JP2004507556A - 化学的または生物学的反応または合成の実施のための方法および作用粒子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、化学的または生物学的反応または合成の実施のための方法および作用粒子に関する。ミクロスケールとマクロスケールとの間の完全な両立性を保証し、その際に大きな多様性でカップリング反応を実施することができ、低費用で個々の作用粒子に反応−または合成生成物の一義的な割当てを保証する解決策を提供するという課題は、ｎ反応液の使用時に作用粒子のｘチャージが考慮され（ｘ≦ｎである）、前記反応液の密度が完全な反応生成物または合成生成物による充填時でも前記反応液の密度にしたがって分離できるように前記密度が互いに区別して決定されるものにおいて、ａ）初めに第１反応パートナーの結合後に、第１反応液の均一の密度の各チャージが供給され、ｂ）ｘチャージの各々が最大ｎ部分量に分割され、互いに全ての密度の作用粒子を含有するそれぞれ新規のチャージと部分量の混合物が製造され、かつｃ）この新規のチャージがそれぞれ別の反応液に供給され、第２反応もしくは合成の実施後にｄ１）それぞれさらに最大ｎの新規の部分量へそれぞれの部分チャージの統計的分割が行われるか、またはｄ２）少なくとも１回その密度にしたがって得た部分チャージの分離が行われ、かつ様々な由来のそれぞれの部分量がさらに新規の部分チャージに混加されるかのいずれかであり、かつｅ）ｃ）、ｄ１）またはｄ２）記載のステップが、所望の反応生成物または合成生成物が得られるかまたは部分量あたりそれぞれｎの使用した様々な密度の１個以上の作用粒子が存在するまでの間繰り返され、この作用粒子の反応経路または合成経路が前記方法ステップの各々において記録される、ことにより解決される。
Description
【０００１】
本発明は、特にコンビナトリアルケミストリおよび分子バイオテクノロジーの分野における自動化実験施設で使用される化学的または生物学的反応または合成の実施のための方法および作用粒子に関する。
【０００２】
作用粒子、ビーズが化学合成のための支持物として使用されている。このような粒子（ビーズ）は、たとえばガラスまたはポリスチレンから形成されている。ビーズへの固相合成は、オリゴヌクレオチド化学およびペプチド化学においても、有機分子の合成においても天文学的規模で導入されている。この場合、固相担体がカラムまたはプレートに満たされ、合成プロトコルもしくは使用した合成装置に応じて試薬で清洗され、湿潤洗浄され、化学合成が誘導される。
【０００３】
生化学研究においても、固相担体（たとえば、いわゆるディナル社のディナビーズ）が生化学材料の担体として使用されている。この場合、担体材料が、たとえばストレプタビジンでコートされ、ストレプタビジンを介してビオチニル化ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を前記担体に結合するビオチン結合を可能にする。それによって選択的に、求めている標的を有する小球体の洗浄によって結合実験を実施することが可能になる。
【０００４】
化学合成自体は、球つまり「ｂｅａｄ」に、いわゆる「リンカー」（固相へのカップリング分子）に出発化合物が共有結合され、前記出発化合物が合成プロトコルに準じて試薬で変換され、必要がある場合はリンカーから分裂できるように実施される。カップリング分子は、それぞれの型に応じて、オリゴヌクレオチド化学におけるホスホアミダイト（Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）またはペプチド化学におけるアミノ酸としてよい（メリフィールド合成）。この方法の長所は、試薬の多量の余剰を供出し、ならびに任意に頻繁にカップリング−、洗浄−および脱保護プロセスを反復できる可能性にある。
【０００５】
この長所は、同じ方法で被カップリング分子がリンカーを介して固相に合成される有機化学合成における前記の方法の適用にも導いた。
【０００６】
所望の機能性を有する新規の化合物の探求は、初めに多数の異なる構造を合成するため、ますます非合理的なリード構造の合成法によって支援されている。これは化学的または酵素反応方法の利用下にペプチド、タンパク質、核酸のようなより大きい分子の合成と同様に、化学的または光合成法によるより小さい分子の合成に関係する。いわゆる「適応度」（Ｆｉｔｎｅｓｓ）（１つまたは複数の所望の作用および性質に関して、合成生成物の化学的または生物学的性質の品質）を確定もしくは定量的に測定できる小型化分析方法の可用性によって、このリード構造の合成がミニチュアスケールで可能であり、もちろん定量的な生成物分析を大抵は多量の生成物の後合成によって後で初めて行うことができる。
【０００７】
上記のように、使用した合成法の制限因子は、数量によって限られた多数の多様な分子の調製もしくは合成である。
【０００８】
化学合成は市販のシンセサイザーでカラムまたは平面でピペタイザロボットを介してマイクロタイタープレートで前記のような作用球で実施される。したがって平行化率は本質的に従来常法の９６種サンプルの標準マイクロタイターの度合を超えない。合成分野における今日の実験室自動化は、約１００μｌから数ｍｌまでの体積範囲で数１００サンプル（たとえばＣｈｅｍ Ｓｐｅｅｄ ３８４）の平行化率を達成する（たとえばＤｅＷｉｔｔ， Ａ．Ｗ． Ｃｚａｍｉｋ： Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ １９９５， ６：６４０−６４５参照）。
【０００９】
合成物質はカラムあたりに天文学的量で存在する。しかし機械的に制約された平行性は、近似的にだけでもコンビナトリアルの多様性を達成するには不充分である（たとえば：オリゴヌクレオチド文字：４ｎ、ペプチド文字：２０ｎ、有機ライブラリ（α）ｎ、長さ６のオリゴヌクレオチド鎖は総計約４０００鎖の多様性になる。長さ６のオリゴペプチドはすでに６４００万種の物質を生ずる）。
【００１０】
