、これらは限定としてではなく例としてのみ示すものである。
【００８０】
例１
材料
明記しない限り、以下の試薬をここに示す実験に使用する。便宜のために、抗体をそれらの特異性および結合蛍光体によって同定する。蛍光体は、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリオジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）である。よってフィコエディトリン（ＰＥ）で標識されＴＮＦαに特異的である抗体を、「ＴＮＦα ＰＥ」と称する。
【００８１】
抗体
以下の抗体は、ベクトン−ディキンソン・イミュノサイトメトリ・システムズ（Becton-Dickinson Immunocytometry Systems、ＢＤＩＳ、カリフォルニア州サンホセ）から入手する。ＴＮＦα ＰＥ、ＩＬ−１α ＰＥ、ＩＬ−１ＲＡ ＰＥ、ＩＬ−１β ＰＥ、ＩＬ−２ ＰＥ、ＩＬ−４ ＰＥ、ＩＬ−６ＰＥ、ＩＬ−８ＰＥ、ＩＬ−１３ＰＥ、ＩＦＮ−γ ＰＥ、ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ（５μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ（１０μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ（リサーチロットＫＷ９８／０７ １．１）（２０μＬ／テスト）、ＣＤ４０ ＰＥ（非結合ｍＡｂはカリフォルニア州パロアルトのDNAX Research Instituteから入手、ＢＤＩＳでＰＥに特別結合、ＢＤＩＳリサーチ結合 ＰＣ♯９３１）（１０μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ＣＤ８０ ＰＥ（２０μＬ／テスト）、ＣＤ２５ ＰＥ（２０μＬ／テスト）、ＨＬＡ−ＤＱ ＰＥ（非結合ｍＡｂはＢＤＩＳから入手、ＢＤＩＳでＰＥに特別結合、ＢＤＩＳリサーチ結合ＰＣ♯１２８４）（０．５μｇ／テスト）、ＩｇＧ２ａ ＰＥ（カタログ番号３４０４５９、２５μ／ｍＬ）、ＩｇＧ１ ＰＥ（カタログ番号３４００１３、５０μｇ／ｍＬ。ＣＤ８３ ＰＥ（ＢＤＩＳリサーチ結合、ＰＣ♯１５２０、５０μｇ／ｍＬ、全血３００μＬごとに２０μＬで使用）もまた、Pharmingenから商業的に入手可能である（カタログ番号３６９３５Ｘ）。
【００８２】
ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ系カクテルもまた商業的に入手可能であり（ＢＤＩＳ、カタログ番号３４０５４６）、すべてＦＩＴＣ標識されたＣＤ３、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６に特異的な抗体の滴定混合を含む。組合されて、抗体はリンパ球、単球、好酸球、および好中球を染色する。
【００８３】
以下の抗体はファーミンゲン（PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）から入手する。ＩＬ−１０ ＰＥ（ＩｇＧ２ａ）（０．１μｇ／テスト）、ＩＬ−１２ ＰＥ（ＩｇＧ１）（０．１μｇ／テスト）、ＣＤ８６ ＰＥ（クローンＩＴ２.２、カタログ番号３３４３５Ｘ、ＩｇＧ２ｂ）（１０μＬ／テスト）。
【００８４】
溶解剤および浸透剤
ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液およびＦＡＣＳ（登録商標）溶解液は、１０ｘストック溶液としてＢＤＩＳから入手し（それぞれカタログ番号３４０４５７および３４９２０２）、同封の説明に従って希釈し使用する。
【００８５】
樹状細胞活性化物質
化学的活性化物質はモンタナ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）から入手し、リポ多糖（「ＬＰＳ」）（シグマカタログ番号Ｌ２６５４）はＤＭＳＯ中に０．５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。イオノマイシン（「Ｉ」）（カタログ番号Ｉ−０６３４）はエタノール中に０．５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（「ＰＭＡ」）（カタログ番号Ｐ−８１３９）はＤＭＳＯ中に０．１ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。
【００８６】
ＣＤ４０架橋は、ＣＤ４０抗体（サンディエゴ、ファーミンゲン）で被覆したポリスチレンビーズ（０．８４μｍ、バクスターBaxter）を用いて行なう。
【００８７】
分泌阻害因子
ブレフェルディンＡ（「ＢＦＡ」）（カタログ番号Ｂ−７６５１）はＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。
【００８８】
洗浄緩衝剤
リン酸緩衝塩類液からなる洗浄緩衝剤（ＧｉｂＣｏＢＲＬ（ニューヨーク州グランドアイランド）から１０ｘストック溶液として入手し、次いで脱イオン水で１ｘに希釈する）は、ウシ胎児血清０．５％を含む（モンタナ州セントルイス、シグマ）（ウシ胎児血清は１０倍のＰＢＳストック溶液を１倍に希釈した後で加える）。
【００８９】
例２
全血フローサイトメトリの樹状細胞免疫機能アッセイのためのプロトコル
明記しない限り、以下のプロトコルをここに示す実験で用いる。
【００９０】
樹状細胞活性化
正常なドナーの静脈血をヘパリンナトリウムのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）管に採集する。ＬＰＳでの活性化のために、血液を１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激する。ＰＭＡ＋Ｉでの活性化のために、全血を第１にＲＰＭＩ溶媒（メリーランド州ウォーターズビル、バイオウィテイカーBiowhittaker）で１：１に希釈する。次いでＰＭＡを５ｍｇ／ｍＬで加え、イオノマイシンを１μｇ／ｍＬで加える。ＣＤ４０架橋による活性化のために、５０μＬのＣＤ４０被覆されたポリスチレンビーズを１ｍＬの全血に加える。すべての試料を、ＣＯ2を５％含んだ保湿インキュベータで、３７℃で４時間インキュベートする。
【００９１】
細胞内のサイトカイン検出のために、上述の活性化を付加的な１０μｇ／ｍＬのブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）存在下で行なう。対照（休止）アリコートはＢＦＡのみでインキュベートする。
【００９２】
表面抗原発現における変化の検出のために、試料はさらにはＢＦＡを加えずに、上述のようにＤＣ活性化物質でインキュベートする。対照（休止）アリコートは、ＢＦＡも活性化物質もなしでインキュベートする。
【００９３】
細胞内サイトカインの免疫蛍光染色
染色の前に、ＰＭＡ＋Ｉ処理した血液試料は、遠心分離および上澄み液の除去により半分にまで量を減じる。
【００９４】
細胞の準備は室温（ＲＴ）で行ない、すべてのインキュベートステップを暗所で行なう。
【００９５】
染色のために、（活性化されているかまたは休止血液対照されている）１ｍＬの試料は、５０ｍＬポリプロピレン分離管内の樹状細胞識別抗体のカクテル（２０μのＬ系カクテル１−ＦＩＴＣ、１０μＬのＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、５μＬのＣＤ１１ｃ ＡＰＣ、試薬の量は血液５０μＬごと）に加える。血液を、蛍光体結合抗体の存在下で１５分間インキュベートする。インキュベートの後に、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解液４０ｍＬを加え、管をさらに１０分間インキュベートする。次いで細胞を５００ｘｇで１０分間の遠心分離によって収集し、ペレットはさらなる処理のためにゆっくりと崩壊する。次いで、ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液１０ｍＬを加え、細胞を１０分間インキュベートする。浸透反応を、４０ｍＬの緩衝剤（ＤＰＢＳ １ｘ、ウシ胎児血清０．５％）を加えることにより停止させる。浸透された細胞を、５００ｘｇで１０分間沈殿し、デカントした後で管に残っている上澄み液（約５００μＬ）内に再懸濁する。
【００９６】
細胞外から染色、溶解、浸透された（１回のテストに対して十分な）細胞の５０μＬのアリコートをポリプロピレン染色管に加え、サイトカインに特異的なｍＡｂ（上述の材料を参照）の存在下で３０分間インキュベートする。次いで試料を緩衝剤で洗浄し、緩衝剤２５０μＬ内に再懸濁し、その後できるだけすぐにフローサイトメトリのデータ獲得を行う。フローサイトメトリのデータ獲得が遅れた場合は、試料を４℃で最大１時間まで保存する。
【００９７】
収率に応じて、１ｍＬの全血の試料はサイトカイン発現測定に対し、７回から１２回のテストをもたらす。
【００９８】
表面抗原の免疫蛍光染色
染色の前に、ＰＭＡ＋Ｉ処理した血液試料は、遠心分離と上澄み液の除去により半分にまで量を減じる。
【００９９】
細胞の準備は室温（ＲＴ）で行ない、すべてのインキュベートステップは暗所で行なう。
【０１００】
染色のために、１５０μＬの（活性化されているか休止血液対照されている）試料を染色管内の単一クローン系抗体のカクテルに加える。カクテルは、複数の樹状細胞識別抗体（２０μＬのｌｉｎ １ ＦＩＴＣカクテル、１０μＬのＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＧＰ、５μＬのＣＤ１１ｃＡＰＣ、試薬の量は血液１００μＬごと）と、以下のＤＣ表面活性抗原に特異的なＰＥ結合抗体（２０μＬのＣＤ２５ ＰＥ、０.１２５μｇのＣＤ４０ ＰＥ、２０μＬのＣＤ８０ ＰＥ、１０μＬのＣＤ８６ ＰＥ、０.５μｇのＨＬＡ−ＤＱ ＰＥ）の１つとを含む。血液とｍＡｂとを暗所で室温で１５分間インキュベートする。
【０１０１】
インキュベートの後に、３ｍＬのＦＡＣＳ（登録商標）溶解液を加え、管を室温で１０分間インキュベートする。溶解した細胞を５００ｘｇで５分間遠心分離し、その後３ｍＬの緩衝剤で（ＤＰＰＳ １ｘ、ウシ胎児血清０．５％）洗浄する。細胞ペレットを２５０μＬの緩衝剤内に再懸濁し直ちにフローサイトメータで獲得する。データ獲得が遅れた場合、細胞は最高１時間まで４℃に維持する。
【０１０２】
フローサイトメトリ分析
上述の試料は、ＦＡＣＳキャリバーTM（FACSCaliburTM）デュアルレーザフローサイトメータ（カリフォルニア州サンホセ、ＢＤＩＳ）によって得られた。機器はオートメーション化したＦＡＣＳコンプTM（FACSCompTM）４.０ソフトウェアおよび４色キャリブライトTM（CalibriteTM）ビーズ（カリフォルニア州サンホセ、ＢＤＩＳ）とを用いて設定された。事象はＦＳＣしきい値上に得られた。リストモードデータファイルのサイズを減じるために、獲得には１ ＦＩＴＣ／ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ ２パラメータ分散内のＨＬＡ−ＤＲ陽性事象のライブゲート（live gate）を用いた。
【０１０３】
例３
全血中のＣＤ１１Ｃ + ＤＣサイトカイン応答の検出
全血試料は健康なボランティアから採取し、例１および例２で説明される手順に従って、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉのいずれかによって活性化するが、いずれもブレフェルディンＡの存在下で行う。結果をそれぞれ図２および図３に示す。
【０１０４】
図２Ａから図２Ｃに、単一ＬＰＳ活性化された全血試料からの末梢血ＤＣの表面免疫表現型特徴を示す。ＣＤ１１Ｃ+樹状細胞は緑に着色され、ＣＤ１１Ｃ-ＤＣは赤に着色され、非樹状細胞は灰色で表される。色は表示の目的で任意に選択され、分析のために用いられる蛍光体とは何の関係も有さない。図２Ａは、両方の樹状細胞サブセットがｌｉｎ １ ＦＩＴＣdimおよびＨＬＡ−ＤＲbrightであることを実証し、これはオドハーティらの「免疫学」８２：４８７−４９３（１９９４）、オルウェウスらのProc. Natl. Acad. Sci. USA９４（２３）、１２５５１−１２５５６（１９９７）によって賛同されており、図２Ｂにおいてはさらに２つのサブセットが同様の側方散乱および前方散乱特性を有することを実証する。図２Ｃは、ＣＤ１１Ｃ発現の示差レベルに基づく２つのサブセットの区別を示す。
【０１０５】
図２Ｄから図２Ｊは、ＩＬ−１ＲＡ（図２Ｄ）、ＴＮＦα（図２Ｅ）、ＩＬ−６（図２Ｆ）、ＩＬ−８（図２Ｇ）、ＩＬ−１２（図２Ｈ）、ＩＬ−１α（図２Ｉ）の発現に対するアッセイの結果を示す。図２Ｊは、アイソタイプが合ったＰＥ結合ネガティブ対照抗体を用いた結果を示す。
【０１０６】
図２Ｄから図２Ｊは、少なくとも検出可能なサイトカイン産生の不在が明示されることから、ＣＤ１１Ｃ-（ＣＤ１２３+）サブセット（赤）はＬＰＳ刺激に応答しないことを実証する。これらの図には直接示されないが、ＬＰＳ活性化されたＣＤ１１Ｃ-ＤＣ内で測定されたサイトカインレベルは、活性化物質不在で産生されたものと区別がつかない。図４に示すように、ＣＤ１１Ｃ-およびＣＤ１１Ｃ+サブセットのいずれもＤＣ活性化物質不在で検出可能なレベルのサイトカインを産生しない。
【０１０７】
対照的に、ＣＤ１１Ｃ+集団は、より高いレベルのサイトカイン産生を示し、より高いレベルのＴＮＦαおよびＩＬ−１β、より低いレベルのＩＬ−６、ＩＬ−１ＲＡおよびＩＬ−８、および極微量のレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１ａを示す。
【０１０８】
