JP2000510113A - Treatment of asthma with TNFR-Ig - Google Patents

Treatment of asthma with TNFR-Ig

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ｐ５５ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分およびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３の重鎖定常領域の第一ドメイン以外のすべてのドメインで構成されるキメラＴＮＦ−α結合タンパク質の有効な量を含む組成物で喘息に対抗する方法および喘息処置用の医薬の製造のためのこのようなキメラＴＮＦ−α結合タンパク質の使用に向けられている。   (57) [Summary] The present invention provides a composition comprising an effective amount of a chimeric TNF-α binding protein comprising a soluble portion of the p55TNF receptor protein and all but the first domain of the heavy chain constant region of human IgG1 or IgG3. A method of opposition and the use of such a chimeric TNF-α binding protein for the manufacture of a medicament for the treatment of asthma.

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＮＦＲ−Ｉｇによる喘息の治療 喘息とは、特定のアレルゲン（ＩｇＥ媒介性反応）、運動、冷気またはストレ スへの曝露による再発性の増悪を特徴とする、気道の炎症性疾患である。喘息病 に関連する炎症の特徴は、活性化された好酸球の存在、非特異的な刺激に対する 気道の感受性の増大（気道過敏性：ＡＨＲ）、浮腫、粘液の過分泌および咳であ る。この炎症過程は、様々なサイトカインを分泌するＴｈ−２型リンパ球の生成 および活性化により一部媒介されていると考えられている。サイトカインＴＮＦ αは、喘息症状の発生に関与しているサイトカインである。 喘息の治療には多数の治療薬が使用されており、吸入β2アゴニスト（急性の 気管支痙輩の軽減）およびステロイド（抗炎症）がよく選択される薬となってい る。しかし、この疾患による死亡率は増加しており、いずれの療法も十分なもの とは言えない。医療において最も緊急に必要とされている未解決問題の一つが、 急性／重症喘息において見られるような重症の進行中の肺内炎症を迅速に改善す ることができる薬剤である。さらに、疾患緩和薬として分類できる治療薬は全く 存在してしない。急性／重症喘息において見られる炎症反応を迅速に改善するこ とができる薬剤、および真の疾患緩和薬である薬剤が、確かに必要とされている 。ＴＮＦαの作用は、喘息症状を促進する。本出願人らは、ＴＮＦαの作用を阻 害することにより、これらの状態を軽減するための手段が提供されることを決定 した。 本出願人らは、１以上のキメラＴＮＦα結合タンパク質で構成される調製物を 含む組成物を患者に投与することを含む、喘息症状を患う患者において喘息に対 抗するための方法を見出した。該調製物中のタンパク質はそれぞれ、ＩｇＧに融 合したｐ５５ ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分で構成される。該融合 したＩｇＧは、ＩｇＧ重鎖定常領域の第一ＩｇＧドメイン以外のＩｇＧドメイン を全て含む。該組成物は治療上不活性の担体を含み、該組成物は、該喘息症状に 対抗するために有効な量の該キメラタンパク質調製物が患者に供給されるよう、 該患者に投与される。 組成物は、発作の影響を軽減させるために十分な量のキメラタンパク質調製物 が投与されるよう、喘息発作を患う患者に有効に投与されうる。喘息発作の開始 前に、発作の開始を予防または遅延させるために有効な量の組成物を、喘息患者 に投与することもできる。 本発明の目的は、１以上のキメラＴＮＦα結合タンパク質で構成される調製物 を含む組成物を患者に投与することにより、喘息症状を患う患者において喘息に 対抗するための方法である。調製物中のタンパク質は、ＩｇＧ（免疫グロブリン Ｇ）重鎖定常領域の第一ドメイン以外のドメインを全て含むＩｇＧに融合したｐ ５５ ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分で構成される(ＴＮＦＲ−Ｉｇ) 。組成物は、治療上不活性な担体も含む。組成物は、該喘息症状に対抗するため に有効な量のキメラタンパク質調製物が患者に供給されるよう、該患者に投与さ れる。 ＩｇＧ重鎖定常領域の第一ＩｇＧドメイン以外のＩｇＧドメインを全て含むＩ ｇＧに融合したｐ５５ ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分で構成される キメラＴＮＦα結合タンパク質の、喘息治療用医薬の製造のための使用は、本発 明のさらなる目的である。 組成物は、タンパク質調製物の量が喘息発作の影響を軽減するために十分な量 となるよう、喘息発作中の患者に有効に投与されうる。喘息発作の開始前に、タ ンパク質調製物の量が発作の開始を予防または遅延させるために有効な量となる よう、組成物を喘息患者に投与することもできる。 任意のＴＮＦＲ−Ｉｇ、すなわちＩｇＧ重鎖定常領域の第一ＩｇＧドメイン以 外のＩｇＧドメインを全て含むＩｇＧに融合したｐ５５ ＴＮＦレセプタータン パク質の可溶性部分で構成されるキメラＴＮＦα結合タンパク質を、上記のよう な喘息症状の患者において喘息に対抗するための本発明の調製物中に使用するこ とができる。ＩｇＧは、ヒトのＩｇＧ１またはＩｇＧ３でありうるが、ＩｇＧ１ が本発明において好ましい。 そのようなＴＮＦＲ−Ｉｇの例としては、欧州特許第４１７５６３号、米国特 許第５，４４７，８５１号、第５，３９５，７６０号、Lesslauer，et al．Eur ．J.Immunol.21(11):2883,1991、Loetscher et al.,J.Bio1.Chem.266(27):18324 ，1991，Ashkenazi et al.，PNAS（USA）88:10535，1991に開示されているタン パク質が挙げられる。それらを得る方法も、これらの文献に開示されている。 好ましい本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇ分子の調製物は、ＩｇＧ１を用いて作製され 、１以上のシアル酸残基を末端に有する複合オリゴ糖を有し、露出Ｎ−アセチル グルコサミンを有するタンパク質を含む。調製物中のシアル酸残基のモル比は、 タンパク質１モル当たりシアル酸約４〜約７モル、特に約５〜約６モルであり、 調製物中の露出Ｎ−アセチルグルコサミンのモル比は、タンパク質１モル当たり Ｎ−アセチルグルコサミン約１〜約２モルであり、そして調製物中のシアル酸残 基とＮ−アセチルグルコサミン残基のモル比は、約０．３５〜約０．５、特に約 ０．４〜約０．４５である。調製物は、約５．５〜約７．５の等電点（ｐＩ）を 有する。この等電点は、クロマトフォーカシングにより決定することができ、そ してノイラミニダーゼ処理感受性である。 本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇは、通常の組み換え技術またはタンパク質合成の方法 により得ることができる。ｐ５５ ＴＮＦレセプターをコードするＤＮＡ、Ｉｇ Ｇ１またはＩｇＧ３の重鎖定常領域の第一ドメイン以外の全てのドメインをコー ドするＤＮＡ、およびそのような配列の適当なベクターにおける発現のためのラ イゲーションは、当業者に既知であり、文献に開示されている。適当なクローニ ングベクターおよび宿主細胞は、周知であり、当業者が選択でき、適当な培養条 件は決定できる(Animal Cell Culture:A Practical Approach 2nd Ed.，Rickwoo d and Hameseds.，Oxford University Press，NY 1992を参照)。 次に、ＴＮＦＲ−Ｉｇは、既知のタンパク質の回収および精製の方法を用いて 精製されうる。ＴＮＦＲ−Ｉｇは、好ましくは、分泌型ポリペプチドとして培養 培地から回収されるが、宿主細胞溶解物から回収することもできる。培養培地ま たは溶解物は、粒子状の細胞破片を除去するために遠心分離されうる。その後、 ＴＮＦＲ−Ｉｇは、混入している可溶性のタンパク質およびポリペプチドから精 製される。以下のような方法が適当な精製法の例である。イムノアフィニティー ・カラムまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シ リカ、またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマ トフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈殿、例えばセファデックスＧ−７ ５を用いたゲル濾過、ならびにＩｇＧのような夾雑物を除去するためのプロテイ ンＡ セファロースカラム。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のよう なプロテアーゼ阻害剤も、精製中のタンパク分解を阻害するために有用である。 当業者であれば、目的のポリペプチドにとって適当な精製法には、組み換え細胞 培養における発現時のポリペプチドの性質の変化のための修飾が必要であるかも しれないことを理解できよう。 特定のシアル酸とＮ−アセチルグルコサミンの比率、およびｐＩを有する本発 明のＴＮＦＲ−Ｉｇは、例えば国際公開第９６／３９４８８号に記載されている ようにして、組み換え哺乳動物細胞を用いてＴＮＦＲ−Ｉｇを発現させ、ＴＮＦ Ｒ−Ｉｇが産生されるよう哺乳動物細胞培養条件を調節することにより得ること ができる。選択された宿主細胞は、シアル酸を含むＮ結合または０結合炭水化物 を、細胞が発現するタンパク質へと付加することができなければならない。その ような宿主細胞の例は、ＣＨＯ細胞である。適当な培養条件は、周知であり、選 択された宿主細胞により異なる。糖タンパク質産生期における細胞特異的な生産 性を増加させることにより、成熟タンパク質のシアル酸含量は減少する。逆もま た同様である。細胞特異的な生産性に影響を与える因子は、当分野で周知であり 、ＤＮＡ／ＲＮＡコピー数に影響を与える因子、ＲＮＡを安定化する因子のよう なＲＮＡに影響を与える因子、培地の栄養素およびその他の添加物、転写エンハ ンサーの濃度、培養環境の浸透圧、細胞培養の温度およびpHなどを含むが、これ らに限定されない。これらの因子を周知の方法により調整することにより、シア ル酸などの糖タンパク質の好ましい含量を得ることができる。移行期に、酪酸ナ トリウムのようなアルカン酸またはそれらの塩を、約０．１mM〜約２０mM、また は５〜２０mMの濃度で細胞培養に添加することにより、細胞培養の浸透圧をおよ そ２５０と６００mOsmの間に調整することにより、場合により互いを組み合わせ て、細胞培養の産生期の細胞特異的な生産性を変化させると、シアル酸量の異な るタンパク質が産生される。約６．０mMという酪酸ナトリウムの濃度および３５ ０〜４００mOsmという条件では、高度にシアル酸化された本発明のＴＮＦＲ−Ｉ ｇが得られるが、約１２mMという酪酸ナトリウムの濃度では、より低くシアル酸 化された本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇが得られる。後者の濃度は、４５０〜５５０mO smという条件と組み合わせることができる。 当業者であれば、培地の浸透圧は培養液中の浸透活性粒子の濃度により変化し 、複雑な哺乳動物細胞培養培地を構成している多数の変数が浸透圧に影響を与え ることを理解できよう。培養培地の最初の浸透圧は、培養培地の組成により決定 される。浸透圧は、例えば、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scie ntific，Pittburgh，Pennsylvania）からオスメッテ（OSMETTE）という商標名で 販売されている浸透圧計（またはPrecision Systems，Inc．Natick MAから入手 可能なOsmetteモデル2007）などの浸透圧計を用いて測定できる。好ましい範囲 の浸透圧を達成するためには、培養培地中の様々な成分の濃度を調整することが できる。浸透圧を増加させるために培養培地に添加することができる溶質には、 タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプトンなどの加水分解された動物タンパク 質、非代謝ポリマー、ビタミン、イオン、塩、糖（特にグルコース）、代謝物、 有機酸、脂質などが含まれる。一つの実施態様において、浸透圧は、流加培養法 においてペプトンを他の培養培地成分と共に細胞培養に添加することにより調節 される。 以下のような細胞培養の３つの期を利用することができる。即ち、選択された 哺乳動物宿主細胞における細胞増殖が最大になる増殖期、次に、成熟糖タンパク 質の所望のシアル酸含量のため、上記のような細胞培養パラメータが選択され、 適用される移行期、次に、移行期に選択されたパラメータが維持され、糖タンパ ク質産物が産生され収得される産生期である。精製に関しては、本発明の炭水化 物を選択する精製の技術および方法が本発明において好ましい。例えばイオン交 換ソフトゲル・クロマトグラフィー、または陽イオンもしくは陰イオン交換樹脂 を用いたＨＰＬＣで、より酸性度の高い画分を収集することにより、シアル酸含 有分子に関して本発明の望ましい糖型を濃縮することができる。 好ましい本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇは、精製された組成物において、以下の特徴 のうちの１以上を有する。ＴＮＦＲ−Ｉｇ組成物のｐＩの範囲は、およそ５．５ 〜７．５である。タンパク質に対するシアル酸のモル比は、約４〜約７、特に約 ５〜約６であり、タンパク質１モル当たりの露出Ｎ−アセチルグルコサミン残基 のモル数は約１〜約２であり、シアル酸とＮ−アセチルグルコサミンのモル比は 約０．３５〜約０．５、より好ましくは約０．４〜約０．４５である。このよう な好ましいＴＮＦＲ−Ｉｇを得るための最も適当な条件としては、約０．１mM〜 約６mMの酪酸ナトリウム濃度、およそ３００〜４５０mOsmの間に維持された浸透 圧、およそ３０℃と３７℃の間の温度を用いた培養条件を使用する。 ＴＮＦＲ−Ｉｇの上記のような特徴は、周知の方法を用いて当業者により決定 されうる。例えば、本発明の方法により産生された糖タンパク質の複合炭水化物 部分は、所望により、通常の炭水化物分析法により容易に分析できる。したがっ て、当分野で周知の、例えばレクチン・ブロッティングのような方法により、末 端のマンノース、またはガラクトースなどのその他の糖の比率が明らかになる。 モノアンテナリー、バイアンテナリー、トリアンテナリー、またはテトラアンテ ナリーのオリゴ糖の末端にシアル酸が存在することは、無水ヒドラジン法または 酵素法を用いてタンパク質から糖を放出させ、イオン交換またはサイズ排除クロ マトグラフィーまたは当分野で周知のその他の方法によりオリゴ糖を分画するこ とにより確認することができる。ノイラミニダーゼ処理によりシアル酸を除去す る前後に、糖タンパク質のｐＩを測定してもよい。ノイラミニダーゼ処理後にｐ Ｉが増加すれば、それは糖タンパク質にシアル酸が存在していることを示してい る。 本発明の炭水化物構造は、Ｎ結合炭水化物またはＯ結合炭水化物として、発現 したタンパク質上に存在する。Ｎ結合炭水化物とＯ結合炭水化物は、主にコア構 造が異なる。Ｎ結合グリコシル化とは、炭水化物部分がＧｌｃＮＡｃを介してペ プチド鎖内のアスパラギン残基に付加されることをさす。Ｎ結合炭水化物は、全 て、共通のＭａｎ１−６（Ｍａｎ１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒコア構造を含む。したがって、上記のコア構造中、Ｒとは産 生されたタンパク質のアスパラギン残基を表す。産生されたタンパク質のペプチ ド配列は、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、および アスパラギン−Ｘ−システインを含む。ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミ ノ酸である。対照的に、Ｏ結合炭水化物は、ＧａｌＮＡｃがトレオニンまたはセ リンの水酸基に付加された共通コア構造により特徴づけられる。Ｎ結合炭水化物 およびＯ結合炭水化物の中で、最も重要なのは、複合Ｎ結合炭水化物およびＯ結 合炭水化物である。このような複合炭水化物は、いくつかのアンテナリー構造を 含む。モノ、バイ、トリ、テトラの外殻構造は、末端シアル酸の付加にとっ て重要である。そのような外殻構造は、特定の糖のための付加部位を提供し、本 発明の炭水化物を構成する結合を提供する。 得られた炭水化物は、本明細書に記載の方法を含む、当分野で既知のいかなる 方法によっても分析できる。グリコシル化分析のためのいくつかの方法が当分野 で知られており、本発明に関して有用である。そのような方法は、ペプチドに付 加されたオリゴ糖の同定および組成に関する情報を与える。本発明において有用 な炭水化物分析の方法には、レクチン・クロマトグラフィー、高pH陰イオン交換 クロマトグラフィーを用いて電荷に基づきオリゴ糖を分離するＨＰＡＥＣ−ＰＡ Ｄ、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖組成分析、連続的酵素分解が含 まれるが、これらに限定されない。 さらに、オリゴ糖を放出させる方法が知られている。これらの方法には、１） 通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンド−β−ガラクトシダーゼを用いて 行われる酵素法、２）苛酷なアルカリ環境を用いて主にＯ結合構造を放出させる 除去法、および３）無水ヒドラジンを用いてＮ結合およびＯ結合両方のオリゴ糖 を放出させる化学法が含まれる。 分析は、以下の工程を用いて行うことができる。 １．脱イオン水に対して試料を透析し、あらゆる緩衝塩を除去した後、凍結乾 燥する。 ２．無水ヒドラジンで完全なオリゴ炭水化物を放出させる。 ３．無水塩酸メタノールで完全なオリゴ炭水化物を処理し、個々の単糖をＯメ チル誘導体として生じさせる。 ４．任意の第一アミノ基をＮアセチル化する。 ５．ペル−Ｏ−トリメチルシリルメチルグリコシドが得られるように誘導体化 する。 ６．ＣＰ−ＳＩＬ８カラムを用いたキャピラリーＧＬＣ（気−液クロマトグラ フィー）により、これらの誘導体を分離する。 ７．ＧＬＣからの保持時間および質量分析を、既知の標品と比較することによ り、個々のグリコシド誘導体を同定する。 ８.内部標準(１３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース)を用いたＦＩＤにより個々 の誘導体を定量する。 中性糖およびアミノ糖は、パルス電流検出と組み合わせた高速陰イオン交換ク ロマトグラフィー（HPAE-PAD Carbohydrate System，Dionex Corp.）により決定 できる。例えば、糖は２０％（v/v）トリフルオロ酢酸中１００℃で６時間加水 分解することにより放出させることができる。加水分解産物を、その後、凍結乾 燥またはスピード・バック（Speed-Vac）(Savant Instruments)により乾燥させ る。次に、Anumulaら（Anal．Biochem．195:269-280(1991)）により記載された ようにして、残さを１％酢酸ナトリウム・３水和物溶液に溶解し、ＨＰＬＣ−Ａ Ｓ６カラムで分析する。 シアル酸は、別に、Yaoら（Anal．Biochem．179:332-335(1989)）の直接比色 法により、三つのサンプルで決定することができる。好ましい実施態様において 、Warren，L．J．Biol Chem238:（8）(1959)のチオバルビツール酸（ＴＢＡ）が 使用される。 または、イムノブロット炭水化物分析を行ってもよい。この方法では、Haselb eckおよびHosel［Haselbeck et al.Glycoconjugate J.，7:63(1990)］により記 載された酸化イムノブロット法に基づく、市販のグリカン検出系（Boeringer） を用いて、タンパク質に結合した炭水化物が検出される。タンパク質をニトロセ ルロース膜ではなくポリビニリデン・ジフルオリド膜に転写すること、ブロッキ ング用緩衝液が０．９％塩化ナトリウムを含む１０mMトリス緩衝液、pH７．４中 に、５％ウシ血清アルブミンを含むこと以外は、製造元の推薦する染色プロトコ ルに従う。検出は、アルカリホスフェートコンジュゲートと結合した抗ジゴキシ ゲニン抗体（Boeringer）をトリス緩衝生理食塩水で１０００倍に希釈したもの を用い、１００mM塩化ナトリウムおよび５０mM塩化マグネシウムを含む、ホスフ ァターゼ基質、０．０３％（w/v）４−ニトロブルー・テトラゾリウム・クロリ ドおよび０．０３％（w/v）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフ ェートの１００mMトリス緩衝液、pH９．５溶液を用いて行う。炭水化物を含むタ ンパク質バンドは、通常、およそ１０〜１５分以内に可視化される。 ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ分解により炭水化物を分析することもできる 。 この方法では、０．１８％ＳＤＳ、１８mMベータ・メルカプトエタノール、９０ mMリン酸、３．６mMＥＤＴＡを含む１４μｌの緩衝液、pH８．６に残さを懸濁さ せ、１００℃で３分間加熱する。室温まで冷却した後、試料を二等分する。一方 のアリコートはそれ以上処理せず、対照として用いる。第二の画分を、約１％Ｎ Ｐ−４０界面活性剤で調整し、０．２ユニットのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ（Boehringer）を添加する。両試料を２時間３７℃で保温し、その後ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。 本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇには、ＰＥＧ化ＴＮＦＲ−Ｉｇも含まれる。ＰＥＧ化 ＴＮＦＲ−Ｉｇとは、ポリアルキレングリコール（置換体または非置換体）のよ うなポリマー、特にポリエチレングリコールに共有結合したＴＮＦＲ−Ｉｇ分子 を意味する。結合は直接的に行われてもよいが、好ましくは、例えば、欧州特許 第５１０３４６号、第５９３８３８号、米国特許第４，７６６，１０６号、第４ ，９１７，８８８号、第４，９０２，５０２号、第４，８４７，３２５号、第４ ，１７９，３３７号、第５，８３２，６５７号、Veronese et al．Applied Bioc hem.and Biotech．11:141(1985)、およびMonfardini et al.Bioconjugate Chem ．6:62(1995)に開示されているリンカーのような、当分野で既知の様々な架橋試 薬を用いて行われる。ＰＥＧ化ＴＮＦＲ−Ｉｇは、ＴＮＦＲ−Ｉｇについて記載 されたのと全く同様に、喘息の治療および予防に使用できる。 本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物は、喘息患者において喘息に対抗するために有 用である。喘息発作中の患者の治療において、これらの調製物は、発作の影響を 軽減することができ、例えば、既に起こっている炎症を改善したり、さらなる炎 症の発生を抑制したりできる。予防のために与えれた場合には、これらの調製物 は、喘息発作の開始を遅延させるか、もしくは予防するか、または発作が起こっ た場合の発作の重症度を減少させることができる。 本発明によると、調製物は、任意の通常の方法で、治療または予防のため患者 に投与されうる。したがって、本発明の調製物は、任意の通常の治療上不活性な 担体を含む、通常の医薬組成物で投与できる。医薬組成物は、不活性な添加物お よび薬力学的に活性な添加物を含みうる。液体組成物は、例えば、水混和性の無 菌溶液の形態をとることができる。さらに、保存料、安定化剤、水分保持剤、お よび乳化剤として通常使用される物質、ならびに浸透圧を変化させるための塩の ような物質、緩衝剤のようなpHを変化させる物質、およびその他の添加物も存在 してよい。所望により、トコフェロール、Ｎ−メチル−ガンマ−トコフェラミン 、酪酸ヒドロキシアニソールまたは酪酸ヒドロキシトルエンのような抗酸化剤が 医薬組成物中に含まれていてもよい。組成物のための薬学的に許容される賦形剤 または担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、または水が含 まれる。組成物は、マンノースおよびマンニトールなどの糖のような特別な安定 化剤、ならびに例えばリドカインのような注射組成物のための局所麻酔薬を含ん でいてもよい。前記の担体物質および希釈剤は、例えば、水、ゼラチン、ラクト ース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴム、ポリアル キレングリコールなど、有機物であっても無機物であってもよい。必要条件は、 薬学的組成物の製造に使用される補助剤および物質が、全て、非毒性であること である。 本発明の調製物は、非経口投与（例えば、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、 眼内注射、嚢内注射、脊椎内注射、胸骨内注射）することも、スプレー吸入によ り投与することもできる。非経口投与またはスプレー吸入投与のための通常の医 薬製剤を使用することができる。適当な医薬組成物の例は、点滴溶液または注射 溶液である。好ましい投与様式は、静脈注射である。もう一つの好ましい投与様 式はエアロゾル投与である。 喘息に対抗するための本発明の調製物は、発作の影響を軽減もしくは改善する ため、または発作の開始を予防もしくは遅延させるために有効な任意の量で使用 することができる。喘息の治療、予防または改善のための本発明の非経口（注射 ）投与用のＴＮＦＲ−Ｉｇ組成物の好ましい投与量は、１患者当たり体重１kg当 たり約０．１〜約５．０mgのＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物（mg/kg）である。特に好ま しい投与量は、約１．０〜約３．０mg/kgである。同目的のスプレー投与用のＴ ＮＦＲ−Ｉｇ組成物の好ましい投与量は、約０．０３重量％〜約５．０重量％の ＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物である。いずれの投与様式でも、治療用量は、治療日に１ 日１回投与されるか、またはそれよりも少ない投与量に分割して、ある総投与用 量に達するまで、約２４時間の間に投与される。 非経口投与による喘息発作の緊急の治療には、１患者当たり１日当たり０．１ 〜５．０、特に１．０〜３．０mg/kgの１回投与量が投与される。非経口投与に よる喘息予防には、０．１〜５．０、特に１．０〜３．０mg/kgのような投与量 が、好ましくは、患者および状態に応じて、毎阻好ましくは週２回〜週１回、月 に１回またはその中間の別の間隔で間隔をおいて投与される。同様に、スプレー 投与による喘息発作の緊急の治療には、１日に１回の投与量が吸入される。予防 には、そのような投与量が、患者および状態に応じて、毎日、好ましくは週２回 〜週１回、月に１回またはその中間の間隔で間隔をおいて吸入される。組成物が 投与される正確な投与量は、熟練の医者により決定される、使用の型、使用の様 式、および患者の必要性により変化しうる。患者にとっての正確な投与量は、状 態の重症度、使用されている特定の処方、および関与しているかもしれないその 他の薬物を考慮して当業者により具体的に調節されうる。 本発明のスプレー組成物は、液体または粉末でありうる。それらは、鼻または 口を介して投与される(鼻腔内または口腔内)。スプレー組成物の例は、ＴＮＦＲ −Ｉｇ調製物の水溶液または生理食塩水溶液に機械的な作用が加わることにより スプレー・アトマイザーから作製され、鼻または口へ向けることができる、アト マイザーにより噴霧されるスプレーである。他の例は、ミストがそのような溶液 から作製され、（鼻または口へと直接スプレーされるのではなく）患者により能 動的に吸入される、ネブライザーにより噴霧されるスプレーである。ＴＮＦＲ− Ｉｇが粉末である場合には、粒子が、吸入後患者により吐き出されずに気道に沈 積する程度の大きさを有している必要がある。緊急の治療または予防のための療 法に応じて、そのようなスプレーは、その患者に対する指示どおり、１日に１回 または複数回、またはそれよりも低頻度で吸入される。スプレー投与では、患者 は吸入により、上記のような喘息の治療または予防のために有効な量の本発明の ＴＮＦＲ−Ｉｇを投与される。気道の罹患部位（鼻腔、気管、気管支、下気道ま たは細気管支）は、喘息のためのこの方法により適量のＴＮＦＲ−Ｉｇを受け取 る。 本発明のスプレー製剤は、約０．０３重量％〜５．０重量％、より好ましくは 約０．０３〜０．５％、特に約０．１〜０．３％の調製物を提供する。好ましい スプレー製剤は、エアロゾル製剤である。一般的に、ネブライザー製剤のような スプレーには低投与量域が好ましく、エアロゾルには高投与量域が好ましい。本 発明においては、有効量のＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物、好ましくは上記の量の調製物 を供給するため、任意の通常のエアロゾル製剤を使用できる。患者が吸入してい る間に患者の口内に測定された投与量のエアロゾル・ミストを放出させ、ミスト が口に取り込まれ、気道を通って肺に取り込まれることにより、調製物は最も効 果的に投与される。上記のように、有効量は、口腔内または鼻腔内に一度に、ま たは数回に分けて低投与量で１日をとおして投与され、緊急の治療には１日単位 投与量が投与され、予防には週単位または月単位の間隔をあけて投与される。 適当なエアロゾル製剤には、適量の薬学的に活性な化合物（例えば、ＴＮＦＲ −Ｉｇ調製物）および有効量の任意の通常のエアロゾル噴射剤が含まれる。任意 の通常の界面活性剤が含まれていてもよい。ＴＮＦＲ−Ｉｇは、溶液中の液体と して、または粉末（例えば、周知の方法により凍結乾燥されたもの）として噴射 剤と組み合わせられる。噴射剤は、適宜、液化される。 噴射剤中に可溶性または分散可能な界面活性剤は、より効果的である。