ＵＨＴＳ（ＵｌｔｒａＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）で導入された開始液は、自動小型化されたスクリーニングシステムの実施に関係する（概要提供：Ｐａｕｗｅｌｓ， Ｈ． Ａｚｉｊｎ， ＭＰ． ｄｅ Ｂ， Ｃ． Ｃｌａｅｙｓ， Ｋ． Ｈｅｒｚｏｇ ”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ １９９５， ６：１１１−１１７またはＺｈａｏ， Ｈ．， Ａｒｎｏｌｄ Ｆ．Ｈ． ”Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” １９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ７Ｓ． ４８０−４８５， Ｂｕｒｂａｕｍ， Ｊ．Ｊ； Ｓｉｇａｌ， Ｎ．Ｍ． ”Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ” （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １：７２−７８）。これらの着手方法は商業的に特にエヴォテック社（ハンブルク）およびオーロラ社（サンディエゴ）によって既知になっている。
【００１１】
従ってテストのためにスクリーニング区間に供給される大きい物質ライブラリに対する需要が急激に増加している。
【００１２】
大きな分子ライブラリを作る別の方法は、いわゆる「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｐｏｏｌ」または「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｍｉｘ」方法によって提案されている（Ｌａｍら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２， Ｇｌａｓｅｒら（１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３９０３−３９１３， Ｌａｍら（１９９３） Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ３：４１９およびＳｅｂｅｓｔｙｅｎら（１９９３） Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ３：４１３参照）。
【００１３】
この方法により、それぞれｎ合成カラムでそれぞれ様々なモノマーがカップリングされる。その後、この混合物が新規の反応室の中に「プール」（「ｇｅｐｏｏｌｅｄ」）され、すなわち混合され、次に再び規定されてそれぞれのカラムに分配され、様々なカップリングステップが実施される。
【００１４】
この方法の長所は、すでに種々のタイプのスペクトルを合成するが、その際に各小球体上で正確に化学的に一義的に特性化される物質を生成することが方法技術的に保証される可能性にある。欠点は、第一にどの物質がどの小球体上に存在するかが不明であることである。この問題は、もちろん結合実験の第１ステップにおいて緊急性がない。まず選別される変異体が特性化されなければならない。
【００１５】
従って、この方法の普遍性を得るために、特性化を間接的にコーディングによって、または直接的にＭＳおよびＭＡＳ−ＮＭＲまたはＩＲ分光学のような分析方法によって実施することが研究されている（Ｗ．Ｌ． Ｆｉｔｃｈ， Ｇ． Ｄｅｔｒｅ， Ｃ．Ｐ． Ｈｏｌｍｅｓ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ５９， ７９５５． Ｂ．Ｊ． Ｅｇｎｅｒ， Ｇ．Ｊ． Ｌａｎｇｌｅｙ， Ｍ． Ｂａｄｌｅｙ， Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９５， ６０， ２６５２）。
【００１６】
大抵のコーディング方法においては合成基質に付加的に、該合成基質のカップリングの前または後のいずれかに、各合成基質に特異的な別の化合物がポリマーにカップリングされる。そのためこの「タグ」（「ｔａｇｓ」）と呼ばれる標識物質は一義的に時間的な合成経過をアーカイブ化する。しかしこのようなコーディング体系は、使用した化学機構と両立性にしなければならないという重大な欠点を有する。すなわち化学者はその合成法において自由ではない。特に解析すなわち化学的タグのデータ解読は高いロジスティック費用を必要とする（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｒ．Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９２， ６０， ５３８１． ／ Ｚ．Ｊ． Ｎｉ， Ｄ． ＭａｃＬｅａｎ， Ｃ．Ｐ． Ｈｏｌｍｅｓｍ Ｍ．Ｍ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｂ． Ｒｕｈｌａｎｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｅ．Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｇａｌｌｏｐ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ３９， １６０１． ／ Ｍ．Ｈ．Ｊ． Ｏｈｌｍｅｙｅｒ， Ｒ．Ｎ． Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｌ．Ｗ． Ｄｉｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｃ． Ｒｅａｄｅｒ， Ｇ． Ａｓｏｕｌｉｎｅ， Ｒ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ． Ｗｉｇｌｅｒ， Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９３， ９０， １０９２２． ｂ） Ｈ．Ｐ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｐ．Ａ． Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ５９， ４７２３参照）。
【００１７】
つまり常法によるコンビナトリアルの「分裂および混合」（「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｍｉｘ」）法は、コンビナトリアルの多様性の問題を解決する最速の可能性である。もちろんこの「化学的タッギング」（「ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔａｇｇｉｎｇ」）の方法も合成との関連で多額のロジスティック費用によって制限されている。
【００１８】
