JP2000510819A - コンビナトリアルライブラリーについての硫黄比率標識法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コンビナトリアルライブラリーの調製方法およびそれにより調製されたコンビナトリアルライブラリーが発明される。また、コンビナトリアルライブラリーから望ましい特徴を有する化合物を同定する方法も発明される。また、硫黄アイデンティファィアーでコードされたビーズを用いてコンビナトリアルライブラリーをコードする方法も発明される。

Description

【発明の詳細な説明】 コンビナトリアルライブラリーについての硫黄比率標識法 発明の分野 本発明の分野は、種々の組成を有する多数の製品が得られる、１またはそれ以 上のコードされたコンビナトリアルライブラリーの合成を含むコンビナトリアル 化学に関する。本発明はまた、コンビナトリアルライブラリーをコードする方法 にも関する。 発明の背景 様々な生物学的プロセスを効果的に調節することのできる新規な化学的成分を 連続的に検索するにおいて、検索を行うための標準的な方法は、種々の既存の化 学的成分、例えば天然に存在する化合物または合成ライブラリーもしくはデータ バンクにある化合物をスクリーンすることである。既存の化学的成分の生物学的 活性は、化学的成分の特定の性質を試験し、スクリーンされるように設計されて いるアッセイ、例えば、該成分の特定のレセプター部位への結合能を試験するレ セプター結合アッセイに、該成分を適用することによって測定される。 多数の無作為に選択された化合物を生物学的活性についてスクリーンすること に関与する時間および費用を減少させる努力において、多くの開発がなされ、リ ード化合物を発見するための化合物のライブラリーが得られた。分子多様性を化 学的に生じさせることが新規なリード構造物の検索における主たる手段となって いる。現在のところ、多数の分子的に異なった化合物を化学的に生じさせる既知 の方法は、一般に、特にペプチドおよびペプチドライブラリーを合成ならびに同 定するための固相合成の使用を含む。例えば、Leblらは、Int．J．Pept．Prot． Res.，41，p.201（1993）において、ある量のペプチドを樹脂から切り離すこと ができるようにペプチドと樹脂の間に選択的に切断できるリンカーを設け、ペプ チドのうちいくらかは樹脂に付着したままであるが、配列決定することので きる可溶形にて検定する方法を開示し；Lamらは、Nature，354，p.82(1991)およ び（WO92/00091）において、ポリスチレンまたはポリアクリルアミド樹脂などの 固体支持体上での直鎖状ペプチドの合成方法を開示し；Geysenらは、J．Immunol ．Meth.，102，p.259（1987）において、ポリスチレン誘導体のピンが９６−ウ ェルのマイクロタイタープレートのウェルの配置に対応するように、一まとめに 配置されている、そのピン上でのペプチドの合成を開示し；および Houghtenらは、Nature，354，p.84(1991)およびWO/92/09300において、可溶性ペ プチドのプールを含む抗体またはレセプター結合配列の新たな決定に対する解決 手段を開示する。 技術的なことは別にして、リード物を形成するこれらの方法の全てに伴う主要 な欠点は、そのリード物の質である。直鎖状ペプチドは、歴史的に、薬剤設計に ついてはリード物が比較的乏しい。特に、直鎖状ペプチドを非ペプチドのリード 物に変換する合理的な方法はない。前記のように、ペプチドレセプターに対する 非ペプチドのリード物を決定するために、人々は、化合物の各々が個々に試験さ れている、大量のデータバンクの化合物をスクリーンする手段に訴えなければな らない。 多種の有機反応は、樹脂に固定された基質上で行うことができることが知られ ている。これらの反応は、当業者によく知られているペプチド合成反応に加えて 、ベンジル系ハロゲン化物での求核置換、ハロゲン化、ニトロ化、スルホン化、 酸化、加水分解、酸クロリド形成、フリーデル−クラフツ反応、ＬｉＡｌＨ₄で の還元、金属化および有機金属ポリマーの多種の試薬との反応を包含する。例え ば、N.K.Mathurら、Polymers as Aids in Organic Chemistry，Academic Press ，New York，p.18(1980)を参照のこと。加えて、Farrallらは、J．Org．Chem.， 41，p.3877（1976）において、樹脂を用いて行われたこれらの反応のうちいくつ かの実験的細目を記載する。 