噴射剤 への溶解性が高い界面活性剤は、最も効果的である。界面活性剤は、非刺激性で 非毒性であることも重要である。 当業者に既知の医薬組成物での使用に許容されうる任意の通常の噴霧剤を使用 することができ、液化してもしなくてもよい。噴射剤には、ＴＮＦＲ−Ｉｇが粉 末化形態であるか液体形態であるかによって、粉末の活性成分との使用に適した もの、または液体の活性成分との使用に適したものを用いる。使用される液化噴 射剤は、室温（６５°Ｆ）および大気圧（水銀の７６０mm）において気体のもの であり、即ち、大気圧において沸点が６５°Ｆ未満であり、非毒性である。使用 できる適当な液化噴射剤としては、ブタンおよびペンタンのような、炭素数５個 までを含有する低級アルカンがある。液化噴射剤の例は、商標名「フレオン(Fre on)」として販売されているもののような、フッ素化またはフッ素塩素化された 低級アルカンである。上記の噴射剤の混合物も好適に使用される。 以上、本発明の概略を説明したが、以下の例を参照することにより本発明はよ り容易に理解されるであろう。例は、例示のためのものであり、明記しない限り 、 本発明を限定するためのものではない。 例例１ ：ＴＮＦＲ−Ｉｇの産生に使用するためのＴＮＦＲ−Ｉｇをコードするプラ スミド Ａ．細胞系 哺乳動物宿主細胞系として使用したチャイニーズハムスタ一卵巣（ＣＨＯ）細 胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC No.CCL61 CHO-K1）由来であった。次に、ＣＨＯ− Ｋ１ ＤＵＸ−Ｂ１１（ＤＨＦＲ-）と名付けられた、ＣＨＯ−Ｋ１変異ジヒドロ 葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ-）欠損細胞系（Columbia UniversityのDr．L．Cha sinから譲り受けた；Simonsen，C．C.，and Levinson，A．D.，（1983）Proc．N atl．Acad．Sci．USA 80:2495-2499;Urlaub G.，and Chasin，L．（1980）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 77:4216-4220）を用いて、プレプロインスリンのｃＤ ＮＡを含むベクターで形質転換することにより(Sures et al.，（1980）Science ，208:57-59)、インスリン要求性が減少した細胞系を得た。ｄｐ１２．ＣＨＯと 名付けられた選択されたクローンは、増殖にグリシン、ヒポキサンチン、および チミジンを必要とするため、ＤＨＦＲ-ゲノタイプが確認される。 Ｂ．可溶性１型ＴＮＦＲ−ＩｇＧ1キメラの構築 ヒト１型ＴＮＦＲの細胞外ドメインを、ＩｇＧ1重鎖のヒンジ領域およびＣH２ ドメインおよびＣH３ドメインと遺伝子融合することにより、可溶性１型ＴＮＦ Ｒ−ＩｇＧ1キメラを構築した(以後ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ1と呼ぶ)。別法として、 ＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域およびＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを使用す ることもできた。 ヒト１型ＴＮＦＲコーディングＤＮＡ配列（Loetscher et al.，前記）は、プ ラスミドｐＲＫ−ＴＮＦ−Ｒ［Schall et al.，Cell 61，361(1990)］から得た 。この出発プラスミドを構築するのに、２．１ｋｂの胎盤ｃＤＮＡクローン（Sc hall et al.，前記）を哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５に挿入した。ｐＲＫ５の 構築は、欧州公開第３０７，２４７号に開示されている。このｃＤＮＡは、Loet scherらにより報告された配列の６４位ヌクレオチドから開始しており、１１８ ｂｐ下流に開始メチオニンを有している。 ＩｇＧ1コーディング領域の起源は、ＩｇＧ1のＣH２ ＦｃドメインおよびＣH ３ Ｆｃドメインを含むように、アスパラギン酸２１６（重鎖−軽鎖結合に関与 するシステイン残基の後のＩｇＧ1ヒンジの最初の残基である、アミノ酸１１４ を重鎖定常領域の最初の残基とする［Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th edition(1987)]）で開始し、残基４４１で終止す るヒトＩｇＧ1配列に融合した、成熟ヒトＣＤ４タンパク質の残基１〜１８０（ ２つのＮ末端ＣＤ４可変ドメイン）からなるハイブリッド・ポリペプチドをコー ドするｃＤＮＡ配列を含む、ＣＤ４−ＩｇＧ発現プラスミドｐＲＫＣＤ４2ＦC1 ［Capon，D．J．et al.，Nature 337，525(1989);Byrn et al.，Nature 344，66 7(1990)］であった。欧州特許第２２７１１０号も参照のこと。別法として、ｐ ＣＤ４−Ｈγ３ベクター（ＤＳＭ５５２３、欧州特許第３９４，８２７号）を使 用してもよい。ＣＤ４ ｃＤＮＡをＳｓｔＩ開裂により除去すると、所望のＩｇ Ｇ３配列が得られる。 ＴＮＦＲ−ＩｇＧ1は、プラスミドｐＲＫ−ＴＮＦ−ＲおよびｐＲＫＣＤ４2ＦC1 の制限断片を生成させ、成熟ＴＮＦＲのトレオニン残基１７１がＩｇＧ1重鎖 のアスパラギン酸残基２１６に隣接するように、欠失突然変異導入法を用いて、 それらをライゲーションすることにより構築した［Kabat et al.,上記]。得られ たプラスミドｐＲＫＴＮＦＲ−ＩｇＧは、ＴＮＦＲ1ＩｇＧ1の全長コーディング 配列を含んでいた。次に、このプラスミドを、リン酸カルシウム沈殿のような通 常の方法により、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞に形質転換することができる。得ら れた細胞を、通常の方法により培養し、ＴＮＦＲ−Ｉｇを発現させることができ 、次にそのＴＮＦＲ−Ｉｇを通常の方法により単離できる。例２ ：タンパク質当たり約５〜６Ｍシアル酸、タンパク質当たり約０．４〜０． ４５ＭＮ−アセチルグルコサミン、約５．５〜７．５のｐＩを有するＴＮＦＲ− Ｉｇの産生細胞培養 可溶性１型ＴＮＦＲ−ＩｇＧ1をコードする例１の遺伝子を、形質転換により ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞に導入した。これは、ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するた めのリン酸カルシウム法を用いて行った。形質転換の２日後、細胞をトリプシン で剥離し、選択培地（グリシン−ヒポキサンチンおよびチミジンを含まないＨａ ｍ'ｓ Ｆ−１２ＤＭＥＭと２％透析済血清の１：１v/v混合物）へと移した。そ の後、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ1の分泌に関して単離物をスクリーニングした。ＴＮＦ Ｒ−ＩｇＧ1を発現するクローンをメトトレキセート中で増幅し、高発現クロー ンを得て、その後無血清培地へ適合させた。これらの細胞を、チャレンジ物の増 殖および増幅のための非選択培地へ移すまで、継続的に選択圧下においた。 ＴＮＦＲ−ＩｇＧ1産生培養用の細胞を提供するため、上記の細胞群をメトト レキセート含有培地から、次第に大容量の容器で継代培養を繰り返すことにより メトトレキセートを含まない増殖培地へと拡大した。この手順のこれらの工程の ため、非選択増殖培地は、グルコース、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、グリシン 、ヒポキサンチン、およびチミジン、組み換えヒトインスリン、加水分解ペプト ン(Primatone HSまたはPrimatone RL)、プルロニツクＦ６８（プルロニック・ポ リオール(Pluronic polyol)）またはその等価物のような細胞保護剤、ゲンタマ イシン、脂質および微量成分などのいくつかの成分の濃度を修飾した、ＤＭＥＭ ／ＨＡＭ Ｆ−１２を基本とした処方（例えば、米国特許第５，１２２，４６９ 号を参照のこと）であった。 培養は、ＣＯ2ガス（酸）および／またはＮａ2ＣＯ3（塩基）を使用すること によりpH７．２＋／−０．４に調節した。増殖期の間、温度は３７℃付近に調節 した。空気および／または酸素ガスを直接通すことにより、溶解酸素を、空気飽 和の約５％以上に維持した。チャレンジ物増幅期の浸透圧は、およそ２５０mOsm と３５０mOsmの間に維持した。 各培養の増殖期の後は、第二期または移行期であり、ここで培養パラメータを 増殖に最適の条件から産生に最適の条件に変化させた。この移行期では、培養系 の温度を、一般的におよそ３０と３５℃の間に低下させた。酪酸を添加し、一定 の浸透圧域とした。この産生期の間に蓄積した産物のシアル酸含量を分析した。 典型的な合成スケジュールでは、選択期のチャレンジ物増幅に由来する約１． ２×１０6個の細胞を、開始浸透圧３００〜４５０mOsm、好ましくは約３００で 、増殖期に増殖させた。増殖培地に、微量成分、組み換えヒト・イン スリンおよび加水分解ペプトンを補充した。これらの条件下で、細胞を２日間増 殖させた。３日目の最初に細胞培養の温度を低下させた。温度の変化と同時、ま たはその後に、およそ１〜６mmol、好ましくは６mmolの酪酸ナトリウムを細胞培 養に添加し、様々な培地成分を添加することにより所望の産生浸透圧とした。こ れらの条件下で９〜１０日間細胞を流加培養した。必要に応じて細胞に様々な培 地成分を与えた。 高度にシアル酸化された組成物のｐＩは、低度のシアル酸化された組成物のｐ Ｉより低い。組成物に対して等電点フォーカシングを行った。等電点フォーカシ ング・ゲルは、異なるpHの両性電解質で作成されたpH勾配を用いて、等電点ｐＩ により組成物の糖タンパク質を分離する。組成物の分析を、１０〜４のpH勾配を 用いて行った。 上記の組成物は、クロマトフォーカシングで測定して、約５．５〜約７．５の 等電点域を示す。このｐＩは、ノイラミニダーゼ処理感受性である。ＴＮＦＲ−Ｉｇの回収 Capon et al.，Nature 337:525，1989に記載されたように、ＩｇＧ融合タンパ ク質は、細胞培養を遠心分離し、得られた培養上清をプロテインＡカラムに通過 させることにより精製することができる。したがって、上記のようにして得られ た細胞培養を遠心分離し、上清をプロテインＡカラムにアプライした。Caponら ，前記、により記載されたようにして、固定化Staphylococcus aureusプロテイ ンＡを用いたこのアフィニティー・クロマトグラフィーにより、ＴＮＦＲ−Ｉｇ 調製物を、９５％以上均一になるよう精製した。炭水化物分析 Ａ．シアル酸含量は、Warren，L．（1959）J．Biol．Chem．234:1971-1975の 方法により分析できる。 Ｂ．中性糖およびアミノ糖の放出は、パルス電流検出と組み合わせた高pH陰イ オン交換クロマトグラフィーにより測定できる。分析を、以下の工程を用いて行 った。 １．最終試料が１％酢酸に含まれるように、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ1（約５０μ ｇ/ml）および適当な参照試料を用いて緩衝液の交換を行った。 ２．約９０μｇのＴＮＦＲ１−ＩｇＧ1および参照物質試料を、ドライアイス およびアルコール浴中で凍結させ、凍結した試料を一晩凍結乾燥させた。 ３.凍結乾燥した試料を、５００μｌのトリフルオロ酢酸で再生させ、１２０ ℃で１時間インキュベートした。 ４．酸加水分解後、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ1および参照試料を冷却し、乾燥状態 になるまで蒸発させた。 ５．最終濃度が約０．６mg/mlになるよう、試料を水で再生させた。 ６．ディオネックス・カーボパックＰＡ１（Dionex CarboPac PA1）（４×２ ５０mm）カラム（Dionex Corp.，Sunnyvale，CA，USA）を用いた、パルス電流検 出と組み合わせた高pH陰イオン交換クロマトグラフィーにより、常温で単糖の分 離を行った。 ７．参照単糖との比較により、個々の単糖を定量した。例３ ＴＮＦＲ−Ｉｇの調製 １．リン酸カルシウム共沈殿を用いて、ＣＨＯ細胞系ＤＰ１２（欧州特許第３０ ７，２４７号）に、プラスミドｐＳＶ１６Ｂ．ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（ＴＮＦＲ−Ｉ ｇＧ１をコードする）およびｐＦＤ１１（ＤＨＦＲをコードする）を形質転換し た。 ２．その形質転換由来の細胞クローンを、２％透析済仔ウシ血清および１００nm ol／ｌメトトレキセートを含む選択培地を用いて、９リットル懸濁培養に規模を 拡大した。２つの９リットル培養を、メトトレキセートを含まない無血清培地を 用いて、１００リットル培養器に接種した。残留血清成分を減少させるため産生 培地で１０００回洗浄した後、細胞を１０００リットル産生容器に接種する前に １００リットル培養を、無血清培地を用いて、４００リットル培養に接種した。 産生培地は、グルコース、アミノ酸、グリシン、ヒポキサンチン、チミジン、組 み換えヒト・インスリン、加水分解ペプトン、プルロニックＦ６８、ゲンタマイ シン、脂質および微量成分を補充したＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ−１２を基本とした処 方であった。 ３．産生培養は、ＣＯ2ガス（酸）および／またはＮａ2ＣＯ3を用いて、１３日 間７．２＋または−０．２のpHに維持した。細胞濃度が１ml当たり５×１０6細 胞に達した後、培養温度を３７Ｃ〜３０Ｃに変化させた。２日目および４日目に 培地成分を添加することにより、培養の浸透圧を、約４５０mOsm/kgに調整した 。酪酸ナトリウムを最終濃度１２mMとなるよう添加した。培養に空気および／ま たは酸素を通すことにより、溶解酸素濃度を、６０％空気飽和に維持した。 ４．１３日後に培養を収得し、正接フロー濾過（tangential flow filtration） により、上清から細胞を分離した。この収得された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、 １０ＫＤマキシセット（Maxisette）膜を用いて約２０倍に濃縮した。プロテイ ンＡクロマトグラフィーのため、１．０Mに固体ＮａＣｌを添加した後、０．２ ２ミクロンのデュラポア（Durapore）フィルターで濾過することにより、濃縮物 を清澄化し、調整した。 ５.濾過後、調整されたＨＣＣＦを固定化プロテインＡに通過させた。物質をロ ードした後、溶出の前に数回洗浄した。ＴＮＦＲ−ＩｇＧを、０．０５Mクエン 酸Ｎａ／２０％（w/v）グリセロール、pH３．０で段階溶出させた。溶出プール を、１Mクエン酸Ｎａを添加することにより、pH５．０に調整した。 ６．pH調整後、プロテインＡプールを希釈し、Ｓ−セファロース・ファースト・ フローにロードした。ロード後、洗浄し、０．０５M ＭＯＰＳ／０．０５M Ｎａ Ｃｌ、pH７．２で段階溶出させた。 ７．段階溶出の後、Ｓ−セファロース・ファースト・フロー・プールを希釈し、 Ｑ−セファロース・ファースト・フロー・カラムにロードした。カラムを、０． １２５M ＭＯＰＳ、pH７．２中、０．０１２５M ＮａＣｌ〜０．１２５M ＮａＣ ｌまでの直線勾配を用いて溶出した。 ８．直線勾配溶出の後、Ｑ−セファロース・ファースト・フロー・プールに、１ 容量の０．１M酢酸Ｎａ／４．０M尿素／２．０M硫酸アンモニウム、pH５．０を 添加することにより調整し、０．０５M酢酸Ｎａ／２．０M尿素／１．０M硫酸ア ンモニウム、pH５．０で平衡化しておいた、フェニル・トヨパール６５０M（phe nyl Toyopearl 650M）カラムにロードした。これらの条件下でカラムにＴＮＦＲ −Ｉｇを通過させた。ロード後、平衡化緩衝液で洗浄した。素通り液および洗浄 液を合わせて、フェニル・トヨパール・プールとした。 ９．２つのフェニル・トヨパール・プールを合わせ、１０ＫＤフィルトロン・セ ントラセット(Filtron Centrasette)膜を用いて濃縮した。濃縮物を、０．０１M クエン酸Ｎａ／０．０２３Mグリシン／０／０２３Mマンニトール、pH６．０で平 衡化しておいた、Ｇ−２５カラムに通過させ、ＴＮＦＲ−Ｉｇ組成物を産生させ た。 以下の例４〜１０は、本発明のＴＮＦ−Ｉｇが喘息発作の影響を軽減すること を示す、インビボ実験を記載する。ＴＮＦレセプター融合タンパク質ＴＮＦＲ− Ｉｇは、アレルギー性肺炎症の動物モデルにおいて、抗原チャレンジにより引き 起こされる反応を著しく減少させ、いくつかの例においては消失させた。ＴＮＦ Ｒ−Ｉｇの阻害効果の大きさは、広域スペクトル抗炎症剤デキサメタゾンで得ら れた効果に匹敵した。 略語：ＴＮＦα、腫瘍壊死因子アルファ；ＴＮＦＲ−Ｉｇ、組み換え可溶性ＴＮ Ｆレセプタ−ＩｇＧ１融合タンパク質；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄；ＯＡ、オボア ルブミン；ＲL、肺抵抗；ＨＢＳＳ、ハンクス平衡塩溶液、サブスタンスＰ、慣 習的に文献でサブスタンスＰと呼ばれる、急性気管支痙摩を誘導するために用い られる神経ペプチド(例えば、Selig and Tocker，Eur．J．Pharmacol．213(3):3 31-336(1992)を参照） データ分析 各実験において全ての値について、平均値＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計 算した。統計的な差は、順位付けられたデータ上の変数に対して２元反復測定分 析を行い、その後、スチューデント・ニューマン・クールズ（Student Newman-K euls）ｔ検定またはスチューデントｔ検定を用いて多重比較を行うことにより決 定した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると考えた。計算は、ＰＣ上で作動さ せたマイクロソフト・エクセル（EXCEL）５．０（Softmart，Exton，PA，USA） およびシグマスタット（SigmaStat）(Jandel Scientific，San Rafael，CA，USA )ソフトウェアパッケージを用いて行った。 薬物 全ての薬物を、１ml/kgの投与量で投与した。ＴＮＦＲ−Ｉｇは、例３に 記載のようにして産生および精製し、ストック液をクエン酸ナトリウム(１０mM) 、グリシン（２３mM）およびマンニトール（２３０mM)、pH６の緩衝液で調製し た。使用前はストック液のアリコートを−２０℃で保存し、希釈液は無菌生理食 塩水で作製した。以下のものはシグマケミカル社(Sigma Chemial Co.)(St.Louis ,MO， USA)から購入し、無菌生理食塩水で調製した。オボアルブミン、水酸化アルミニ ウム、ウレタン、サブスタンスＰアセテート、（+／-）プロプラノロール塩酸塩 、デキサメタゾン２１−リン酸およびエバンスブルー。例４： ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減されたモルモットにおける喘息症状（気道過敏 性） この例では、続いてのＯＡ曝露により気道過敏性という喘息症状が誘導される よう、ＯＡに対してアレルギー性にされたモルモットを使用する。この症状は、 ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減される。その効果は、喘息を軽減させることが知られ ているステロイド、デキサメタゾンと比較した。 雄のモルモットを０日目にＯＡ（１０μｇ、０．５ml生理食塩水中、１mgのＡ ｌ（ＯＨ）3を加えた、皮下注射）で感作し、１４日目に追加投与として同じ投 与量のＯＡを与えた。２１日目に、動物を０．１％ＯＡエアロゾルで３０分間チ ャレンジした。この感作は、モルモットにおいて、サブスタンスＰに対する気道 過敏性を含む、喘息様の症状を引き起こす。この症状に対するＴＮＦＲ−Ｉｇの 効果を測定するため、チャレンジの前にＴＮＦＲ−Ｉｇを投与し、チャレンジし ていない動物と症状を比較したところ、減少していることが示された。デキサメ タゾン（３０mg/kg、静脈注射、チャレンジの１時間前および４時間後）に匹敵 する気道過敏性に対する効果が得られた。デキサメタゾンは、喘息のための既知 の治療である。 モルモットは、感作し、チャレンジし、そして処置することにより、以下のよ うにして実験用に調製した。 感作 体重２５０〜３００ｇの雄のハートレイ（Hartley）系統モルモット（Cha rles River，Kingston，NY，USA）を、０日目および１４日目に、１回の皮下注 射（０．５ml無菌生理食塩水中１０μｇＯＡ＋１mg水酸化アルミニウム）により 、オボアルブミン（ＯＡ）で能動感作し、２１日目と２８日目の間に実験に使用 した。 チャレンジ 抗原チャレンジのためのプロトコルは、以前に記載されている(O'D onnell，et al.，1994)。感作された動物を、プレキシグラス・チャンバー（Ple xiglas Chamber）に収容し、０．１％（w/v無菌生理食塩水）ＯＡエアロ ゾルで３０分間チャレンジした。エアロゾルは、３０L／分の気流速度を用いて 、内部ファンにより駆動するデ・ビルビス・ウルトラネブ（De Vilbiss Ultra-N eb）１００超音波ネブライザー（Breathing Services,Ephrata,PA,USA）により 送った。アナフィラキシーによる死亡数を最少にするため、曝露の最初の５分間 は、６０秒間ごとにネブライザーのオフとオンを繰り返した。これらの条件で、 動物の死亡率は、約５％であった。 薬物処置 ＯＡエアロゾルの１８および１時間前に、動物群に、ビヒクル（薬物 の項を参照）またはＴＮＦＲ−Ｉｇ（１または３mg/kg、静脈注射）のいずれか を与えた。デキサメタゾンを用いた実験では、別の動物群に、ＯＡエアロゾルの １時間前または４時間後に、ビヒクル（生理食塩水）またはデキサメタゾン（３ ０mg/kg、静脈注射）のいずれかを与えた。ＴＮＦＲ−Ｉｇおよびデキサメタゾ ンの投与パラメータは、予備観察からの結果に基づき最適となるよう決定した。 この例の結果は、ＯＡ曝露によりＯＡ感作されたモルモットが、ＯＡチャレン ジの６時間後、サブスタンスＰ（１〜１０μｇ/kg、静脈注射）に対する増大し た気道反応性を表したことを示している。サブスタンスＰに対する増大した反応 性は、喘息様感作の特徴であり、モルモットが上記の実験条件により誘導された 過敏性という喘息症状を患っていたことを示している。過敏性は、ＴＮＦＲ−Ｉ ｇ（３mg/kg、静脈注射、チャレンジの１８および１時間前）により阻害された 。 使用した方法は、以下のとおりである。サブスタンスＰに対する気道の反応は 、以前に記載された方法に従い(Selig and Tocker，1992)、ＯＡエアロゾル曝露 の後の６時間、感作非チャレンジモルモットおよび感作チャレンジモルモットの 両方で調べた。動物にウレタン（２ｇ/kg、静脈注射）で麻酔をかけ、頸動脈（ 血圧）および頸静脈（薬物投与）にＰＥ−５０管材料のカニューレを取り付けた 。気管に１５ゲージのニードルを用いてカニューレを取り付け、動物を全身プレ チスモグラフ（Modular Instruments，Malvern，PA，USA）に収容した。自発的 な呼吸を塩化スクシニルコリン（１．２mg/kg、静脈注射）で制止し、体重１０ ０ｇ当たり１mlという潮量および６０呼吸／分という頻度で、動物を機械的に換 気した(Harvard Apparatus Model 683;South Natick，MA，USA)。プレチスモグ ラフは、２Lの総容量を有し、動物と呼吸器との間の換気回路量は１０mlであっ た。プレチスモグラフには、気流を測定するためのバリダイン・ディファレンシ ャル・プレツシャー・トランスデューサー（Validyne differential pressure t ransducer）(ＤＰ４５−１４)に接続されたフライシュ（Fleisch）呼吸気流計（ モデル＃００００）が装着されていた。経肺圧は、気管カニューレのサイドアー ムと、第５および第６肋間空間の間に挿入された１６ゲージ胸内ニードルとの間 に接続された第二のバリダイン・トランスデューサー（ＤＰ４５−２８）により 測定した。気流および経肺圧は、ＩＢＭ４８６ＤＸ２ＰＣにより駆動するモデュ ラー・インストルメンツ（Modular Instruments）（Malvern，PA，USA）Ｍ−３ ０００データ捕捉システムで記録した。コンピュータは、アンダー(Amdur)およ びミード（Mead）(1958)の方法に基づく肺抵抗（ＲL）の訃算にカスタム・ソフ トウェア（BioReport，Modular Instruments）を利用した。読み取りは、継続的 に行われ、１０秒間隔で平均をとった。ＲLの値を、換気回路の内部抵抗(０．１ １cmＨ2Ｏ/ml／秒)に関して補正した。動物にプロプラノロール(１mg/kg、静脈 注射）を与え、サブスタンスＰの投与開始まで１０分間安定化した。 約５〜１０分間隔でボーラス注射を投与することにより、サブスタンスＰ（１ 、３、５および１０μg/kg、静脈注射）の投与量反応効果が得られた。各投与量 に関して最大のＲLの変化を得て、サブスタンスＰの投与前に測定した基線値に 対するパーセンテージで表した。ＲLの２００％増加を引き起こすサブスタンス Ｐの投与量として定義される、ＥＤ200値を、対数投与量反応曲線の線型回帰に より、各動物に関して測定した。 ＲLの基線値は、約０．３０cmＨ2Ｏ/ml／秒であり、群間に有意な差はなかっ た(Ｐ＞０．０５)。感作非チャレンジモルモットは、サブスタンスＰに対する感 受性が比較的低く、ＲLを少なくとも２００％またはそれ以上増加させるために ３０μｇ/kgの投与量を必要とした(表１)。対照的に、ＯＡチャレンジ後には、 サブスタンスＰに対する気道反応性が顕著に増加した。ＥＤ200値は、約１０倍 増加し(表１)、サブスタンスＰの最大投与量で、最大ＲLが約５倍増加した(表１ )。 表１：ＯＡ感作モルモットのサブスタンスＰに対する気道反応に対するＴＮＦＲ −Ｉｇおよびデキサメタゾンの効果の要約 a サブスタンスＰの投与量反応効果は、０．１％ＯＡエアロゾルを３０分間チ ャレンジした６時間後に測定した。サブスタンスＰに対する気道反応を調べる１ ０分前に、動物をプロプラノロール（１mg/kg、静脈注射）で前処理した。b １ml/kgという投与容量を用いて、それぞれ、ビヒクル、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（Ｏ Ａチャレンジの１８および１時間前）またはデキサメタゾン（ＯＡチャレンジの １時間前および４時間後）の静脈注射で動物を前処理した。c 値は、肺抵抗（ＲL）を基線の２００％増加させるために必要なサブスタンス Ｐの投与量（ｇ/kgでの）の負の対数（平均値+／-Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。d 値（平均値+／-Ｓ．Ｅ．Ｍ．）は、サブスタンスＰ（１０μｇ/kg、静脈注射 ）により生じた基線ＲLの％増加を表す。e 群当たりの動物数f ＯＡエアロゾルでチャレンジされなかった感作動物群でサブスタンスＰの投 与量反応効果を調べた。* それぞれのビヒクル処理群と薬物処理群との間で、値に統計的有意な差（Ｐ ＜０．０５） 感作動物へＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg）を投与することにより、ＯＡにより誘 導されるサブスタンスＰに対する気道過敏性が有意に阻害された(Ｐ＜０．０５) 。サブスタンスＰのＥＤ200値は約３倍減少し、最大ＲLは約６０％減少した(表 １)。低い方の投与量のＴＮＦＲ−Ｉｇ（１mg/kg）は、サブスタンスに対する感 受性に影響を与えなかった(表１)。デキサメタゾン処理（３０mg/kg）でも、感 作モルモットにおいて、ＯＡにより誘導される気道過敏性が有意に阻害された( Ｐ＜０．０５)。その程度は、ＴＮＦＲ−Ｉｇの大きい方の投与量で得られたも のとほぼ同程度であった(表１)。例５： ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減されたモルモットにおける喘息症状（炎症細胞 流入） この例では、続いてのＯＡ曝露により炎症細胞流入という喘息症状が誘導され るよう、ＯＡに対してアレルギー性にされた、例４に記載のモルモットを使用す る。この症状は、ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減される。それもまた、喘息を軽減さ せることが知られているステロイド、デキサメタゾンと比較する。 例４と同様にして、気道炎症細胞蓄積を含む喘息症状を誘導するため、記載さ れたようにして雄のモルモットをＯＡ感作し、チャレンジを行った。炎症細胞蓄 積を、チャレンジの６、２４、４８および７２時間後に定量した。例４と同様に して、これらの症状に対するＴＮＦＲ−Ｉｇの効果を測定するため、チャレンジ 前にＴＮＦＲ−Ｉｇを投与し、チャレンジされていない動物とその症状を比較し たところ、減少していることが示された。炎症のためのチャレンジの前にもＴＮ ＦＲ−Ｉｇを投与し、炎症細胞流入が改善されることが示された。６および２４ 時間での、炎症細胞蓄積に対する匹敵する効果が、デキサメタゾン(３０mg/kg、 静脈注射、チャレンジの１時間前および４時間後)で得られた。 用いた方法は以下のとおりである。以前に記載された方法（Selig and Tocker ，1992）に従い、ＯＡチャレンジの６時間後および２４時間後に、ＢＡＬにより 気道炎症細胞流入を調べた。簡単に説明すると、モルモットにウレタン（２g/kg 、静脈注射）で麻酔をかけ、１５ゲージのカテーテルで気管開口した。Ｃａ2+お よびＭｇ2+を含まない５mlの無菌ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Gibco，Gra nd Island，NY，USA）で３回肺を洗浄した。試料を２５℃で１０分間２００ｇで 遠心分離し、得られたペレットから蒸留水（１ml、３０秒間）で赤血球を溶解 させた後、１０mlのＨＢＳＳを添加することにより浸透圧を元に戻した。試料を 再び遠心分離し(２００ｇ、１０分間、２５℃)、得られたペレットを１mlのＨＢ ＳＳに再懸濁させた。血球計数器を用いて、細胞懸濁液のアリコートから、トリ パンブルー（Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA）排除により、全細胞数を決定し た。種類別の細胞数を計数するため、細胞懸濁液のアリコートをサイトスピン（ Cytospin）で遠心分離し(５分、１３００rpm;Shandon Southern Instruments，S ewickey,PA,USA)、スライドを固定し、改変ライト染色で染色した(Leukostat;Fi sher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)。