図３Ａから図３Ｃは、ＰＭＡ＋Ｉで活性化された単一の全血試料からの末梢血ＤＣの表面免疫表現特徴を示す。ＣＤ１１Ｃ+樹状細胞は緑に着色され、ＣＤ１１Ｃ-ＤＣは赤に着色され、非樹状細胞は灰色に現われる。色は表示の目的で任意に選択され、分析のために用いられる蛍光体とは何の関係も有さない。
【０１０９】
図３Ａは、両方の樹状細胞サブセットがｌｉｎ １ ＦＩＴＣdimおよびＨＬＡ−ＤＲbrightであることを実証し、図３Ｂはさらに、２つのサブセットが同様の側方散乱および前方散乱特性を有することを実証する。図３Ｃは、ＣＤ１１Ｃ発現の示差レベルに基づく２つのサブセットの区別を示す。
【０１１０】
図３Ｄから図３Ｉは、ＴＮＦα（図３Ｄ）、ＩＬ−１α（図３Ｅ）、ＩＬ−１β（図３Ｆ）、ＩＬ−１ＲＡ（図３Ｇ）、およびＩＬ−８（図３Ｈ）の発現に対するアッセイの結果を示す。図３Ｉは、アイソタイプが合ったＰＥ結合ネガティブ対照抗体を用いた結果を示す。
【０１１１】
図３Ｄから図３Ｉは、少なくとも検出可能なサイトカイン産生の不在が明示されることから、ＣＤ１１Ｃ-（ＣＤ１２３+）サブセット（赤）はＰＭＡ＋Ｉ刺激に応答しないことを実証する。これらの図には直接示されないが、ＬＰＳ活性化されたＣＤ１１Ｃ-ＣＤ内で測定されたサイトカインレベルは、活性化物質不在で産生されたものと区別がつかない（図４と比較）。
【０１１２】
対照的に、ＣＤ１１Ｃ+集団は、より高いレベルのサイトカイン産生を示し、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＴＮＦα、およびＩＬ−８を実証可能に産生する。図３Ｅは、ＣＤ１１Ｃ+細胞は極微量のＩＬ−１αを産生することを実証する。
【０１１３】
単球のサイトカイン発現は同じ試料のいくつかで評価された。単球は、それらの散乱特徴と、それらの鮮やかな（bright）ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰおよびＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ染色とに基づき同定される。見られるように、ＬＰＳ＋ＢＦＡ刺激された試料においては、単球はＣＤ１１Ｃ+ＤＣよりもより高いレベルのサイトカインを発現する。ＰＭＡ＋Ｉ＋ＢＦＡ刺激において、ＣＤ１１Ｃ+ＣＤと単球とのサイトカイン分泌は等価であるが、ＬＰＳ活性化された試料と比較するとより少ない。細胞内のたんぱく質分泌は、ＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）として評価される。
【０１１４】
例４
全血中でのＣＤ１１Ｃ + ＤＣ表面抗原発現の検出
全血試料を健康なボランティアから採取し、例１および例２に説明される手順に従って、ブレフェルディンＡ不在下で、ＬＰＳ、ＰＭＡ＋Ｉで活性化するかまたはＣＤ４０架橋する。結果を図６に示す。
【０１１５】
ヒストグラムで実証するように、ＣＤ１１Ｃ-サブセットは、ＰＭＡ＋Ｉ活性化においてＣＤ２５発現の明らかなアップレギュレーションを実証する。ＣＤ２５のアップレギュレーションは、ＣＤ１１Ｃ-サブセット内で観察される唯一の明確な応答である。対照的に、ＣＤ１１Ｃ+サブセットは、ＬＰＳ活性化においてＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを示す。Ｔ細胞共刺激分子群、特にＣＤ８０は、最も強いシグナルを発する。ＰＭＡ＋Ｉは、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのＣＤ１１Ｃ+細胞内でアップレギュレーションをもたらす。ＣＤ２５およびＣＤ４０の最小限の増加が観察される。ＣＤ４０の架橋を通した活性化は、ＣＤ８６、ＣＤ８０のレベルの増大と、ＨＬＡ−ＤＲの最小限のアップレギュレーションとをもたらす。
【０１１６】
図５は、ＬＰＳに対して、ＰＭＡ＋Ｉでの活性化の間のＣＤ１１Ｃ+末梢血ＤＣサブセットのＴＮＦα、ＩＬ−８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の応答の違いを強調する。２つのドナーを表示する。サイトカインと共刺激分子との発現パターンは、異なった刺激剤の間で変動し、ドナーの間では一致する。ＩＬ−８およびＣＤ８６はＰＭＡ＋Ｉ刺激において優勢のシグナルである。ＬＰＳ活性化試料では、ＴＮＦαおよびＣＤ８０が多く産生される。
【０１１７】
例５
サイトカインカイネチックアッセイ
全血を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激し、ポリプロピレン管（１２×７５ｍｍ）内で、ＣＯ2を５％含む加湿空気内で３７℃でインキュベートする。アリコートを刺激後の０時間から８時間までの毎時間、主に例１および例２に説明のとおり処理する。各々の試料を採取する１時間前に、１０μｇ／ｍＬでＢＦＡを加える。結果を図８に示す。
【０１１８】
例６
全血フローサイトメトリの樹状細胞免疫機能アッセイのための変形プロトコル
この例では、例１および例２で説明したものをわずかに変形させたプロトコルを示す。変形されたプロトコルはより速く、より多くの細胞からのデータの獲得を可能にし、これにより統計値を向上させ、より少ないアリコートのステップを含む。
【０１１９】
全血中のＤＣ表面抗原発現
共刺激分子ＣＤ８０またはＤＣ活性化マーカーＣＤ８３の表面発現の平均蛍光強度（平均ＭＦＩ）として報告した、ＬＰＳ刺激に対するＣＤ１１Ｃ+ＤＣの応答を、以下のように測定する。
【０１２０】
材料
・リポ多糖（ＬＰＳ）、シグマから入手、カタログ番号Ｌ２６５４、ＤＭＳＯ内に０．５ｍｇ／ｍＬ、−７０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液
・ＤＭＳＯをＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］希釈（刺激溶媒）
・ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４４、３００μＬの全血（ＷＢ）に対し１５μＬ使用
・系カクテル１（ｌｉｎ１）ＦＩＴＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４６、３００μＬのＷＢに対し６０μＬ
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４７３６４、３００μＬのＷＢに対し３０μＬ
・ＣＤ８０ ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５１２、３００μＬのＷＢに対し６０μＬ
・ＣＤ８３ ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、（特別結合）、ＰＣ番号１５２０、５０μｇ／ｍＬ、３００μＬのＷＢに対し２０μＬ
・ＦＡＣＳTM溶解液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４９２０２、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・洗浄緩衝ＰＢＳ（１ｘ）、ＢＳＡ０．５％
・ＰＢＳ（１ｘ）
刺激プロトコル
・２０μＬのＬＰＳ作業溶液を１ｍＬのヒト全血に加える（活性対照）
・２０μＬのＤＭＳＯ：ＰＢＳ１ｘ［１：１００］を１ｍＬのヒト全血に加える（休止対照）
・管を３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。
【０１２１】
染色プロトコル
すべてのステップを１２×７５ポリプロピレン管内で行なう。
【０１２２】
・ｌｉｎ １ ＦＩＴＣを６０μＬ、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰを３０μＬ、ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣを１５μＬおよびＣＤ８３ ＰＥを２０μＬ、またはＣＤ８０ ＰＥを６０μＬ加える。
【０１２３】
・刺激プロトコルから得られた全血（ＷＢ）３００μＬを加え、撹拌する。
・暗所でＲＴで１５分間インキュベートする。
【０１２４】
・ＦＡＣＳ溶解液（１ｘ）３ｍＬを加え、管に蓋をして撹拌する。
・暗所でＲＴで１０分間インキュベートする。
【０１２５】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ型遠心分離機で１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１２６】
・上澄み液を吸引し、撹拌してペレットを崩壊させる。
・２ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、撹拌する。
【０１２７】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ型遠心分離機で１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１２８】
・上澄み液を吸引する。
・染色された細胞を〜２００μＬの洗浄緩衝剤に再懸濁する。
【０１２９】
・１時間以内に試料を獲得する（すなわちフローサイトメトリ分析を行なう）、獲得前には４℃で試料を保存する。
【０１３０】
注意：獲得のために試料を１２×７５ポリスチレン管に移すことが必要である。ポリプロピレン管は、フローサイトメータの試料注入システムに一般に適合しない。移動は獲得の直前に行なう。
【０１３１】
機器およびセットアップおよび獲得基準
・ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメータ
・４色溶解／洗浄（ＬＷ）をＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェアにセットする。
【０１３２】
・ＦＣＳしきい値を使用する。
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ陽性／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣｄｉｍ事象を使用してＦＣＳファイルを獲得する。獲得のために細胞全体の懸濁を用いる（４，０００から７，０００事象）
細胞同定
散乱−低／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ−低／抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ−高／ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ−高
全血中のＤＣサイトカイン発現
ゴルジ輸送阻害剤ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）の存在下でのＴＮＦα発現の平均蛍光強度（平均ＭＦＩ）として報告した、ＬＰＳ刺激へのＣＤ１１Ｃ+ＤＣの応答を、以下のように測定する。細胞は２時間活性化される。
【０１３３】
材料
・リポ多糖（ＬＰＳ）、シグマから入手、カタログ番号Ｌ２６５４、ＤＭＳＯ内に０．５ｍｇ／ｍＬ、−７０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液
・ＤＭＳＯをＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］希釈（刺激溶媒）
・ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、シグマから入手、カタログ番号Ｂ−７６５１、ストック溶液はＤＭＳＯ内に５０ｍｇ／ｍＬ、−２０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液、１ｍＬのＷＢに対し２０μＬ使用
・ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４４、３００μＬの全血（ＷＢ）に対し３０μＬ使用
・系カクテル１（ｌｉｎ １）ＦＩＴＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４６、３００μＬのＷＢに対し１２０μＬ
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４７３６４、３００μＬのＷＢに対し６０μＬを使用
・抗ヒトＴＮＦα ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５１２、２０μＬ／テストで使用
・ＦＡＣＳTM浸透溶液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０４５７、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・ＦＡＣＳTM溶解液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４９２０２、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・洗浄緩衝剤ＰＢＳ（１ｘ）、ＢＳＡ０．５％
・ＰＢＳ（１ｘ）
刺激プロトコル
・２０μＬのＬＰＳ作業溶液を１ｍＬのヒト全血に加える（活性対照）。
【０１３４】
・２０μＬのＤＭＳＯ：ＰＢＳ１ｘ［１：１００］を１ｍＬのヒト全血に加える（休止対照）。
【０１３５】
・次いで両方の対照管に２０μＬのＢＦＡ作業溶液を加える。
・管を５％ＣＯ2で３７℃で２時間インキュベートする。
【０１３６】
染色プロトコル（細胞内）
・すべてのステップを１２×７５ポリプロピレン管内で行なう。
【０１３７】
