JP2000509965A

JP2000509965A - Fibroblast growth factor homologous factor-3 (FHF-3) and method of use

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Publication number: JP2000509965A
Application number: JP09533753A
Authority: JP
Inventors: ネイサンス，ジャーミー; スモールウッド，フィリップ，エム．; トング，パトリック
Original assignee: ザジョンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 2000-08-08
Also published as: IL126298A0; WO1997035007A1; EP0935654A1; AU2341597A; EP0935654A4; AU719538B2; CA2249179A1

Abstract

(57)【要約】新規なタンパク質である繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）、ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列、および推定されるアミノ酸配列を開示する。さらに、ＦＨＦ−３ポリペプチド、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチド配列、およびＦＨＦ−３と特異的に結合する抗体を用いる診断および治療方法を開示する。 (57) [Summary] Disclosed is a novel protein, fibroblast growth factor homologue factor-3 (FHF-3), a polynucleotide sequence encoding FHF-3, and a deduced amino acid sequence. Further disclosed are diagnostic and therapeutic methods using FHF-3 polypeptides, FHF-3 polynucleotide sequences, and antibodies that specifically bind to FHF-3.

Description

【発明の詳細な説明】繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）および使用方法発明の背景１．発明の利用分野本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、より特定的には繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（fibroblast growth factor homologous factor-3:ＦＨＦ−３）と称する繊維芽細胞増殖因子ファミリーの新規なメンバーおよびＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチドに関するものである。２．関連技術の説明繊維芽細胞増殖因子ファミリーは、in vivoおよびin vitroにおいて広範囲の増殖促進、生存および／または分化活性を有する、構造的に関係のあるタンパク質の一群を包含する（Baird，A．and Gospodarowicz，D.，Ann N.Y．Acad．Sci. ，638:1，1991;Eckenstein，F.P.，J．Neurobiology 25:1467，1994;Mason，I. ，J．Cell，78:547，1994に論評されている）。１９９４年１２月現在で、このファミリーの９つのメンバーが分子クローニングにより特性付けられている。特性付けられた最初の２つのメンバーである、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ／ＦＧＦ−１）と塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）は、例えば脳、眼、腎臓、胎盤、副腎を含めて、多数の組織で見いだされている（Jayeら，Science 233:541，1986;Abrahamら，Science 233:545，1986）。これらの因子は、繊維芽細胞、内皮細胞、海馬および大脳皮質ニューロン、大グリア細胞を含めて、中胚葉および神経外胚葉由来のさまざまな組織の強力な分裂促進因子および生存因子であることが判明している（Burgess，W.H．and Maciag，T.，Ann．R ev．Biochemistry 58:575，1989）。ＦＧＦファミリーの追加のメンバーとしては、マウス乳癌ウイルスの通常の組込み部位の１つとして同定され、それゆえ発癌因子であると推定されるｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３(Smithら，EMBO J．7:1013， 1988);NIH 3T3トランスフェクションアッセイで形質転換遺伝子として同定されたＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50:729，1987）およびＦＧＦ −５(Zhanら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988);ＦＧＦ−４に対する相同性に基づいて分子クローニングにより単離されたＦＧＦ−６(Maricsら，Oncogene 4:33 5，1989);ケラチノサイトの分裂促進因子として同定されたケラチノサイト増殖因子／ＦＧＦ−７(Finchら，Sclence 245:752，1989);乳癌細胞のアンドロゲン誘導分裂促進因子として同定されたＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89:8928，1992);および一次神経膠星状細胞の分裂促進因子としてのＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Biol．13:4251，1993）などがある。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦを含めて数種のＦＧＦは古典的なシグナル配列をもたず、それらの分泌機構は不明である。ＦＧＦファミリーの全メンバーはおよそ２５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し、この相同度はそれらがほぼ同一の三次元構造を共有するらしいことを示唆する。この推論はＸ線回折により測定されたｂＦＧＦとインタ．ロイキン１−βの三次元構造の比較により支持される（Erikssonら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 88:3441，1991;Zhangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3446，19 91;Agoら，J．Biochem．110:360，1991）。これらのタンパク質はアミノ酸同一性が１０％しかないが、２つの結晶構造のα炭素バックボーンは２オングストローム未満の二乗平均の平方根の偏差でもって重ね合わせることができる(Zhangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3446，1991)。両タンパク質はほとんど完全にβシートから成っていて、３コピーの四本鎖β曲折モチーフから構成されたバレルを形成している。ヘパリン結合性およびレセプター結合性と思われる両領域が該タンパク質の一面上の近接した領域に位置づけられる。ａＦＧＦ、ｂＦＧＦおよびＦＧＦ−７／ＫＧＦは、細胞表面のチロシンキナーゼ受容体への高親和性結合を介して生物学的活性の一部または全部を発揮することがわかっている(例えば、Lee，P.L．ら，Science 245:57，1989;Johnson，D.E ．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60:1，1993)。また、ＦＧＦファミリーの多くのメンバーはヘパリンに強固に結合し、ヘパリンとＦＧＦと膜貫通受容体の三成分複合体は生物学的に有意義なシグナル伝達種であり得る。これまでに、ＦＧＦファミリーのメンバーの受容体をコードする４種類の遺伝子が同定されている。最近の研究から、細胞外リガンド結合ドメイン内の示差的ｍＲＮＡスプライシングにより受容体多様性が増加することがわかり、異なるリガンド結合特性をもつ複数の受容体イソ型が同一の遺伝子によってコードされ得るという結果をもたらした（Johnson，D.E．and Williams，L.T.，Adv．Cancer Res．60: 1，1993）。組織培養系において、ａＦＧＦまたはｂＦＧＦのその細胞表面受容体への結合はホスホリパーゼＣ−γを活性化し（Burgess，W.H．ら，Mol．Cell Biol．10:4770，1990）、このホスホリパーゼＣ−γはさまざまな分裂促進シグナルを統合することが知られている経路である。ＦＧＦファミリーの新メンバーを同定し特性決定することにより、細胞や臓器がその増殖、生存、老化、分化、損傷からの回復をコントロールする作用機構を洞察することができよう。発明の概要本発明は細胞の増殖、生存、分化因子としてのＦＨＦ−３および該因子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。この因子は中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢組織の細胞の増殖、生存および／または分化に関与している。本発明は、神経変性疾患または腫瘍性疾患の診断に役立つＦＨＦ−３遺伝子発現における変化を検出する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明はＦＨＦ−３の発現または活性を調節することにより神経変性疾患または腫瘍性疾患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ヒトＦＨＦ−３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（配列番号１および２）。図２は、ヒトＦＨＦ−３のアミノ酸配列と、ＦＧＦファミリーの他の９つのメンバーのそれぞれのアミノ酸配列とのアライメント（並列化）を示す。保存された残基を強調してある。ＦＧＦファミリーのメンバーは次のとおりである：ａＦＧＦ／FＧＦ−１（Jayeら，Science 233:541，1986）、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２（ Abrahamら，Science 233:545，1986）、ｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３（Smithら，EMB O J．7:1013，1988)、ＦＧＦ−４（Delli-Boviら，Cell 50:729，198 7）、ＦＧＦ−５（Zhanら，Mol．Cell Biol．8，3487，1988)、ＦＧＦ−６（Mar icsら，Oncogene 4:335，1989)、ケラチノサイト増殖因子／ＦＧＦ−７（Finch ら，Science 245:752，1989）、ＦＧＦ−８(Tanakaら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 89:8928，1992)、およびＦＧＦ−９（Miyamotoら，Mol．Cell Blol．13:4 251，1993）。図３は、ＦＧＦファミリーのメンバーの任意の対をつなぐ直線の長さがその対のアミノ酸配列の分岐度に比例する樹状図を示す。図４は、ＦＨＦ−３をコードする遺伝子がヒト17番染色体上に位置することを示す。ヒト特異的ハイブリダイゼーションが17番染色体上に見いだせる。図５は、ＦＨＦ−３発現の組織特異性を示す。図示したマウスの組織由来の全ＲＮＡ10μｇを調製し（Chomczinski & Sacchi．Anal．Biochem．162:156，19４ 87）、5'非翻訳配列の70塩基とコード領域の最初の130塩基を含むクローン化ｃＤＮＡの200塩基に及ぶマウスＦＨＦ−３アンチセンスプローブを用いるＲＮアーゼプロテクションに使用した（Ausabelら，Current Protocols in Molecular Biology;New York:Wiley Interscience，1987）。脳および眼由来のＲＮＡでは、予想されたサイズ（矢印）で最も強くＲＮアーゼプロテクションが観察され、肺および精巣由来のＲＮＡでは弱いプロテクションが見られた。図６は、一時的にトランスフェクトしたヒト胚腎細胞（細胞系293）にて産生されたＦＨＦ−３の免疫ブロットを示す。ＦＨＦ−３でトランスフェクトした細胞（右レーン）は、見掛けの分子量が30kDの免疫反応性ポリペプチドを合成する。