この問題を解決するために、巨視的レベルで、いわゆる「ＩＲＯＲＩ ｒａｄｉｏ ｔａｇ」法により物理的一歩が踏み出されている：この場合はポリスチレン球で充填されるマイクロリアクタ内で、付加的にガラスの中に流し込まれた、いわゆる「ラジオ周波数タグ」（ＲＦ−タグと略す）が取り込まれる。このＲＦ−タグは本質的にアンテナと送信機もしくは受信機とから構成される。各化学合成ステップおよび対応する反応器とＲＦ−タグからなるユニットは一義的にコード番号によって特徴づけられる。この対応する番号は、書込みも読出しもできる。それによってこのプロセスが完全に記述される。ＲＦ−タグ法の欠点は、比較的高い費用と、この方法を多額の費用をかけずに小型化する可能性が不足していることである。
【００１９】
さらに小型化された方法が既知である。位置特異的光誘導カップリング反応による、いわゆるＡＦＦＹＭＡＸ技術（Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｆｏｄｏｒら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３）により、特異的結合を一義的にその各々のｘ／ｙ位置から同定することができる。しかしこの方法は、種々の理由からその適用幅に制限がある。この方法は、たとえば光活性可能のカップリング反応に制限され、全ての反応位置がそれぞれ使用した全ての試薬と接触するため、各反応時に広範囲な中間−および洗浄ステップを必要とする。さらに、連続的な反応の実施が反応ステップあたりの様々な試薬の使用において欠点とみなされなければならない。
【００２０】
Ｒ． Ｆｒａｎｋ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｖｏｌ． ４８， ４２， ９２１７−９２３２に１つの方法が記載されており、この方法にしたがってセルロース−フィルタ上にスポット法で固相カップリング・ペプチドのライブラリを平行管理合成で作成し、それに続きこのライブラリを作用試験、たとえば抗体への結合にかけることが可能である。比較しうる方法はＦｏｄｏｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１， ２５１， ７６７−７７３）およびＧｅｙｓｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， １９８４， ８１， ３９９８−４００２）に記載された。その他の方法は概要（ＦｉｅｌｄｓらＩｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １９９０， ３５， １６１−２１４）で検討された。カップリング化学は、変形方式を度外視すれば、全ての方法で原理的に比較可能であり、溶剤、保護基化学および活性化に関して伝統的な方法に拠っている。比較しうる方法はオリゴヌクレオチド合成のために開発された。
【００２１】
この場合の収率は当然少なく、巨視的特性化はもはや達し得ない。
【００２２】
要約すれば、既知の先行技術に関して、平行合成が該当する反応容器（または小型化平面方法におけるスポット）の調整を利用してそれぞれ発生した生成物を同定することであると言える。それに対してコンビナトリアル合成の場合は、ＩＲＯＲＩ ｒａｄｉｏ ｔａｇ法の場合と同様に一義的に同定可能の物理的コーディングが存在することを除き、後からの生成物同一性の同定が必要である。この既知の方法は上記の欠点が付着している。
【００２３】
本発明は、ミクロスケールとマクロスケールとの間の完全な両立性を保証し、その際に大きな多様性でカップリング反応を実施することができ、低費用で個々の作用粒子に反応−または合成生成物の一義的な割当てを保証した化学的または生物学的な反応または合成の実施のための方法およびそれに好適な作用粒子を提供する課題を基礎においている。
【００２４】
この課題は特許請求の範囲第１項および第４項の表示特徴によって解決される。
【００２５】
本発明は、以下、実施例を利用してより詳細に説明する。
【００２６】
図１記載の第１実施例において、例としてｎ合成反応容器（たとえばカラム）およびｎコーディング粒子チャージが存在することとする。ｎ粒子チャージは、該粒子チャージが互いに異なる密度ρ１．．．ｎを有し、この密度がコードを表すことによって互いに区別されている。それによって、任意の物質種類≦ｎを以下のように合成することができる：
【００２７】
ｎ反応容器の各々は、たとえばそれぞれ様々な化学反応液でプールから被組み合わせ基質に給送（図１参照）されるものとする。その後、各カラム中に可能性に応じて同数の作用球が取り込まれ、各カラムが同じ密度の作用球に割当てられ、個々のカラムに供給される作用球の密度が互いに区別される。
【００２８】
この第１カップリングステップは、１型の作用粒子が反応容器１に、ｉ型の作用粒子が反応容器ｉに、またはｎ型の作用粒子が反応容器ｎに、それぞれ所定量の割当によって実施される。合成カップリング（種々の溶剤、プロトコルなど）が成就される。その後、作用球が反応容器から抽出され、それぞれのチャージを引き続き実施する反応の数に対応して、たとえばｎの同じ部分に分割され、かつチャージあたりｎの様々な密度を有する粒子からなる混合物が存在するように、すなわちたとえば第ｉカラムに部に応じた全てのｎコード粒子と共にｎ種の物質のチャージがあるように新規のチャージに配合（混合）される。つまり次の合成ステップでカラムｉ中で（１．．．ｉ．．．ｎ）からなる全ての組み合わせが作られる。このライブラリは、ここでそれぞれその個々の成分に沈降法によりまたは遠心分離により分離することができる。この場合に重要であるのは、各ステップへの割当が得られ、もしくは各カラムへの割当が得られることだけである：つまり（（１，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ）．．．（ｎ，ｉ））がそれぞれ容器中に満たされ、番号付けもしくは割当が別々に記録される。
【００２９】
ここでそれに続くステップで、第１位置において相互に一致しない全ての画分が組み合わされる。つまり出発画分の一部がｉで組み合わされる：（（１，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ）；．．．（ｎ，ｉ））・ｉ＝（（１，ｉ，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ，ｉ）；．．．（ｎ，ｉ，ｉ））；画分たとえば第１カラムの部分が同様にｉで組み合わされる：（（１，１）；（ｉ，１）；（ｎ，１））・ｉ＝（（１，１，ｉ）；（ｉ，１，ｉ）；（ｎ，１，ｉ））など。