・ｌｉｎ １ＦＩＴＣを１２０μＬ、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰを６０μＬ、Ｃｄ１１Ｃ ＡＰＣを３０μＬ加える。
【０１３８】
・刺激プロトコルから得られた３００μＬの全血（ＷＢ）を加え、撹拌する。
・暗所でＲＴで１５分間インキュベートする。
【０１３９】
・３ｍＬのＦＡＣＳ溶解液１ｘを加え、管に蓋をして撹拌する。
・暗所でＲＴで１０分間インキュベートする。
【０１４０】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１４１】
・上澄み液を吸引し、緩やかに撹拌してペレットを崩壊させる。
・１ｍＬのＦＡＣＳ浸透溶液１ｘに再懸濁する。
【０１４２】
・暗所で１０分間ＲＴでインキュベートする。
・２．５ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、管に蓋をして緩やかに撹拌する。
【０１４３】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで１０分間）。
【０１４４】
・上澄み液をデカントする。
・浸透された細胞ペレットを残留する上澄み液に緩やかに再懸濁する。
【０１４５】
・細胞内の染色のために抗ヒトＴＮＦα ＰＥ試薬を２０μＬ加える。
・暗所でＲＴで３０分間インキュベートする
・２ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、緩やかに撹拌する。
【０１４６】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで１０分間）。
【０１４７】
・上澄み液をデカントする。
・染色され浸透された細胞を〜２００μＬの洗浄緩衝剤に再懸濁する。
【０１４８】
・１時間以内に試料を獲得する、獲得前には４℃で試料を保存する。
注意：獲得のために試料を１２×７５ポリスチレン管に移すことが必要である。ポリプロピレン管はフローサイトメータの試料注入システムに一般に適合しない。移動は獲得の直前に行なう。
【０１４９】
機器およびセットアップおよび獲得基準
・ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメータ
・４色溶解／非洗浄（ＬＮＷ）をＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェア内にセットする。
【０１５０】
・ＦＳＣしきい値を使用する。
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ陽性／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ ｄｉｍ事象を用いてＦＣＳファイルを獲得する。細胞全体の懸濁を用いて獲得する（４，０００−７，０００事象）。
【０１５１】
細胞同定
散乱−低／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ−低／抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ−高／ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ−高
ここに述べたすべての特許、特許公報、および他の公開された資料は、その全体を、その各々が独立して特定的に引用により援用されるように、引用により援用する。
【０１５２】
この発明の好ましい例示的な実施例を説明したが、当業者においては、この発明から逸脱することなくさまざまな変更と修正とを行なえることが明らかであろう。添付の特許請求の範囲は、この発明の真の精神および範囲に含まれる、そのようなすべての変更および修正を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 樹状細胞活性化物質としてＬＰＳを例示した、樹状細胞機能に対する全血フローサイトメトリアッセイにおける基本的なステップを概説する流れ図である。
【図２】 ブレフェルディンＡの存在下でＬＰＳによって活性化された全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図３】 ブレフェルディンＡの存在下でＰＭＡ＋Ｉによって活性化された全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図４】 ブレフェルディンＡの存在下で活性化物質の不在下（休止対照）でインキュベートされた全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図５】 代替的にＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで各々活性化された、二人のドナーからのＣＤ１１ｃ+樹状細胞におけるＴＮＦα、ＩＬ−８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現の差を表わす図である。
【図６】 全血中の末梢血樹状細胞上の同定されるマーカの表面発現における３つの異なる樹状活性化物質の影響を概略的に示す、一連のヒストグラムを表わす図である。
【図７】 活性化した全血中の単球（灰色のバー）およびＣＤ１１ｃ+ＤＣ（黒色のバー）のサイトカイン発現を比較した図であり、図７ＡはＬＰＳ＋ブレフェルディンＡに刺激された細胞を示し、図７ＢはＰＭＡ＋Ｉ＋ブレフェルディンＡに刺激された細胞を示す。
【図８】 ＬＰＳに活性化されたＣＤ１１ｃ+ＤＣ中のＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＣＤ８０の動力学を示す図である。ＬＰＳインキュベーションのタイムコースは０から８時間であった。細胞内のサイトカインおよびＣＤ８０の発現はＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。
【関連出願の相互参照】
この出願は１９９８年９月２２日に出願された共通の所有者および同時出願の米国特許出願連続番号第０９／１５８，４０６号の部分的な継続であり、その開示を全体にわたってここに引用により援用する。
【０００２】
【発明の分野】
この発明は血液細胞機能のアッセイに関し、特定的には全血中の樹状細胞機能のアッセイに関する。
【０００３】
【発明の背景】
樹状細胞（ＤＣ）は四半世紀前に末梢リンパ系組織において観察される特徴的な「樹状の」形態によって最初に同定され（スタインマン(Steinman)ら，J. Exp. Med. 137:1142-1162 (1973)）、現在では形態的に多様で広く分布する細胞集団として公知である。今日、これらの多様な細胞はその共通の機能によって集合的に識別される。すなわち、樹状細胞は哺乳動物の免疫系の最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、さまざまな抗原提示細胞の中で唯一１次Ｔリンパ系応答を起こし得ることが示される。
【０００４】
Ｔ細胞の介在する免疫応答を起こすという単一の能力を、活性化したＴ細胞に抗原を提示する強力な能力と組み合わせると、樹状細胞は免疫に基づく療法のための強力な試薬であるとともに、さまざまな免疫の介在する疾患の治療における療法的関与の標的となり得ることを意味する。
【０００５】
たとえばＷＯ９７／２４４３８は、樹状細胞をＴリンパ球およびタンパク質抗原とともにin vitroで共培養することによって、Ｔ細胞のex vivoでの抗原特異的な活性化を起こすための組成物および方法を記載する。活性化されたＴ細胞はin vivoでの抗原特異的な免疫応答をもたらすために投与される。同様にＷＯ９７／２９１８３は、Ｔリンパ球と組換え構造から抗原タンパク質を直接発現するＤＣとを接触させることによってin vitroでＴ細胞を活性化する方法を記載する。ここでも活性化されたＴ細胞を自己注入することが意図される。米国特許第５，７８８，９６３号においては、前立腺癌の治療に対する、ＤＣによるex vivoでのＴ細胞活性化の特定的な適用が記載および請求されている。さらに別のアプローチにおいて、ネマジー（Nemazee）の米国特許第５，６９８，６７９号では、in vivoで樹状細胞を含む標的とする抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原ペプチドをもたらす免疫グロブリン融合タンパク質が記載および請求されている。
【０００６】
樹状細胞は、ＡＩＤＳの病原論および病態生理学においても重要な意味を有する。ＤＣの１つのタイプであるランゲルハンス細胞（ＬＣ）は一般的に、ウィルスへの粘膜露出の後にＨＩＶに感染される主要な細胞タイプであると考えられている。ＤＣはＨＩＶ疾患の初期相において作用するのみならず、慢性相、感染の促進およびＴリンパ球の欠乏においても作用すると考えられている（ゾートワイジ(Zoeteweij)ら, J Biomed Sci 5(4):253-259 (1998)）。リンパ系粘膜におけるＤＣは、疾患の行程におけるウィルス核酸およびビリオンの主要な貯蔵所となり得る（グルアード（Grouard)ら, Curr. Opin. Immunol. 9(4):563-567 (1997);ワイスマン(Weissman)ら, Clin. Microbiol. Rev. 1997 10(2):358-367 (1997)）。ＤＣのＨＩＶ感染を排除するための薬剤に対する医薬候補物質のスクリーニングのためのin vitro法は、スタインマンらの米国特許第５，６２７，０２５号に記載および請求されている。
【０００７】
正常な哺乳動物の免疫応答および免疫病理学におけるその重要性にもかかわらず、ＤＣは研究が困難であり、特にそのネイティブの環境における研究が困難であった。
【０００８】
その困難さの一部は樹状細胞の希少性から生じる。広く分布しているにもかかわらず、ＤＣはリンパ系組織においても乏しく、ヒト末梢血においては有核細胞の約０．３％−０．５％以下しか示されない。
【０００９】
さらに困難なのは、混合された細胞集団からの容易なＤＣのポジティブ免疫選択を許す、ＤＣに特異的な細胞表面マーカがないことである。
【００１０】
ＤＣを定める表面マーカを同定するための多くの努力は部分的にしか成功していない。その結果、現在ＤＣは複数のマーカパネルによって同定されており、その同定は主にその他の系（すなわちｌｉｎ-細胞など）に対するマーカでの染色がないことに基づくものである。その結果、典型的なＤＣ免疫精製プロトコルは、さまざまな樹状細胞以外の血液系、たとえばリンパ球、単球、顆粒球およびＮＫ系などの細胞をなくすための少なくとも１つの免疫枯渇ステップと、少なくとも１つの免疫強化ステップとを必要とする。この免疫強化ステップは、たとえばＣＤ４+細胞の選択（血液樹状細胞分離キット（Blood Dendritic Cell Isolation Kit）、ミルテニー・バイオテック（Miltenyi Biotec）♯４６８−０１、オーバーン、ＣＡ）を含んでもよく、また代替的または付加的に、ＨＬＡ−ＤＲ発現に対する選択（ガネカー(Ghanekar)ら, J. Immunol. 157:4028-4036 (1996)）を含んでもよい。
【００１１】
しかしこれらの連続的な操作は、ＤＣ細胞の表現型をin vivoで示されるものと実質的に変えてしまうおそれがある。たとえば、扁桃単核細胞の新鮮な調製物中のｌｉｎ-ＨＬＡ−ＤＲ+ＣＤ１２３+樹状細胞は、低レベルのＴ細胞共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、およびＨＬＡ−ＤＱを発現する。加えられたサイトカインの不在下でのこれらの細胞の一晩の培養でも、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを伴う成熟ＤＣ表現型の誘導が十分に起こる（オルエウス(Olweus)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。サイトカイン存在下でのＣＤ３４+樹状細胞前駆体のより長期間の培養は、実質的な表現型の変化をもたらす（コー(Caux)ら, J. Exp. Med. 184:695,1996;オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。
【００１２】
したがって当該技術分野においては、予め免疫精製またはin vitro培養することなく樹状細胞をアッセイするための方法が必要とされている。
【００１３】
ＤＣに対して特異的な細胞表面マーカの不足により、表面免疫表現型マーカは機能的に異なる樹状細胞のサブセットを不完全にしか識別していない可能性がさらに示唆される。たとえば、末梢血樹状細胞はＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３の互いに異なる発現によって識別可能な２つのサブセットに分けられることが示されている。すなわち、一方のサブセットはＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowであり、他方はＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+である（オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。免疫系において樹状細胞が演じる決定的および異なる役割のため、これら２つのサブセットの各々は異なる機能的活性を有するさまざまな細胞型を含むのではないかと論じられている。
【００１４】
したがって当該技術分野においては、細胞表面マーカの発現以外の、またはそれに加えられる表現型の基準を用いた樹状細胞サブセットの識別方法が必要とされている。さらに、ＤＣ機能により直接的に関係し得る基準に基づいてＤＣをサブセット化する方法が必要とされている。