この免疫反応性ポリペプチドは、関連のＦＧＦファミリーメンバー（ＦＨＦ− ２）でトランスフェクトした細胞（中央レーン）または偽トランスフェクトした細胞（左レーン）では見られないものである。前もって染色したタンパク質サイズ標品の見掛けの分子量(kD)を左側に示す。図７ａおよび７ｂは、各々ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す（配列番号６〜９）。発明の詳細な説明本発明は増殖因子ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＦＨＦ−３は脳と眼の組織で高レベルに発現され、肺および精巣で低レベルに発現される。一つの態様において、本発明は、ＦＨＦ−３の発現または機能と関連がある中枢神経系の細胞増殖性疾患または細胞変性疾患を検出する方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は、ＦＨＦ−３の発現または活性を抑制または増強する薬剤を用いることにより細胞増殖性疾患または免疫学的疾患を治療する方法を提供する。本発明のＦＨＦ−３タンパク質とＦＧＦファミリーのメンバーとの構造相同性は、ＦＨＦ−３がこの増殖因子ファミリーの新メンバーであることを示す。多くの他のメンバーの公知の活性に基づくと、ＦＨＦ−３も診断および治療用の薬剤として有用な生物学的活性を保持することが期待される。多くの増殖因子は神経系の機能に関係する発現パターンまたは活性を有する。例えば、ＴＧＦファミリーの一つの増殖因子、すなわちＧＤＮＦはドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することができる強力な神経栄養因子であることがわかった(Linら，Science 260:1130)。もう一つのファミリーメンバーであるドーサリン−ｌ１は神経冠細胞の分化を促進することが可能である（Baslerら，Ce ll 73:687，1993）。インヒビンおよびアクチビンは脳において発現されることが明らかになり（Meunierら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:247，1988;Sawc henkoら，Nature，334:615，1988）、アクチビンは神経細胞生存分子として機能する能力をもつことがわかった(Schubertら，Nature，344 868，1990)。別のＴＧＦファミリーメンバーであるＧＤＦ−１はその発現パターンが神経系特異的であり(Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250，1991)、また、いくつかの他のファミリーメンバー、例えばＶｇｒ−１(Lyonsら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，86:4554，1989;Jonesら，Development，111:581，1991)、ＯＰ−１(Ozkayna kら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)およびＢＭＰ−４(Jonesら，Developme nt，111:531，1991)も神経系で発現されることが知られている。脳内でのＦＨＦ−３の発現は、神経系の機能に関係する活性がＦＨＦ−３にもありうることを示唆する。ＦＨＦ−３は、各種ニューロン集団の神経栄養活性をもつのかもしれない。それゆえ、ＦＨＦ−３は筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患を治療したり、移植に先立って細胞または組織を培養下で維持するといったin vitroおよびin vivo用途をもつ可能性がある。第一の態様において、本発明は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときの分子量が約26〜28ｋＤでありかつ本質的に配列番号２(図１)のアミノ酸配列を有することにより特性付けられる、実質的に純粋な繊維芽細胞増殖因子相同因子−３（ＦＨＦ−３）を提供する。本明細書中で用いる「実質的に純粋な」とは、他のタンパク質、脂質、炭水化物またはＦＨＦ−３が天然で結合している他の物質を実質的に含まないＦＨＦ−３のことである。当業者であれば、標準的なタンパク質精製法を用いてＦＨＦ−３を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは非還元性ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。ＦＨＦ−３ポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列解析により測定することもできる。ＦＨＦ−３の活性が残っている限り、ＦＨＦ−３ポリペプチドにはこのポリペプチドの機能性断片も含まれる。ＦＨＦ−３の生物学的活性を有する小型のペプチドは本発明に含まれる。本発明はＦＨＦ−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、ＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列がある。ＦＨＦ−３の全部または一部をコードする全てのポリヌクレオチドは、それらがＦＨＦ−３活性をもつポリペプチドをコードする限り、本発明に含まれることを理解すべきである。このようなポリヌクレオチドとしては、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、意図的に操作されたポリヌクレオチドがある。例えば、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。ＦＨＦ−３のポリヌクレオチド配列にはアンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドは遺伝子コードの結果として縮重している配列を包含する。２０種類の天然アミノ酸があり、そのうちの大部分は２以上のコドンにより規定されている。したがって、あらゆる縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によりコードされるＦＨＦ−３ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りでは、本発明に含まれる。ヒトＦＨＦ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がここに詳細に開示される。この配列は長さが225アミノ酸からなるポリペプチドをコードする読取り枠（オープンリーディングフレーム）を含有する。図１の位置74に示されるヒトＦＨＦ−３の開始メチオニンコドンは読取り枠の合った最初のATGコドンであり、良好なコンセンサスリボソーム結合部位（GCGCTATGG；Kozak，Nucleic Acids Re s.，15:8125，1987）がこの位置に存在する。読取り枠内の次のメチオニンコドンは、推定上の開始メチオニンコドンの124コドン3'側に見られる。ａＦＧＦとｂＦＧＦの場合に観察されるように、ＦＨＦ−３の一次翻訳産物のアミノ末端は、小胞体の膜を通過する同時翻訳挿入(cotranslational insertion)を指令するシグナルペプチドのコンセンサス配列と一致しない。ＦＨＦ−３配列は、潜在的なアスパラギン結合グリコシル化のためのasn-X-ser/thr部位を欠く。好ましくは、ヒトＦＨＦ−３ヌクレオチド配列は配列番号１であり、推定アミノ酸配列はおそらく配列番号２である（図１参照）。ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチドは配列番号１だけでなく配列番号１に相補的な核酸配列も含む。相補的配列にはアンチセンスヌクレオチドが含まれ得る。この配列がＲＮＡであるときは、配列番号１のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴがそれぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵにより置き換えられる。鎖長が少なくとも15塩基である上記核酸配列の断片も本発明に含まれ、この15塩基という鎖長は、断片が生理的条件下で配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることを可能にするに十分である。特に、これらの断片は中程度のストリンジェント条件下でＦＨＦ−３タンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズすべきである。ＦＨＦ−３に対して最も相同性が高いＦＧＦファミリーメンバーはＦＧＦ−９であり、ＦＧＦ−９は８個のギャップを加えてアライメントするとき、ＦＨＦ− ３と30％のアミノ酸同一性を共有する。ＦＨＦ−３の一次アミノ酸配列のわずかな修飾により、本明細書に記載するＦＨＦ−３ポリペプチドと実質的に同等の活性を有するタンパク質が得られる。このようなタンパク質には、「本質的に配列番号２のアミノ酸配列を有する」という表現で規定されるタンパク質が含まれる。こうした修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発によるように、意図的であっても、自然発生的であってもよい。これらの修飾により産生されるポリペプチドはすべて、ＦＨＦ−３の生物学的活性がまだ存在する限り、本発明に含まれる。さらに、１以上のアミノ酸を欠失させることによっても、その生物学的活性を有意に変えることなく、得られた分子の構造を修飾することができる。これはよリ広範な有用性を有する小型の活性分子の開発へとつながる。例えば、ＦＨＦ−３の生物学的活性にとって必要でないアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸を除くことができる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドには、開示された配列（配列番号２）およびその保存的変異が含まれる。本明細書中で用いる「保存的変異」という用語は、あるアミノ酸残基を生物学的に類似した別のアミノ酸残基と置換することをいう。保存的変異の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンのような、ある疎水性残基の他の疎水性残基による置換、または、ある極性残基の他の極性残基による置換、例えばアルギニンのリシンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、グルタミンのアスパラギンによる置換などが挙げられる。「保存的変異」という用語はまた、無置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、この置換ポリペプチドに対して誘導された抗体は無置換ポリペプチドと免疫反応しなければならない。本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法により得ることができる。例えば、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーション技法を用いてＤＮＡを単離することができる。これらの技法として、１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、２）目的のＤＮＡ配列にアニーリングすることができるプライマーを用いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および３）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングがあるが、これらに限らない。本発明のＦＨＦ−３ポリヌクレオチドは好ましくは哺乳動物に由来するものであり、ヒトに由来するものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法は、適当なプローブが入手可能であるという前提で、どのような生物からも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。それには、短いオリゴペプチド領域のアミノ酸配列が既知である必要がある。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子コードから推測することができるが、遺伝子コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重するときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性した二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列の量が極端に少ない供給源に由来するｃＤＮＡクローンを検出する際に特に有用である。