光学顕微鏡下で少なくとも３００個 の細胞を分類するため、標準的な形態学的基準を用いた。データは、ＢＡＬ細胞 数×１０6／動物として表した。 ＴＮＦＲ−Ｉｇ処理（１〜３mg/kg）静脈注射、１８および１時間および、６ および２４時間後のＢＡＬのための１時間前処理）により、それぞれ、ＢＡＬ中 の好中球および全細胞の蓄積が有意に阻害された（ＯＡの６および２４時間後） (Ｐ＜０．０５)。ＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg、静脈注射）は、両時点でＢＡＬ中 の好酸球数も有意に減少させたが(Ｐ＜０．０５)、低い方の投与量（１mg/kg、 静脈注射）は効果がなかった。本実験の結果は、アレルゲンにより誘導された炎 症反応の好中球成分が、ＴＮＦにより媒介されることも示している。最も注目す べきこととして、ＴＮＦＲ−Ｉｇは、抗原チャレンジの２４時間後に感作モルモ ットのＢＡＬ中の好中球の流入をほぼ消失させ、好中球数はＢＡＬ中の全細胞の 約２％となった。さらに、ＴＮＦＲ−Ｉｇ処理により、チャレンジの６時間後に モルモットにおける好中球の実質的な減少が生じたが、デキサメタゾンではその ようなことは起こらなかった。ＴＮＦＲ−Ｉｇまたはそれと類似のアンタゴニス トによるＴＮＦの阻害は、肺への好中球の動員に寄与することが知られている因 子を非間接的に減少させる。 感作非チャレンジモルモットのＢＡＬの細胞組成は、以前に記載されている(S elig and Tocker，1992)。これらの動物における全細胞数は、平均約１×１０6 個／動物であり、そのうちの約２〜３％が好酸球および好中球である。ＯＡの６ 時間後、ＴＮＦＲ−Ｉｇまたはデキサメタゾンいずれかのビヒクルで処理した動 物においては、好酸球および好中球は、それぞれ、全細胞数の少な くとも４０および２０％を構成していた。ＢＡＬ中の好酸球のパーセンテージは 、２４時間では一定のままであったが、好中球数は、全細胞数の約１０％に減少 した。それぞれのＴＮＦＲ−Ｉｇビヒクル群とデキサメタゾンビヒクル群との間 では、炎症細胞数および全細胞数は相違しなかった(Ｐ＞０．０５)。 感作チャレンジモルモットのＢＡＬへの炎症細胞流入は、デキサメタゾン（３ ０mg/kg）によっても阻害された。ＯＡの６時間後、ＴＮＦＲ−Ｉｇにより引き 起こされたのと同様な、ＢＡＬ中の好酸球数および全細胞数の有意な減少が見ら れた(Ｐ＜０．０５)。６時間の時点０で、好中球数には影響はなかった。ＯＡの ２４時間後、ＢＡＬ中の好酸球数、好中球数および全細胞数はデキサメタゾンに より有意に阻害された(Ｐ＜０．０５)。ＴＮＦＲ−Ｉｇと比較すると、デキサメ タゾン処理動物の好酸球数は約５倍少なかった(Ｐ＜０．０５)。対照的に、デキ サメタゾン処理はＢＡＬ中の好中球数を減少させたが、種類別には、これらの細 胞の割合は、全細胞数の約８％のまま不変であった(Ｐ＞０．０５)。 ＴＮＦＲ−Ｉｇが進行中の炎症反応を改善する能力を、感作モルモットで調べ た。上記のようにして、動物をＯＡ感作し、次にチャレンジした。ＴＮＦＲ−Ｉ ｇ（３mg/kg、静脈注射）をＯＡチャレンジの３０分後に投与した。チャレンジ の２４、４８および７２時間後、ＢＡＬにより炎症を測定した。４８および７２ 時間の時点には、ＴＮＦＲ−Ｉｇを毎日投与した。チャレンジ後のＴＮＦＲ−Ｉ ｇ処理は、感作モルモットのＢＡＬ中の炎症細胞の流入を顕著に改善した。例６： ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減されたモルモットにおける喘息症状（肺浮腫） この例では、続いてのＯＡ曝露により肺浮腫という喘息症状が誘導されるよう 、ＯＡに対してアレルギー性にされた、例４に記載のモルモットを使用する。こ の症状は、ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減される。それもまた、喘息を軽減させるこ とが知られているステロイド、デキサメタゾンと比較する。 例４と同様にして、浮腫を含む喘息症状を誘導するため、記載されたようにし て雄のモルモットをＯＡ感作し、チャレンジを行った。浮腫は、チャレンジの６ 時間後に定量した。例４と同様にして、これらの症状に対するＴＮＦＲ−Ｉｇの 効果を決定するため、チャレンジ前にＴＮＦＲ−Ｉｇを投与し、チャレンジされ ていない動物と症状を比較したところ、減少していることが示された。 用いた方法は以下のとおりである。ＯＡの６時間後に、肺浮腫のマーカーであ る気道毛細血管漏出を、以前に記載された方法（Wasserman et al.，Adv．Prost aglandin Thromboxane LeukotrieneRes．23:271-273,1995）を用いて、エバンス ブルー色素溢出により定量した。モルモットにウレタン（２g/kg、静脈注射）で 麻酔をかけ、頚静脈にカテーテルを取り付けた。次に、６０秒かけて送ったエバ ンスブルー色素（３０mg/kg、静脈注射）を動物に与えた。１０分後、胸郭を切 開し、左心室から大動脈へとカテーテル（ＰＥ−２４０管材料）を挿入した。心 室をクロス・クランプし(cross clamped)、右心房を切断し、１００ml／分の速 度でカートリッジ・ポンプ(Masterflex;Cole-Parmer,Chicago，IL，USA)を用い て１００mlの生理食塩水で動物を灌流することにより血液を排出させた。肺動脈 にカテーテルを挿入し、左心室を切断することにより、さらに５０mlの生理食塩 水で肺循環を灌流した。肺全体を取り出し、胸郭（遠位５mm）および主気管支を 切除し、フィルター紙間でブロッティングし、定量した。エバンスブルー色素を ホルムアミド（３７℃、２４時間）で抽出し、吸光度計(Beckman Instruments M odel DU-64，Somerset，NJ，USA）で６２０nmの吸光度を測定することにより定 量した。エバンスブルー色素濃度の標準曲線（０．５〜１０μｇ/ml）から組織 色素含量を内挿し、組織１mg湿重量当たりのｎｇ数で表した。 エバンスブルー色素を気道毛細血管漏出のマーカーとして使用すると、感作非 チャレンジモルモットの胸郭および主気管支の基底レベルは、平均して、組織１ mg湿重量当たり１０〜２０ng/mgであった。ＯＡチャレンジの６時間後、胸郭お よび主気管支のエバンスブルー色素含量は、約５倍に増加した。ＴＮＦＲ−Ｉｇ （１または３mg/kg）またはデキサメタゾン（３０mg/kg）のいずれかで処理する ことにより、胸郭および主気管支両方で、チャレンジの６時間後のＯＡ誘導気道 漏出が軽減された(Ｐ＜０．０５)。 ＴＮＦＲ−Ｉｇ（１または３mg/kg、静脈注射）により、感作モルモットの胸 郭および主気管支におけるＯＡ誘導気道浮腫（組織エバンスブルー色素含量によ り定量）が消失した。例７： ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減されたブラウン・ノルウェー（Brown Norway） ラットにおける喘息症状 モルモットを用いた例４と同様にして、ラットにおいて炎症細胞蓄積という喘 息症状を誘導し、ＴＮＦＲ−Ｉｇで処置した。ブラウン・ノルウェー・ラットに おけるアレルギー反応は、ＩｇＥにより媒介される点で、このモデルはモルモッ トと異なる。 用いた方法は以下のとおりである。雄のブラウン・ノルウェー・ラットをＯＡ （１mgＯＡおよび１００mgＡｌ(ＯＨ)3の０．５ml生理食塩水溶液、静脈注射） で、０、１、および２日目に感作した。２１日目に、１％ＯＡエアロゾルで３０ 分間動物をチャレンジした。チャレンジの２４時間後、ＢＡＬにより炎症細胞蓄 積を定量した。感作、チャレンジおよびＢＡＬのプロトコルは、以下の点を除い て、上記のモルモットの場合と同様であった。１、２、３日目に、体重２００〜 ２５０ｇの雄ブラウン・ノルウェー・ラット（Charles River，Kingston，NY） を、１回の静脈注射（１mgＯＡ＋１００mg水酸化アルミニウムの１ml無菌生理食 塩水溶液）で能動的にＯＡ感作し、２１日目に実験に用いた（Elwood et al.，1 992)。ＯＡエアロゾルの１時間前に、別のラット群に、それぞれ、ビヒクル、Ｔ ＮＦＲ−Ｉｇ（１または３mg/kg、静脈注射）またはデキサメタゾン(０．３mg/k g、静脈注射)を与えた。 実験の日、ラットを１％ＯＡエアロゾルで３０分間チャレンジした。チャレン ジの２４時間後、１ml／１００ｇのＨＢＳＳで２回肺を洗浄することにより、Ｂ ＡＬを行った。赤血球を０．５mlの蒸留水で溶解し、５mlのＨＢＳＳで浸透圧を 元に戻した。 上記ラットをＴＮＦＲ−Ｉｇ（3mg/kg、静脈注射、チャレンジの１時間前）で 処理することにより、ＢＡＬ中の好中球の蓄積が実質的に消失し、好酸球数およ び全細胞数が有意に減少した。デキサメタゾン（０．３mg/kg、静脈注射、チャ レンジの１時間前）では、同様の結果が得られた。低い方の投与量のＴＮＦＲ− Ｉｇ（１mg/kg、静脈注射）でも、ＢＡＬ中の好中球数は有意に減少したが、好 酸球数および全細胞数には影響がなかった。 より詳細には、感作非チャレンジブラウン・ノルウェー・ラットのＢＡＬ中の 基線全細胞数は、約１×１０6個／動物であり、そのうちの１〜２％が好酸球お よび好中球である。ＯＡチャレンジの２４時間後、ビヒクル処理動物のＢＡＬ中 の全細胞数は、約３倍に増加し、好酸球および好中球がそれぞれ、細胞集団の少 なくとも４０および２５％であった。それぞれのビヒクル処理群間で、ＢＡＬ中 の炎症細胞数および全細胞数は相違しなかった(Ｐ＞０．０５)。 ＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg、静脈注射）またはデキサメタゾン（０．３mg/kg、 静脈注射）のいずれかで処理することにより、ＢＡＬ中の好酸球、好中球および 全細胞の蓄積が同程度に有意に減少した(Ｐ＜０．０５)。低い方の投与量のＴＮ ＦＲ−Ｉｇ（１mg/kg、静脈注射）処理では、ＢＡＬ中の好中球数が有意に阻害 されたが(Ｐ＜０．０５)、ＢＡＬ中の好酸球の蓄積または全細胞数には影響がな かった。例８： 傷害を受けたラット肺における好中球増加症の減少 セファデックス粒子誘導肺炎症のラットモデルは、慢性喘息で見られるものと 類似した、肺内の好酸球数および好中球数の上昇、ならびに肉芽腫形成を示す。 このモデルを用いて、ＴＮＦＲ−Ｉｇがこの慢性症状を減少させることを示した 。 用いた方法は以下のとおりである。セファデックス・ビーズ懸濁液(７．５mg/ kg、静脈注射)を投与することにより、雄のスプラーグ・ダウレー（Sprague-Daw ley）ラットにおいて、肺への炎症細胞蓄積を誘導した。セファデックスの２４ および７２時間後、ＢＡＬ流体中の全白血球数が有意に増加した。２４時間後に 、好中球数は、全白血球数の約５０％となり、７２時間までに全体の約１０％に 減少した。好酸球数は、全白血球数の約１０％に維持された。 ＴＮＦＲ−Ｉｇ（１および３mg/kg、静脈注射、チャレンジの１時間前）また はデキサメタゾン（０．１および０．３mg/kg、静脈注射）のいずれかで前処理 することにより、セファデックスの２４時間後の好中球増加症は阻害されたが、 ＴＮＦＲ−Ｉｇは全細胞数には有意な影響を与えなかった。セファデックスの７ ２時間後、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（１および３mg/kg、静脈注射、毎日）によりＢＡＬ 流体中への好中球流入は有意に減少したが、好酸球数には阻害効果はなかった。 対照的に、デキサメタゾン（０．１および０．３mgkg−１、静脈注射、毎日）は 、ＢＡＬ流体中への好中球および好酸球の流入を実質的に消失させた。ＴＮＦＲ −Ｉｇ（１および３mg/kg、静脈注射）またはデキサメタゾン（０．１お よび０．３mg/kg、静脈注射）は、７２時問の時点で全細胞数を有意に減少させ た。例９： 霊長類におけるアトピー性喘息の軽減 ブタ回虫（Ascaris suum）抗原に対して天然の気道感受性を表す野生のカニク イザルを用いたアトピー性喘息の霊長類モデルを用い、ＴＮＦＲ−Ｉｇが気道過 敏性という喘息症状の効果を軽減させることを示した。反復的に抗原曝露される ことにより、気道の喘息症状、特に肺抵抗（ＲL）の増加が誘導される。ＴＮＦ Ｒ−Ｉｇで処理すると、サルはＲLの減少を示した。 天然に回虫感受性の野生カニクイザルは、吸入メタコリンに対する気道反応性 の増強を表し、反復的なブタ回虫抗原曝露に付すと気道好酸球増加症を表す。し たがって、この抗原を用いて、これらのサルにおいて、アレルギー反応およびそ の後の気道過敏性という喘息症状を誘導した。気道過敏性に対するＴＮＦＲ−Ｉ ｇの効果を調べるため、以下のようなプロトコルを用いた。 １日目：肺抵抗（ＲL）を１００％（ＰＣ100）増加させる、メタコリン(ＭＣｈ) 、気管支痙攣誘導因子様サブスタンスＰの投与量を測定。 ３日目：ＲLを少なくとも倍増させる吸入投与量回虫抗原でサルをチャレンジ。 ５および８日目：３日目の反復。 １０日目：１日目の反復。１日目と１０日目の間の対数ＰＣ100値の変化を測定 。 １、３、５および８日目にＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg、静脈注射）を投与する ことにより、ＭＣｈに対する気道過敏性が軽減された。例１０： ＴＮＦＲ−Ｉｇにより軽減されたマウスにおけるアレルギー性気道炎症 マウスにおけるＯＡ誘導アレルギー性肺炎症のマウスモデルを用いて、ＴＮＦ Ｒ−Ｉｇが炎症細胞流入という喘息症状を軽減させることを示した。感作マウス を反復的にＯＡ曝露させると、次第に、気道過敏性およびＢＡＬ中の好酸球流入 の増加を発症する。このモデルは、ＩｇＥレベルの上昇と関連しており、古典的 なＴｈ２サイトカイン・プロフィールを表す(すなわち、ＩＬ−４およびＩＬ− ５のレベルの上昇)。ＴＮＦＲ−Ｉｇが、進行中のアレルギー性炎症反応を軽減 させる能力をこのモデルで評価した。 気道過敏性および炎症細胞流入を誘導するためには、感作動物をアレルゲンに 複数回曝露させる必要があるという点で、アレルギー性肺炎症のマウスモデルは 、霊長類と類似している。０日目に、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをＯＡ（１０μ ｇ、１mgのＡｌ(ＯＨ)3ゲルとともに、０．１ml、静脈注射）で感作し、１４〜 ２０日から毎日３０分間１％ＯＡエアロゾルでチャレンジした。最後のＯＡチャ レンジの次の２４時間、ＭＣｈに対する気道過敏性およびＢＡＬを行った。感作 チャレンジマウスの肺のいくつかを組織学的試験のために固定化し、他をＴＮＦ レベルの決定のためホモジナイズした。 感作チャレンジマウスにおける炎症細胞蓄積およびＴＮＦのレベルは、ＯＡエ アロゾルによる最終チャレンジ（２０日目）に続いてピークに達した。本実験で は、最終ＯＡ曝露の直後に、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg、静脈注射）を投与した 。ＴＮＦＲ−Ｉｇは、ＯＡ誘導過敏症を軽減させたが、ＢＡＬ中の炎症細胞流入 には影響を与えなかった。チャレンジ期中毎日ＴＮＦＲ−Ｉｇを投与しても、Ｂ ＡＬ細胞数に対する影響はなかった。しかし、ＴＮＦＲ−Ｉｇ（３mg/kg、静脈 注射、２０日目）の投与は、感作チャレンジマウスの肺組織における好酸球数を 有意に減少させ、肺組織におけるＴＮＦレベルを消失させた。例１１： エアロゾル組成物 以下に、本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物を含むエアロゾル組成物の例を示す。例Ａ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ（１〜５ミクロンの粒子サイズ域） ３．０ｇ スパン(Span)（登録商標）８５（トリオレイン酸ソルビタン） １．０ フレオン（登録商標）１１（トリクロロモノフルオロメタン） ３０．０ フレオン（登録商標）１１４（ジクロロテトラフルオロエタン） ４１．０ フレオン（登録商標）１２（ジクロロジフルオロメタン） ２５．０例Ｂ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ ０．５％ スパン８５ ０．５％ 噴射剤Ｂ1 ９９．０％1 噴射剤Ｂは、１０％フレオン１１、５０．４％フレオン１１４、３１．５％フ レオン１２、および８．０％ブタンからなる。例Ｃ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ １．００％ スパン８５ ０．２５％ フレオン１１ ５．０％ フレオンＷ1 ９３．７５％1 フレオンＷは、６１．５％フレオン１１４および３８．５％フレオン１２から なる。例Ｄ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ ０．５０％ スパン８５ ０．５０％ 噴射剤（Ｃ）1 ９９．０％1 噴射剤Ｃは、３０．０％フレオン１１および７０％フレオンＷからなる。例Ｅ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ ０．８８％ 硫酸ナトリウム(無水)、微粒子化 ０．８８％ スパン８５ １．００％ ５０％フレオン１２、２５％フレオン１１、 ９７．２４％ および２５％フレオン１１４からなる噴射剤例Ｆ−エアロゾル ＴＮＦＲ−Ｉｇ ０．０６％ スパン８５ ０．０５％ フレオン１１ ２０．０％ フレオン１２／フレオン１１４（２０／８０） ７８．９％例１２： 注射用組成物 以下に、本発明のＴＮＦＲ−Ｉｇ調製物を含む注射用組成物の例を示す。成分 １ml当たりの含量 ＴＮＦＲ−ＩｇＧ１ * 無水クエン酸、米国薬局方 １．９２mg グリシン、米国薬局方 １．７０mg マンニトール、発熱性物質非含有、米国薬局方 ４１．９０mg 水酸化ナトリウム 十分量、pH６．０ 塩酸 十分量、pH６．０ 注射用水、米国薬局方 十分量、全量１０ml** * 本処方において用いられるＴＮＦＲ−ＩｇＧ１の濃度は、１．０mg/ml〜２０m g/mlでありうる。本処方中のＴＮＦＲ−ＩｇＧ１の最終量は、処方濃度およびバ イアル容量に基づき選択される。** 凍結乾燥により除去される １mgバイアル （１mlの１．０mg/ml処方を使用） ２．５mgバイアル （１mlの２．５mg/ml処方を使用） ５．０mgバイアル （１mlの５．０mg/ml処方を使用） １０mgバイアル （２m1の５．０mg/ml処方を使用） １０mgバイアル （１mlの１０．０mg/ml処方を使用） ２０mgバイアル （２．５mlの８．０mg/ml処方を使用） ２０mgバイアル （４mlの５．０mg/ml処方を使用） ５０mgバイアル （２．５mlの２０mg/ml処方を使用） 参考文献 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                       Treatment of asthma with TNFR-Ig   Asthma is defined as specific allergens (IgE-mediated reactions), exercise, cold or stress. Is an inflammatory disease of the respiratory tract, characterized by recurrent exacerbations following exposure to cancer. Asthma disease The characteristics of inflammation associated with are the presence of activated eosinophils, Increased airway sensitivity (airway hyperresponsiveness: AHR), edema, mucus hypersecretion and cough You. This inflammatory process involves the production of Th-2 type lymphocytes that secrete various cytokines. And is thought to be mediated in part by activation. Cytokine TNF α is a cytokine that is involved in the development of asthma symptoms.   Many therapeutic agents are used to treat asthma,TwoAgonist (acute Reducing bronchial spasm) and steroids (anti-inflammatory) have become the drugs of choice. You. However, mortality from the disease is increasing, and both therapies are adequate. It can not be said. One of the most urgently needed open issues in healthcare is Rapidly ameliorates severe, ongoing pulmonary inflammation as seen in acute / severe asthma It is a drug that can be used. In addition, there are no therapeutics that can be classified as Does not exist. Immediately improve the inflammatory response seen in acute / severe asthma Drugs that can and are true palliatives are indeed needed . The action of TNFα promotes asthmatic symptoms. Applicants block the action of TNFα. Determines that harm provides a means to mitigate these conditions did.   Applicants have prepared a preparation consisting of one or more chimeric TNFα binding proteins. Treating asthma in a patient suffering from asthma symptoms comprising administering to the patient a composition comprising We found a way to resist. Each protein in the preparation was fused to IgG. Composed of a soluble portion of the combined p55 TNF receptor protein. The fusion The IgG thus obtained is an IgG domain other than the first IgG domain of the IgG heavy chain constant region. Is included. The composition comprises a therapeutically inert carrier, wherein the composition is capable of treating the asthmatic condition. An effective amount of the chimeric protein preparation is provided to the patient to counteract. Is administered to the patient.   The composition comprises a chimeric protein preparation in an amount sufficient to reduce the effects of the seizure. Can be effectively administered to a patient suffering from an asthma attack. Onset of asthma attack Prior to administering an effective amount of the composition to prevent or delay the onset of a seizure, Can also be administered.   An object of the present invention is a preparation comprising one or more chimeric TNFα binding proteins Is administered to a patient with asthma symptoms by administering to the patient a composition comprising It is a way to compete. The protein in the preparation was IgG (immunoglobulin). G) p fused to IgG containing all but the first domain of the heavy chain constant region Consists of the soluble portion of the 55 TNF receptor protein (TNFR-Ig) . The composition also includes a therapeutically inert carrier. The composition is for combating the asthma symptoms Administered to a patient such that an effective amount of the chimeric protein preparation is provided to the patient. It is.   I containing all IgG domains other than the first IgG domain of the IgG heavy chain constant region Consists of the soluble part of the p55 TNF receptor protein fused to gG The use of a chimeric TNFα binding protein for the manufacture of a medicament for treating asthma is disclosed by the present invention. It is a further purpose of Ming.   The composition is such that the amount of the protein preparation is sufficient to reduce the effects of the asthma attack. Can be effectively administered to patients undergoing an asthma attack. Before starting an asthma attack, Amount of protein preparation is effective to prevent or delay onset of seizure As such, the compositions can also be administered to asthmatics.   Any TNFR-Ig, ie, from the first IgG domain of the IgG heavy chain constant region P55 TNF receptor protein fused to an IgG containing the entire outer IgG domain A chimeric TNFα binding protein composed of a soluble portion of Use in a preparation according to the invention for combating asthma in patients with severe asthma symptoms Can be. The IgG can be a human IgG1 or an IgG3, but the IgG1 Is preferred in the present invention.   Examples of such TNFR-Ig include EP 417563, U.S. Pat. Nos. 5,447,851, 5,395,760, Lesslauer, et al. Eur . J. Immunol. 21 (11): 2883,1991, Loetscher et al. , J. Bio1. Chem. 266 (27): 18324 , 1991, Ashkenazi et al. , PNAS (USA) 88: 10535, 1991. Park quality. Methods for obtaining them are also disclosed in these documents.   Preferred preparations of TNFR-Ig molecules of the invention are made using IgG1. A conjugated oligosaccharide having at least one sialic acid residue at the end, and exposed N-acetyl Includes proteins with glucosamine. The molar ratio of sialic acid residues in the preparation is About 4 to about 7 moles of sialic acid per mole of protein, especially about 5 to about 6 moles, The molar ratio of exposed N-acetylglucosamine in the preparation was About 1 to about 2 moles of N-acetylglucosamine, and sialic acid residues in the preparation. The molar ratio of the group to the N-acetylglucosamine residue is about 0.5. 