ペプチド模倣物などの非ペプチド性有機化合物は、酵素の特定のレセプターに 対する親和性においてペプチドリガンド以上であることがしばしばである。高親 和性生物学的リガンド、最終的には、新規で重要な薬物を速やかに同定する効果 的な方法は、迅速な構築と、水素結合、塩架橋、ｐｉ−錯形成反応、疎水性効果 などの、１またはそれ以上の種類の生物学的アクセプター（例えば、レセプター または酵素）との相互作用を確立する能力を有する種々の構造単位を有する非ペ プチド構造物の多様なライブラリーをスクリーンすることを必要とする。しかし ながら、非ペプチド分子を含有する合成試験化合物ライブラリーの構築およびス クリーニングについての研究は、今はその初期にある。この分野における一例と して、EllmanおよびBuninの固体支持体上でのベンゾジアゼピンのコンビナトリ アル合成についての研究が挙げられる（J.Am.Chem.Soc．114，10997，(1992);Ch emical and Engineering News，January 18，1993，page33を参照のこと）。 非ペプチドライブラリーの構築および使用の分野における鍵となる未解決の問 題は、生物学的活性を示す可能性のある、ライブラリーから選択された分子の構 造を解明することである。 ペプチドライブラリーと協力して合成される、独特のヌクレオチド配列コード を用いてライブラリーから選択されたペプチドの構造を解明する試みは、Brenne rおよびLerner（Brenner,S．およびLerner,R.A.、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA ，1992 89．5381-5383）によって記載された。各ペプチドに付着したコードのヌ クレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されるものでな ければならない。しかしながら、ヌクレオチド合成技術は、多種の分子ライブラ リーの合成に要求される合成技術の全てと適合するものではない。さらに、また 、ライブラリーにおいてヌクレオチドと合成試験化合物が極めて近接しているこ とは、生物学的アッセイの間、リガンドと酵素の標的レセプターとの結合を妨害 するこれらの分子間に相互作用をもたらし、この解決方法は制限されることとな る。ライブラリーのヌクレオチド成分もまた、様々な他の方法における生物学的 アッセイの間に妨害し得る。 Kerrら（J.Am.Chem.Soc.，1993，115，2520-2531）は、ペプチドコーディング 鎖と同時に、非-天然アミノ酸残基を含有する、ペプチドの溶液相ライブラリー を合成することを報告した。該ライブラリーにおけるペプチドリガンドおよ びそのコーディング鎖は共有結合し、それで合成試験化合物と対応するコードの 対を単離し、かつ配列決定することが可能にする。しかしながら、前記のBrenne rおよびLernerによって記載された核酸コード化ライブラリーと同様に、コード 化ペプチドはスクリーニングアッセイを妨害し得る。 ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９３４５は、所定の二成分コーディングシステムにおい て複数のタグを付着することでコンビナトリアルライブラリーの活性を同定する 方法を記載する。 ＰＣＴ／ＨＵ９３／００３０は、ペプチド合成に使用するための蛍光標識され たサブ-ライブラリーペプチドキットを記載する。 ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０７８は、ポリマー配列を用いてコンビナトリアルラ イブラリーをコードする方法を記載する。 Shearerら（Journal of Chromatographic Science，Vol.31，March 1993およ びAnal.Chem．1992，64，2192-2196）は、ガスクロマトグラフィーおよびフレー ムレス硫黄化学発光検出操作の石油製品の分析への応用を記載する。 本発明は、公知方法にある多数の欠点ならびにその公知方法により達成されな い多くの要求を取り扱うものであり、以下により完全に記されるように、公知方 法に比べて多くの利益を提供するものである。 発明の概要 本発明は、硫黄アイデンティファイアーを利用することからなるコンビナトリ アルライブラリーをコードする方法に関する。 