換言すると、非特異的結合を回避するように設定したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、混合物中の単一プローブ（標的ＤＮＡの完全な相補鎖である）への標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションにより特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフによる可視化が可能である(W allaceら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981;Maniatisら，Molecular Cloning:A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y．1988)。ＦＨＦ−３をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）目的のポリペプチドの必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学合成、および３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、によっても得ることができる。後者の場合、結局ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が形成され、これは一般的にｃＤＮＡと呼ばれている。組換え法で使用する特定のＤＮＡ配列を得るための上記３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡ分離物の単離は最も一般的でない。このことは、イントロンが存在するために、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得ることが望まれる場合には特に当てはまる。ＤＮＡ配列の合成は、しばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知である場合には最上の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明である場合には、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であって、最上の方法はｃＤＮＡ配列の合成である。目的のｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法は、中でも、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞内に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写から誘導されるプラスミドまたはファージに担持されるｃＤＮＡライブラリーの作製である。ポリメラーゼ連鎖反応の技術と組み合わせて用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると推定される配列を複製する一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列を作製して、一本鎖の形に変性しておいたｃＤＮＡのクローン化コピーに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において使用する（Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。ＦＨＦ−３に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＦＨＦ−３ペプチドに関して、ラムダgt11のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。このような抗体はポリクローナル的に誘導されてもモノクローナル的に誘導されてもよく、ＦＨＦ−３のｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に用いられる。ＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ移入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」はベクターを増やすことができかつそのＤＮＡを発現させることができる細胞である。この用語はその宿主細胞のあらゆる子孫をも包含する。複製中に突然変異が起こることがあるので、全部の子孫が親細胞と同一であるとは限らないことを理解すべきである。しかしながら、用語「宿主細胞」が用いられるときは、このような子孫も含まれる。安定した移入法（外来ＤＮＡが宿主中に連続して維持されることを意味する）は当技術分野で公知である。本発明において、ＦＨＦ−３ポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクター中に挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＦＨＦ−３遺伝子配列の挿入または組込みにより操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野で公知の他の運搬体を意昧する。このような発現ベクターは宿主の挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含有する。本発明で使用するのに適したベクターとしては、細菌発現用のＴ７ベースの発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125，1987）、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター（Lee and Nathans，J．Biol．Chem.，263:352 1，1988)および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターがあるが、これらに限らない。ＤＮＡセグメントは調節要素、例えばプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩまたはポリヘドリンプロモーター）に機能的に連結された状態でベクター中に存在する。ＦＨＦ−３をコードするポリヌクレオチド配列は原核または真核生物内で発現させることができる。宿主として、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられる。原核生物内で真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現および複製する能力を有する、生物学的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で公知である。本発明のＤＮＡ配列を組み入れるためにこの種のベクターが用いられる。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知であるような慣用の技術により行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取リ込む能力があるコンピテント細胞を調製するには、指数増殖期後に細胞を回収し、その後当技術分野で公知の手順を用いるCaCl₂法により処理する。また、MgCl₂ やRbClを使用してもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成した後で形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションなどの通常の機械的方法、リポソーム内に封入したプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのようなＤＮＡトランスフェクション法が用いられる。また、真核細胞は本発明のＦＨＦ−３をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子）により同時形質転換することもできる。もう一つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシ乳頭腫ウイルスのような真核生物ウイルスベクターを用いて真核細胞を一時的に感染または形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Eukaryotic Viral V ectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編，1982を参照されたい）。本発明により提供される、微生物において発現されたポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分離用クロマトグラフィー、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて慣用の手段により行うことができる。本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドはまた、ＦＨＦ−３ポリペプチドのエピトープと免疫反応するまたは結合する抗体を産生するためにも使用される。エピトープ特異性が異なるモノクローナル抗体のプールから成る抗体、および明確に区別されるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当技術分野で公知の方法によりタンパク質の抗原含有断片から作られる（Kohlerら，Natu re，256:495，1975;Current Protocols in Molecular Biology，Ausubelら編，1 989）。本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な分子だけでなく、エピトープ決定基と結合する能力があるFab、F(ab')₂、Fvなどのそのフラグメントも含む。これらの抗体フラグメントはその抗原または受容体と選択的に結合する能力をいくらか保持しており、次のように定義される。（１）Fab、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含むこのフラグメントは、完全な抗体を酵素パパインで消化して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成することにより得られる。（２）Fab’、抗体分子のこのフラグメントは完全な抗体をペプシンで処理した後に還元して無傷のＬ鎖とＨ鎖の一部を生成することにより得られる。抗体１分子につき２個のFab’フラグメントが得られる。（３）F(ab')₂、この抗体フラグメントは完全な抗体を酵素ペプシンで処理する（後続の還元を行わない）ことにより得られる。F(ab')₂は２つのFab’フラグメントが２つのジスルフィド結合により一緒に結合した二量体である。（４）Fv、２本の鎖として発現されたＬ鎖可変部とＨ鎖可変部を含む遺伝子工学的に作製されたフラグメントとして定義される。（５）単鎖抗体（single chain antibody:ＳＣＡ）、遺伝的に融合された単鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、Ｌ鎖可変部とＨ鎖可変部を含む遺伝子工学的に作製された分子として定義される。これらのフラグメントの調製方法は当技術分野で公知である（例えば、参考としてここに組み入れられるHarlow and Lane，Antibodies:A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)を参照されたい）。本発明で用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基はアミノ酸や糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピング(groupings)から成り、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性をもつのが普通である。本発明のＦＨＦ−３ポリペプチドと結合する抗体は、無傷のポリペプチドまたは目的の小型ペプチドを含む断片を免疫用抗原として用いて調製することができる。動物の免疫化に用いられるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡ（例えば実施例４および６参照）から、または所望により担体タンパク質に結合させることができる化学合成により誘導される。ペプチドに化学的に結合される慣用の担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風毒素などがある。その後、結合したペプチドを用いて動物（例：マウス、ラット、ウサギ）を免疫する。所望により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、抗体の誘導に使用したポリペプチドまたはペプチドを結合させたマトリックスに結合させて、そのマトリックスから溶出することにより、さらに精製することができる。