35 to about 0. 5, especially about 0. 4 to about 0. 45. The preparation is about 5. 5 to about 7. The isoelectric point (pI) of 5 Have. This isoelectric point can be determined by chromatofocusing. And is sensitive to neuraminidase treatment.   The TNFR-Ig of the present invention can be prepared by a conventional recombinant technique or a protein synthesis method. Can be obtained by DNA encoding the p55 TNF receptor, Ig Coding all domains except the first domain of the heavy chain constant region of G1 or IgG3. DNA to be loaded, and ligation for expression of such sequences in a suitable vector. Iigation is known to those skilled in the art and has been disclosed in the literature. Suitable Cloni Vectors and host cells are well known and can be selected by those skilled in the art, and (Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed. , Rickwoo d and Hameseds. , Oxford University Press, NY 1992).   Next, TNFR-Ig is synthesized using known protein recovery and purification methods. It can be purified. TNFR-Ig is preferably cultured as a secreted polypeptide. It is recovered from the culture medium but can also be recovered from the host cell lysate. Culture medium Alternatively, the lysate can be centrifuged to remove particulate cell debris. afterwards, TNFR-Ig is purified from contaminating soluble proteins and polypeptides. Made. The following method is an example of a suitable purification method. Immuno affinity ・ Fractionation on column or ion exchange column, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, Chromatography and chromatography on cation exchange resins such as Lica or DEAE Tofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation, such as Sephadex G-7 5 and a protein for removing contaminants such as IgG. A Sepharose column. Like phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Various protease inhibitors are also useful for inhibiting proteolysis during purification. One of skill in the art will recognize that appropriate purification methods for the polypeptide of interest include recombinant cells. Modifications may be required to alter the properties of the polypeptide during expression in culture Understand what you can't do.   Patent application title: Specific ratio of sialic acid to N-acetylglucosamine and pI The clear TNFR-Ig is described, for example, in WO 96/39488. Thus, TNFR-Ig is expressed using recombinant mammalian cells, Obtaining by adjusting mammalian cell culture conditions to produce R-Ig Can be. The selected host cells are N-linked or O-linked carbohydrates containing sialic acid. Must be able to be added to the protein expressed by the cell. That An example of such a host cell is a CHO cell. Appropriate culture conditions are well known. Depends on the host cell chosen. Cell-specific production during the glycoprotein production phase Increasing the sex reduces the sialic acid content of the mature protein. Converse The same is true. Factors affecting cell-specific productivity are well known in the art. , Factors affecting DNA / RNA copy number, such as factors stabilizing RNA Factors that affect various RNAs, nutrients and other additives in the medium, transcription enhancement Including the concentration of the sensor, the osmotic pressure of the culture environment, and the temperature and pH of the cell culture. It is not limited to them. By adjusting these factors using known methods, Preferred contents of glycoproteins such as luic acid can be obtained. During the transition period, An alkanoic acid such as thorium or a salt thereof is added to about 0. 1 mM to about 20 mM, and Is added to the cell culture at a concentration of 5-20 mM to increase the osmotic pressure of the cell culture. Adjusting between 250 and 600 mOsm, possibly combining each other Therefore, when the cell-specific productivity during the production phase of cell culture is changed, the amount of sialic acid differs. Protein is produced. About 6. Sodium butyrate concentration of 0 mM and 35 Under conditions of 0-400 mOsm, the highly sialylated TNFR-I of the present invention g, but at a concentration of about 12 mM sodium butyrate, lower sialic acid Thus, a TNFR-Ig of the present invention is obtained. The latter concentration is 450-550 mO Can be combined with the condition sm.   One skilled in the art will appreciate that the osmotic pressure of the medium will vary with the concentration of Many variables that make up complex mammalian cell culture media affect osmotic pressure Understand that. The initial osmotic pressure of the culture medium is determined by the composition of the culture medium Is done. The osmotic pressure is determined, for example, by Fisher Scie ntific, Pittburgh, Pennsylvania) under the trade name OSMETTE. Osmometers sold (or Precision Systems, Inc. Obtain from Natick MA It can be measured using an osmometer such as the Osmette Model 2007). Preferred range In order to achieve an osmotic pressure, the concentration of various components in the culture medium can be adjusted. it can. Solutes that can be added to the culture medium to increase osmotic pressure include: Hydrolyzed animal proteins such as proteins, peptides, amino acids and peptones Quality, non-metabolizable polymers, vitamins, ions, salts, sugars (especially glucose), metabolites, Organic acids and lipids are included. In one embodiment, the osmotic pressure is a fed-batch method. By adding peptone to cell culture with other culture media components Is done.   The following three stages of cell culture can be utilized: That is, the selected The growth phase, at which cell growth in mammalian host cells is maximized, followed by the mature glycoprotein Cell culture parameters as described above are selected for the desired sialic acid content of the quality, The transition phase to be applied, then the parameters selected during the transition phase are maintained and the glycoprotein This is the production phase in which the quality product is produced and obtained. Regarding purification, the carbohydrate of the present invention Purification techniques and methods for selecting the product are preferred in the present invention. For example, ion exchange Soft gel chromatography or cation or anion exchange resin By collecting the more acidic fraction by HPLC using Desirable glycoforms of the invention can be enriched for molecules.   The preferred TNFR-Ig of the present invention has the following characteristics in a purified composition. Having one or more of the following: The pi range of the TNFR-Ig composition is approximately 5. 5 ~ 7. 5 The molar ratio of sialic acid to protein is from about 4 to about 7, especially about 5 to about 6 exposed N-acetylglucosamine residues per mole of protein Is about 1 to about 2, and the molar ratio of sialic acid to N-acetylglucosamine is About 0. 35 to about 0. 5, more preferably about 0. 4 to about 0. 45. like this The most suitable conditions for obtaining the most preferable TNFR-Ig are about 0.3. 1 mM ~ Sodium butyrate concentration of about 6 mM, osmosis maintained between about 300-450 mOsm Culture conditions using pressure, temperatures between approximately 30 ° C. and 37 ° C. are used.   Such characteristics of TNFR-Ig can be determined by those skilled in the art using well-known methods. Can be done. For example, complex carbohydrates of glycoproteins produced by the method of the invention The portions can be easily analyzed by conventional carbohydrate analysis, if desired. Accordingly And by methods well known in the art, such as, for example, lectin blotting. The ratio of mannose at the end or other sugars such as galactose is revealed. Mono-antennary, bi-antennary, tri-antennary, or tetra-antennary The presence of sialic acid at the end of the nuri oligosaccharide is determined by the hydrazine anhydride method or Sugars are released from the protein using an enzymatic method and ion exchange or size exclusion chromatography. The oligosaccharide can be fractionated by chromatography or other methods well known in the art. And can be confirmed. Sialic acid removal by neuraminidase treatment Before and after the measurement, the pI of the glycoprotein may be measured. P after neuraminidase treatment If I increases, it indicates that sialic acid is present in the glycoprotein. You.   The carbohydrate structures of the present invention are expressed as N-linked or O-linked carbohydrates. Present on isolated proteins. N-linked and O-linked carbohydrates are mainly Structure is different. N-linked glycosylation means that the carbohydrate moiety is penetrated via GlcNAc. It refers to being added to an asparagine residue in the peptide chain. N-linked carbohydrates are And a common Man1-6 (Man1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4 Includes GlcNAcβ-R core structure. Therefore, in the above core structure, R is a product. Represents the asparagine residue of the produced protein. Protein pepti produced The sequences are asparagine-X-serine, asparagine-X-threonine, and Includes asparagine-X-cysteine. Here, X is any amino acid other than proline. No acid. In contrast, O-linked carbohydrates show that GalNAc has threonine or It is characterized by a common core structure added to the hydroxyl group of phosphorus. N-linked carbohydrate The most important of the N- and O-linked carbohydrates are complex N-linked carbohydrates and O-linked carbohydrates. It is a carbohydrate. Such complex carbohydrates have several antennary structures Including. Mono-, bi-, tri- and tetra-shell structures are responsible for the addition of terminal sialic acid. Important. Such shell structures provide additional sites for specific sugars and Provided are the bonds that make up the carbohydrates of the invention.   The resulting carbohydrate can be obtained by any method known in the art, including the methods described herein. It can also be analyzed by methods. Several methods for glycosylation analysis are available in the art. And are useful with respect to the present invention. Such methods are available for peptides. Provides information on the identity and composition of added oligosaccharides. Useful in the present invention Lectin chromatography, high pH anion exchange HPAEC-PA Separates Oligosaccharides Based on Charge Using Chromatography D, NMR, mass spectrometry, HPLC, GPC, monosaccharide composition analysis, But not limited to them.   Furthermore, methods for releasing oligosaccharides are known. These methods include 1) Usually using peptide-N-glycosidase F / endo-β-galactosidase Enzymatic method performed 2) Mainly release O-bonded structure using severe alkaline environment Removal method, and 3) both N-linked and O-linked oligosaccharides using anhydrous hydrazine Chemical methods to release   The analysis can be performed using the following steps.   1. Dialyze the sample against deionized water to remove any buffer salts and freeze dry. Dry.   2. The complete oligocarbohydrate is released with anhydrous hydrazine.   3. Treat the complete oligocarbohydrate with anhydrous hydrochloric acid methanol and separate the individual monosaccharides with O-medium. Generated as a chill derivative.   4. N-acetylation of any primary amino groups.   5. Derivatization to give per-O-trimethylsilylmethyl glycoside I do.   6. Capillary GLC (gas-liquid chromatography) using a CP-SIL8 column Fee) separates these derivatives.   7. By comparing retention times and mass spectrometry from GLC with known standards To identify individual glycoside derivatives.   8. Individual by FID using internal standard (13-O-methyl-D-glucose) Is quantified.   Neutral and amino sugars are used for fast anion exchange combined with pulsed current detection. Chromatography (HPAE-PAD Carbohydrate System, Dionex Corp. Determined by it can. For example, sugars are hydrolyzed in 20% (v / v) trifluoroacetic acid at 100 ° C for 6 hours. It can be released by decomposition. The hydrolyzate is then freeze-dried Dry or dry with a Speed-Vac (Savant Instruments) You. Next, Anumula et al. (Anal. Biochem. 195: 269-280 (1991)) Thus, the residue was dissolved in a 1% sodium acetate trihydrate solution, and HPLC-A Analyze on S6 column.   Sialic acid can be obtained separately from Yao et al. (Anal. Biochem. 179: 332-335 (1989)) By the method, three samples can be determined. In a preferred embodiment Warren, L .; J. Biol Chem238: (8) (1959) thiobarbituric acid (TBA) used.   Alternatively, immunoblot carbohydrate analysis may be performed. In this method, Haselb eck and Hosel [Haselbeck et al. Glycoconjugate J. , 7:63 (1990)]. Commercial glycan detection system (Boeringer) based on the oxidized immunoblot method described Is used to detect carbohydrates bound to proteins. Nitrose protein Transferring to polyvinylidene difluoride membrane instead of roulose membrane, blocky Buffering solution is 0. 10 mM Tris buffer containing 9% sodium chloride, pH7. In 4 Except that it contains 5% bovine serum albumin, except for the staining protocol recommended by the manufacturer. Obey the rules. Detection was performed with anti-digoxy conjugated to an alkaline phosphate conjugate. Genin antibody (Boeringer) diluted 1000 times with Tris buffered saline Phosphine containing 100 mM sodium chloride and 50 mM magnesium chloride Vatase substrate; 03% (w / v) 4-nitro blue tetrazolium chloride And 0. 03% (w / v) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosph 8. 100 mM Tris buffer, pH 9. Perform using 5 solutions. Carbohydrates Protein bands are usually visualized within approximately 10-15 minutes.   Carbohydrates can also be analyzed by peptide-N-glycosidase F degradation . In this method, 0. 