【００３０】
つまりこの方法により全ての可能な物質組み合わせを製造することができるが、個々のステップ間で同じ密度と類似の由来の粒子を組み合わせないことに多少配慮されなければならない。
【００３１】
実施した合成ステップと新規のチャージ配合後の粒子密度による分離の上記方式は、所望の反応鎖長が達成されるまでの間、もしくは配合されたチャージあたりにそれぞれまだただ１つの粒子が所定の様々な密度あたりに存在するまで実施可能の間で実施される。それぞれ所望の合成と前置した反応液の数とに応じて、配合したチャージの分離は、以下の実施例が具体的に示すように、必ずしも各合成ステップ後に行う必要がない。
【００３２】
この第２実施例において、ペプチドライブラリの簡単な事例（紹介した方法は決してペプチドまたはその他のオリゴマーに限定されていない）と、簡略にするために３画分とを説明することにする。
【００３３】
図２に示したように、それぞれ様々な密度ρ１、ρ２、ρ３の粒子で給送される３カラムを設けている。第１カラム中で、たとえばアラニンＡを、第２カラム中でグリシンＧを、第３カラム中でプロリンＰをそれぞれポリマー小球に結合させることにする。ポリマー小球の抽出後（ステップ１）、それぞれ様々な密度の全ての３出発チャージのポリマー小球を含有する各々３つの別のチャージに、各チャージおよび混合の３分割が行われる（ステップ２）。これらのチャージは、たとえばそれぞれ再びカラム１ないし３に供給され、その結果第１カラム中で合成Ａ，Ａ；Ｇ，ＡおよびＰ，Ａと、第２カラム中で合成Ａ，Ｇ；Ｇ，ＧおよびＰ，Ｇと、第３カラム中で合成Ａ，Ｐ；Ｇ，ＰおよびＰ，Ｐとが行われる；この方法結果は図式的に図２にステップ３で示している。たとえば、このように得た３チャージが統計的に、すなわちポリマー小球の様々な密度による分離が行われることなく、それぞれ３部に分割され、それぞれ１部が再びそれぞれカラム１から３に供給される。このように得た全ての可能な物質組み合わせによる合成多様性は、図２のステップ４に示している。この多様性は例における所望の鎖長に相当するため、最後の合成ステップ後に初めてポリマー小球の密度にしたがって分離を行った。個々の合成ステップが記録されるため、粒子とそれに合成される鎖の正確な割当が簡単な方法で可能である。
【００３４】
密度コーディングによる合成物質の分離は、最高精度で実施することができる。超遠心分離は、たとえばさらに同位元素１５Ｎによる１４Ｎの自然の位置でのみ区別される２種類のＤＮＡ鎖を分離することができる。相補性λファージＤＮＡ鎖の分離が同様に可能である；１．７４３および１．７３０ｇ／ｃｍ３。それに対して、それより大きい粒子の場合は、すでに単純な沈降法で充分である。それぞれ使用した分離法と実施する合成ステップの数とに応じて、本発明の枠内では単に、個々のポリマー小球の密度差が合成鎖による充填でもまだ密度差にしたがって正確な分離が可能であるような大きさであることにのみ配慮している。たとえば１００μｍポリスチレン球の充填は、約１００ｐＭｏｌ合成物質に相当する。たとえば直径１００μｍおよび密度１ｇ／ｃｍ３もしくは１．１ｇ／ｃｍ３（これは重量約５．２もしくは５．７２・１０−７ｇに相当する）と、平均分子量約１１０を有する充填１００ｐＭｏｌ（これは重量約１０−８ｇに相当する）とを有する２つのポリスチレン／コンポジット球を取り上げると、約２％の密度変化が生じる。密度は全ての球種で平均的に変化し、主成分は不変の状態にとどまるので、この方法は幅広く適用可能である。
【００３５】
先行技術による前記解決策に対する本発明の主な長所は、必要な合成ステップの数が使用した密度画分の数に低減され、合成ステップの終了時に個々の作用小球への合成鎖の正確な割当が与えられていることにある。
【００３６】
提案した方法において使用した作用小球のために、たとえば懸濁重合法によって得たＳｉＯ２粒子が好適である。たとえばこの場合、５から２０μｍの範囲の直径を有するＳｉＯ２粒子１５ｇをメタクリルオリルオキシプロピル−トリメトキシシラン（トルエン３０ｍｌ溶液中０．５ｍｌ）で９０分間水分排除下に４０℃で変換する。その後この粒子を回転蒸発器中で真空下に室温で乾燥する。撹拌機と還流冷却器とを含む１リットル反応器中にポリビニルピロリドンＫ９０ ２ｇ溶液６５０ｍｌと、ＣａＳＯ４６５０ｍｇと、リン酸カリウム１００ｍｇとを前置する。７８℃で、前処理した二酸化珪素１５ｇを懸濁し、スチレン３０ｍｌ、ジビニルベンゼン０．６ｍｌおよび過酸化ジベンゾイルペルオキシド４００ｍｇからなる混合物中に添加し、回転数５００ｒｐｍで懸濁する。６時間後の重合反応の終了後、コンポジット粒子を吸引し、洗浄し、ふるい分けによって分級する。この方法により１００μｍから８００μｍの範囲の直径と、１．００から１．５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度とを有する粒子４３ｇを得、前記粒子からふるい分けと密度分離後に本方法に必要な、様々な密度のチャージを分別可能である。この粒子は、必要がある場合および先行技術により常法の、第１の化学的または生物学的成分の一時的不動化のためのアンカー基を付けることができる。
【００３７】
バイオ解析適用のために、以下のように得る粒子も使用可能である：トルエン中のポリスチレンの溶融物および二酸化珪素の懸濁液（粒径５から１０μｍ）をグラジエント混合室内で混合し、連続的に冷却受け器中にメタノールを滴下する。この方法により、直径１５０μｍおよび１ｇ／ｃｍ３から２．０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度分布を有する粒子を得る。
【００３８】
この粒子は多数の有機溶剤中に溶解するが、水に不溶性である。たとえばタンパク質を前記粒子上に不動化し、水性溶媒中のアッセイのために使用することができる。
【００３９】
同様に、他の好適な作用粒子、また前記のような様々な組成または性状を、これらが使用する反応液に対して不活性である限りにおいて、個々の粒子チャージの様々な密度の基準が満たされている場合に使用することも本発明の枠内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｎ合成反応容器およびｎ作用粒子のための方法による経過の一部である。
【図２】
ペプチドライブラリの形成のための例示としての特異的方法経過である。