当業者であれば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮に関する、免疫学の分野で公知のさまざまな技法を熟知しているだろう（例えば、参考として組み入れられるColiganら，Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1994を参照されたい）。抗イディオタイプ技法を用いて、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を作製することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体が結合するエピトープの「イメージ」である結合ドメインを超可変部にもつだろう。「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば形態も遺伝子型も周囲の組織と違っているような、悪性細胞と非悪性細胞の集団を表す。悪性細胞（すなわち、癌）は複数の過程を経て発生する。アンチセンス分子であるＦＨＦ−３ポリヌクレオチドは種々の器官系の悪性疾患、特に、神経組織を含む中枢神経系、精巣、眼の細胞の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＦＨＦ−３発現の変化と病因的に関連がある疾患はどれも、ＦＨＦ−３抑制剤を用いる治療に感受性であると考えられる。このような疾患の一つが例えば悪性の細胞増殖性疾患である。本発明の目的のため、ＦＨＦ−３に特異的な抗体または核酸プローブを用いて生物学的液体または組織中のＦＨＦ−３ポリペプチド（抗体を使用）またはＦＨＦ−３ポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）を検出することができる。本発明は、例えば、抗ＦＨＦ−３抗体または核酸プローブを、ＦＨＦ−３関連疾患が疑われる細胞と接触させ、前記抗体または核酸プローブへの結合を検出することを含んでなる、神経組織または精巣の細胞増殖性疾患の検出方法を提供する。ＦＨＦ−３に反応性の抗体または核酸プローブはＦＨＦ−３への結合の検出を可能にする化合物で標識することが好ましい。検出可能な量の抗原またはポリヌクレオチドを含有するどのような検体を使用してもよい。本発明の好適なサンプルはＣＮＳ、例えば神経組織または脳脊髄液または眼の組織である。前記疾患が疑われる細胞中のＦＨＦ−３のレベルを正常細胞におけるそのレベルと比較して、被験者がＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患をもつかどうか判定することができる。好ましくは被験者はヒトである。細胞成分が核酸である場合、ＦＨＦ−３特異的プローブとの結合に先立って核酸を増幅することが必要になるかもしれない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することが好ましいが、他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ligated activated transcription:ＬＡＴ）および核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification:ＮＡＳＢＡ）を使用してもよい。本発明の抗体は、in vitroまたはin vivo免疫診断または免疫治療を施すことが望まれるどのような患者にも使用することができる。本発明の抗体は、例えば抗体を液相中でまたは固相担体に結合させて利用するイムノアッセイにおいて使用するのに適している。さらに、これらのイムノアッセイでは抗体をさまざまな方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用しうるイムノアッセイの種類としては、直接または間接フォーマットでの競合および非競合イムノアッセイがある。このようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルに対する免疫組織化学的アッセイを始めとする、フォワード、リバースまたは同時モードで実施されるイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれば、他のイムノアッセイのフォーマットを熟知しており、また、過度の実験を行わなくとも他のフォーマットを容易に見つけ出すことができよう。本発明の抗体は、多種多様な担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するために使用される。公知の担体の例として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鋼が挙げられる。担体の性質は本発明においては可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者であれば、抗体を結合させるのに適した他の担体について熟知しているか、ルーチンな実験操作を用いてそのような担体を確認できるだろう。さまざまな標識および標識化方法が当業者に公知である。本発明において使用できる標識の種類として、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、リン光化合物、生物発光化合物が挙げられる。当業者は抗体に結合させるのに適した他の標識を熟知しているか、ルーチンな実験操作を用いてそのような標識を確認できるだろう。より高い感度をもたらし得るもう一つの技法は、抗体を低分子量のハプテンにカップリングさせることから成る。その後これらのハプテンは第二の反応手段により特異的に検出される。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレセインのようなハプテンを用いることが一般的である。抗原のin vivo検出のために本発明のモノクローナル抗体を用いるにあたって、検出可能に標識された抗体は診断的に有効な用量で投与される。「診断的に有効」という用語は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明のポリペプチド（これに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有する部位の検出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに対して検出可能であるように十分なものとすべきである。さらに、最良の標的対バックグラウンドのシグナル比を与えるために、検出可能に標識されたモノクローナル抗体はすみやかに循環系から排出されることが望ましい。一般に、検出可能に標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断用の投与量は個体の年齢、性別、疾患の重症度といった要因に応じて変化するだろう。例えば、このような投与量は、注入が複数回行われるのか、抗原の負担量、当業者に公知の他の要因に応じて変化しうる。 in vivo診断映像化の場合は、利用可能な検出装置のタイプが特定のラジオアイソトープを選択する際に主な要因となる。選択されたラジオアイソトープは所定の装置で検出できるタイプの崩壊を示す必要がある。in vivo診断用のラジオアイソトープを選択する上でさらに重要な要因は、宿主に対して有害な放射線を最小限にすることである。理想的には、in vivo映像化に用いるラジオアイソトープは、粒子を発生しないが、通常のγカメラで容易に検出できる140〜250keV の範囲で多数の光子を発生するものである。 in vivo診断のために、ラジオアイソトープを直接、または中間官能基を用いて間接的に、免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在するラジオアイソトープを免疫グロブリンに結合させるためにしばしば用いられる中間官能基は二官能性キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることができる金属イオンの代表的な例は¹¹¹ Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒおよび²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴映像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）のようなin vivo診断のために常磁性アイソトープで標識することもできる。一般的に、診断用画像を可視化する従来の方法はどれも利用できる。通常、カメラ映像化のためにはγ線および陽電子発生ラジオアイソトープが、そしてＭＲＩのためには常磁性アイソトープが用いられる。こうした技術において特に有用な元素としては¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体またはポリヌクレオチドは、被験者のＦＨＦ−３関連疾患の回復過程をモニターするためにin vitroおよびin vivoで使用することができる。こうして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加または減少を測定するか、または種々の体液中に存在する前記抗原の濃度の変化を測定することにより、ＦＨＦ−３関連疾患を軽減することに目標を定めた特定の治療計画が果して有効であるのか否かを調べることができるだろう。「軽減する」という用語は、治療を受ける被験者においてＦＨＦ−３関連疾患の有害作用が減少することを意昧する。本発明により、正常細胞における発現と比べて変化した方法で発現されるヌクレオチド配列を同定することができ、それゆえ、この配列に向けられた適当な治療法または診断法を設計することが可能である。ＦＨＦ−３の上昇した発現レベルの検出は、ＦＨＦ−３関連増殖性疾患が疑われる細胞から単離した核酸を、本発明のＦＨＦ−３ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより達成される。ノーザンブロット分析のような分析を用いてＦＨＦ−３の発現を定量する。その他の標準的な核酸検出法は当業者に公知である。ＦＨＦ−３関連細胞増殖性疾患の治療として、ＦＨＦ−３遺伝子発現およびＦＨＦ−３活性を調節することが含まれる。「調節する」という用語は、ＦＨＦ− ３が過剰発現されるときはＦＨＦ−３の発現を抑制し、ＦＨＦ−３が過小発現されるときはＦＨＦ−３の発現を増強することを意味する。細胞増殖性疾患がＦＨＦ−３の発現と関連がある場合、ＦＨＦ−３の発現を翻訳レベルで妨害する核酸配列が使用される。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムまたはトリプレックス（三重らせん）薬剤を利用するもので、特定のＦＨＦ−３ｍＲＮＡをアンチセンス核酸またはトリプレックス薬剤でマスクするか、またはそれをリボザイムで切断することにより、そのｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックする。この種の疾患としては例えば神経変性疾患がある。アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。この細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害することとなる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好適である。なぜならば、それらを容易に合成することができ、しかも標的ＦＨＦ−３産生細胞に導入するとき、より大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が少ないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は当技術分野で公知である（Marcus-Sakura，Anal．Bio chem.，172:289，1988）。転写を停止させるためのオリゴヌクレオチドの使用は、そのオリゴマーが二本鎖ＤＮＡの回りに巻きついて三重らせんを形成することから、トリプレックス戦略として知られている。したがって、これらのトリプレックス化合物は所定の遺伝子のユニークな部位を認識するように設計される(Maherら，Antisence Res．a nd Dev.，1(3):227，1991;Helene，C.，Anticancer Drug Design，6(6):569，19 91)。リボザイムはＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力があるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列を認識して切断する分子を作製することが可能である(Cech，J．Amer．Med．Assn.，26 0:3030，1988)。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異的であるので特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点である。