【００１５】
近年いくつかのグループが、精製した樹状細胞を含む高度に精製した血液細胞系におけるサイトカイン発現のフローサイトメトリ分析を可能にする、サイトカインに対して特異的な抗体を用いた細胞の細胞内染色を報告した（ピッカー(Picker)ら, Blood 86(4):1408-1419 (1995);ワルドロップ（Waldrop)ら, J. Clin. Invest. 99:1739-1750 (1997);ガネカー(Ghanekar)ら, J. Immunol. 157:4028-4036 (1996);ド・サン−ビス(de Saint-Vis)ら, J. Immunol. 160:1666-1676 (1998)）。より最近には、スニ(Suni)ら、J. Immunol. 212:89-98 (1998)が、予めＴ細胞を精製しない、抗原刺激したＴリンパ球における細胞内サイトカインおよび細胞表面タンパク質の同時発現に対するアッセイを記載した。共通の所有者および同時出願の米国特許出願番号第０８／７６０，４４７号および０８／８０３，７０２号に類似のアッセイが記載および請求されている。
【００１６】
当該技術分野においては、全血中の精製されないＤＣ細胞によるサイトカイン生成の測定に対する細胞内サイトカインアッセイに適合する方法が必要とされている。
【００１７】
【発明の概要】
この発明は、第１の局面において以下のステップを含む全血中の樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ法を提供することによって、当該技術分野におけるこれらおよびその他の課題を解決する。すなわち、（ａ）全血サンプルを樹状細胞活性化物質と接触させるステップと、（ｂ）サンプルを複数の樹状細胞識別抗体および少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体と接触させるステップと、（ｃ）少なくとも１つの識別可能なＤＣサブセットによるサイトカイン特異的抗体の結合に対するサンプルのフローサイトメトリアッセイを行なうステップとである。
【００１８】
好ましい実施例において、活性化はタンパク質分泌の阻害剤の存在下で行なわれ、細胞の浸透の後に細胞内でサイトカインが検出される。よって特に好ましい実施例においては、樹状細胞活性化物質の接触ステップはブレフェルディンＡの存在下で行なわれ、抗体接触ステップ自身も以下のステップを順に含む。すなわち、（ｂ１）サンプルに複数の樹状細胞識別抗体を加えるステップと、（ｂ２）サンプル中の赤血球を溶解させるステップと、（ｂ３）サンプル中の有核細胞を浸透させるステップと、（ｂ４）サンプルに少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体を加えるステップとである。
【００１９】
樹状細胞識別抗体は複数の非ＤＣ系−特異的抗体を含んでもよい。このような場合、非ＤＣ系−特異的抗体の各々は同一の蛍光体に結合（conjugate）していることが特に好ましい。複数の非ＤＣ系特異的抗体を用いるとき、樹状細胞識別抗体はＨＬＡ−ＤＲに対して特異的な抗体をさらに含む。
【００２０】
好ましい実施例において、樹状細胞のサブセットは識別可能にラベルされる。この実施例において、樹状細胞識別抗体は異なる樹状細胞サブセットの表面に異なる態様で結合する少なくとも１つの抗体を含む。この実施例においては、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１２３に対して特異的な抗体を用いることが特に好ましい。
【００２１】
ＤＣの機能は、そのサイトカイン発現パターンと、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）の分化／活性化マーカ（ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＣＤ８３、ＣＤ２５）の動的制御とによって特徴付けることができる。よってこの発明は第２の局面において、以下のステップを含む、全血における樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ法を提供する。すなわち、（ａ）全血サンプルを樹状細胞活性化物質と接触させるステップと、（ｂ）サンプルに複数の樹状細胞識別抗体と、樹状細胞の活性化を示す樹状細胞表面マーカに対して特異的な少なくとも１つの抗体とを加えるステップと、（ｃ）少なくとも１つの識別可能なＤＣサブセットによる、樹状細胞表面活性化マーカに対して特異的な前記抗体の結合に対して前記サンプルをフローサイトメトリアッセイするステップとである。樹状細胞表面活性化マーカは、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）の分化／活性化マーカ（ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＣＤ８３、ＣＤ２５）からなる群より有用に選択される。
【００２２】
この発明の前述およびその他の目的および利益は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。図面を通じて、類似の参照記号は類似の部分を表わす。
【００２３】
【詳細な説明】
ここに記載する発明が完全に理解されるために、以下の詳細な説明を示す。この説明には以下の用語を用いる。
【００２４】
「全血」とは、哺乳動物から採取した後に実質的に分画されない液体血液サンプルを意図するものである。つまり、血液採取の後に分画を行なうと、その分画によって樹状細胞の割合が全有核細胞の約５％未満、好ましくは１−４％未満、最も好ましくは１％未満まで上昇したためである。
【００２５】
「抗体」は、ここに記載するフローサイトメトリ法においてマーカとして有用な、抗体もしくは抗体遺伝子に由来するか、または由来可能なすべての製品を含む。「抗体」は特に天然抗体、抗体断片、抗体誘導体、ならびに遺伝子工学的に作られた抗体、抗体断片、および抗体誘導体を含む。
【００２６】
「樹状細胞識別抗体」は、単独または他の抗体と組合せて樹状細胞の同定を促進するために用い得るあらゆる抗体を含み、よってそれは非ＤＣ系によって提示されるエピトープに対して特異的な抗体を含み、またポジティブ免疫同定のために有用であることが判明している、ＤＣによって提示される構造に結合する抗体をさらに含む。
【００２７】
「系ネガティブ（Lineage negative）」は「ｌｉｎ-」とも略され、非樹状リンパ球または造血細胞系の特徴として知られる細胞表面マーカの不在を表わす。「不在」とは、フローサイトメトリアッセイなどの免疫アッセイにおいて測定される際の表面発現のレベルが、バックグラウンドと顕著に異ならないことを意図するものである。
【００２８】
「樹状細胞活性化物質」とは、樹状細胞によるサイトカイン、ケモカインまたは検出可能な細胞表面タンパク質の発現を誘導またはアップレギュレートできるあらゆる物質のことである。
【００２９】
残りの用語はすべてフローサイトメトリ技術分野における通常の意味を有し、それらは特に、オーメロッド(Ormerod)（編集）の「フローサイトメトリ：実用的アプローチ（Flow Cytometry:A Practical Approach）」（Oxford Univ. Press (1997)）と、ジャロゼスキ(Jaroszeski)ら（編集）の「フローサイトメトリプロトコル(Flow Cytometry Protocols）」（Methods in Molecular Biology No. 91, Humana Press (1997)）と、「実用フローサイトメトリ（Practical Flow Cytometry）」の第３版（Wiley-Liss (1995)）とに示される。
【００３０】
樹状細胞（ＤＣ）は記憶Ｔ細胞および免疫記憶のない細胞に対して抗原を捕捉、処理および提示し、哺乳動物の免疫応答における中枢的役割を果たしている。ＤＣ機能の理解は、哺乳動物の免疫機能のあらゆる詳細な理解にとって重要である。しかし過去における樹状細胞の機能研究は、集合的に樹状細胞と命名された細胞の機能的多様性によって妨げられてきた。
【００３１】
たとえば末梢血樹状細胞の研究は２０年もの間、末梢血の樹状細胞が細胞表面の免疫表現型によって識別可能な２つの互いに排他的なサブセットに分けられるという事実に気づかないまま行なわれていた（トーマスら, J. Immunol. 153:4016 (1994);オドアティー(O'Doherty)ら, Immunology 82:487-493 (1994);オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997)）。どちらのサブセットも高レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、その他の系に特徴的なマーカ（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１６、ＣＤ５６）を欠く。このサブセットは、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３の発現が異なることによって互いに識別される。すなわち一方のサブセットはＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowであり、他方はＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+である（オドアティーら, Immunology 82:487-493 (1994);オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23):12551-12556 (1997);ウィルマンら,「フローサイトメトリによって示される末梢血樹状細胞(Peripheral Blood Dendritic Cells Revealed by Flow Cytometry」(Becton-Dickinson Application Note 3)(1998)）。
【００３２】
この２つの末梢血ＤＣサブセットは、最初は偶然の細胞表面の相違によって識別されたが、現在では機能的に異なることが示されている。たとえば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞の刺激では、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣサブセットはＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+サブセットよりも強力であることが公知である。またここに新たに示すとおり、ＣＤ１１ｃ+サブセットのみが、サイトカイン生成のアップレギュレーションおよびＴ細胞共刺激分子の表面発現の増加を伴うＤＣ活性化物質に応答する。
【００３３】
ＤＣを最初に識別してから末梢血が免疫表現型的および機能的に別のＤＣサブセットを含むことを最初に示すまでに２０年かかったということは、表面表現型の分類が樹状細胞の機能的多様性を完全に捕らえるためには不十分であることを示すものである。
【００３４】
この発明は、末梢血樹状細胞をそのＤＣ活性化物質に対する機能的応答の相違に基づいて説明および識別できるようにする。この発明はさらに、最小限の実験的介在によって、樹状細胞の公知の表現型の柔軟性によって結果を混乱させることなくこれらの機能的応答を測定できるようにする。
【００３５】
図１はこの発明の基本的な方法を概略的に示すものである。全血のサンプルはまずＤＣ活性化物質とともにインキュベートされる。図面中にはＬＰＳを例示する。
【００３６】
樹状細胞活性化物質とのインキュベーションは、サンプル中に存在するさまざまなＤＣサブセットの異なる表現型応答を起こす役割をする。すなわちこれらの相違を測定することによって、別の方法では識別不能であり得るＤＣサブセットを区別できる。異なる活性化物質は異なる応答のセットを生成するため、さらに詳細な区別が可能となる。図１およびここに報告する実験においては、ＬＰＳなどの広範囲および多面発現性の効果を有するＤＣ活性化物質を用いてこの発明を例示するが、より細かい特異性を有する活性化物質も有用であることが示されるであろう。
【００３７】
樹状細胞活性化物質とのインキュベーションは、刺激のないときに検出可能なサイトカインを生成しない末梢血樹状細胞によるさまざまなサイトカインの生成のアップレギュレーションに対して特に異なって示される。ゴルジ複合体を分解するブレフェルディンＡ（“ＢＦＡ”）存在下での活性化ステップを行なうことにより（オープンショー(Openshaw)ら, J. EXp. Med. 182:1357 (1995);チャーディン(Chardin)およびマコーミック(McCormick), Cell 97:153 (1999)）、細胞分泌経路を通じたタンパク質輸送を阻害し、サイトカインタンパク質が細胞中に蓄積して、アッセイのその後のステップにおいてフローサイトメトリによる検出が可能となる。モネンシンなどの同等の分泌阻害剤を用いることによって、同様の結果が得られる。
【００３８】
活性化物質およびＢＦＡの存在下でインキュベートした後、細胞の表面を蛍光体に結合された抗体によって染色する。
【００３９】
この表面染色ステップは、抗体の第１のクラスとして、複数の樹状細胞識別抗体を含む。樹状細胞識別抗体は単独またはその他の抗体と組合せて樹状細胞の識別を促進するために用い得るあらゆる抗体である。よってこのステップにおいて用いられる抗体は、
（１）非樹状細胞に優先的に結合する抗体と、（２）ＤＣの同定に有用な樹状細胞表面構造に結合する抗体とを含んでもよい。
【００４０】