本発明はまた、コンビナトリアルライブラリーの選択物を、各々、硫黄アイデ ンティファイアーでコードする方法およびそれによりコードされたコンビナトリ アルライブラリーに関する。 本発明はまた、硫黄アイデンティファイアーが付着したビーズにも関する。 本発明はまた、種々の比率の硫黄アイデンティファイアーが付着したビーズに 関する。 発明の詳細な記載 本明細書において用いる場合の、「ビーズ」なる語は、コンビナトリアル合成 のための基礎を提供することが可能ないずれかの固体支持体、例えば１〜２％架 橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールポリスチレンコ ポリマー、好ましくはポリエチレングリコール側鎖を組み込むように修飾された ポリスチレンを意味する。 本明細書においてに用いる場合の、「タグ」なる語は、特記しない限り、ビー ズまたはビーズ群のコード化特徴、例えば大きさの相違、物質組成の相違または 種々の比率の硫黄アイデンティファイアーを用いる流動性における相違を意味す る。 本明細書において用いる場合の、「硫黄アイデンティファイアー」または「ア ィデンティファイアー」なる語は、種々の比率の硫黄成分を、好ましくは２種の 異なる硫黄成分を種々の比率で加えることによってビーズまたはビーズ群に付着 されたコード化ラベルを意味する。 本明細書において用いる場合の、「強度-差別化した(intensity-differentiat ed)」なる語は、種々の比率の異なる硫黄成分をビーズまたはビーズ群に加えた アイデンティファイアー（本明細書で使用されるような）を意味する。 本明細書において用いる場合の、「選択物」なる語は、コンビナトリアル合成 （ペプチド化学に限定しない）における所定の段階についての別の可変部、例え ば反応物、試薬、反応条件、およびそれらの組合せを意味する。「段階」なる語 が化合物またはリガンドの一連の合成における１工程に相当する場合には、化合 物またはリガンドがコンビナトリアル合成の最終産物である。「レジストリー(r egistry)」なる語は、本明細書中で使用される場合、前記で示したような「段階 」なる語と同じ意味を有する。 化合物をビーズライブラリーより構造決定するための簡明なマススペクトル法 が開発されたことで、適当な大きさのライブラリーでは反応同定タグをそれほど 必要としなくなった。しかしながら、大きなライブラリーが開発されると、質量 の重複は避けられなくなり、ＭＳはあまり有用ではなくなる。ＭＳフラグメント を試験することで、ある程度の問題が軽減されるかもしれないが、これは時間の 浪費であり、いっも成功するわけではない。本明細書中に開示されるように、単 独で、または反応工程がすべて標識されているのでないならば、ＭＳと組み合わ せて、特定のビーズの反応歴を明らかにするタグが特に有用である。 近年、数種類の便利な選択的硫黄ＧＣ検出器（フレームレス硫黄化学発光検出 器）が市場に現れ、そのうちの少なくとも１台は、低ピコグラムのレベルから開 始し、３〜４オーダーの大きさに及ぶ範囲で＞５％の精度を有する。これらの検 出器は、炭素または窒素に反応せず、よって分析では干渉物は比較的少ない。検 出器は最高度の硫黄含有量のみを測定するので、含硫黄化合物の構造には無関係 である。したがって、本発明は、２または３個の少数のタグを用いて、硫黄比率 および保持時間により樹脂ビーズ上の多数の事象を同定するものである。 典型的な大型のビーズライブラリーは、リガンドを付着するための約１５ナノ モルの官能価を有するビーズを含むであろう。現在では、１〜１０００ｐｇ量の 硫黄を、２種の因子を区別できるほど十分に正確に測定することができる。さら には、個々のアイデンティファイアーは、付着およびその後の切断について極め て類似した反応性を有するであろう。よって、２つのアイデンティファイアーを 変えることによって、２１個の独特なタグの比率を、０.００１から１０００の 範囲の比率で利用できる。１工程において３つのアイデンティファイアーを用い ると、１２６種の識別可能な比率が得られる。よって、対称な２工程のサブライ ブラリー合成において、６個のタグを用いて１５,８７６種（１２６ｘ１２６） の反応歴に関する情報が得られる。これらのサブライブラリーは混合することが でき、第３工程を多数の試薬を用いて行い、極めて大きなサブライブラリーを得 る。例えば、第３工程での１００種の試薬は、たった６個のタグを用いるだけで １,５８６,６００（１５,８７６ｘ１００）種の化合物の標識化ライブラリーを 付与することができる。 カラム上で１０００ｐｇの硫黄を得るには、消失を考慮して、ビーズ上に約２ ０００ｐｇの硫黄を必要とするであろう。