リボザイムの基本的なタイプには２種類あり、すなわちテトラヒメナ型(Hasse lhoff，Nature，334:585，1988)と「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基である配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは長さが11〜18塩基の配列を認識する。認識配列が長くなればなるほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種中に独占的に存在する可能性が高くなる。その結果、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するにはハンマーヘッド型リボザイムの方がテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、18塩基の認識配列の方がより短い認識配列よりも好ましい。本発明はまた、ＦＨＦ−３タンパク質により媒介される細胞増殖性疾患または免疫疾患を治療するための遺伝子治療を提供する。このような治療は、増殖性疾患にかかっている細胞にＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドを導入することによりその治療効果を奏するだろう。アンチセンスＦＨＦ−３ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて達成される。アンチセンス配列の治療的送達には標的化リポソームの使用が特に適している。本明細書において教示されるような遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスがある。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入し得るレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）であるが、これらに限らない。患者がヒトであるときは、テナガザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のようなベクターを利用することが好ましい。多数の追加のレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターはどれも、形質導入された細胞を同定して増やせるように、選択マーカーの遺伝子を組み入れることができる。目的のＦＨＦ−３配列を、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することにより、このベクターはまさに標的特異性となる。例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を結合させることで、レトロウイルスベクターを標的特異性とすることができる。好適な標的化（ターゲッティング）は抗体を用いてレトロウイルスベクターを標的特異性とすることにより達成される。当業者であれば、ＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異性送達を可能にするようにレトロウイルスゲノムに挿入し得るまたはウイルスエンベロープに結合し得る特定のポリヌクレオチド配列を熟知しているか、または過度の実験操作を行うことなく容易に確認できるだろう。組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性のベクター粒子を産生するには介助が必要である。この介助は例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下にレトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を用いることにより提供される。これらのプラスミドはパッケージング機構に包膜用のＲＮＡ転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞系としては、例えばΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２があるが、これらに限らない。これらの細胞系はゲノムがパッケージされないので中空ビリオンを産生する。レトロウイルスベクター（パッケージングシグナルが無傷であるが、構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置き換えられている細胞）をこのような細胞に導入すると、そのベクターはパッケージされて、ベクタービリオンを産生する。あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞を、慣用のリン酸カルシウムトランスフェクションによりレトロウイルス構造遺伝子gag、polおよびenvをコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることもできる。次に、これらの細胞を目的の遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトする。得られた細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。ＦＨＦ−３アンチセンスポリヌクレオチドの別の標的送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系として、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、水中油型エマルジョンを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを挙げることができる。本発明の好適なコロイド分散系はリポソームである。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達用ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0μｍである大型の単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は大きな巨大分子を含有する水性バッファーを十分な割合でカプセル化することができる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを水性の内部にカプセル化して、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる（Fraleyら，Trends Biochem ．Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、植物、酵母および細菌細胞内にポリヌクレオチドを送達するためにもリポソームが使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるためには、次の特性が存在する必要がある。すなわち、（１）目的の遺伝子を高効率的にカプセル化するが、その生物学的活性を損なわない；（２）非標的細胞と比べて標的細胞に優先的にかつ強固に結合する；（３）小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に高効率的に送達する；および（４）遺伝情報を正確かつ効率よく発現させる、ことである（Mann inoら，Biotechniques，6:682,1988）。リポソームの組成は、通常ステロイド（特にコレステロール）と組み合わせた、リン脂質（特に相転移温度が高いリン脂質）類の混合物である。他のリン脂質や他の脂質を使用してもよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価のカチオンの存在に影響を受ける。リポソームの調製に有用な脂質の例として、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドが挙げられる。特に有用なものはジアシルホスファチジルグリセロールであり、脂質成分が14〜18個の炭素原子、特に16〜18個の炭素原子を含み、飽和であるものである。リン脂質の例には卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的化（ターゲッティング）は解剖的および機械的要因に基づいて分類することができる。解剖的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ（細胞小器官）特異性のレベルに基づいている。機械的ターゲッティングはそれが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的ターゲッティングはリポソームが洞様毛細血管を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布しやすいという傾向を利用するものである。一方、能動的ターゲッティングはリポソームを特定のリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質）に結合させることによるか、または天然に存在する局在部位以外の器官または細胞型へのターゲッティングを達成するためにリポソームの組成またはサイズを変えることによる、リポソームの変更を含むものである。標的送達系の表面をさまざまな方法で修飾してもよい。リポソーム標的送達系の場合には、ターゲッティング用のリガンドをリポソームニ重層との安定した結合状態に維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を組み込むことができる。脂質鎖をターゲッティング用のリガンドに結合させるために種々の連結基を用いることができる。ＦＨＦ−３が精巣、眼および脳、または神経組織において発現されるため、これらの組織に関係した、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を用いるさまざまな用途が存在する。そのような用途として、これらの組織と他の組織に係わる細胞増殖性疾患および免疫疾患の治療がある。加えて、ＦＨＦ−３は各種の遺伝子治療法にも有用でありうる。ＦＨＦ−３は精巣で高レベルに発現されるため、この組織に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用する用途は広範囲にわたる。このような用途には、精巣でのＦＨＦ−３発現と関連がある細胞増殖性疾患の治療が含まれる。各種の精巣発育異常または後天性疾患にＦＨＦ−３を適用することが可能である。これらの疾患には、ウイルス感染症（例えば、ウイルス性精巣炎）、自己免疫疾患、精子産生または機能不全、外傷、および精巣腫瘍が含まれるが、これらに限らない。精巣における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、ＦＨＦ−３またはＦＨＦ−３の類似体を使用して男性の生殖能力を増加または低下させ得ることを示唆する。ＦＧＦファミリーの新規メンバーの同定はＦＨＦ−３媒介疾患の診断、予後および治療戦略のための有用なツールを提供する。抗ＦＨＦ−３抗体を用いてＦＨＦ−３レベルを測定することは、癌、卒中、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病）、網膜疾患（例えば、色素性網膜炎）またはウイルス脳炎を含めて、神経系の疾患の進行または回復をモニターするのに有用である。中枢神経系における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、多くの末梢組織で観察された低レベルのＦＨＦ−３が末梢神経におけるＦＨＦ−３および後根神経節や３叉神経節における感覚ニューロンでの存在を反映するため、抗ＦＨＦ−３抗体を用いるＦＨＦ−３レベルの測定が末梢神経疾患の診断に役立つことを示唆する。精巣における高レベルのＦＨＦ−３の存在は、抗ＦＨＦ−３抗体を用いるＦＨＦ− ３レベルの測定が精巣癌の診断に有用であることを示唆する。ＦＧＦファミリーの他のメンバーと同様に、ＦＨＦ−３は分裂促進活性および／または細胞生存活性をもつようであり、それゆえ、ＦＨＦ−３またはＦＨＦ− ３作用を模倣する類似体を用いて組織の修復または置換を促進することができるだろう。ＣＮＳにおけるＦＨＦ−３の存在は、卒中、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病）を含めた神経系の疾患、網膜変性疾患（例えば、色素性網膜炎または黄斑変性）または末梢神経疾患におけるこのような治療的役割を示唆する。反対に、抗ＦＨＦ−３抗体またはＦＨＦ−３アンタゴニストを用いてＦＨＦ−３の作用をブロックすることは、過度の細胞増殖が病因となる疾患（最も明白には癌）を遅延させたり軽減させたりするかもしれない。以下の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明を制限するものではない。