本発明は、特にコンビナトリアルケミストリおよび分子バイオテクノロジーの分野における自動化実験施設で使用される化学的または生物学的反応または合成の実施のための方法および作用粒子に関する。
【０００２】
作用粒子、ビーズが化学合成のための支持物として使用されている。このような粒子（ビーズ）は、たとえばガラスまたはポリスチレンから形成されている。ビーズへの固相合成は、オリゴヌクレオチド化学およびペプチド化学においても、有機分子の合成においても天文学的規模で導入されている。この場合、固相担体がカラムまたはプレートに満たされ、合成プロトコルもしくは使用した合成装置に応じて試薬で清洗され、湿潤洗浄され、化学合成が誘導される。
【０００３】
生化学研究においても、固相担体（たとえば、いわゆるディナル社のディナビーズ）が生化学材料の担体として使用されている。この場合、担体材料が、たとえばストレプタビジンでコートされ、ストレプタビジンを介してビオチニル化ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を前記担体に結合するビオチン結合を可能にする。それによって選択的に、求めている標的を有する小球体の洗浄によって結合実験を実施することが可能になる。
【０００４】
化学合成自体は、球つまり「ｂｅａｄ」に、いわゆる「リンカー」（固相へのカップリング分子）に出発化合物が共有結合され、前記出発化合物が合成プロトコルに準じて試薬で変換され、必要がある場合はリンカーから分裂できるように実施される。カップリング分子は、それぞれの型に応じて、オリゴヌクレオチド化学におけるホスホアミダイト（Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）またはペプチド化学におけるアミノ酸としてよい（メリフィールド合成）。この方法の長所は、試薬の多量の余剰を供出し、ならびに任意に頻繁にカップリング−、洗浄−および脱保護プロセスを反復できる可能性にある。
【０００５】
この長所は、同じ方法で被カップリング分子がリンカーを介して固相に合成される有機化学合成における前記の方法の適用にも導いた。
【０００６】
所望の機能性を有する新規の化合物の探求は、初めに多数の異なる構造を合成するため、ますます非合理的なリード構造の合成法によって支援されている。これは化学的または酵素反応方法の利用下にペプチド、タンパク質、核酸のようなより大きい分子の合成と同様に、化学的または光合成法によるより小さい分子の合成に関係する。いわゆる「適応度」（Ｆｉｔｎｅｓｓ）（１つまたは複数の所望の作用および性質に関して、合成生成物の化学的または生物学的性質の品質）を確定もしくは定量的に測定できる小型化分析方法の可用性によって、このリード構造の合成がミニチュアスケールで可能であり、もちろん定量的な生成物分析を大抵は多量の生成物の後合成によって後で初めて行うことができる。
【０００７】
上記のように、使用した合成法の制限因子は、数量によって限られた多数の多様な分子の調製もしくは合成である。
【０００８】
化学合成は市販のシンセサイザーでカラムまたは平面でピペタイザロボットを介してマイクロタイタープレートで前記のような作用球で実施される。したがって平行化率は本質的に従来常法の９６種サンプルの標準マイクロタイターの度合を超えない。合成分野における今日の実験室自動化は、約１００μｌから数ｍｌまでの体積範囲で数１００サンプル（たとえばＣｈｅｍ Ｓｐｅｅｄ ３８４）の平行化率を達成する（たとえばＤｅＷｉｔｔ， Ａ．Ｗ． Ｃｚａｍｉｋ： Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ １９９５， ６：６４０−６４５参照）。
【０００９】
合成物質はカラムあたりに天文学的量で存在する。しかし機械的に制約された平行性は、近似的にだけでもコンビナトリアルの多様性を達成するには不充分である（たとえば：オリゴヌクレオチド文字：４ｎ、ペプチド文字：２０ｎ、有機ライブラリ（α）ｎ、長さ６のオリゴヌクレオチド鎖は総計約４０００鎖の多様性になる。長さ６のオリゴペプチドはすでに６４００万種の物質を生ずる）。
【００１０】
ＵＨＴＳ（ＵｌｔｒａＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）で導入された開始液は、自動小型化されたスクリーニングシステムの実施に関係する（概要提供：Ｐａｕｗｅｌｓ， Ｈ． Ａｚｉｊｎ， ＭＰ． ｄｅ Ｂ， Ｃ． Ｃｌａｅｙｓ， Ｋ． Ｈｅｒｚｏｇ ”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ １９９５， ６：１１１−１１７またはＺｈａｏ， Ｈ．， Ａｒｎｏｌｄ Ｆ．Ｈ． ”Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” １９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ７Ｓ． ４８０−４８５， Ｂｕｒｂａｕｍ， Ｊ．Ｊ； Ｓｉｇａｌ， Ｎ．Ｍ． ”Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ” （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １：７２−７８）。これらの着手方法は商業的に特にエヴォテック社（ハンブルク）およびオーロラ社（サンディエゴ）によって既知になっている。
【００１１】
従ってテストのためにスクリーニング区間に供給される大きい物質ライブラリに対する需要が急激に増加している。
【００１２】
大きな分子ライブラリを作る別の方法は、いわゆる「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｐｏｏｌ」または「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｍｉｘ」方法によって提案されている（Ｌａｍら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２， Ｇｌａｓｅｒら（１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３９０３−３９１３， Ｌａｍら（１９９３） Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ３：４１９およびＳｅｂｅｓｔｙｅｎら（１９９３） Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ． ３：４１３参照）。