こうした第１のカテゴリに対して、同一の蛍光体でラベルされた系特異的な抗体のカクテルを用いることが有利であり得る。商業的に入手可能なこうしたカクテルの１つは、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリ・システムによるｌｉｎ１ ＦＩＴＣ系カクテル（ＢＤＩＳ、サンホセ、ＣＡ、カタログ番号３４０５４６）であり、これはＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６に対して特異的な抗体の混合物を含み、各々の抗体はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合される。カクテル中の抗体は共同してリンパ球、単球、好酸球および好中球を染色するが、樹状細胞は染色しない。よってラベルされたサンプル中のＤＣはＦＩＴＣ-またはＦＩＴＣlowクラスに集合する。このｌｉｎ１カクテルは、抗体の濃度および結合の度合いを滴定して、抗体が結合するさまざまな非ＤＣ系の細胞から同等の強度の蛍光信号を与えるようにしているために特に有利である。
【００４１】
樹状細胞識別抗体の第２のカテゴリに関しては、樹状細胞を単独でポジティブに同定する表面マーカがまだ存在しない。このようなＤＣ特異的表面構造が同定されたときには、それに対する抗体をプロトコルのこの段階において単独で用いてもよい。しかし現在は、ＤＣ識別抗体の第２のカテゴリにおける抗体、すなわち樹状細胞表面構造に積極的に結合する抗体を使用するためには、第１のカテゴリからのＤＣ識別抗体、すなわち非樹状系を同定する抗体を付加的に用いることが必要である。
【００４２】
逆に、ＤＣ識別抗体の第１のカテゴリからの抗体、すなわち非樹状細胞に優先的に結合する抗体は現在のところ、第２のカテゴリからの少なくとも１つの抗体なしに用いることはできない。好塩基球はｌｉｎ-ＣＤ１２３highＣＤ１１ｃ+だがＨＬＡ−ＤＲ-であり、このアッセイにおいて非樹状細胞に優先的に結合する抗体（カテゴリ１）を用いるときには抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体も用いることが必要である。
【００４３】
第１および第２の両方のカテゴリの樹状細胞識別抗体を用いるとき、２つのカテゴリの抗体はフローサイトメトリにおいて識別可能な蛍光体によって優先的にラベルされる。
【００４４】
表面染色ステップは、第２の広いクラスとして、公知の樹状細胞サブセットを識別する抗体を任意に含んでもよい。ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１２３に対して特異的な抗体は、互いに排他的な末梢血ＤＣサブセットを定めることが公知であるため、特に有用であることが示される。用いる蛍光体はフローサイトメトリで識別可能であるべきである。よってその後のアッセイにおいて細胞内染色に用いられる抗体がフィコエリトリン（ＰＥ）でラベルされるとき、典型的な表面染色スキームはたとえば、ｌｉｎ１ ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、およびＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（この命名法において、抗体はその特異性とそれに続く蛍光体とによって同定される）などを含む。
【００４５】
表面染色の後、サンプル中の赤血球が溶解され、次いで有核細胞が浸透される。これら２つのステップは、ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液およびＦＡＣＳ溶解溶液（順にＢＤＩＳカタログ番号３４０４５７および３４９２０２）などの商業的に入手可能な試薬を用いて、製造者の案内に従って達成されてもよい。
【００４６】
浸透に続き、細胞はサイトカインに対して特異的な、蛍光体に結合された抗体を用いて細胞内で染色される。サイトカイン特異的抗体に結合される蛍光体は、フローサイトメトリアッセイにおいて、表面染色に用いられたあらゆる蛍光体から識別可能であることが好ましい。
【００４７】
細胞内染色の後、細胞は洗浄され、次いで複数の蛍光体を同時に励起および検出できることが好ましいフローサイトメータを用いて分析される。
【００４８】
図１においては、サイトカイン発現の変化を検出するために用いるアッセイといくつかの面で異なる、樹状細胞活性化物質マーカの表面発現の変化を検出するためのアッセイは示さない。
【００４９】
こうしたアッセイにおいては、全血中の樹状細胞の活性化はブレフェルディンＡなどの分泌阻害剤の不在下で行なわれる。このことによって、あらゆるこうしたサンプルにおける細胞内サイトカイン発現の同時測定を防ぐ。
【００５０】
活性化物質の存在下でインキュベートした後、細胞の表面を蛍光体と結合した抗体によって染色する。このステップにおいては前述のとおり、複数の樹状細胞識別抗体が、公知の樹状細胞サブセットを識別する抗体を任意に伴って用いられる。
【００５１】
しかしこれに加えて、第３のクラスの表面染色抗体が用いられる。これらの抗体は表面構造、典型的には樹状細胞活性化物質との先行インキュベーションによってその発現が変化するようなタンパク質を認識する。たとえば末梢血樹状細胞の活性化は、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）およびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを起こすことが公知である（オルエウスら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12551-12556 (1997)）。よって表面染色ステップは所望により、これらの抗原の１つまたはそれ以上に対して特異的な抗体を含んでもよい。最近の報告では、ＣＤ８３およびＣＭＲＦ−４４が血液およびリンパ系組織からの活性化または培養されたＤＣにおいて高レベルで発現される細胞表面マーカとして同定されたため、これらのマーカに対して特異的な抗体を用いることも有利であり得る。このクラスの抗体を用いるときには、フローサイトメトリにおいて前述の抗体から識別可能な蛍光体と典型的に結合される。よって典型的な表面染色スキームはたとえば、ｌｉｎ１ ＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ、およびＰＥでラベルされたＤＣ表面活性化抗原に対して特異的な抗体などを含む。
【００５２】
表面染色の後、サンプル中の赤血球は溶解され、細胞は洗浄されて、複数の蛍光体の同時励起および検出が可能であることが好ましいフローサイトメータを用いて分析される。
【００５３】
以下の例示的な例および図２−８においてさらに詳述するとおり、正常なボランティアの全血サンプルの樹状細胞機能をアッセイした。調製物はリポ多糖（“ＬＰＳ”）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（“ＰＭＡ”）およびイオノマイシン（“Ｉ”）（合わせて“ＰＭＡ＋Ｉ”）、またはＣＤ４０−架橋のいずれかによって、各々３７℃において４時間活性化した。活性化物質として試みたがサイトカイン生成を誘発しなかった物質、すなわちＰＨＡ、ＣＤ２／２Ｒ（ＢＤＩＳカタログ番号３４０３６６）、ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）、ＣＭＶ、およびＣＤ４９ｄの架橋については報告しない。ＣＤ４０の架橋は表面抗原発現を変化させたが、サイトカイン生成は誘発できなかった。
【００５４】
表１に、１つまたはそれ以上の実験においてアッセイし、実験において用いたＤＣ活性化物質に従ってさらに分類したサイトカインの一覧を示す。プラス（“＋”）は１つまたはそれ以上の実験においてそれぞれのサイトカインの発現が評価されたことを示し、マイナス（“−”）はそれぞれのサイトカインの発現が評価されなかったことを示す。表１は発現のレベルを報告するものではなく、それは続く表２に示す。
【００５５】
【表１】
表２は、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで刺激され、全血中でアッセイされた、ＣＤ１１ｃ+およびＣＤ１１ｃ-樹状細胞サブセットの機能応答を示す。サイトカイン発現は平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定し、表面分子発現の変化は活性化サンプル対対照サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合として測定する。
【００５７】
【表２】
これらの実験の結果、非常に驚くべきことに、ＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+サブセットはどのＤＣ活性化物質を用いても試験されたサイトカインのいずれも生成できないことが示された。表面抗原発現の変化をアッセイすると、このサブセットはＰＭＡ＋Ｉ活性化の際にＣＤ２５発現の明瞭なアップレギュレーションを示した。すなわちＣＤ２５のアップレギュレーションは、調べた刺激物質のすべてに対してＣＤ１１ｃ-ＣＤ１２３+ＤＣにおいて観察された唯一の明確な応答であった。
【００５９】
それとは著しく対照的に、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣは、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで刺激されたときにサイトカイン発現の容易に測定される変化を示した。
【００６０】
ＬＰＳの刺激によって、ＣＤ１１ｃ+細胞は高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ−１βと、低レベルのＩＬ−６、ＩＬ−１ＲＡおよびＩＬ−８と，わずかなレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１ａとを生成した。ＬＰＳに対するこの応答は驚くべきものである。つまり、ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１２３lowＤＣはＣＤ１４-であり、ＣＤ１４は主要なＬＰＳ受容体である。ＬＰＳは第２の受容体、おそらくはＣＤ１１ｃ自身を通じて付加的に作用すると考えられる。この仮説と一致して、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｃのどちらも欠くＣＤ１１ｃ-ＤＣは細胞内サイトカイン発現の増加を伴うＬＰＳ刺激に応答できない。さらにこの仮説と一致して、ＣＤ１４+ＣＤ１１ｃ+単球はＣＤ１４-ＣＤ１１ｃ+ＤＣよりもかなり強力にＬＰＳ刺激に応答し（図７Ａ）、ＰＭＡ＋Ｉに対する応答の顕著な増加は示さない（図７Ｂ）。
【００６１】
図８に、ＣＤ１１ｃ+ＤＣのＬＰＳに対する応答の動力学をさらに示す。最初にＴＮＦαが生成され、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が続く。活性化の約４時間後にＣＤ８０は強くアップレギュレートされる。
【００６２】
ＰＭＡ＋Ｉ活性化により、ＣＤ１１ｃ+細胞はＩＬ−８およびＩＬ−１βと、より低いが明らかなレベルのＩＬ−１ＲＡおよびＴＮＦαと、わずかな量のＩＬ−１αとを生成し、ＩＬ−６は検出できなかった。
【００６３】
このように、さまざまな活性化物質に対するＣＤ１１ｃ+ＤＣサブセットのサイトカイン応答の違いを容易に観察できた。これらの違いの中で主要なのは、ＬＰＳで刺激された際のＩＬ−６の一意の発現と、ＩＬ−８およびＴＮＦαの相対的発現の変化とである。
【００６４】
全血中でＣＤ１１ｃ+ＤＣを活性化することによって、アクセサリー分子の発現も増加する。ＬＰＳ活性化はＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを起こす。Ｔ細胞共刺激分子、特にＣＤ８０は最強の信号を与えた。ＰＭＡ＋ＩはＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを起こす。ＣＤ２５およびＣＤ４０の最小限の増加が観察された。
【００６５】
ＣＤ４０の架橋を介する活性化により、ＣＤ８６およびＣＤ８０のレベルが増加し、ＨＬＡ−ＤＲの最小限のアップレギュレーションが起こった。
【００６６】
これらのデータは、以下の実験例にさらに詳細に示すとおり、末梢血ＤＣサブセットをそのＤＣ活性化物質に応答したサイトカインおよび／または細胞表面タンパク質の生成の相違によって全血中で容易に識別できることを示すものである。
【００６７】
さらに、ＤＣ活性化物質に応答することが観察される樹状細胞が属するサブセット（ＣＤ１１ｃ+）は、こうした応答が見られないサブセット（ＣＤ１１ｃ-）よりも強力にＴ細胞を活性化することが公知であるため、この発明の方法において測定されたパラメータ、すなわちサイトカイン生成および表面活性化抗原のアップレギュレーションはＤＣ機能と直接かかわることが、このデータからさらに示される。
【００６８】
血液中のＤＣの頻度が低いこと、および活性化したＤＣは装置に付着する傾向があることから、以前は臨床的に適切な大きさの血液サンプルにおいてはほとんどの事象がアッセイ不可能であると示唆されていたため、先行するＤＣ精製なしに全血におけるＤＣ機能の測定を可能にするこの発明の簡便性は予期されていなかった。
【００６９】
先行するＤＣ精製なしに全血中のＤＣ機能を測定できることは、顕著な利点を提案する。
【００７０】
手順の見地からいうと、この発明の方法はすべてのＤＣ精製スキームに伴う細胞の損失をなくし、感受性を増加させ、システムの偏りの可能性を減少させる。加えて、この発明の方法によって影響される摂動が最小限であるため、実験的介在による表現型の変化の機会が減少する。またフローサイトメトリアッセイにおいて、この発明の方法はバルクベースではなく細胞ごとのＤＣ機能の評価を可能にするため、精密な区別が可能となる。