それらは使用可能な手順の代表であり、当業者に公知の他の手順を代わりに使用することができる。実施例１ＦＧＦファミリーの新しいメンバーであるＦＨＦ−３の同定ヒト網膜で発現する新規な遺伝子産物を同定するために、ヒト網膜ｃＤＮＡクローンのランダムなセグメントを部分的に配列決定し、得られた部分配列を公のデータベースで利用できる配列と比較した。詳細には、ラムダgt10で構築した成人網膜ｃＤＮＡライブラリー(Nathansら， Science，232:193，1986)を増幅し、EcoRIでの開裂によりｃＤＮＡインサートを大量に切除し、アガロースゲル電気泳動によって精製してベクターを除いた。こうして精製したｃＤＮＡインサートを熱変性した後、５’端にEcoRI部位をもち３’端に６つのランダムなヌクレオチドを含有する合成オリゴヌクレオチド（5' GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN）（配列番号３）をプライマーとして用いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片の存在下で連続して二回ＤＮＡ合成を行なった。得られた二重鎖分子の増幅を、独特な５’フランキング配列に対応するプライマー（5'CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAATTCTACTCG）（配列番号４）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して行なった。元のｃＤＮＡインサートのランダムなサンプル採取に相当するこれらのＰＣＲ産物をEcoRIで開裂し、分取用アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画して長さが約５００ｂｐのセグメントのみとし、ラムダgt10にクローン化した。この誘導体ライブラリーに由来する 3000個の単一プラークを96ウェルのトレーに並べ、これらのクローンから、フランキングベクタープライマーを用いたＰＣＲによりインサートを増幅した後、ジデオキシ法と自動化蛍光検出(Applied Biosystems)を用いて配列決定した。各インサートの一端から一回配列決定したものを３つの読取り枠（リーディングフレーム）すべてにおいて両方の鎖上で概念的に翻訳し、得られた６つのアミノ酸配列を使用して、BLASTX検査アルゴリズムを用いた重複のないGenBankタンパク質データベースで相同性を検査した。すでに記載されているＦＧＦファミリーのメンバーに対して統計的に有意な相同性を示す部分ｃＤＮＡ配列がひとつ見つかった。この部分ｃＤＮＡをプローブとして使用して、読取り枠（オープンリーディングフレーム）全体を含むもの２つを含めて多数の独立したｃＤＮＡクローンをヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーから単離し、この２つにつき、完全なヌクレオチド配列を決定した。この配列はＦＧＦスーパーファミリーの新規かつ高度に分岐したメンバーをコードしており、繊維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）と命名されている。続いて、２番目の密接に関連する配列（ＦＨＦ−２）がそのＦＨＦ−１配列に対する類似性に基づいて特性決定された（配列番号６〜９、図７ａおよび７ｂ）。ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２アミノ酸配列を使用して、統計的に有意な類似性を有するアミノ酸配列について概念的に翻訳したＤＮＡ配列（ＤＢＥＳＴ）の公的利用可能なGenbankデータベースをスクリーニングした。ヒトゲノムＤＮＡの短い領域（ＤＢＥＳＴ受け入れ番号76387）が、ＦＨＦ−１およびＦＨＦ−２アミノ酸配列の約25％に対して有意な相同性を有する翻訳配列を有することを見出した。このゲノムセグメントは、17番染色体上の乳癌感受性遺伝子の検索の際にランドマークとして使用された多くのゲノムセグメントのうちの一つであった。配列76387に基づく合成ＤＮＡプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡおよびヒト網膜由来のｃＤＮＡからこの領域部分を増幅した。次いでこれらのＰＣＲ産物をプローブとして使用し、前記ヒト網膜ｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡクローンを単離した。実施例２ＦＨＦ−３の推定一次構造２つの独立したヒト網膜ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定されたヒトＦＨＦ−３の配列を図１に示す。ヒトＦＨＦ−３の一次翻訳産物は長さが２ 25個のアミノ酸であると予想される。図１の位置74に示したヒトＦＨＦ−３開始メチオニンコドンは、読取り枠が合った最初のATGコドンである。この位置に良好なコンセンサスリボソーム結合部位(GCGCTATGG（配列番号５）;Kozak，Nuclei c Acids Res.，15:8125，1987)が見られる。読取り枠内にある次のメチオニンコドンは推定開始メチオニンコドンの124コドン３’側に見られる。ａＦＧＦとｂＦＧＦに対して観察されているように、ＦＨＦ−３の一次翻訳産物のアミノ末端は、シグナルペプチドの小胞体膜を横切る同時翻訳挿入を指令するためのコンセンサス配列と一致しない。ＦＨＦ−３配列は、アスパラギン結合グリコシル化のための潜在的なasn-X-ser/thr部位を欠く。ＦＨＦ−３をＦＧＦファミリーの公知の他のメンバーと並べて図２に示し、また、アミノ酸の類似度を示す樹状図を図３に示す。最も相同性の高いＦＧＦファミリーのメンバーは、８個のギャップをもって並べたときにＦＨＦ−３と30％のアミノ酸が同一であるＦＧＦ−９である。各々のポリペプチドの中央領域で、ＦＨＦ−３も含めたすべてのＦＧＦファミリーのメンバーが約50％のアミノ酸同一性を共有していることに注目されたい。実施例３ＦＨＦ−３の染色体位置決定各々が異なるヒト染色体(Oncor，Gaithersburg，MD)を含有している24のヒト ‐マウスおよびヒト‐ハムスター細胞系のパネルから誘導され制限酵素で消化したＤＮＡを含有するサザンブロットを探査することによってＦＨＦ−３の染色体位置を決定した。図４に示されているように、ヒトＦＨＦ−３プローブとヒト、マウスおよびハムスターのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって異なるサイズのハイダリダイズ断片が生成する。ハイブリッドパネルのうち、ヒト特異的ハイブリダイゼーションパターンはヒト17番染色体を担持するハイブリッド細胞系に相当するレーンのみに見られる。実施例４ＦＨＦ−３ｍＲＮＡの組織分布ＦＨＦ−３のｍＲＮＡの組織分布を決定するために、マウスの脳、眼、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓および精巣に由来する全ＲＮＡならびに酵母ｔＲＮＡ陰性対照に対してＲＮアーゼプロテクション解析を実施した。使用したプローブは、全長ヒトＦＨＦ−３ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによってマウス眼ｃＤＮＡライブラリーから単離したマウスＦＨＦ−３遺伝子のセグメントから誘導したものである。図５に示されているように、ＦＨＦ−３の発現は脳および眼で最も高レベルである。肺および精巣では、オートラジオグラムをさらに長く露出させて検出されたＦＨＦ−３の発現レベルは低かった。実施例５図６は、一時的にトランスフェクトしたヒト胚腎細胞（細胞系293）にて産生されたＦＨＦ−３の免疫ブロットを示す。完全ＦＨＦ−３タンパク質にカルボキシ末端で結合したバクテリオファージT7由来の遺伝子10タンパク質を含む融合タンパク質に対して抗ＦＨＦ−３抗体を誘導させた（Studier and Moffatt，J．Mo lec．Biol．189:113，1986）。得られた融合タンパク質を分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製し、ウサギに注射した。ＦＨＦ−３をヒト細胞で発現させるために、完全な読取り枠（オープンリーディングフレーム）を真核細胞用発現ベクターpCISへ挿入した（Gormanら，DNA Protein Eng．Tech.，2:3，1990 ）。翻訳の効率を向上させるために、開始メチオニンコドンのすぐ5'側の領域を、所望の配列を担持したプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって適切なリボソーム結合部位（CCACCATGG）へ変換した。この発現構築物およびシミアンウイルス4 0（SV40）ラージＴ抗原を発現するプラスミド（pRSV-TAg;Gormanら，DNA Protei n Eng．Tech.，2:3，1990）でヒト胚腎細胞を一時トランスフェクトした24時間後に、細胞を回収し、タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、1: 5000の希釈率のウサギ抗ＦＨＦ−３抗血清を用いて免疫ブロットした。図６に示すように、ＦＨＦ−３でトランスフェクトした細胞（右レーン）は、見掛けの分子量が30kDの免疫反応性ポリペプチドを合成する。この免疫反応性ポリペプチドは、関連のＦＧＦファミリーメンバー（ＦＨＦ−２）でトランスフェクトした細胞（中央レーン）または偽トランスフェクトした細胞（左レーン）では見られないものである。前もって染色したタンパク質サイズ標品の見掛けの分子量(kD)を左側に示す。組換えＦＨＦ−３の見掛けの分子量は一次翻訳産物の推定分子量（25kD）よりも５kD多く、この不一致はおそらくこのタンパク質の等電点（10.275）が高いことを反映している。現状で好ましい態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなくさまざまな修正をすることができるものと理解されたい。したがって、本発明は請求の範囲によってのみ制限されるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Fibroblast growth factor homologous factor-3 (FHF-3) and methods of use Background of the Invention 1. Field of application of the invention The present invention relates generally to growth factors, and more particularly to fibroblasts. Vesicle growth factor homologous factor-3 (fibroblast growth factorhomologousfactor-3: F Novel member of the fibroblast growth factor family, designated HF-3) and FH The present invention relates to a polynucleotide encoding F-3. 2. Description of related technology The fibroblast growth factor family has a broad spectrum in vivo and in vitro. Structurally related proteins having growth promoting, survival and / or differentiation activity Encompasses a class of qualities (Baird, A. and Gospodarowicz, D., Ann NY Acad. Sci. , 638: 1, 1991; Eckenstein, F.P., J.E. Neurobiology 25: 1467, 1994; Mason, I. J. Cell, 78: 547, 1994). As of December 1994, Nine members of the family have been characterized by molecular cloning. Special The first two members to be sexed, acidic fibroblast growth factor (aFGF / FGF-1) and basic fibroblast growth factor (bFGF / FGF-2) Have been found in numerous tissues, including the brain, eye, kidney, placenta, and adrenal gland (Jaye et al.). , Science 233: 541, 1986; Abraham et al., Science 233: 545, 1986). These factors Includes fibroblasts, endothelial cells, hippocampal and cerebral cortical neurons, and glial cells First of all, potent mitogens and various mesoderm-derived neuroectoderm-derived tissues And survival factors (Burgess, W.H. and Maciag, T., Ann. R. ev. Biochemistry 58: 575, 1989). As an additional member of the FGF family Has been identified as one of the normal integration sites for the mouse mammary tumor virus and therefore Int-2 / FGF-3 (Smith et al., EMBO J. 7: 1013, putative as a cancer factor. 