【００１３】
この方法により、それぞれｎ合成カラムでそれぞれ様々なモノマーがカップリングされる。その後、この混合物が新規の反応室の中に「プール」（「ｇｅｐｏｏｌｅｄ」）され、すなわち混合され、次に再び規定されてそれぞれのカラムに分配され、様々なカップリングステップが実施される。
【００１４】
この方法の長所は、すでに種々のタイプのスペクトルを合成するが、その際に各小球体上で正確に化学的に一義的に特性化される物質を生成することが方法技術的に保証される可能性にある。欠点は、第一にどの物質がどの小球体上に存在するかが不明であることである。この問題は、もちろん結合実験の第１ステップにおいて緊急性がない。まず選別される変異体が特性化されなければならない。
【００１５】
従って、この方法の普遍性を得るために、特性化を間接的にコーディングによって、または直接的にＭＳおよびＭＡＳ−ＮＭＲまたはＩＲ分光学のような分析方法によって実施することが研究されている（Ｗ．Ｌ． Ｆｉｔｃｈ， Ｇ． Ｄｅｔｒｅ， Ｃ．Ｐ． Ｈｏｌｍｅｓ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ５９， ７９５５． Ｂ．Ｊ． Ｅｇｎｅｒ， Ｇ．Ｊ． Ｌａｎｇｌｅｙ， Ｍ． Ｂａｄｌｅｙ， Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９５， ６０， ２６５２）。
【００１６】
大抵のコーディング方法においては合成基質に付加的に、該合成基質のカップリングの前または後のいずれかに、各合成基質に特異的な別の化合物がポリマーにカップリングされる。そのためこの「タグ」（「ｔａｇｓ」）と呼ばれる標識物質は一義的に時間的な合成経過をアーカイブ化する。しかしこのようなコーディング体系は、使用した化学機構と両立性にしなければならないという重大な欠点を有する。すなわち化学者はその合成法において自由ではない。特に解析すなわち化学的タグのデータ解読は高いロジスティック費用を必要とする（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｒ．Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９２， ６０， ５３８１． ／ Ｚ．Ｊ． Ｎｉ， Ｄ． ＭａｃＬｅａｎ， Ｃ．Ｐ． Ｈｏｌｍｅｓｍ Ｍ．Ｍ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｂ． Ｒｕｈｌａｎｄ， Ｊ．Ｗ． Ｊａｃｏｂｓ， Ｅ．Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｍ．Ａ． Ｇａｌｌｏｐ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９６， ３９， １６０１． ／ Ｍ．Ｈ．Ｊ． Ｏｈｌｍｅｙｅｒ， Ｒ．Ｎ． Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｌ．Ｗ． Ｄｉｌｌａｒｄ， Ｊ．Ｃ． Ｒｅａｄｅｒ， Ｇ． Ａｓｏｕｌｉｎｅ， Ｒ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ． Ｗｉｇｌｅｒ， Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９９３， ９０， １０９２２． ｂ） Ｈ．Ｐ． Ｎｅｓｔｌｅｒ， Ｐ．Ａ． Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９４， ５９， ４７２３参照）。
【００１７】
つまり常法によるコンビナトリアルの「分裂および混合」（「Ｓｐｌｉｔ ａｎｄ Ｍｉｘ」）法は、コンビナトリアルの多様性の問題を解決する最速の可能性である。もちろんこの「化学的タッギング」（「ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔａｇｇｉｎｇ」）の方法も合成との関連で多額のロジスティック費用によって制限されている。
【００１８】
この問題を解決するために、巨視的レベルで、いわゆる「ＩＲＯＲＩ ｒａｄｉｏ ｔａｇ」法により物理的一歩が踏み出されている：この場合はポリスチレン球で充填されるマイクロリアクタ内で、付加的にガラスの中に流し込まれた、いわゆる「ラジオ周波数タグ」（ＲＦ−タグと略す）が取り込まれる。このＲＦ−タグは本質的にアンテナと送信機もしくは受信機とから構成される。各化学合成ステップおよび対応する反応器とＲＦ−タグからなるユニットは一義的にコード番号によって特徴づけられる。この対応する番号は、書込みも読出しもできる。それによってこのプロセスが完全に記述される。ＲＦ−タグ法の欠点は、比較的高い費用と、この方法を多額の費用をかけずに小型化する可能性が不足していることである。
【００１９】
さらに小型化された方法が既知である。位置特異的光誘導カップリング反応による、いわゆるＡＦＦＹＭＡＸ技術（Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｆｏｄｏｒら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３）により、特異的結合を一義的にその各々のｘ／ｙ位置から同定することができる。しかしこの方法は、種々の理由からその適用幅に制限がある。この方法は、たとえば光活性可能のカップリング反応に制限され、全ての反応位置がそれぞれ使用した全ての試薬と接触するため、各反応時に広範囲な中間−および洗浄ステップを必要とする。さらに、連続的な反応の実施が反応ステップあたりの様々な試薬の使用において欠点とみなされなければならない。
【００２０】
Ｒ． Ｆｒａｎｋ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｖｏｌ． ４８， ４２， ９２１７−９２３２に１つの方法が記載されており、この方法にしたがってセルロース−フィルタ上にスポット法で固相カップリング・ペプチドのライブラリを平行管理合成で作成し、それに続きこのライブラリを作用試験、たとえば抗体への結合にかけることが可能である。比較しうる方法はＦｏｄｏｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１， ２５１， ７６７−７７３）およびＧｅｙｓｅｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， １９８４， ８１， ３９９８−４００２）に記載された。その他の方法は概要（ＦｉｅｌｄｓらＩｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． １９９０， ３５， １６１−２１４）で検討された。カップリング化学は、変形方式を度外視すれば、全ての方法で原理的に比較可能であり、溶剤、保護基化学および活性化に関して伝統的な方法に拠っている。比較しうる方法はオリゴヌクレオチド合成のために開発された。