さらに小さな比率が必要とされるなら ば、必要とされるタグの量は大いに減少する。かくして、１５個の比率は最大２ ５０ｐｇ（０．００８ナノモル）の硫黄を必要とし、３個のタグは９０種の反応 歴を同定できる。 よって、消失を考慮して、３個のタグは、１０００ｐｇ（０．０３２ナノモル ）の硫黄を必要とするであろう。これは、２５０ミクロンのビーズ上で約１５ナ ノモルの官能価および典型的な市販されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）-ポリスチレン樹脂上で０.１５ナノモルに匹敵する。最初の２工程のみを標識 化する対称なライブラリーの場合、６個のタグは８１００個のサブライブラリー 化合物の反応歴を同定することができ、例えば、たった１０種の識別試薬を用い て第３の工程に付した後に８１,０００個の化合物を同定できる。 必要なタグの数を減少させる別法は、マススペクトル分析によって区別するこ とができない重複する分子量を有する生産物を担持するであろうビーズのみを標 識することである。 最終のリガンドが分析前に樹脂から切り離される場合には、リガンドを使用し たのと同じシステムをリンカーによって、最初のタグを樹脂に付着させてもよい 。タグは、リガンドバイオアッセイ溶液中にあるが、その低濃度でのタグはバイ オアッセイを妨害せず、タグ検出器は硫黄選択的および保持時間選択的であるの で、リガンドは、一般に、タグ分析を妨害しないであろう。 ライブラリーを調製するために合成を行うにあたり、最初、多数のビーズ、一 般に、少なくとも１０¹⁵を超えてはならず、より一般には少なくとも１０¹⁰を超 えてはならないが、通常少なくとも１０³、より一般には少なくとも１０⁴、およ び望ましくは少なくとも１０⁵のビーズを用いて始めてもよく、ビーズを数群に 分け、各群のビーズは標識されていないかまたは各群はアイデンティファイアー によって特異的に標識されているのと同様に標識されているか、あるいは１の群 は標識されておらず、残りの群は、各々、アイデンティファイアーにより特異的 に標識されていることを特徴とする。ビーズの群数は、最初の区別工程における 選択物の数に対応するであろう。各群の全体を別々の容器に入れる。マイクロタ イターウェルプレート、メリフィールド合成器（Merrifield synthesis vessels）などを使用することができる。ビーズは、通常、各々、少なくとも１ 個のビーズ、通常は多数のビーズ、一般には１０００個またはそれ以上のビーズ の群に分けられ、ライブラリーに含まれるレジストリーの全体の数および最終化 合物の各々について望ましいビーズの数に応じて１０⁵個またはそれ以上であっ てもよい。 次いで、適当な試薬を個々の容器に加えて、それらを段階（または本明細書で 使用されるような「レジストリー」）において処理するであろう。もし第１段階に おいてビーズが標識されていないならば、その場合、各プールを試薬および段階 をコードする独特なアイデンティファイアーと反応させ、つづいて全てのビーズ を単一混合物に合し、次のレジストリーの選択物の数にしたがってビーズを分離 する。もし最初の段階でビーズが標識されているならば、プールを単一混合物に 合し、ついで次のレジストリーの選択物の数にしたがって分離される。ビーズの 分離し、つづいて標識化工程を含め、合成する段階（レジストリーを形成するた めの）の操作、次いでビーズを再び合する操作は、コンビナトリアルライブラリ ーが完成するまで繰り返される。 ある場合には、他の選択物と比較して特定のレジストリーにて特定の置換基を 有する生成物の割合を強化させるために同じ反応を行ってもよい。別の場合には 、１またはそれ以上のレジストリーは、最終生産物に関連した多様性を強化する ために、無視されて反応を受けない一部のビーズを含んでいてもよい。他の状況 において、バッチは完全に異なる合成経路に沿って扱われ得る。 このように調製されたライブラリーは、ライブラリーにある各選択物の反応経 路を同定する標識化ビーズを有しているであろう。 強度‐差別化した硫黄-標識化ビーズは、種々の量の硫黄成分を有するビーズ のプールを誘導することによって調製することができる。加えて、複数の、好ま しくは２または３個の硫黄タグを種々の比率で用いて、ビーズをコードすること ができる。これは好ましくは、例えば、標識化工程（複数でも可）において、第 １硫黄タグ（Ａ）および第２硫黄タグ（Ｂ）の化学量論を変化させること、例え ばＡ：Ｂ＝１：１、１：２、２：１、１：４、４：１等によって実行される。 