【００７１】
この発明によって新たに入手可能となったデータの見地からいうと、この発明の方法によって、初めて全血におけるＤＣ機能の容易かつ迅速な評価が可能となった。
【００７２】
ヒトの患者に適用すると、この発明の方法は免疫機能アッセイの既存のリストに加えられるＤＣ機能の測定を可能にし、現在こうした既存の免疫機能テストを用いている臨床状況における有用性が見出される。たとえばこの発明の方法は単独で、またはＣＤ４+Ｔリンパ球レベルのフローサイトメトリ定量とともに、ＡＩＤＳ進行の臨床的段階付けにおいて有利に用い得る。またこの発明の方法は単独で、または既存のアッセイとともに、後天的ではなく先天的な免疫不全症候群における免疫機能の評価、および治療における免疫抑制または免疫除去に続く免疫能力の評価において用いられてもよい。臨床範囲の他方端においては、この発明の方法は単独で、または既存のアッセイとともに、さまざまな形の免疫過敏症、アレルギーの臨床的評価、または複数の硬化症、リュウマチ様関節炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の臨床的評価において有利に用い得るであろう。
【００７３】
全血中のＤＣ機能の研究を可能にすることにより、この発明の方法はまた、血液の中で循環する薬剤がＤＣ機能に及ぼすであろう影響の簡単な評価をも可能にする。特にこのアッセイは、意図的にまたは偶然にＤＣ機能に影響を及ぼす薬剤の、ＤＣ機能への特定的な影響の評価を可能にする。
【００７４】
こうして、実験哺乳類のＤＣ機能の測定に適用する場合、それが異系、同系、またはトランスジェニックであっても、この発明の方法は薬剤のin vivoでのＤＣ機能に及ぼす影響をテストすることを可能にし、免疫調節的な効果を望ましく実証する薬剤の選択、またはそのような効果を特定的に欠く薬剤の選択を可能にする。
【００７５】
人体に適用する場合、この発明の方法は、現存の免疫機能アッセイに対する補完物として、患者の血液内で循環する薬品のＤＣ機能に及ぼす意図的なまたは偶然の影響の簡単な評価を可能にする。たとえば、この発明の方法を用いて免疫抑制剤の監視と滴定とを補助してもよい。この発明は、サイトカイン、ケモキネシスまたは増殖因子の機能を排除するか、低下調節するか、でなければ干渉する免疫抑制剤の監視および滴定に特に有用であることを立証する。反対に、この発明の方法はまた、多発性硬化症の治療におけるインターフェロンの投与、骨髄切断後の増殖因子の投与などを含む療法のような、肯定的な（affirmative）サイトカイン療法の効果を監視することにも特に有用であることをも立証する。
【００７６】
この発明の方法を用いて、無関係の臨床的目標を達成するための薬剤の、免疫調節的な副作用を監視することも可能である。
【００７７】
この発明の方法は、ＤＣ細胞を含む療法自体の実験的および臨床的評価に特に好適である。こうして、この発明の方法を用いて、自己樹状細胞をin vitroでの操作の後に投与する療法、移植を容易にするためにin vitroでまたは免疫抑制を達成もしくは耐性を誘導するためにin vivoで、樹状細胞が切断の対象となる療法、または樹状細胞が全般的なまたは特定的な免疫機能を向上させることを目標とする療法の、計画、評価および監視が可能である。
【００７８】
血液が採取されたときに末梢血内を循環するのが認められる樹状細胞は、この発明の方法でアッセイされるのだが、１つまたはそれ以上の細胞系の成熟において、一時的な窓（temporal window）から採取されることが理解されるであろう。すなわち、離散的な系ごとに、細胞は成熟プロセスの特定的な局面の間、優先的に循環する。しかしながら、この発明の方法のいずれのステップもＤＣ成熟の特定の局面に限られるものではない。こうして、この方法は自発的に循環するＤＣ前駆体にコミットされるＣＤ３４+にも、または薬理学的な介入などにより動かされるＣＤ３４+ＤＣ前駆体にも等しく適用し得る。
【００７９】
この発明は以下の例を参照することにより、よりよく理解されるであろうが、これらは限定としてではなく例としてのみ示すものである。
【００８０】
例１
材料
明記しない限り、以下の試薬をここに示す実験に使用する。便宜のために、抗体をそれらの特異性および結合蛍光体によって同定する。蛍光体は、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリオジニンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）である。よってフィコエディトリン（ＰＥ）で標識されＴＮＦαに特異的である抗体を、「ＴＮＦα ＰＥ」と称する。
【００８１】
抗体
以下の抗体は、ベクトン−ディキンソン・イミュノサイトメトリ・システムズ（Becton-Dickinson Immunocytometry Systems、ＢＤＩＳ、カリフォルニア州サンホセ）から入手する。ＴＮＦα ＰＥ、ＩＬ−１α ＰＥ、ＩＬ−１ＲＡ ＰＥ、ＩＬ−１β ＰＥ、ＩＬ−２ ＰＥ、ＩＬ−４ ＰＥ、ＩＬ−６ＰＥ、ＩＬ−８ＰＥ、ＩＬ−１３ＰＥ、ＩＦＮ−γ ＰＥ、ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ（５μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ（１０μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ（リサーチロットＫＷ９８／０７ １．１）（２０μＬ／テスト）、ＣＤ４０ ＰＥ（非結合ｍＡｂはカリフォルニア州パロアルトのDNAX Research Instituteから入手、ＢＤＩＳでＰＥに特別結合、ＢＤＩＳリサーチ結合 ＰＣ♯９３１）（１０μＬ／テスト）（０．１２５μｇ／テスト）、ＣＤ８０ ＰＥ（２０μＬ／テスト）、ＣＤ２５ ＰＥ（２０μＬ／テスト）、ＨＬＡ−ＤＱ ＰＥ（非結合ｍＡｂはＢＤＩＳから入手、ＢＤＩＳでＰＥに特別結合、ＢＤＩＳリサーチ結合ＰＣ♯１２８４）（０．５μｇ／テスト）、ＩｇＧ２ａ ＰＥ（カタログ番号３４０４５９、２５μ／ｍＬ）、ＩｇＧ１ ＰＥ（カタログ番号３４００１３、５０μｇ／ｍＬ。ＣＤ８３ ＰＥ（ＢＤＩＳリサーチ結合、ＰＣ♯１５２０、５０μｇ／ｍＬ、全血３００μＬごとに２０μＬで使用）もまた、Pharmingenから商業的に入手可能である（カタログ番号３６９３５Ｘ）。
【００８２】
ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ系カクテルもまた商業的に入手可能であり（ＢＤＩＳ、カタログ番号３４０５４６）、すべてＦＩＴＣ標識されたＣＤ３、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６に特異的な抗体の滴定混合を含む。組合されて、抗体はリンパ球、単球、好酸球、および好中球を染色する。
【００８３】
以下の抗体はファーミンゲン（PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）から入手する。ＩＬ−１０ ＰＥ（ＩｇＧ２ａ）（０．１μｇ／テスト）、ＩＬ−１２ ＰＥ（ＩｇＧ１）（０．１μｇ／テスト）、ＣＤ８６ ＰＥ（クローンＩＴ２.２、カタログ番号３３４３５Ｘ、ＩｇＧ２ｂ）（１０μＬ／テスト）。
【００８４】
溶解剤および浸透剤
ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液およびＦＡＣＳ（登録商標）溶解液は、１０ｘストック溶液としてＢＤＩＳから入手し（それぞれカタログ番号３４０４５７および３４９２０２）、同封の説明に従って希釈し使用する。
【００８５】
樹状細胞活性化物質
化学的活性化物質はモンタナ州セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）から入手し、リポ多糖（「ＬＰＳ」）（シグマカタログ番号Ｌ２６５４）はＤＭＳＯ中に０．５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。イオノマイシン（「Ｉ」）（カタログ番号Ｉ−０６３４）はエタノール中に０．５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（「ＰＭＡ」）（カタログ番号Ｐ−８１３９）はＤＭＳＯ中に０．１ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。
【００８６】
ＣＤ４０架橋は、ＣＤ４０抗体（サンディエゴ、ファーミンゲン）で被覆したポリスチレンビーズ（０．８４μｍ、バクスターBaxter）を用いて行なう。
【００８７】
分泌阻害因子
ブレフェルディンＡ（「ＢＦＡ」）（カタログ番号Ｂ−７６５１）はＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍＬで作り、−２０℃で保存する。
【００８８】
洗浄緩衝剤
リン酸緩衝塩類液からなる洗浄緩衝剤（ＧｉｂＣｏＢＲＬ（ニューヨーク州グランドアイランド）から１０ｘストック溶液として入手し、次いで脱イオン水で１ｘに希釈する）は、ウシ胎児血清０．５％を含む（モンタナ州セントルイス、シグマ）（ウシ胎児血清は１０倍のＰＢＳストック溶液を１倍に希釈した後で加える）。
【００８９】
例２
全血フローサイトメトリの樹状細胞免疫機能アッセイのためのプロトコル
明記しない限り、以下のプロトコルをここに示す実験で用いる。
【００９０】
樹状細胞活性化
正常なドナーの静脈血をヘパリンナトリウムのＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）管に採集する。ＬＰＳでの活性化のために、血液を１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激する。ＰＭＡ＋Ｉでの活性化のために、全血を第１にＲＰＭＩ溶媒（メリーランド州ウォーターズビル、バイオウィテイカーBiowhittaker）で１：１に希釈する。次いでＰＭＡを５ｍｇ／ｍＬで加え、イオノマイシンを１μｇ／ｍＬで加える。ＣＤ４０架橋による活性化のために、５０μＬのＣＤ４０被覆されたポリスチレンビーズを１ｍＬの全血に加える。すべての試料を、ＣＯ2を５％含んだ保湿インキュベータで、３７℃で４時間インキュベートする。
【００９１】
細胞内のサイトカイン検出のために、上述の活性化を付加的な１０μｇ／ｍＬのブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）存在下で行なう。対照（休止）アリコートはＢＦＡのみでインキュベートする。
【００９２】
表面抗原発現における変化の検出のために、試料はさらにはＢＦＡを加えずに、上述のようにＤＣ活性化物質でインキュベートする。対照（休止）アリコートは、ＢＦＡも活性化物質もなしでインキュベートする。
【００９３】
細胞内サイトカインの免疫蛍光染色
染色の前に、ＰＭＡ＋Ｉ処理した血液試料は、遠心分離および上澄み液の除去により半分にまで量を減じる。
【００９４】
細胞の準備は室温（ＲＴ）で行ない、すべてのインキュベートステップを暗所で行なう。
【００９５】
染色のために、（活性化されているかまたは休止血液対照されている）１ｍＬの試料は、５０ｍＬポリプロピレン分離管内の樹状細胞識別抗体のカクテル（２０μのＬ系カクテル１−ＦＩＴＣ、１０μＬのＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、５μＬのＣＤ１１ｃ ＡＰＣ、試薬の量は血液５０μＬごと）に加える。血液を、蛍光体結合抗体の存在下で１５分間インキュベートする。インキュベートの後に、ＦＡＣＳ（登録商標）溶解液４０ｍＬを加え、管をさらに１０分間インキュベートする。次いで細胞を５００ｘｇで１０分間の遠心分離によって収集し、ペレットはさらなる処理のためにゆっくりと崩壊する。次いで、ＦＡＣＳ（登録商標）浸透溶液１０ｍＬを加え、細胞を１０分間インキュベートする。浸透反応を、４０ｍＬの緩衝剤（ＤＰＢＳ １ｘ、ウシ胎児血清０．５％）を加えることにより停止させる。浸透された細胞を、５００ｘｇで１０分間沈殿し、デカントした後で管に残っている上澄み液（約５００μＬ）内に再懸濁する。
【００９６】
細胞外から染色、溶解、浸透された（１回のテストに対して十分な）細胞の５０μＬのアリコートをポリプロピレン染色管に加え、サイトカインに特異的なｍＡｂ（上述の材料を参照）の存在下で３０分間インキュベートする。次いで試料を緩衝剤で洗浄し、緩衝剤２５０μＬ内に再懸濁し、その後できるだけすぐにフローサイトメトリのデータ獲得を行う。フローサイトメトリのデータ獲得が遅れた場合は、試料を４℃で最大１時間まで保存する。
【００９７】
収率に応じて、１ｍＬの全血の試料はサイトカイン発現測定に対し、７回から１２回のテストをもたらす。
【００９８】
表面抗原の免疫蛍光染色
染色の前に、ＰＭＡ＋Ｉ処理した血液試料は、遠心分離と上澄み液の除去により半分にまで量を減じる。
【００９９】
細胞の準備は室温（ＲＴ）で行ない、すべてのインキュベートステップは暗所で行なう。
【０１００】
染色のために、１５０μＬの（活性化されているか休止血液対照されている）試料を染色管内の単一クローン系抗体のカクテルに加える。カクテルは、複数の樹状細胞識別抗体（２０μＬのｌｉｎ １ ＦＩＴＣカクテル、１０μＬのＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＧＰ、５μＬのＣＤ１１ｃＡＰＣ、試薬の量は血液１００μＬごと）と、以下のＤＣ表面活性抗原に特異的なＰＥ結合抗体（２０μＬのＣＤ２５ ＰＥ、０.１２５μｇのＣＤ４０ ＰＥ、２０μＬのＣＤ８０ ＰＥ、１０μＬのＣＤ８６ ＰＥ、０.５μｇのＨＬＡ−ＤＱ ＰＥ）の１つとを含む。血液とｍＡｂとを暗所で室温で１５分間インキュベートする。