18% SDS, 18 mM beta-mercaptoethanol, 90 2. mM phosphoric acid, 14 μl of buffer containing 6 mM EDTA, pH 8. Suspended residue in 6 And heat at 100 ° C. for 3 minutes. After cooling to room temperature, the sample is bisected. on the other hand Aliquots are not treated further and serve as controls. Approximately 1% N Adjusted with P-40 surfactant, 0.1 Two units of peptide-N-glycosidase Add F (Boehringer). Both samples were kept at 37 ° C for 2 hours, and then SDS- Analyze by polyacrylamide gel electrophoresis.   The TNFR-Ig of the present invention also includes PEGylated TNFR-Ig. PEG conversion TNFR-Ig is a polyalkylene glycol (substituted or unsubstituted). TNFR-Ig molecules covalently bonded to such polymers, especially polyethylene glycol Means The conjugation may take place directly, but preferably, for example, in European Patent Nos. 510346, 593838, U.S. Pat. No. 4,917,888, No. 4,902,502, No. 4,847,325, No. 4, No. 5,179,337, 5,832,657, Veronese et al. Applied Bioc hem. and Biotech. 11: 141 (1985), and Monfardini et al. Bioconjugate Chem . 6:62 (1995), various cross-linking assays known in the art. It is performed using drugs. PEGylated TNFR-Ig is described for TNFR-Ig It can be used in the treatment and prevention of asthma in exactly the same way.   The TNFR-Ig preparations of the present invention are useful for combating asthma in asthmatics. It is for. In the treatment of patients with asthma attacks, these preparations may Can be reduced, e.g. to improve already occurring inflammation or to further inflammation Or suppress the occurrence of illness. These preparations, if given for prevention, Delays or prevents the onset of an asthma attack, or If so, the severity of seizures can be reduced.   According to the present invention, the preparation can be treated in any conventional manner for treatment or prevention in patients. Can be administered. Accordingly, the preparations of the present invention can be prepared using any of the usual therapeutically inactive It can be administered in a conventional pharmaceutical composition containing a carrier. Pharmaceutical compositions contain inert additives and And pharmacodynamically active additives. Liquid compositions include, for example, water-miscible It can be in the form of a bacterial solution. In addition, preservatives, stabilizers, water retention agents, Substances commonly used as emulsifiers and emulsifiers, and salts to alter osmotic pressure Substances that change the pH, such as buffers, and other additives May do it. Optionally, tocopherol, N-methyl-gamma-tocoferamine Antioxidants such as hydroxyanisole butyrate or hydroxytoluene butyrate It may be included in a pharmaceutical composition. Pharmaceutically acceptable excipients for the composition Alternatively, the carrier includes saline, buffered saline, dextrose, or water. I will. The composition has special stability such as sugars such as mannose and mannitol Agent, as well as a local anesthetic for an injectable composition such as, for example, lidocaine. You may go out. Said carrier substances and diluents include, for example, water, gelatin, Sauce, starch, magnesium stearate, talc, gum arabic, polyal It may be organic or inorganic, such as kylene glycol. The prerequisites are All auxiliaries and substances used in the manufacture of pharmaceutical compositions are non-toxic It is.   The preparations of the present invention can be administered parenterally (eg, subcutaneous, intravenous, intramuscular, Intraocular injection, intracapsular injection, intravertebral injection, intrasternal injection) can also be performed by spray inhalation. Can also be administered. Ordinary physicians for parenteral or spray inhalation administration Drug formulations can be used. Examples of suitable pharmaceutical compositions are infusion solutions or injections Solution. The preferred mode of administration is intravenous. Another preferred mode of administration The formula is aerosol administration.   Preparations according to the invention for combating asthma reduce or ameliorate the effects of seizures Used in any amount effective to prevent or delay the onset of seizures can do. Parenteral (injection) of the present invention for treating, preventing or ameliorating asthma ) The preferred dosage of the TNFR-Ig composition for administration is 1 kg body weight per patient. About 0. 1 to about 5. 0 mg TNFR-Ig preparation (mg / kg). Especially preferred A suitable dosage is about 1. 0 to about 3. It is 0 mg / kg. T for spraying for the same purpose The preferred dose of the NFR-Ig composition is about 0.5. 03% by weight to about 5. 0% by weight TNFR-Ig preparation. For each mode of administration, the therapeutic dose is 1 day on the day of treatment. Once daily or divided into smaller doses for a total administration It is administered during about 24 hours until the amount is reached.   For urgent treatment of asthma attacks by parenteral administration, 0.1 mg / patient / day. 1 ~ 5. 0, especially 1. 0-3. A single dose of 0 mg / kg is administered. For parenteral administration To prevent asthma by 1-5. 0, especially 1. 0-3. Dosage such as 0mg / kg However, preferably, every week, preferably twice a week to once a week, Is administered once or at intervals in another interval in between. Similarly, spray For emergency treatment of asthmatic attacks by administration, a single daily dose is inhaled. Prevention May be administered daily, preferably twice a week, depending on the patient and the condition. ~ Inhaled once a week, once a month or at intermediate intervals. Composition The exact dosage to be administered will be determined by the skilled physician and will depend on the type of use, It may vary depending on the formula and the needs of the patient. The exact dose for the patient The severity of the condition, the particular prescription used, and any It may be adjusted specifically by those skilled in the art in view of other drugs.   The spray composition of the present invention can be liquid or powder. They are nose or Administered via the mouth (intranasal or buccal). Examples of spray compositions are TNFR By adding mechanical action to the aqueous solution of the Ig preparation or the saline solution An atomizer made from a spray atomizer that can be directed to the nose or mouth This is a spray that is sprayed by a miser. Another example is when the mist is in such a solution Made by the patient (rather than spraying directly into the nose or mouth) A dynamically inhaled spray sprayed by a nebulizer. TNFR- If the Ig is a powder, the particles will not be exhaled by the patient after inhalation and will settle in the airways. It is necessary to have a size enough to stack. Urgent treatment or treatment for prevention Depending on the law, such a spray may be applied once a day as directed by the patient. Or inhaled more than once or less frequently. Spray on patient Is an inhaled amount of an effective amount of the present invention for treating or preventing asthma as described above. TNFR-Ig is administered. Affected areas of the respiratory tract (nasal cavity, trachea, bronchi, lower respiratory tract Or bronchiole) receives adequate amounts of TNFR-Ig by this method for asthma You.   The spray formulation of the present invention comprises about 0.1. 03% by weight to 5. 0% by weight, more preferably About 0. 03-0. 5%, especially about 0. 1-0. Provides a 3% preparation. preferable Spray formulations are aerosol formulations. Generally, such as nebulizer formulations A low dose range is preferred for sprays and a high dose range for aerosols. Book In the present invention, an effective amount of the TNFR-Ig preparation, preferably the above amount of preparation Any conventional aerosol formulation can be used to provide The patient is inhaling Release a measured dose of aerosol mist into the patient's mouth while Is most effectively taken into the mouth and into the lungs through the respiratory tract. Is effectively administered. As noted above, an effective amount may be administered orally or intranasally at once. Or several divided doses throughout the day in low doses, daily for emergency treatment A dose is administered and prophylaxis is administered at weekly or monthly intervals.   Suitable aerosol formulations include a suitable amount of a pharmaceutically active compound (eg, TNFR -Ig preparation) and an effective amount of any conventional aerosol propellant. Any May be included. TNFR-Ig is combined with the liquid in solution Sprayed or as a powder (eg, lyophilized by known methods) Combined with the agent. The propellant is appropriately liquefied.   Surfactants that are soluble or dispersible in the propellant are more effective. Propellant Surfactants with a high solubility in water are most effective. Surfactants are non-irritating and It is also important to be non-toxic.   Uses any conventional propellant which is acceptable for use in pharmaceutical compositions known to those skilled in the art And may or may not be liquefied. TNFR-Ig powder Suitable for use with powdered active ingredients, depending on whether it is in a powdered or liquid form Or those suitable for use with liquid active ingredients. Liquefied jet used The propellant is a gas at room temperature (65 ° F.) and atmospheric pressure (760 mm of mercury) That is, it has a boiling point of less than 65 ° F. at atmospheric pressure and is non-toxic. use Suitable liquefied propellants that can be used include those having 5 carbon atoms, such as butane and pentane. There are lower alkanes containing Examples of liquefied propellants are trade names "Freon" on) '' or fluorinated or fluorinated It is a lower alkane. Mixtures of the above propellants are also preferably used.   The outline of the present invention has been described above, but the present invention is better understood by referring to the following examples. It will be easily understood. Examples are for illustration and unless otherwise noted. , It is not intended to limit the invention. An exampleExample 1 : Plasmid encoding TNFR-Ig for use in the production of TNFR-Ig Sumid A.Cell line   Chinese hamster ovary (CHO) cells used as mammalian host cell lines The cell system was derived from CHO-K1 (ATCC No. CCL61 CHO-K1). Next, CHO- K1 DUX-B11 (DHFR-), The CHO-K1 mutant dihydro Folate reductase (DHFR-) Deficient cell line (Dr. L. Cha from Columbia University) Sin; Simonsen, C .; C., and Levinson, A. D., (1983) Proc. N atl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499; Urlaub G., and Chasin, L .; (1980) Proc . Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220) to determine the cD of preproinsulin. Transformation with a vector containing NA (Sures et al., (1980) Science , 208: 57-59), resulting in a cell line with reduced insulin requirement. dp12. CHO and The selected clones named for growth, glycine, hypoxanthine, and DHFR requires thymidine-The genotype is confirmed. B.Construction of a soluble type 1 TNFR-IgG 1 chimera   The extracellular domain of human type 1 TNFR is1Heavy chain hinge region and CH2 Domain and CHBy fusion with 3 domains, soluble type 1 TNF R-IgG1A chimera was constructed (hereinafter TNFR1-IgG1). Alternatively, Uses the hinge region and the CH2 and CH3 domains of the IgG3 heavy chain I was able to do it.   The human type 1 TNFR coding DNA sequence (Loetscher et al., Supra) was Rasmid pRK-TNF-R [Schall et al., Cell 61, 361 (1990)]. . To construct this starting plasmid, a 2.1 kb placental cDNA clone (Sc hall et al., supra) was inserted into the mammalian expression vector pRK5. pRK5 The construction is disclosed in EP 307,247. This cDNA is Starting at nucleotide 64 of the sequence reported by Scher et al. It has an initiating methionine downstream of bp.   IgG1The origin of the coding region is IgG1CH2 Fc domain and CH 3 Aspartic acid 216 (participating in heavy-light chain binding to contain the Fc domain IgG after cysteine residue1Amino acid 114, the first residue of the hinge Is the first residue in the heavy chain constant region [Kabat et al., Sequences of Proteins of  Immunological Interest 4th edition (1987)]) and end at residue 441 Human IgG1Residues 1-180 of the mature human CD4 protein fused to the sequence ( A hybrid polypeptide consisting of two N-terminal CD4 variable domains) CD4-IgG expression plasmid pRKCD4 containing the cDNA sequence to be loadedTwoFC1 [Capon, D .; J. et al., Nature 337, 525 (1989); Byrn et al., Nature 344, 66. 7 (1990)]. See also EP 227110. Alternatively, p Using the CD4-Hγ3 vector (DSM5523, EP 394,827) May be used. Removal of the CD4 cDNA by SstI cleavage yields the desired Ig The G3 sequence is obtained.   TNFR-IgG1Are the plasmids pRK-TNF-R and pRKCD4TwoFC1 And the threonine residue 171 of the mature TNFR is IgG1Heavy chain Using deletion mutagenesis to be adjacent to aspartic acid residue 216 of They were constructed by ligation [Kabat et al., Supra]. Obtained The plasmid pRKTNFR-IgG was used for TNFR1IgG1Full length coding Contained an array. This plasmid is then passed through a method such as calcium phosphate precipitation. Host cells such as CHO cells can be transformed by a conventional method. Get The cultured cells can be cultured by a conventional method to express TNFR-Ig. The TNFR-Ig can then be isolated by conventional methods.Example 2 : About 5-6M sialic acid per protein, about 0.4-0. 45 MN-acetylglucosamine, TNFR- having a pI of about 5.5 to 7.5 Ig productionCell culture   Soluble type 1 TNFR-IgG1The gene of Example 1 encoding dp12. It was introduced into CHO cells. This is useful for introducing DNA into mammalian cells. This was performed using the calcium phosphate method. Two days after transformation, cells are trypsinized. With selective medium (Ha without glycine-hypoxanthine and thymidine) (1: 1 v / v mixture of m's F-12 DMEM and 2% dialyzed serum). So Followed by TNFR-IgG1The isolates were screened for secretion of. TNF R-IgG1Clones expressing are amplified in methotrexate and Were obtained and then adapted to serum-free media. These cells are used to increase the challenge Continued under selective pressure until transfer to non-selective medium for growth and amplification.   