【００２１】
この場合の収率は当然少なく、巨視的特性化はもはや達し得ない。
【００２２】
要約すれば、既知の先行技術に関して、平行合成が該当する反応容器（または小型化平面方法におけるスポット）の調整を利用してそれぞれ発生した生成物を同定することであると言える。それに対してコンビナトリアル合成の場合は、ＩＲＯＲＩ ｒａｄｉｏ ｔａｇ法の場合と同様に一義的に同定可能の物理的コーディングが存在することを除き、後からの生成物同一性の同定が必要である。この既知の方法は上記の欠点が付着している。
【００２３】
本発明は、ミクロスケールとマクロスケールとの間の完全な両立性を保証し、その際に大きな多様性でカップリング反応を実施することができ、低費用で個々の作用粒子に反応−または合成生成物の一義的な割当てを保証した化学的または生物学的な反応または合成の実施のための方法およびそれに好適な作用粒子を提供する課題を基礎においている。
【００２４】
この課題は特許請求の範囲第１項および第４項の表示特徴によって解決される。
【００２５】
本発明は、以下、実施例を利用してより詳細に説明する。
【００２６】
図１記載の第１実施例において、例としてｎ合成反応容器（たとえばカラム）およびｎコーディング粒子チャージが存在することとする。ｎ粒子チャージは、該粒子チャージが互いに異なる密度ρ１．．．ｎを有し、この密度がコードを表すことによって互いに区別されている。それによって、任意の物質種類≦ｎを以下のように合成することができる：
【００２７】
ｎ反応容器の各々は、たとえばそれぞれ様々な化学反応液でプールから被組み合わせ基質に給送（図１参照）されるものとする。その後、各カラム中に可能性に応じて同数の作用球が取り込まれ、各カラムが同じ密度の作用球に割当てられ、個々のカラムに供給される作用球の密度が互いに区別される。
【００２８】
この第１カップリングステップは、１型の作用粒子が反応容器１に、ｉ型の作用粒子が反応容器ｉに、またはｎ型の作用粒子が反応容器ｎに、それぞれ所定量の割当によって実施される。合成カップリング（種々の溶剤、プロトコルなど）が成就される。その後、作用球が反応容器から抽出され、それぞれのチャージを引き続き実施する反応の数に対応して、たとえばｎの同じ部分に分割され、かつチャージあたりｎの様々な密度を有する粒子からなる混合物が存在するように、すなわちたとえば第ｉカラムに部に応じた全てのｎコード粒子と共にｎ種の物質のチャージがあるように新規のチャージに配合（混合）される。つまり次の合成ステップでカラムｉ中で（１．．．ｉ．．．ｎ）からなる全ての組み合わせが作られる。このライブラリは、ここでそれぞれその個々の成分に沈降法によりまたは遠心分離により分離することができる。この場合に重要であるのは、各ステップへの割当が得られ、もしくは各カラムへの割当が得られることだけである：つまり（（１，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ）．．．（ｎ，ｉ））がそれぞれ容器中に満たされ、番号付けもしくは割当が別々に記録される。
【００２９】
ここでそれに続くステップで、第１位置において相互に一致しない全ての画分が組み合わされる。つまり出発画分の一部がｉで組み合わされる：（（１，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ）；．．．（ｎ，ｉ））・ｉ＝（（１，ｉ，ｉ）；．．．（ｉ，ｉ，ｉ）；．．．（ｎ，ｉ，ｉ））；画分たとえば第１カラムの部分が同様にｉで組み合わされる：（（１，１）；（ｉ，１）；（ｎ，１））・ｉ＝（（１，１，ｉ）；（ｉ，１，ｉ）；（ｎ，１，ｉ））など。
【００３０】
つまりこの方法により全ての可能な物質組み合わせを製造することができるが、個々のステップ間で同じ密度と類似の由来の粒子を組み合わせないことに多少配慮されなければならない。
【００３１】
実施した合成ステップと新規のチャージ配合後の粒子密度による分離の上記方式は、所望の反応鎖長が達成されるまでの間、もしくは配合されたチャージあたりにそれぞれまだただ１つの粒子が所定の様々な密度あたりに存在するまで実施可能の間で実施される。それぞれ所望の合成と前置した反応液の数とに応じて、配合したチャージの分離は、以下の実施例が具体的に示すように、必ずしも各合成ステップ後に行う必要がない。
【００３２】
この第２実施例において、ペプチドライブラリの簡単な事例（紹介した方法は決してペプチドまたはその他のオリゴマーに限定されていない）と、簡略にするために３画分とを説明することにする。
【００３３】
図２に示したように、それぞれ様々な密度ρ１、ρ２、ρ３の粒子で給送される３カラムを設けている。第１カラム中で、たとえばアラニンＡを、第２カラム中でグリシンＧを、第３カラム中でプロリンＰをそれぞれポリマー小球に結合させることにする。ポリマー小球の抽出後（ステップ１）、それぞれ様々な密度の全ての３出発チャージのポリマー小球を含有する各々３つの別のチャージに、各チャージおよび混合の３分割が行われる（ステップ２）。これらのチャージは、たとえばそれぞれ再びカラム１ないし３に供給され、その結果第１カラム中で合成Ａ，Ａ；Ｇ，ＡおよびＰ，Ａと、第２カラム中で合成Ａ，Ｇ；Ｇ，ＧおよびＰ，Ｇと、第３カラム中で合成Ａ，Ｐ；Ｇ，ＰおよびＰ，Ｐとが行われる；この方法結果は図式的に図２にステップ３で示している。たとえば、このように得た３チャージが統計的に、すなわちポリマー小球の様々な密度による分離が行われることなく、それぞれ３部に分割され、それぞれ１部が再びそれぞれカラム１から３に供給される。このように得た全ての可能な物質組み合わせによる合成多様性は、図２のステップ４に示している。この多様性は例における所望の鎖長に相当するため、最後の合成ステップ後に初めてポリマー小球の密度にしたがって分離を行った。個々の合成ステップが記録されるため、粒子とそれに合成される鎖の正確な割当が簡単な方法で可能である。