【０１０１】
インキュベートの後に、３ｍＬのＦＡＣＳ（登録商標）溶解液を加え、管を室温で１０分間インキュベートする。溶解した細胞を５００ｘｇで５分間遠心分離し、その後３ｍＬの緩衝剤で（ＤＰＰＳ １ｘ、ウシ胎児血清０．５％）洗浄する。細胞ペレットを２５０μＬの緩衝剤内に再懸濁し直ちにフローサイトメータで獲得する。データ獲得が遅れた場合、細胞は最高１時間まで４℃に維持する。
【０１０２】
フローサイトメトリ分析
上述の試料は、ＦＡＣＳキャリバーTM（FACSCaliburTM）デュアルレーザフローサイトメータ（カリフォルニア州サンホセ、ＢＤＩＳ）によって得られた。機器はオートメーション化したＦＡＣＳコンプTM（FACSCompTM）４.０ソフトウェアおよび４色キャリブライトTM（CalibriteTM）ビーズ（カリフォルニア州サンホセ、ＢＤＩＳ）とを用いて設定された。事象はＦＳＣしきい値上に得られた。リストモードデータファイルのサイズを減じるために、獲得には１ ＦＩＴＣ／ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ ２パラメータ分散内のＨＬＡ−ＤＲ陽性事象のライブゲート（live gate）を用いた。
【０１０３】
例３
全血中のＣＤ１１Ｃ + ＤＣサイトカイン応答の検出
全血試料は健康なボランティアから採取し、例１および例２で説明される手順に従って、ＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉのいずれかによって活性化するが、いずれもブレフェルディンＡの存在下で行う。結果をそれぞれ図２および図３に示す。
【０１０４】
図２Ａから図２Ｃに、単一ＬＰＳ活性化された全血試料からの末梢血ＤＣの表面免疫表現型特徴を示す。ＣＤ１１Ｃ+樹状細胞は緑に着色され、ＣＤ１１Ｃ-ＤＣは赤に着色され、非樹状細胞は灰色で表される。色は表示の目的で任意に選択され、分析のために用いられる蛍光体とは何の関係も有さない。図２Ａは、両方の樹状細胞サブセットがｌｉｎ １ ＦＩＴＣdimおよびＨＬＡ−ＤＲbrightであることを実証し、これはオドハーティらの「免疫学」８２：４８７−４９３（１９９４）、オルウェウスらのProc. Natl. Acad. Sci. USA９４（２３）、１２５５１−１２５５６（１９９７）によって賛同されており、図２Ｂにおいてはさらに２つのサブセットが同様の側方散乱および前方散乱特性を有することを実証する。図２Ｃは、ＣＤ１１Ｃ発現の示差レベルに基づく２つのサブセットの区別を示す。
【０１０５】
図２Ｄから図２Ｊは、ＩＬ−１ＲＡ（図２Ｄ）、ＴＮＦα（図２Ｅ）、ＩＬ−６（図２Ｆ）、ＩＬ−８（図２Ｇ）、ＩＬ−１２（図２Ｈ）、ＩＬ−１α（図２Ｉ）の発現に対するアッセイの結果を示す。図２Ｊは、アイソタイプが合ったＰＥ結合ネガティブ対照抗体を用いた結果を示す。
【０１０６】
図２Ｄから図２Ｊは、少なくとも検出可能なサイトカイン産生の不在が明示されることから、ＣＤ１１Ｃ-（ＣＤ１２３+）サブセット（赤）はＬＰＳ刺激に応答しないことを実証する。これらの図には直接示されないが、ＬＰＳ活性化されたＣＤ１１Ｃ-ＤＣ内で測定されたサイトカインレベルは、活性化物質不在で産生されたものと区別がつかない。図４に示すように、ＣＤ１１Ｃ-およびＣＤ１１Ｃ+サブセットのいずれもＤＣ活性化物質不在で検出可能なレベルのサイトカインを産生しない。
【０１０７】
対照的に、ＣＤ１１Ｃ+集団は、より高いレベルのサイトカイン産生を示し、より高いレベルのＴＮＦαおよびＩＬ−１β、より低いレベルのＩＬ−６、ＩＬ−１ＲＡおよびＩＬ−８、および極微量のレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１ａを示す。
【０１０８】
図３Ａから図３Ｃは、ＰＭＡ＋Ｉで活性化された単一の全血試料からの末梢血ＤＣの表面免疫表現特徴を示す。ＣＤ１１Ｃ+樹状細胞は緑に着色され、ＣＤ１１Ｃ-ＤＣは赤に着色され、非樹状細胞は灰色に現われる。色は表示の目的で任意に選択され、分析のために用いられる蛍光体とは何の関係も有さない。
【０１０９】
図３Ａは、両方の樹状細胞サブセットがｌｉｎ １ ＦＩＴＣdimおよびＨＬＡ−ＤＲbrightであることを実証し、図３Ｂはさらに、２つのサブセットが同様の側方散乱および前方散乱特性を有することを実証する。図３Ｃは、ＣＤ１１Ｃ発現の示差レベルに基づく２つのサブセットの区別を示す。
【０１１０】
図３Ｄから図３Ｉは、ＴＮＦα（図３Ｄ）、ＩＬ−１α（図３Ｅ）、ＩＬ−１β（図３Ｆ）、ＩＬ−１ＲＡ（図３Ｇ）、およびＩＬ−８（図３Ｈ）の発現に対するアッセイの結果を示す。図３Ｉは、アイソタイプが合ったＰＥ結合ネガティブ対照抗体を用いた結果を示す。
【０１１１】
図３Ｄから図３Ｉは、少なくとも検出可能なサイトカイン産生の不在が明示されることから、ＣＤ１１Ｃ-（ＣＤ１２３+）サブセット（赤）はＰＭＡ＋Ｉ刺激に応答しないことを実証する。これらの図には直接示されないが、ＬＰＳ活性化されたＣＤ１１Ｃ-ＣＤ内で測定されたサイトカインレベルは、活性化物質不在で産生されたものと区別がつかない（図４と比較）。
【０１１２】
対照的に、ＣＤ１１Ｃ+集団は、より高いレベルのサイトカイン産生を示し、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＴＮＦα、およびＩＬ−８を実証可能に産生する。図３Ｅは、ＣＤ１１Ｃ+細胞は極微量のＩＬ−１αを産生することを実証する。
【０１１３】
単球のサイトカイン発現は同じ試料のいくつかで評価された。単球は、それらの散乱特徴と、それらの鮮やかな（bright）ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰおよびＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ染色とに基づき同定される。見られるように、ＬＰＳ＋ＢＦＡ刺激された試料においては、単球はＣＤ１１Ｃ+ＤＣよりもより高いレベルのサイトカインを発現する。ＰＭＡ＋Ｉ＋ＢＦＡ刺激において、ＣＤ１１Ｃ+ＣＤと単球とのサイトカイン分泌は等価であるが、ＬＰＳ活性化された試料と比較するとより少ない。細胞内のたんぱく質分泌は、ＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）として評価される。
【０１１４】
例４
全血中でのＣＤ１１Ｃ + ＤＣ表面抗原発現の検出
全血試料を健康なボランティアから採取し、例１および例２に説明される手順に従って、ブレフェルディンＡ不在下で、ＬＰＳ、ＰＭＡ＋Ｉで活性化するかまたはＣＤ４０架橋する。結果を図６に示す。
【０１１５】
ヒストグラムで実証するように、ＣＤ１１Ｃ-サブセットは、ＰＭＡ＋Ｉ活性化においてＣＤ２５発現の明らかなアップレギュレーションを実証する。ＣＤ２５のアップレギュレーションは、ＣＤ１１Ｃ-サブセット内で観察される唯一の明確な応答である。対照的に、ＣＤ１１Ｃ+サブセットは、ＬＰＳ活性化においてＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱのアップレギュレーションを示す。Ｔ細胞共刺激分子群、特にＣＤ８０は、最も強いシグナルを発する。ＰＭＡ＋Ｉは、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲのＣＤ１１Ｃ+細胞内でアップレギュレーションをもたらす。ＣＤ２５およびＣＤ４０の最小限の増加が観察される。ＣＤ４０の架橋を通した活性化は、ＣＤ８６、ＣＤ８０のレベルの増大と、ＨＬＡ−ＤＲの最小限のアップレギュレーションとをもたらす。
【０１１６】
図５は、ＬＰＳに対して、ＰＭＡ＋Ｉでの活性化の間のＣＤ１１Ｃ+末梢血ＤＣサブセットのＴＮＦα、ＩＬ−８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の応答の違いを強調する。２つのドナーを表示する。サイトカインと共刺激分子との発現パターンは、異なった刺激剤の間で変動し、ドナーの間では一致する。ＩＬ−８およびＣＤ８６はＰＭＡ＋Ｉ刺激において優勢のシグナルである。ＬＰＳ活性化試料では、ＴＮＦαおよびＣＤ８０が多く産生される。
【０１１７】
例５
サイトカインカイネチックアッセイ
全血を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激し、ポリプロピレン管（１２×７５ｍｍ）内で、ＣＯ2を５％含む加湿空気内で３７℃でインキュベートする。アリコートを刺激後の０時間から８時間までの毎時間、主に例１および例２に説明のとおり処理する。各々の試料を採取する１時間前に、１０μｇ／ｍＬでＢＦＡを加える。結果を図８に示す。
【０１１８】
例６
全血フローサイトメトリの樹状細胞免疫機能アッセイのための変形プロトコル
この例では、例１および例２で説明したものをわずかに変形させたプロトコルを示す。変形されたプロトコルはより速く、より多くの細胞からのデータの獲得を可能にし、これにより統計値を向上させ、より少ないアリコートのステップを含む。
【０１１９】
全血中のＤＣ表面抗原発現
共刺激分子ＣＤ８０またはＤＣ活性化マーカーＣＤ８３の表面発現の平均蛍光強度（平均ＭＦＩ）として報告した、ＬＰＳ刺激に対するＣＤ１１Ｃ+ＤＣの応答を、以下のように測定する。
【０１２０】
材料
・リポ多糖（ＬＰＳ）、シグマから入手、カタログ番号Ｌ２６５４、ＤＭＳＯ内に０．５ｍｇ／ｍＬ、−７０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液
・ＤＭＳＯをＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］希釈（刺激溶媒）
・ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４４、３００μＬの全血（ＷＢ）に対し１５μＬ使用
・系カクテル１（ｌｉｎ１）ＦＩＴＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４６、３００μＬのＷＢに対し６０μＬ
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４７３６４、３００μＬのＷＢに対し３０μＬ
・ＣＤ８０ ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５１２、３００μＬのＷＢに対し６０μＬ
・ＣＤ８３ ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、（特別結合）、ＰＣ番号１５２０、５０μｇ／ｍＬ、３００μＬのＷＢに対し２０μＬ
・ＦＡＣＳTM溶解液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４９２０２、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・洗浄緩衝ＰＢＳ（１ｘ）、ＢＳＡ０．５％
・ＰＢＳ（１ｘ）
刺激プロトコル
・２０μＬのＬＰＳ作業溶液を１ｍＬのヒト全血に加える（活性対照）
・２０μＬのＤＭＳＯ：ＰＢＳ１ｘ［１：１００］を１ｍＬのヒト全血に加える（休止対照）
・管を３７℃および５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。
【０１２１】
染色プロトコル
すべてのステップを１２×７５ポリプロピレン管内で行なう。
【０１２２】
・ｌｉｎ １ ＦＩＴＣを６０μＬ、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰを３０μＬ、ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣを１５μＬおよびＣＤ８３ ＰＥを２０μＬ、またはＣＤ８０ ＰＥを６０μＬ加える。
【０１２３】
・刺激プロトコルから得られた全血（ＷＢ）３００μＬを加え、撹拌する。
・暗所でＲＴで１５分間インキュベートする。
【０１２４】
・ＦＡＣＳ溶解液（１ｘ）３ｍＬを加え、管に蓋をして撹拌する。
・暗所でＲＴで１０分間インキュベートする。
【０１２５】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ型遠心分離機で１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１２６】
・上澄み液を吸引し、撹拌してペレットを崩壊させる。
・２ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、撹拌する。
【０１２７】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ型遠心分離機で１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１２８】
・上澄み液を吸引する。
・染色された細胞を〜２００μＬの洗浄緩衝剤に再懸濁する。
【０１２９】
・１時間以内に試料を獲得する（すなわちフローサイトメトリ分析を行なう）、獲得前には４℃で試料を保存する。
【０１３０】
注意：獲得のために試料を１２×７５ポリスチレン管に移すことが必要である。ポリプロピレン管は、フローサイトメータの試料注入システムに一般に適合しない。移動は獲得の直前に行なう。
【０１３１】
機器およびセットアップおよび獲得基準
・ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメータ
・４色溶解／洗浄（ＬＷ）をＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェアにセットする。