1988); identified as a transforming gene in the NIH 3T3 transfection assay. FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 1987) and FGF -5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8, 3487, 1988); FGF-6 isolated by molecular cloning (Marics et al., Oncogene 4:33 5, 1989); Keratinocyte proliferation identified as a mitogen for keratinocytes Factor / FGF-7 (Finch et al., Sclence 245: 752, 1989); Androgen in breast cancer cells FGF-8 identified as an induced mitogen (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. S. ci. USA 89: 8928, 1992); and F as a mitogen for primary astrocytes GF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13: 4251, 1993). aFG Some FGFs, including F and bFGF, do not have a classical signal sequence, The mechanism of their secretion is unknown. All members of the FGF family have an amino acid sequence of approximately 25% or more Identities, this degree of homology indicates that they seem to share nearly identical three-dimensional structures. And suggest. This inference was made between bFGF measured by X-ray diffraction and inter. Loiki Supported by a comparison of the three-dimensional structure of 1-β (Eriksson et al., Proc. Natl. Acad. . Sci. USA 88: 3441, 1991; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3446,19 91; Ago et al. Biochem. 110: 360, 1991). These proteins are identical amino acids Only 10%, but the two crystalline α-carbon backbones are 2 Å Can be superimposed with a root mean square deviation of less than , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3446, 1991). Both proteins are almost complete Consists of a β-sheet and three copies of a four-stranded β-bend motif. Forming a rel. Both heparin-binding and receptor-binding regions Is located in a contiguous region on one side of the protein. aFGF, bFGF and FGF-7 / KGF are tyrosine kinases on the cell surface Exerts some or all of its biological activity through high-affinity binding to (Eg, Lee, P.L., et al., Science 245: 57, 1989; Johnson, D.E. . and Williams, L.T., Adv. Cancer Res. 60: 1, 1993). Also, FGF family Members are tightly bound to heparin, heparin, FGF and transmembrane receptors The ternary complex of the body can be a biologically significant signaling species. So far Have identified four genes encoding receptors for members of the FGF family ing. Recent studies have shown that differential mRNA within the extracellular ligand binding domain Splicing has been shown to increase receptor diversity, suggesting that different ligand binding Multiple receptor isoforms with matching properties can be encoded by the same gene (Johnson, DE and Williams, L.T., Adv. Cancer Res. 60: 1, 1993). In a tissue culture system, its cell surface reception of aFGF or bFGF Binding to the body activates phospholipase C-γ (Burgess, WH et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4770, 1990), and this phospholipase C-γ has various mitogenic signals. It is a path known to integrate nulls. By identifying and characterizing new members of the FGF family, Regulates growth, survival, aging, differentiation and recovery from injury You can gain insight.Summary of the Invention The present invention relates to FHF-3 as a growth, survival, differentiation factor The polynucleotide sequence to be loaded. This factor is associated with the central nervous system (CNS) and And the proliferation, survival, and / or differentiation of cells in peripheral tissues. The present invention relates to FHF-3 gene expression useful for diagnosis of neurodegenerative diseases or neoplastic diseases. A method is provided for detecting changes in reality. In another embodiment, the present invention provides Neurodegenerative disease or neoplastic disease by regulating the expression or activity of FHF-3 Methods for treating a condition are provided.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of human FHF-3 ( SEQ ID NOs: 1 and 2). FIG. 2 shows the amino acid sequence of human FHF-3 and the other nine members of the FGF family. The alignment (parallelization) with the amino acid sequence of each member is shown. Saved Residues are highlighted. The members of the FGF family are: aF GF / FGF-1 (Jaye et al., Science 233: 541, 1986), bFGF / FGF-2 ( Abraham et al., Science 233: 545, 1986), int-2 / FGF-3 (Smith et al., EMB). O J. 7: 1013, 1988), FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 198). 7), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8, 3487, 1988), FGF-6 (Mar ics et al., Oncogene 4: 335, 1989), keratinocyte growth factor / FGF-7 (Finch Et al., Science 245: 752, 1989), FGF-8 (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. . USA 89: 8928, 1992), and FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Blol. 13: 4). 251, 1993). FIG. 3 shows that the length of the straight line connecting any pair of FGF family members is 1 shows a dendrogram proportional to the degree of branching of the amino acid sequence of FIG. FIG. 4 shows that the gene encoding FHF-3 is located on human chromosome 17. Show. Human specific hybridization is found on chromosome 17. FIG. 5 shows the tissue specificity of FHF-3 expression. All mouse tissues shown 10 μg of RNA was prepared (Chomczinski & Sacchi. Anal. Biochem. 162: 156, 194). 