TNFR-IgG1To provide cells for production culture, the above group of cells was By repeating subculture from a medium containing rexate in a container of gradually larger capacity Expanded to growth medium without methotrexate. Of these steps in this procedure Therefore, non-selective growth medium contains glucose, amino acids, salts, sugars, vitamins, glycine , Hypoxanthine, and thymidine, recombinant human insulin, hydrolyzed pept (Primatone HS or Primatone RL), Pluronic F68 (Pluronic Po Gentama, a cytoprotective agent such as riol (Pluronic polyol) or its equivalent DMEM with modified concentrations of several components such as isin, lipids and minor components / HAM F-12 based formulation (eg, US Pat. No. 5,122,469) No.).   The culture is COTwoGas (acid) and / or NaTwoCOThreeUse (base) PH was adjusted to 7.2 +/- 0.4 by. Temperature controlled around 37 ° C during the growth phase did. By passing air and / or oxygen gas directly, dissolved oxygen is It was maintained at about 5% or more of the sum. The osmotic pressure during the challenge amplification period is approximately 250 mOsm And 350 mOsm.   After the growth phase of each culture is the second or transition phase, where the culture parameters are The conditions optimal for growth were changed to those optimal for production. In this transition phase, the culture system Was generally lowered to between about 30 and 35 ° C. Add butyric acid, constant Osmotic pressure range. Products accumulated during this production phase were analyzed for sialic acid content.   In a typical synthesis schedule, approximately 1. 1. 2 × 106Cells at an initial osmotic pressure of 300-450 mOsm, preferably about 300 , Grown in the growth phase. Minor components, recombinant human in Suline and hydrolyzed peptone were supplemented. Under these conditions, cells were expanded for 2 days. Bred. At the beginning of the third day, the temperature of the cell culture was reduced. At the same time as the temperature changes, Or about 1 to 6 mmol, preferably 6 mmol, of sodium butyrate in the cell culture. The desired production osmotic pressure was obtained by adding various medium components to the culture. This The cells were fed-batch cultured under these conditions for 9 to 10 days. Various cultures can be applied to the cells as needed Earth components were given.   The pi of the highly sialylated composition is lower than the pI of the lower sialylated composition. Lower than I. Isoelectric focusing was performed on the composition. Isoelectric Focus Gels use a pH gradient created with ampholytes of different pH to provide an isoelectric point pI. Separates the glycoproteins of the composition. The composition was analyzed using a pH gradient of 10-4. It was performed using.   The above composition has a composition of about 5.5 to about 7.5, as measured by chromatofocusing. Indicates the isoelectric point range. This pI is sensitive to neuraminidase treatment.Recovery of TNFR-Ig   IgG fusion proteins as described in Capon et al., Nature 337: 525, 1989. The cell culture is obtained by centrifuging the cell culture and passing the resulting culture supernatant through a protein A column. Can be purified. Therefore, obtained as above The cell culture was centrifuged and the supernatant was applied to a protein A column. Capon et al. Immobilized Staphylococcus aureus protein, as described above, supra. The affinity chromatography using TNFR-Ig The preparation was purified to be more than 95% homogeneous.Carbohydrate analysis   A. The sialic acid content is described in Warren, L .; (1959) J.I. Biol. Chem. 234: 1971-1975 It can be analyzed by the method.   B. The release of neutral and amino sugars is controlled by high pH negative ions combined with pulsed current detection. It can be measured by on-exchange chromatography. Perform the analysis using the following steps: Was.   1. TNFR1-IgG so that the final sample is in 1% acetic acid1(About 50μ g / ml) and an appropriate reference sample was used to exchange the buffer.   2. About 90 μg of TNFR1-IgG1And reference material samples on dry ice And frozen in an alcohol bath, and the frozen samples were lyophilized overnight.   3. The lyophilized sample is regenerated with 500 μl of trifluoroacetic acid and Incubated for 1 hour at ° C.   4. After acid hydrolysis, TNFR1-IgG1And cool the reference sample and dry Evaporated to.   5. The sample was regenerated with water to a final concentration of about 0.6 mg / ml.   6. Dionex CarboPac PA1 (4 × 2 Pulse current detection using a 50 mm) column (Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA). High-pH anion-exchange chromatography combined with Separated.   7. Individual monosaccharides were quantified by comparison with a reference monosaccharide.Example 3   Preparation of TNFR-Ig 1. Using calcium phosphate co-precipitation, the CHO cell line DP12 (EP 30) 7,247)), plasmid pSV16B. TNFR-IgG (TNFR-I gG1) and pFD11 (encoding DHFR). Was. 2. Cell clones from the transformation were subjected to 2% dialyzed calf serum and 100 nm Using a selective medium containing ol / l methotrexate, scale up to 9 liters suspension culture. Expanded. Two 9 liter cultures were grown in serum-free medium without methotrexate. Used to inoculate a 100 liter incubator. Produced to reduce residual serum components After washing 1000 times with medium, before inoculating cells into a 1000 liter production vessel A 100 liter culture was inoculated into a 400 liter culture using a serum-free medium. Production medium consists of glucose, amino acids, glycine, hypoxanthine, thymidine, Recombinant human insulin, hydrolyzed peptone, Pluronic F68, Gentami A process based on DMEM / HAMF-12 supplemented with syn, lipid and trace components Who was 3. The production culture is COTwoGas (acid) and / or NaTwoCOThree13 days using During which time a pH of 7.2+ or -0.2 was maintained. Cell concentration of 5 × 10 per ml6Fine After reaching the cells, the culture temperature was changed to 37C-30C. On the second and fourth day The osmotic pressure of the culture was adjusted to about 450 mOsm / kg by adding a medium component. . Sodium butyrate was added to a final concentration of 12 mM. Air and / or culture Alternatively, the dissolved oxygen concentration was maintained at 60% air saturation by passing oxygen through. 4. Collect culture after 13 days and tangential flow filtration To separate the cells from the supernatant. The obtained cell culture solution (HCCF) is Concentration was approximately 20-fold using a 10 KD Maxisette membrane. Protein For A-chromatography, 1.0 M solid NaCl was added followed by 0.2 M Concentrate by filtration through a 2 micron Durapore filter Was clarified and adjusted. 5. After filtration, the conditioned HCCF was passed through immobilized Protein A. Substance After loading, it was washed several times before elution. TNFR-IgG was added to 0.05 M Stepwise elution was performed with Na / 20% (w / v) acid glycerol, pH 3.0. Elution pool Was adjusted to pH 5.0 by adding 1 M Na citrate. 6. After adjusting the pH, the protein A pool was diluted and S-Sepharose Fast. Loaded into the flow. After loading, washing, 0.05M MOPS / 0.05M Na Stepwise eluted with Cl, pH 7.2. 7. After step elution, dilute the S-Sepharose Fast Flow pool, Loaded on a Q-Sepharose Fast Flow column. The column is 0.125 M NaCl to 0.125 M NaC in 125 M MOPS, pH 7.2 Elution was performed with a linear gradient up to 1. 8. After linear gradient elution, add 1 to the Q-Sepharose Fast Flow Pool. Volume of 0.1 M Na acetate / 4.0 M urea / 2.0 M ammonium sulfate, pH 5.0 It was adjusted by adding 0.05M Na acetate / 2.0M urea / 1.0M sulfuric acid. Phenyl Toyopearl 650M (phe nyl Toyopearl 650M) column. Under these conditions, TNFR was applied to the column. -Ig passed. After loading, it was washed with equilibration buffer. Flow-through liquid and washing The liquids were combined to form a phenyl toyopearl pool. 9. Combine the two phenyl toyopearl pools and combine the 10 KD Filtron Concentration was performed using a Filtron Centrasette membrane. Concentrate to 0.01M Na citrate / 0.023M glycine / 0 / 023M mannitol, average pH 6.0 Through a balanced G-25 column to produce a TNFR-Ig composition. Was.   Examples 4-10 below show that the TNF-Ig of the present invention reduces the effects of asthma attacks An in vivo experiment is described that shows TNF receptor fusion protein TNFR- Ig is induced by antigen challenge in animal models of allergic lung inflammation. The reactions that occurred were significantly reduced and in some cases eliminated. TNF The magnitude of the inhibitory effect of R-Ig was obtained with the broad spectrum anti-inflammatory drug dexamethasone. Effect was comparable. Abbreviations: TNFα, tumor necrosis factor alpha; TNFR-Ig, recombinant soluble TN F receptor-IgG1 fusion protein; BAL, bronchoalveolar lavage; OA, Oboa Albumin; RL, Lung resistance; HBSS, Hanks balanced salt solution, substance P, Used to induce acute bronchospasm, conventionally called substance P in the literature Neuropeptides (eg, Selig and Tocker, Eur. J. Pharmacol. 213 (3): 3). 31-336 (1992)) Data analysis For all values in each experiment, mean +/- S.D. E. FIG. M. Total Calculated. Statistical differences are expressed as two-way repeated measures for variables on ranked data. Analysis, followed by Student Newman-K euls) Determined by performing multiple comparisons using the t-test or Student's t-test. Specified. P <0.05 was considered statistically significant. Calculations are run on a PC Microsoft Excel (EXCEL) 5.0 (Softmart, Exton, PA, USA) And Sigmastat (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA ) Performed using software package. Drugs All drugs were administered at a dose of 1 ml / kg. TNFR-Ig is described in Example 3. Produced and purified as described and the stock solution was sodium citrate (10 mM). Glycine (23 mM) and mannitol (230 mM), pH 6 Was. Before use, store an aliquot of the stock solution at -20 ° C and dilute with a sterile physiological diet. Made with salt water. The following are available from Sigma Chemical Co. (St. Louis , MO, USA) and prepared with sterile saline. Ovalbumin, aluminum hydroxide Um, urethane, substance P acetate, (+/-) Propranolol hydrochloride , Dexamethasone 21-phosphate and Evans blue.Example 4: TNFR-Ig reduced asthmatic symptoms in guinea pigs (airway hyperresponsiveness) sex)   In this example, subsequent OA exposure induces asthmatic symptoms of airway hyperresponsiveness Thus, guinea pigs made allergic to OA are used. This symptom Reduced by TNFR-Ig. Its effects are known to reduce asthma Compared to the steroid, dexamethasone.   Male guinea pigs were treated on day 0 with OA (10 μg, 1 mg A in 0.5 ml saline). l (OH)ThreeAnd subcutaneous injection). A dose of OA was given. On day 21, animals are challenged with 0.1% OA aerosol for 30 minutes. Arranged. This sensitization is due to the airway to substance P in guinea pigs. Causes asthma-like symptoms, including hypersensitivity. TNFR-Ig for this condition To determine the effect, administer TNFR-Ig before challenge and challenge A comparison of the symptoms with animals that did not show a decrease. Dexame Comparable to Tazone (30 mg / kg, intravenous injection, 1 hour before and 4 hours after challenge) The effect on respiratory tract hyperresponsiveness was obtained. Dexamethasone is known for asthma The treatment of.   By sensitizing, challenging, and treating guinea pigs, Thus, it was prepared for the experiment. Sensitization Male Hartley strain guinea pig weighing 250-300 g (Cha rles River, Kingston, NY, USA) on days 0 and 14 with a single subcutaneous injection By injection (10 μg OA in 0.5 ml sterile saline + 1 mg aluminum hydroxide) Actively sensitized with ovalbumin (OA) and used in experiments between days 21 and 28 did. Challenge The protocol for antigen challenge has been described previously (O'D onnell, et al., 1994). The sensitized animals are placed in a Plexiglas chamber (Ple xiglas Chamber) and 0.1% (w / v sterile saline) OA Aero Challenged with sol for 30 minutes. Aerosol is applied at an air flow rate of 30 L / min. , De Vilbiss Ultra-N driven by internal fan eb) by 100 ultrasonic nebulizer (Breathing Services, Ephrata, PA, USA) sent. First 5 minutes of exposure to minimize anaphylactic deaths Repeatedly turned the nebulizer off and on every 60 seconds. Under these conditions, Animal mortality was about 5%. Drug Treatment Eighteen and one hour prior to OA aerosol, groups of animals were given vehicle (drug) Or TNFR-Ig (1 or 3 mg / kg, intravenous injection) Gave. In an experiment with dexamethasone, another group of animals were given OA aerosols. One hour or four hours later, vehicle (saline) or dexamethasone (3 0 mg / kg, intravenous injection). TNFR-Ig and dexamethazo Dosing parameters were determined to be optimal based on results from preliminary observations.   The results of this example show that OA sensitized guinea pigs were exposed to OA 6 hours later, there was an increase in substance P (1-10 μg / kg, intravenous injection). It indicates that it exhibited airway responsiveness. Increased response to substance P Sex is a feature of asthma-like sensitization, and guinea pigs were induced by the above experimental conditions This indicates that she suffered from asthma symptoms of irritability. Hypersensitivity is TNFR-I g (3 mg / kg, iv, 18 and 1 hour before challenge) .   