本明細書において用いる場合の、強度-差別化した硫黄-標識化ビーズは、下記 の反応図式１において示される方法によって調製できる。 反応図式１ Ｒ＝低級アルキル；Ｒ¹＝低級アルキル、ハロゲン、−ＯＣＨ₃等 基質＝その上でリガンドが合成されているビーズ 反応図式１にて用いる場合の、ビーズの試料、好ましくはポリエチレングリコ ール修飾のポリスチレン樹脂、１００−３００ミクロン粒子を使用する。ビーズ をＮ個のプールに分ける。各プールのメンバーは、そのプールに独特のアイデン ティファイアーで誘導される。２のＲおよびＲ¹基は、４の最終の４−ヒドロキ シベンゼンスルホンアミドがキャピラリーＧＣによって直接的にまたは誘導化の 後に分離されるように選択される。２または３個の２つの異なる例の既知濃度の 溶液を調製し、アリコートを混合して、成分比が正確にわかる溶液を得る。これ らの溶液を用い、例えば、Ｐｈ（ＴＦＡ）₂を用いてカルベンを生成すること によって種々のバッチの樹脂を標識する。目的とする個々のビーズの反応歴は、 ３６６ｎｍのＵＶ光源を用いて放射線を照射することによってタグをビーズから 除去して４を得、フレームレス硫黄化学発光検出器（Sievers Instruments，Inc .，Boulder，Colorado）を用いるＧＣによって成分比を測定することによって決 定する。 多数のビーズを特徴付ける場合、オートサンプラー（autosampler）によって タグをＧＣへ採り入れ、よって無人で高処理量を扱える。本明細書中で使用する ための別の型のタグは、反応図式１において５（３の代わりに使用することがで きる）として示され、それはＣｅ(ＮＨ₄)₂(ＮＯ₃)₆で酸化することによってＧＣ タグを放つ。本発明の標識化方法において使用できる他のリンカー法は、ＰＣＴ ／ＵＳ９３／０９３４５において議論されている。 本発明の特に好ましい態様において、その中にある選択物を、各々、硫黄アイ デンティファイアーを用いるタグによってコードし、生物学的活性について試験 する、コンビナトリアルライブラリーを調製する。 本発明のさらに好ましい態様は、硫黄アイデンティファイアーによってコード されたビーズを用いて調製されるコンビナトリアルライブラリー、およびかかる コンビナトリアルライブラリーによって同定される医薬上活性な化合物に関する 。 さらに工夫することなく、前の記載を用いて、当業者であれば本発明を最大限 利用できると考える。 本発明の好ましい具体例は前の記載によって説明されるが、本発明は本明細書 中に開示される指示そのものに限定されるものではなく、以下の請求の範囲の範 囲内で行われる全修飾に対する権利を保持することが、理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．硫黄アイデンティファイアーを組み込むことによってコンビナトリアルラ イブラリーを標識する方法。 ２．コンビナトリアルライブラリーの合成の間における特定の段階にて、２ま たはそれ以上の硫黄構築物の比率を変化させることによって、硫黄アイデンティ ファイアーを調製する請求項１記載の方法。 ３．請求項１におけるように調製したコンビナトリアルライブラリー。 ４．コンビナトリアルライブラリーにおいて所望の特徴を有する化合物を同定 する方法であって： ａ）ビーズがコンビナトリアルライブラリーの合成の間における特定の段階に て、２またはそれ以上の硫黄構築物の比率を変化させることによって調製された 硫黄アイデンティファイアーで標識されている、コンビナトリアルライブラリー を調製し； ｂ）該ライブラリーを所望の特徴を有する化合物を同定するバイオアッセイに おいて試験し； ｃ）バイオアッセイにおいて所望の活性を示すビーズまたは個々のビーズ由来 の可溶化された誘導体を同定し；および ｄ）硫黄高選択性分析システムを用いて硫黄構築物の割合を測定し、相互に関 連するアイデンティファイアーを同定かつ定量することにより理論上活性なリガ ンドを同定すること からなる方法。 ５．硫黄アイデンティファイアーでコードされたビーズ。 ６．その中にある選択の各々が独特の硫黄アイデンティファイアーによってコ ードされているコンビナトリアルライブラリー。 ７．請求項６のコンビナトリアルライブラリーによって同定される医薬上活性 な化合物。 ８．請求項１または６におけるように調製されたコンビナトリアルライブラ リーであって、ビーズの反応歴を、２またはそれ以上の硫黄含有リガンドの割合 によって少なくとも部分的に同定するコンビナトリアルライブラリー。