【００３４】
密度コーディングによる合成物質の分離は、最高精度で実施することができる。超遠心分離は、たとえばさらに同位元素１５Ｎによる１４Ｎの自然の位置でのみ区別される２種類のＤＮＡ鎖を分離することができる。相補性λファージＤＮＡ鎖の分離が同様に可能である；１．７４３および１．７３０ｇ／ｃｍ３。それに対して、それより大きい粒子の場合は、すでに単純な沈降法で充分である。それぞれ使用した分離法と実施する合成ステップの数とに応じて、本発明の枠内では単に、個々のポリマー小球の密度差が合成鎖による充填でもまだ密度差にしたがって正確な分離が可能であるような大きさであることにのみ配慮している。たとえば１００μｍポリスチレン球の充填は、約１００ｐＭｏｌ合成物質に相当する。たとえば直径１００μｍおよび密度１ｇ／ｃｍ３もしくは１．１ｇ／ｃｍ３（これは重量約５．２もしくは５．７２・１０−７ｇに相当する）と、平均分子量約１１０を有する充填１００ｐＭｏｌ（これは重量約１０−８ｇに相当する）とを有する２つのポリスチレン／コンポジット球を取り上げると、約２％の密度変化が生じる。密度は全ての球種で平均的に変化し、主成分は不変の状態にとどまるので、この方法は幅広く適用可能である。
【００３５】
先行技術による前記解決策に対する本発明の主な長所は、必要な合成ステップの数が使用した密度画分の数に低減され、合成ステップの終了時に個々の作用小球への合成鎖の正確な割当が与えられていることにある。
【００３６】
提案した方法において使用した作用小球のために、たとえば懸濁重合法によって得たＳｉＯ２粒子が好適である。たとえばこの場合、５から２０μｍの範囲の直径を有するＳｉＯ２粒子１５ｇをメタクリルオリルオキシプロピル−トリメトキシシラン（トルエン３０ｍｌ溶液中０．５ｍｌ）で９０分間水分排除下に４０℃で変換する。その後この粒子を回転蒸発器中で真空下に室温で乾燥する。撹拌機と還流冷却器とを含む１リットル反応器中にポリビニルピロリドンＫ９０ ２ｇ溶液６５０ｍｌと、ＣａＳＯ４６５０ｍｇと、リン酸カリウム１００ｍｇとを前置する。７８℃で、前処理した二酸化珪素１５ｇを懸濁し、スチレン３０ｍｌ、ジビニルベンゼン０．６ｍｌおよび過酸化ジベンゾイルペルオキシド４００ｍｇからなる混合物中に添加し、回転数５００ｒｐｍで懸濁する。６時間後の重合反応の終了後、コンポジット粒子を吸引し、洗浄し、ふるい分けによって分級する。この方法により１００μｍから８００μｍの範囲の直径と、１．００から１．５ｇ／ｃｍ３の範囲の密度とを有する粒子４３ｇを得、前記粒子からふるい分けと密度分離後に本方法に必要な、様々な密度のチャージを分別可能である。この粒子は、必要がある場合および先行技術により常法の、第１の化学的または生物学的成分の一時的不動化のためのアンカー基を付けることができる。
【００３７】
バイオ解析適用のために、以下のように得る粒子も使用可能である：トルエン中のポリスチレンの溶融物および二酸化珪素の懸濁液（粒径５から１０μｍ）をグラジエント混合室内で混合し、連続的に冷却受け器中にメタノールを滴下する。この方法により、直径１５０μｍおよび１ｇ／ｃｍ３から２．０ｇ／ｃｍ３の範囲の密度分布を有する粒子を得る。
【００３８】
この粒子は多数の有機溶剤中に溶解するが、水に不溶性である。たとえばタンパク質を前記粒子上に不動化し、水性溶媒中のアッセイのために使用することができる。
【００３９】
同様に、他の好適な作用粒子、また前記のような様々な組成または性状を、これらが使用する反応液に対して不活性である限りにおいて、個々の粒子チャージの様々な密度の基準が満たされている場合に使用することも本発明の枠内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｎ合成反応容器およびｎ作用粒子のための方法による経過の一部である。
【図２】
ペプチドライブラリの形成のための例示としての特異的方法経過である。
Claims (4)
- 化学的または生物学的反応または合成の実施のための方法であって、化学成分の結合または固相合成を可能にする多数の作用粒子が使用される方法において、
ｎ反応液の使用時に作用粒子のｘチャージが考慮され（ｘ≦ｎである）、前記反応液の密度が完全な反応生成物または合成生成物による充填時でも前記反応液の密度にしたがって分離できるように前記密度が互いに区別して決定されるものにおいて、
ａ）初めに第１反応パートナーの結合後、第１反応液の均一の密度の各チャージが供給され、
ｂ）ｘチャージの各々が最大ｎ部分量に分割され、互いに全ての密度の作用粒子を含有するそれぞれ新規のチャージと部分量の混合物が製造され、
ｃ）この新規のチャージがそれぞれ別の反応液に供給され、第２反応もしくは合成の実施後に
ｄ１）それぞれさらに最大ｎの新規の部分量へそれぞれの部分チャージの統計的分割が行われるか、
ｄ２）少なくとも１回その密度にしたがって得た部分チャージの分離が行われ、かつ様々な由来のそれぞれの部分量がさらに新規の部分チャージに混加されるかのいずれかであり、
ｅ）ｃ）、ｄ１）またはｄ２）記載のステップが、所望の反応生成物または合成生成物が得られるかまたは部分量あたりそれぞれｎの使用した様々な密度の１個以上の作用粒子が存在するまでの間繰り返され、この作用粒子の反応経路または合成経路が前記方法ステップの各々において記録される、ことを特徴とする方法。 - 複数の反応の実施時に様々な密度の作用粒子の得た部分チャージが何度もその密度にしたがって分別され、このように得た部分量が新規の部分チャージに配合されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- ｘ反応の実施時に得た様々な密度の作用粒子の部分チャージが各反応後にその密度にしたがって分別され、このように得た部分量が新規の部分チャージに配合されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 上記請求項のいずれか１項記載の化学的または生物学的反応または合成の実施のための作用粒子であって、
ｎの供出可能の反応液の数に依存してそれぞれ多数の作用粒子のｘチャージが考慮され（ｘ≦ｎである）、作用粒子が完全な反応生成物または合成生成物による充填時でもその密度にしたがって好適な分別方法を利用して分離可能であるような大きさに、互いに個々のチャージの密度が区別して決定されたことを特徴とする作用粒子。
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