The method used is as follows. The response of the airway to substance P is OA aerosol exposure according to previously described method (Selig and Tocker, 1992) 6 hours after immunization of sensitized non-challenge guinea pig and sensitized challenge guinea pig Investigated in both. Animals are anesthetized with urethane (2 g / kg, iv) and the carotid artery ( Blood pressure) and jugular vein (drug administration) were cannulated with PE-50 tubing . Attach the cannula to the trachea using a 15 gauge needle and allow the animal to Housed in a chismograph (Modular Instruments, Malvern, PA, USA). Voluntary Breathing was stopped with succinylcholine chloride (1.2 mg / kg, intravenous injection) and the body weight was 10 The animals are mechanically replaced at a tidal volume of 1 ml / g and at a rate of 60 breaths / min. (Harvard Apparatus Model 683; South Natick, MA, USA). Plethysmog The rough has a total volume of 2 liters and the ventilation circuit volume between the animal and the respiratory organs is 10 ml. Was. The plethysmograph includes a validin differential to measure airflow. Valleyne differential pressure t ransducer (DP45-14) connected to a Fleisch respiratory anemometer ( Model # 0000). Transpulmonary pressure is determined by the side And a 16-gauge intrathoracic needle inserted between the fifth and sixth intercostal spaces By a second validin transducer (DP45-28) connected to It was measured. Airflow and transpulmonary pressure are controlled by a module driven by the IBM486DX2PC. Modular Instruments (Malvern, PA, USA) M-3 000 data acquisition system. The computer is under (Amdur) and Lung resistance (R) based on the method of Mead (1958)L) Custom soft Software (BioReport, Modular Instruments) was used. Read is continuous And averaged at 10 second intervals. RLValue of the internal resistance of the ventilation circuit (0.1 1cmHTwoO / ml / sec). Animals receive propranolol (1 mg / kg, iv) Injection) and stabilized for 10 minutes until the start of substance P administration.   By administering bolus injections at approximately 5-10 minute intervals, substance P (1 3, 5, and 10 μg / kg, intravenous injection). Each dose The largest RLTo the baseline value measured before administration of substance P. Expressed as a percentage of the total. RLCausing a 200% increase in sales ED, defined as the dose of P200Values to linear regression of log dose response curve From each animal.   RLIs about 0.30 cmHTwoO / ml / sec, no significant difference between groups (P> 0.05). Sensitized non-challenge guinea pigs have a feeling for substance P Relatively low acceptability, RLTo increase by at least 200% or more A dose of 30 μg / kg was required (Table 1). In contrast, after the OA challenge, Airway responsiveness to substance P was significantly increased. ED200The value is about 10 times Increased (Table 1), and at the maximum dose of substance P, the maximum RLIncreased about 5 times (Table 1) ). Table 1: TNFR on airway response to substance P in OA-sensitized guinea pigs -Summary of the effects of Ig and dexamethasone a  The dose-response effect of substance P was 0.1% OA aerosol for 30 minutes. Measured 6 hours after the arrangement. Examining airway response to substance P 1 0 minutes before, the animals were pretreated with propranolol (1 mg / kg, iv).b   Using a dose volume of 1 ml / kg, the vehicle, TNFR-Ig (O 18 and 1 hour before A challenge or dexamethasone (for OA challenge) Animals were pre-treated with intravenous injection (1 hour before and 4 hours later).c   The value is the lung resistance (RL) Required to increase the baseline by 200% The negative log (mean) of the dose of P (in g / kg)+/-S. E. FIG. M. ).d   Value (average+/-S. E. FIG. M. ) Is substance P (10 μg / kg, intravenous injection) ) Caused by the baseline RL% Increase.e   Number of animals per groupf   Throwing substance P in sensitized objects that were not challenged with OA aerosol The dose response effect was examined.*   Statistically significant differences in the values between the respective vehicle and drug treated groups (P <0.05)   Administration of TNFR-Ig (3 mg / kg) to the sensitized animal induces OA. Airway hyperresponsiveness to induced substance P was significantly inhibited (P <0.05) . Substance P ED200The value decreases by about 3 times and the maximum RLDecreased by about 60% (Table 1). The lower dose of TNFR-Ig (1 mg / kg) is sensitive to substance It did not affect receptivity (Table 1). Even with dexamethasone treatment (30 mg / kg), In guinea pigs, airway hyperresponsiveness induced by OA was significantly inhibited ( P <0.05). The extent was obtained with the higher dose of TNFR-Ig. (Table 1).Example 5: TNFR-Ig reduced asthmatic symptoms in guinea pigs (inflammatory cells Inflow)   In this example, subsequent OA exposure induces inflammatory cell influx, an asthmatic condition. Use the guinea pig described in Example 4 which has been rendered allergic to OA You. This symptom is alleviated by TNFR-Ig. It also reduces asthma Compare with dexamethasone, a steroid known to cause.   In order to induce asthmatic symptoms including airway inflammatory cell accumulation as described in Example 4, Male guinea pigs were sensitized to OA as described above and challenged. Inflammatory cell stores The product was quantified at 6, 24, 48 and 72 hours after the challenge. As in Example 4 To determine the effect of TNFR-Ig on these symptoms Before administration of TNFR-Ig, the animals were compared with the non-challenged animals. It was shown that it had decreased. TN before challenge for inflammation Administration of FR-Ig was shown to improve inflammatory cell influx. 6 and 24 A comparable effect on inflammatory cell accumulation over time was dexamethasone (30 mg / kg, Intravenous injection, 1 hour before and 4 hours after the challenge).   The method used is as follows. The previously described method (Selig and Tocker , 1992), 6 and 24 hours after the OA challenge by BAL Airway inflammatory cell influx was examined. Briefly, urine (2g / kg) , Intravenous injection) and the trachea was opened with a 15-gauge catheter. Ca2+You And Mg2+5 ml of sterile Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco, Gra (Lund Island, NY, USA). Sample at 200g for 10 minutes at 25 ° C Centrifuge and lyse red blood cells from the resulting pellet with distilled water (1 ml, 30 seconds) After that, the osmotic pressure was restored by adding 10 ml of HBSS. Sample Centrifuge again (200 g, 10 minutes, 25 ° C.) and pellet the resulting pellet in 1 ml of HB Resuspended in SS. From the aliquot of the cell suspension, Total cell counts were determined by pan blue (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) exclusion. Was. To count the number of cells by type, aliquots of the cell suspension were cytospinned ( (5 minutes, 1300 rpm; Shandon Southern Instruments, S ewickey, PA, USA), slides were fixed and stained with a modified light stain (Leukostat; Fi sher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). At least 300 under light microscope Standard morphological criteria were used to classify the cells. Data is for BAL cells Number x 106/ Expressed as animals.   TNFR-Ig treatment (1-3 mg / kg) intravenous injection, 18 and 1 hour and 6 And 1 hour pretreatment for BAL after 24 hours), respectively, Neutrophil and total cell accumulation was significantly inhibited (6 and 24 hours after OA) (P <0.05). TNFR-Ig (3 mg / kg, iv) was in BAL at both time points Also significantly reduced the number of eosinophils (P <0.05), but the lower dose (1 mg / kg, Iv) had no effect. The results of this experiment show that allergen-induced flame It has also been shown that the neutrophil component of the symptom response is mediated by TNF. Most notable It should be noted that TNFR-Ig was not sensitized guinea pigs 24 hours after antigen challenge. The neutrophil influx in the BAL was almost eliminated, and the neutrophil count was It was about 2%. In addition, by TNFR-Ig treatment, 6 hours after the challenge There was a substantial decrease in neutrophils in guinea pigs, but dexamethasone Nothing like that happened. TNFR-Ig or similar antagonis Inhibition of TNF by neutrophils is known to contribute to the recruitment of neutrophils to the lung. Decrease children indirectly.   The cell composition of BAL in sensitized non-challenged guinea pigs has been described previously (S elig and Tocker, 1992). The total number of cells in these animals averaged about 1 × 106 Individual / animal, of which about 2-3% are eosinophils and neutrophils. OA 6 After hours, the animals treated with either TNFR-Ig or dexamethasone Eosinophils and neutrophils, respectively, have low total cell numbers. At least 40 and 20%. The percentage of eosinophils in BAL is Neutrophil count decreased to about 10% of total cell count, while remaining constant at 24 hours did. Between each TNFR-Ig vehicle group and dexamethasone vehicle group Did not differ in the number of inflammatory cells and the total number of cells (P> 0.05).   Inflammatory cell influx into the BAL of sensitized challenge guinea pigs was determined by dexamethasone (3 0 mg / kg). Six hours after OA, pull by TNFR-Ig A significant decrease in the number of eosinophils and total cells in the BAL was seen, similar to what occurred. (P <0.05). At time 0 at 6 hours, neutrophil count was unaffected. OA After 24 hours, eosinophil count, neutrophil count and total cell count in BAL were determined by dexamethasone. It was more significantly inhibited (P <0.05). Dexame as compared to TNFR-Ig Eosinophil counts in the tazone-treated animals were about 5-fold lower (P <0.05). In contrast, Deki Sametasone treatment reduced the number of neutrophils in the BAL, but by type, The percentage of vesicles remained unchanged at about 8% of the total cell number (P> 0.05).   The ability of TNFR-Ig to improve the ongoing inflammatory response in sensitized guinea pigs Was. Animals were OA sensitized and then challenged as described above. TNFR-I g (3 mg / kg, iv) was administered 30 minutes after the OA challenge. Challenge 24, 48 and 72 hours after, inflammation was measured by BAL. 48 and 72 At time points, TNFR-Ig was administered daily. TNFR-I after challenge g treatment significantly improved the influx of inflammatory cells in the BAL of sensitized guinea pigs.Example 6: TNFR-Ig reduced asthmatic symptoms in guinea pigs (pulmonary edema)   In this example, subsequent OA exposure may induce the asthma symptom of pulmonary edema. The guinea pig described in Example 4, which has been rendered allergic to OA, is used. This Is alleviated by TNFR-Ig. It also helps reduce asthma. Compare with dexamethasone, a known steroid.   In order to induce asthma symptoms including edema, as described in Example 4, Male guinea pigs were OA-sensitized and challenged. Edema is a challenge 6 Quantified after time. In the same manner as in Example 4, TNFR-Ig To determine the effect, administer TNFR-Ig before challenge and challenge A comparison of the symptoms with animals that did not show a decrease.   The method used is as follows. Six hours after OA, a marker for pulmonary edema Airway capillary leak is determined by the method described previously (Wasserman et al., Adv. Prost. aglandin Thromboxane LeukotrieneRes. 23: 271-273, 1995) using Evans Quantified by blue dye extravasation. Guinea pig with urethane (2g / kg, intravenous injection) Under anesthesia, a catheter was attached to the jugular vein. Next, Eva sent over 60 seconds Animals were given a blue dye (30 mg / kg, intravenous injection). 10 minutes later, cut the rib cage It was opened and a catheter (PE-240 tubing) was inserted from the left ventricle into the aorta. heart The chamber was cross-clamped, the right atrium was cut, and the speed was 100 ml / min. Using a cartridge pump (Masterflex; Cole-Parmer, Chicago, IL, USA) Blood was drained by perfusing the animals with 100 ml of saline. Pulmonary artery Insert a catheter into the stomach and cut the left ventricle to add another 50 ml of saline. The pulmonary circulation was perfused with water. Remove the entire lung and remove the thorax (distal 5 mm) and the main bronchus Excised, blotted between filter papers and quantified. Evans blue dye Extract with formamide (37 ° C, 24 hours), absorbance meter (Beckman Instruments M odel DU-64, Somerset, NJ, USA) by measuring the absorbance at 620 nm. Weighed. Tissue from standard curve of Evans blue dye concentration (0.5-10 μg / ml) The pigment content was interpolated and expressed as ng / mg tissue wet weight.   When Evans Blue dye is used as a marker for airway capillary leakage, Basal levels of the thoracic and main bronchi of challenge guinea pigs averaged 1 tissue It was 10-20 ng / mg per mg wet weight. Six hours after the OA challenge, And the Evans blue pigment content of the main bronchi increased about 5-fold. TNFR-Ig (1 or 3 mg / kg) or dexamethasone (30 mg / kg) Thus, in both the rib cage and the main bronchus, OA-induced airways 6 hours after challenge Leakage was reduced (P <0.05).   TNFR-Ig (1 or 3 mg / kg, intravenous injection) was used to sensitize guinea pig breasts. OA-induced airway edema in the gut and main bronchus (due to tissue Evans blue pigment content) Quant) disappeared.Example 7: Brown Norway mitigated by TNFR-Ig Asthma symptoms in rats   In a similar manner to Example 4 using guinea pigs, inflammatory cell accumulation Respiratory symptoms were induced and treated with TNFR-Ig. Brown Norway Rat This model is guinea pig in that allergic reactions in Different from   The method used is as follows. OA male Brown Norway rat (1 mg OA and 100 mg Al (OH)Three0.5 ml saline solution, intravenous injection) Sensitized on days 0, 1, and 2. On day 21, 30% with 1% OA aerosol The animals were challenged for minutes. 