【０１３２】
・ＦＣＳしきい値を使用する。
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ陽性／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣｄｉｍ事象を使用してＦＣＳファイルを獲得する。獲得のために細胞全体の懸濁を用いる（４，０００から７，０００事象）
細胞同定
散乱−低／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ−低／抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ−高／ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ−高
全血中のＤＣサイトカイン発現
ゴルジ輸送阻害剤ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）の存在下でのＴＮＦα発現の平均蛍光強度（平均ＭＦＩ）として報告した、ＬＰＳ刺激へのＣＤ１１Ｃ+ＤＣの応答を、以下のように測定する。細胞は２時間活性化される。
【０１３３】
材料
・リポ多糖（ＬＰＳ）、シグマから入手、カタログ番号Ｌ２６５４、ＤＭＳＯ内に０．５ｍｇ／ｍＬ、−７０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液
・ＤＭＳＯをＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］希釈（刺激溶媒）
・ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、シグマから入手、カタログ番号Ｂ−７６５１、ストック溶液はＤＭＳＯ内に５０ｍｇ／ｍＬ、−２０℃で保存、作業溶液はＰＢＳ（１ｘ）で［１：１００］の希釈溶液、１ｍＬのＷＢに対し２０μＬ使用
・ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４４、３００μＬの全血（ＷＢ）に対し３０μＬ使用
・系カクテル１（ｌｉｎ １）ＦＩＴＣ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５４６、３００μＬのＷＢに対し１２０μＬ
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４７３６４、３００μＬのＷＢに対し６０μＬを使用
・抗ヒトＴＮＦα ＰＥ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０５１２、２０μＬ／テストで使用
・ＦＡＣＳTM浸透溶液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４０４５７、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・ＦＡＣＳTM溶解液１０ｘ、ＢＤＩＳから入手、カタログ番号３４９２０２、作業溶液は脱イオン水で［１：１０］の希釈溶液
・洗浄緩衝剤ＰＢＳ（１ｘ）、ＢＳＡ０．５％
・ＰＢＳ（１ｘ）
刺激プロトコル
・２０μＬのＬＰＳ作業溶液を１ｍＬのヒト全血に加える（活性対照）。
【０１３４】
・２０μＬのＤＭＳＯ：ＰＢＳ１ｘ［１：１００］を１ｍＬのヒト全血に加える（休止対照）。
【０１３５】
・次いで両方の対照管に２０μＬのＢＦＡ作業溶液を加える。
・管を５％ＣＯ2で３７℃で２時間インキュベートする。
【０１３６】
染色プロトコル（細胞内）
・すべてのステップを１２×７５ポリプロピレン管内で行なう。
【０１３７】
・ｌｉｎ １ＦＩＴＣを１２０μＬ、抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰを６０μＬ、Ｃｄ１１Ｃ ＡＰＣを３０μＬ加える。
【０１３８】
・刺激プロトコルから得られた３００μＬの全血（ＷＢ）を加え、撹拌する。
・暗所でＲＴで１５分間インキュベートする。
【０１３９】
・３ｍＬのＦＡＣＳ溶解液１ｘを加え、管に蓋をして撹拌する。
・暗所でＲＴで１０分間インキュベートする。
【０１４０】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで７分間）。
【０１４１】
・上澄み液を吸引し、緩やかに撹拌してペレットを崩壊させる。
・１ｍＬのＦＡＣＳ浸透溶液１ｘに再懸濁する。
【０１４２】
・暗所で１０分間ＲＴでインキュベートする。
・２．５ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、管に蓋をして緩やかに撹拌する。
【０１４３】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで１０分間）。
【０１４４】
・上澄み液をデカントする。
・浸透された細胞ペレットを残留する上澄み液に緩やかに再懸濁する。
【０１４５】
・細胞内の染色のために抗ヒトＴＮＦα ＰＥ試薬を２０μＬ加える。
・暗所でＲＴで３０分間インキュベートする
・２ｍＬの洗浄緩衝剤を加え、緩やかに撹拌する。
【０１４６】
・沈殿する（ソルボール・ベンチトップ遠心分離機、１５００ｒｐｍで１０分間）。
【０１４７】
・上澄み液をデカントする。
・染色され浸透された細胞を〜２００μＬの洗浄緩衝剤に再懸濁する。
【０１４８】
・１時間以内に試料を獲得する、獲得前には４℃で試料を保存する。
注意：獲得のために試料を１２×７５ポリスチレン管に移すことが必要である。ポリプロピレン管はフローサイトメータの試料注入システムに一般に適合しない。移動は獲得の直前に行なう。
【０１４９】
機器およびセットアップおよび獲得基準
・ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメータ
・４色溶解／非洗浄（ＬＮＷ）をＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェア内にセットする。
【０１５０】
・ＦＳＣしきい値を使用する。
・抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ陽性／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ ｄｉｍ事象を用いてＦＣＳファイルを獲得する。細胞全体の懸濁を用いて獲得する（４，０００−７，０００事象）。
【０１５１】
細胞同定
散乱−低／ｌｉｎ １ ＦＩＴＣ−低／抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ ＰｅｒＣＰ−高／ＣＤ１１Ｃ ＡＰＣ−高
ここに述べたすべての特許、特許公報、および他の公開された資料は、その全体を、その各々が独立して特定的に引用により援用されるように、引用により援用する。
【０１５２】
この発明の好ましい例示的な実施例を説明したが、当業者においては、この発明から逸脱することなくさまざまな変更と修正とを行なえることが明らかであろう。添付の特許請求の範囲は、この発明の真の精神および範囲に含まれる、そのようなすべての変更および修正を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 樹状細胞活性化物質としてＬＰＳを例示した、樹状細胞機能に対する全血フローサイトメトリアッセイにおける基本的なステップを概説する流れ図である。
【図２】 ブレフェルディンＡの存在下でＬＰＳによって活性化された全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図３】 ブレフェルディンＡの存在下でＰＭＡ＋Ｉによって活性化された全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図４】 ブレフェルディンＡの存在下で活性化物質の不在下（休止対照）でインキュベートされた全血のフローサイトメトリ分析中に生じる一連のドットプロットを表わす図である。ＣＤ１１ｃ+樹状細胞を緑色で示し、ＣＤ１１ｃ-樹状細胞を赤色で示す。非樹状細胞を灰色で示す。色は任意に選択したものであり、分析に用いられる蛍光体とは関係しない。
【図５】 代替的にＬＰＳまたはＰＭＡ＋Ｉで各々活性化された、二人のドナーからのＣＤ１１ｃ+樹状細胞におけるＴＮＦα、ＩＬ−８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現の差を表わす図である。
【図６】 全血中の末梢血樹状細胞上の同定されるマーカの表面発現における３つの異なる樹状活性化物質の影響を概略的に示す、一連のヒストグラムを表わす図である。
【図７】 活性化した全血中の単球（灰色のバー）およびＣＤ１１ｃ+ＤＣ（黒色のバー）のサイトカイン発現を比較した図であり、図７ＡはＬＰＳ＋ブレフェルディンＡに刺激された細胞を示し、図７ＢはＰＭＡ＋Ｉ＋ブレフェルディンＡに刺激された細胞を示す。
【図８】 ＬＰＳに活性化されたＣＤ１１ｃ+ＤＣ中のＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＣＤ８０の動力学を示す図である。ＬＰＳインキュベーションのタイムコースは０から８時間であった。細胞内のサイトカインおよびＣＤ８０の発現はＰＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。
Claims (19)
- 全血中の樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ方法であって、
（ａ） 全血試料を、in vitro前培養なしで、樹状細胞活性化物質に接触させるステップと、
（ｂ） 前記試料に、複数の樹状細胞識別抗体および少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体を加えるステップと、
（ｃ） 前記試料中の少なくとも１つの識別可能な樹状細胞サブセットの内部のサイトカインと、前記サイトカイン特異的抗体との結合を、フローサイトメトリでアッセイするステップとを含む、方法。 - 前記ステップ（ｂ）は、
（ｂ１） 複数の樹状細胞識別抗体を前記試料に加えるステップと、
（ｂ２） 前記試料内に赤血球を溶解させるステップと、
（ｂ３） 前記試料内に有核細胞を浸透させるステップと、
（ｂ４） 少なくとも１つのサイトカイン特異的抗体を前記試料に加えるステップとをこの順序で含む、請求項１に記載の方法。 - 前記試料は、前記ステップ（ａ）の間にブレフェルディンＡの存在下で前記樹状細胞活性化物質と接触される、請求項２に記載の方法。
- 前記樹状細胞活性化物質は、リポ多糖（ＬＰＳ）、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートとイオノマイシン（ＰＭＡ＋Ｉ）、および、ＣＤ４０−架橋からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記樹状細胞識別抗体は、複数の抗体を含み、各々が非樹状細胞系に特異的な抗体である、請求項３に記載の方法。
- 前記非樹状細胞系に特異的な抗体の各々は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６からなる群から採取されたタンパク質のうちの、異なった１つに
特異的である、請求項５に記載の方法。 - 前記非樹状細胞系に特異的な抗体の各々は、同一の蛍光体に結合される、請求項６に記載の方法。
- 前記蛍光体はＦＩＴＣである、請求項７に記載の方法。
- 前記樹状細胞識別抗体は、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗体を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記樹状細胞識別抗体は、ＣＤ４に特異的な抗体を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記樹状細胞識別抗体は、異なった樹状細胞サブセットを示差的に結合する少なくとも１つの示差的抗体を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記示差的抗体は、ＣＤ１１Ｃに特異的である、請求項１１に記載の方法。
- 前記示差的抗体は、ＣＤ１２３に特異的である、請求項１１に記載の方法。
- 前記サイトカイン特異的抗体は、インターロイキンに特異的である、請求項３に記載の方法。
- 前記サイトカイン特異的抗体は、サイトカイン受容体に特異的である、請求項３に記載の方法。
- 前記サイトカイン特異的抗体は、ＴＮＦ−αに特異的である、請求項３に記載の方法。
- 前記サイトカイン特異的抗体は、インターフェロンに特異的である、請求項３に記載の方法。
- 全血中の樹状細胞機能を測定するためのフローサイトメトリ方法であって、
（ａ） 全血試料を樹状細胞活性化物質に接触させるステップと、
（ｂ） 複数の樹状細胞識別抗体と、樹状細胞表面活性マーカに特異的な少なくとも１つの抗体とを前記試料に加えるステップと、
（ｃ） 前記試料中の少なくとも１つの識別可能な樹状細胞サブセットの樹状細胞表面活性マーカと、前記樹状細胞表面活性マーカに特異的な抗体との結合を、フローサイトメトリでアッセイするステップとを含む、方法。 - 前記樹状細胞表面活性マーカは、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６およびＨＬＡ−ＤＱからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
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