24 hours after challenge, inflammatory cell accumulation by BAL The product was quantified. Sensitization, challenge and BAL protocols, except: Thus, it was the same as in the case of the guinea pig. On days 1, 2, 3 250g male Brown Norway rat (Charles River, Kingston, NY) With a single intravenous injection (1 mg OA + 100 mg aluminum hydroxide in 1 ml sterile physiological diet) OA was actively sensitized and used for experiments on day 21 (Elwood et al., 1). 992). One hour before the OA aerosol, another group of rats were given vehicle, T, respectively. NFR-Ig (1 or 3 mg / kg, intravenous injection) or dexamethasone (0.3 mg / k g, intravenous injection).   On the day of the experiment, rats were challenged with 1% OA aerosol for 30 minutes. Charen Twenty-four hours after washing, the lungs were washed twice with 1 ml / 100 g HBSS to give B Performed AL. Red blood cells are lysed with 0.5 ml of distilled water and osmotic pressure is increased with 5 ml of HBSS. Reverted.   The rats were treated with TNFR-Ig (3 mg / kg, intravenous injection, 1 hour before challenge) The treatment substantially eliminates the accumulation of neutrophils in the BAL and increases the number of eosinophils and And the total cell count decreased significantly. Dexamethasone (0.3mg / kg, intravenous injection, tea (1 hour before range), similar results were obtained. The lower dose of TNFR- Ig (1 mg / kg, intravenous injection) also significantly reduced the number of neutrophils in BAL. There was no effect on eosinophil count or total cell count.   More specifically, in the BAL of sensitized non-challenge Brown Norway rats Baseline total cell count is approximately 1 × 106Animals / animal, of which 1-2% are eosinophils And neutrophils. 24 hours after OA challenge, in BAL of vehicle treated animals Total cell number increased approximately three-fold, with eosinophils and neutrophils each being a smaller cell population. It was at least 40 and 25%. BAL between vehicle treatment groups Did not differ (P> 0.05).   TNFR-Ig (3 mg / kg, intravenous injection) or dexamethasone (0.3 mg / kg, Intravenous injection), the eosinophils in the BAL, neutrophils and Total cell accumulation was reduced significantly as well (P <0.05). Lower dose of TN FR-Ig (1 mg / kg, iv) treatment significantly inhibited neutrophil count in BAL (P <0.05), but had no effect on eosinophil accumulation or total cell number in BAL. won.Example 8: Reduction of neutrophilia in injured rat lung   Rat models of Sephadex particle-induced lung inflammation are similar to those seen in chronic asthma It shows a similar increase in the number of eosinophils and neutrophils in the lung and granuloma formation. Using this model, it was shown that TNFR-Ig reduces this chronic condition. .   The method used is as follows. Sephadex bead suspension (7.5 mg / kg, intravenous) to give male Sprague-Daw ley) Induced inflammatory cell accumulation in the lung in rats. Sephadex 24 And after 72 hours, the total white blood cell count in the BAL fluid increased significantly. 24 hours later The neutrophil count is about 50% of the total leukocyte count and about 10% of the total by 72 hours. Diminished. Eosinophil counts were maintained at about 10% of total leukocyte counts.   TNFR-Ig (1 and 3 mg / kg, iv, 1 hour before challenge) Is pretreated with either dexamethasone (0.1 and 0.3 mg / kg, iv) Did inhibit neutropenia 24 hours after Sephadex, TNFR-Ig did not significantly affect the total cell number. Sephadex 7 Two hours later, BAL with TNFR-Ig (1 and 3 mg / kg, iv, daily) Neutrophil influx into the fluid was significantly reduced, but had no inhibitory effect on eosinophil count. In contrast, dexamethasone (0.1 and 0.3 mg kg-1, intravenous, daily) , Substantially eliminated the influx of neutrophils and eosinophils into the BAL fluid. TNFR -Ig (1 and 3 mg / kg, i.v.) or dexamethasone (0.1 and And 0.3 mg / kg, iv) significantly reduced the total cell count at 72 hours. Was.Example 9: Reducing atopic asthma in primates   Wild crab displaying natural airway sensitivity to Ascaris suum antigen Using a primate model of atopic asthma using monkeys, TNFR-Ig It has been shown to reduce the effects of asthma symptoms of sensitivity. Repeated antigen exposure As a result, airway asthma symptoms, especially lung resistance (RL) Is induced. TNF When treated with R-Ig, monkeysLShowed a decrease.   Wild round cynomolgus monkeys that are naturally susceptible to roundworm are airway responsive to inhaled methacholine And airway eosinophilia when exposed to repeated roundworm antigen exposure. I Thus, using this antigen, allergic reactions and Induced asthmatic symptoms of airway hyperreactivity after. TNFR-I for airway hyperresponsiveness To examine the effect of g, the following protocol was used. Day 1: Lung resistance (RL) To 100% (PC100) Increase, methacholine (MCh) The dose of bronchospasm-inducing factor-like substance P was measured. Day 3: RLChallenge monkeys with inhaled dose roundworm antigen to at least double the amount. Day 5 and 8: Day 3 repetition. Day 10: Day 1 repetition. Logarithmic PC between days 1 and 10100Measure changes in value .   Administer TNFR-Ig (3 mg / kg, iv) on days 1, 3, 5 and 8 This reduced airway hyperresponsiveness to MCh.Example 10: Allergic airway inflammation in mice reduced by TNFR-Ig   Using a mouse model of OA-induced allergic lung inflammation in mice, TNF R-Ig has been shown to reduce the asthmatic symptoms of inflammatory cell influx. Sensitizing mouse Are repeatedly exposed to OA, gradually increasing airway hyperresponsiveness and eosinophil influx in the BAL Develop an increase. This model is associated with elevated IgE levels, (See, eg, IL-4 and IL- 5 level rise). TNFR-Ig reduces ongoing allergic inflammatory response The ability to do so was evaluated with this model.   To induce airway hyperresponsiveness and inflammatory cell influx, sensitizers should be used as allergens. Mouse models of allergic pulmonary inflammation in that multiple exposures are required , Similar to primates. On day 0, female C57BL / 6 mice were OA (10 μl) g, 1 mg of Al (OH)ThreeSensitize with 0.1 ml, intravenous injection) Challenged with 1% OA aerosol for 30 minutes daily from the 20th. Last OA Cha Airway hyperresponsiveness to MCh and BAL were performed for the next 24 hours of the range. Sensitization Some of the lungs of challenge mice were immobilized for histological examination and others were Homogenized for level determination.   Inflammatory cell accumulation and TNF levels in sensitized challenge mice were The peak was reached following the final challenge with aerosol (day 20). In this experiment Administered TNFR-Ig (3 mg / kg, iv) immediately after final OA exposure . TNFR-Ig reduced OA-induced hypersensitivity, but inflammatory cell influx in BAL Had no effect. Even if TNFR-Ig is administered every day during the challenge period, B There was no effect on AL cell numbers. However, TNFR-Ig (3 mg / kg, iv Injection, on day 20), the number of eosinophils in lung tissue of sensitized challenge mice was Significantly reduced and eliminated TNF levels in lung tissue.Example 11: Aerosol composition   Below, the example of the aerosol composition containing the TNFR-Ig preparation of this invention is shown.Example A-aerosol TNFR-Ig (particle size range from 1 to 5 microns) 3.0 g Span® 85 (Sorbitan Trioleate) 1.0 Freon (registered trademark) 11 (trichloromonofluoromethane) 30.0 Freon (registered trademark) 114 (dichlorotetrafluoroethane) 41.0 Freon (registered trademark) 12 (dichlorodifluoromethane) 25.0Example B-aerosol TNFR-Ig 0.5% Span 85 0.5% Propellant B1                                                     99.0%1  Propellant B was 10% Freon 11, 50.4% Freon 114, 31.5% Freon. Consists of Leon 12, and 8.0% butane.Example C-aerosol TNFR-Ig 1.00% Span 85 0.25% Freon 11 5.0% Freon W1                                                 93.75%1  Freon W is from 61.5% Freon 114 and 38.5% Freon 12 Become.Example D-aerosol TNFR-Ig 0.50% Span 85 0.50% Propellant (C)1                                               99.0%1  Propellant C consists of 30.0% Freon 11 and 70% Freon W.Example E-aerosol TNFR-Ig 0.88% Sodium sulfate (anhydrous), micronized 0.88% Span 85 1.00% 50% Freon 12, 25% Freon 11, 97.24% And 25% Freon 114 propellantExample F-aerosol TNFR-Ig 0.06% Span 85 0.05% Freon 11 20.0% Freon 12 / Freon 114 (20/80) 78.9%Example 12: Injectable composition   Below, the example of the composition for injection containing the TNFR-Ig preparation of this invention is shown.component Content per ml TNFR-IgG1* Citric anhydride, USP 1.92mg Glycine, USP 1.70mg Mannitol, nonpyrogenic, USP 41.90mg Sodium hydroxide sufficient, pH 6.0 Hydrochloric acid sufficient, pH 6.0 Water for Injection, USP, enough, total volume 10ml** *  The concentration of TNFR-IgG1 used in this formulation is 1.0 mg / ml to 20 m g / ml. The final amount of TNFR-IgG1 in this formulation depends on the formulation concentration and Selected based on earl capacity.** Removed by lyophilization 1mg vial (use 1ml 1.0mg / ml formula) 2.5mg vial (use 1ml 2.5mg / ml formula) 5.0mg vial (use 1ml 5.0mg / ml formula) 10mg vial (use 2ml 5.0mg / ml prescription) 10mg vial (use 1ml 10.0mg / ml formula) 20mg vial (use 2.5ml 8.0mg / ml formula) 20mg vial (use 4ml 5.0mg / ml formula) 50mg vial (use 2.5ml 20mg / ml formula) References

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 37/02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61K 47/48 A61K 37/02

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．喘息症状を患う患者における喘息に対抗するための方法であって、１以上の キメラＴＮＦ−α結合タンパク質であり、調製物中のタンパク質の各々がＩｇＧ に融合されているｐ５５ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分で構成され、 該融合ＩｇＧは、ＩｇＧ重鎖定常領域の第一ＩｇＧドメイン以外のＩｇＧドメイ ンのすべてを含んでいる、キメラＴＮＦ−α結合タンパク質で構成されている調 製物を含有する組成物であって、該組成物が、治療的に不活性な担体を含み、そ して、該組成物が該喘息症状に対抗するための該キメラタンパク調製物の有効量 を患者に与えるために、該患者に適用される、組成物を該患者に適用することを 含む方法。 ２．該患者が、喘息発作を患っており、キメラタンパク質調製物が、該発作の影 響を軽減するために充分な量で適用される、請求項１に記載の方法。 ３．該組成物が、喘息発作の開始前に、該発作の開始を予防するかまたは遅延さ せるために有効な量で、喘息患者に適用される、請求項１に記載の方法。 ４．融合ＩｇＧが、ヒトＩｇＧ1である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の 方法。 ５．該タンパク質調製物中のタンパク質が１以上のシアル酸残基を末端に有する 複合オリゴ糖類を有し、露出Ｎ−アセチルグルコサミンを有し、該調製物中のシ アル酸残基のモル比が、タンパク質のモル当たりシアル酸約４〜７モルであり、 該調製物中の露出Ｎ−アセチルグルコサミンのモル比が、タンパク質のモル当た りＮ−アセチルグルコサミン約１〜約２モルであり、該調製物中のシアル酸残基 のＮ−アセチルグルコサミン残基に対するモル比が、約０．３５〜約０．５であ り、該調製物が、約５．５〜約７．５の等電点を有している、請求項１〜４のい ずれか１項に記載の方法。 ６．シアル酸のＮ−アセチルグルコサミンに対するモル比が約０．４〜約０．４ ５であり、シアル酸のタンパク質に対するモル比が約５．０〜約６．０である、 請求項５に記載の方法。 ７．該調製物が該患者に、１日当たり患者の体重１kg当たり０．１mg〜５．０mg の投与量で注射により適用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８．投与量が、１日当たり体重１kg当たり１．０mg〜３．０mgである、請求項７ に記載の方法。 ９．該調製物が、口腔または鼻腔スプレーにより適用される、請求項１〜８のい ずれか１項に記載の方法。 １０．該スプレーが、該調製物の約０．０３重量％〜５．０重量％含む液体スプ レー組成物である、請求項９に記載の方法。 １１．ＩｇＧに融合されたｐ５５ＴＮＦレセプタータンパク質の可溶性部分で構 成されるキメラＴＮＦ−α結合タンパク質の使用であって、該融合ＩｇＧがＩｇ Ｇ重鎖定常領域の第一ＩｇＧドメイン以外のすべてのＩｇＧドメインを含む、キ メラＴＮＦ−α結合タンパク質の喘息処置用医薬の製造のための使用。[Claims] 1. A method for combating asthma in a patient suffering from asthmatic conditions, comprising one or more chimeric TNF-α binding proteins, each of the proteins in the preparation comprising a soluble portion of a p55TNF receptor protein fused to an IgG. Wherein the fusion IgG comprises a preparation comprising a chimeric TNF-α binding protein comprising all of the IgG domains other than the first IgG domain of the IgG heavy chain constant region. The composition comprises a therapeutically inert carrier, and the composition is applied to the patient to provide the patient with an effective amount of the chimeric protein preparation to combat the asthma condition. Applying the composition to the patient. 2. 2. The method of claim 1, wherein the patient has an asthma attack, and the chimeric protein preparation is applied in an amount sufficient to reduce the effects of the attack. 3. 2. The method of claim 1, wherein the composition is applied to an asthmatic patient prior to the onset of the asthmatic attack, in an amount effective to prevent or delay the onset of the attack. 4. Fusion IgG is human IgG 1, method according to any one of claims 1 to 3. 5. The protein in the protein preparation has complex oligosaccharides terminated with one or more sialic acid residues, has exposed N-acetylglucosamine, and the molar ratio of sialic acid residues in the preparation is Wherein the molar ratio of exposed N-acetylglucosamine in the preparation is from about 1 to about 2 moles of N-acetylglucosamine per mole of protein; The molar ratio of sialic acid residues to N-acetylglucosamine residues is from about 0.35 to about 0.5, and the preparation has an isoelectric point of from about 5.5 to about 7.5. The method according to claim 1, wherein 6. 6. The molar ratio of sialic acid to N-acetylglucosamine is from about 0.4 to about 0.45, and the molar ratio of sialic acid to protein is from about 5.0 to about 6.0. Method. 7. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the preparation is applied to the patient by injection at a dose of 0.1 mg to 5.0 mg / kg of the patient's body weight per day. 8. The method according to claim 9, wherein the dosage is 1.0 mg to 3.0 mg / kg body weight per day. 9. 9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the preparation is applied by oral or nasal spray. 10. 10. The method of claim 9, wherein the spray is a liquid spray composition comprising from about 0.03% to 5.0% by weight of the preparation. 11. Use of a chimeric TNF-α binding protein composed of a soluble portion of a p55TNF receptor protein fused to an IgG, wherein the fused IgG comprises all but the first IgG domain of the IgG heavy chain constant region. Use of a chimeric TNF-α binding protein for the manufacture of a medicament for treating asthma.
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