87), cloned c containing 70 bases of the 5 'untranslated sequence and the first 130 bases of the coding region RNase using mouse FHF-3 antisense probe spanning 200 bases of DNA (Ausabel et al., Current Protocols in Molecular). Biology; New York: Wiley Interscience, 1987). RNA from brain and eyes RNase protection was observed most strongly at the expected size (arrow), Weak protection was seen with RNA from lung and testis. Figure 6: Produced in transiently transfected human embryonic kidney cells (cell line 293) 2 shows an immunoblot of FHF-3. Cells transfected with FHF-3 Vesicles (right lane) synthesize an immunoreactive polypeptide with an apparent molecular weight of 30 kD . The immunoreactive polypeptide is a member of a related FGF family member (FHF- Cells transfected in 2) (middle lane) or mock transfected It is not seen in the cells (left lane). Protein stains previously stained The apparent molecular weight (kD) of the standard sample is shown on the left. Figures 7a and 7b show the nucleotide sequences and FHF-1 and FHF-2, respectively. And deduced amino acid sequences (SEQ ID NOs: 6 to 9).Detailed description of the invention The present invention relates to growth factors FHF-3 and polynucleotides encoding FHF-3 Provide an array. FHF-3 is expressed at high levels in brain and eye tissues, and in lung and sperm. It is expressed at low levels in the nest. In one embodiment, the invention relates to the expression of FHF-3 Or detect cell proliferative or cytopathic diseases of the central nervous system that are associated with function Provide a way to In another embodiment, the invention relates to the expression of FHF-3. Or use of agents that suppress or enhance activity A method for treating an epidemiological disease is provided. Structural homology between FHF-3 proteins of the present invention and members of the FGF family Indicates that FHF-3 is a new member of this growth factor family. Many Based on the known activities of other members of the group, FHF-3 is also a diagnostic and therapeutic agent It is expected to retain useful biological activity. Many growth factors have expression patterns or activities that are involved in the functioning of the nervous system. For example, one growth factor of the TGF family, GDNF, is a dopaminergic product. Be a potent neurotrophic factor that can promote the survival of kinetic neurons I understand (Lin et al., Science 260: 1130). De, another family member -Sarin-11 can promote the differentiation of neural crest cells (Basler et al., Ce ll 73: 687, 1993). Inhibin and activin are expressed in the brain (Meunier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 247, 1988; Sawc. henko et al., Nature, 334: 615, 1988), activin functions as a neuronal survival molecule (Schubert et al., Nature, 344 868, 1990). Another T GDF-1, a GF family member, has a nervous system-specific expression pattern. Yes (Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4250, 1991), and some others Family members of, for example, Vgr-1 (Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA, 86: 4554, 1989; Jones et al., Development, 111: 581, 1991), OP-1 (Ozkayna k et al. Biol. Chem., 267: 25220, 1992) and BMP-4 (Jones et al., Developme nt, 111: 531, 1991) is also known to be expressed in the nervous system. Expression of FHF-3 in the brain indicates that activity related to the function of the nervous system Suggest possible. FHF-3 enhances neurotrophic activity of various neuronal populations May have. Therefore, FHF-3 is used in neurons such as amyotrophic lateral sclerosis. To treat a degenerative disease or to maintain cells or tissues in culture prior to transplantation May have in vitro and in vivo applications. In a first embodiment, the present invention provides a method for determining the amount of reducing SDS-PAGE. It has an amino acid sequence of about 26 to 28 kD and has essentially the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (FIG. 1). Substantially pure fibroblast growth factor homologue factor-3 characterized by (FHF-3). As used herein, “substantially pure” refers to other Proteins, lipids, carbohydrates or other substances to which FHF-3 is naturally associated FHF-3 substantially not contained. Those skilled in the art will recognize standard protein It is possible to purify FHF-3 using a quality purification method. Virtually pure poly Peptides yield a single major band on non-reducing polyacrylamide gels Would. Purity of FHF-3 polypeptide is determined by amino-terminal amino acid sequence analysis You can also. As long as the activity of FHF-3 remains, FHF-3 polypeptide The term also includes functional fragments of this polypeptide. The biological activity of FHF-3 Small peptides possessed are included in the present invention. The invention provides a polynucleotide encoding a FHF-3 polypeptide. These polynucleotides include DNA, cDNA, and the like encoding FHF-3. And RNA sequences. All polynucleotides encoding all or part of FHF-3 Nucleotides, as long as they encode a polypeptide having FHF-3 activity, It should be understood that it is included in the present invention. As such a polynucleotide Are naturally occurring polynucleotides, synthetic polynucleotides, Polynucleotide. For example, the FHF-3 polynucleotide is site-specific. Mutagenesis. The polynucleotide sequence of FHF-3 includes Antisense sequences are also included. The polynucleotide of the present invention is a gene encoding result. As well as sequences that are degenerate. There are 20 natural amino acids, of which Are largely defined by two or more codons. Therefore, any degenerate The nucleotide sequence is the FHF-3 polypeptide encoded by the nucleotide sequence. As long as the amino acid sequence of the peptide is not functionally changed, it is included in the present invention. A DNA sequence encoding a human FHF-3 polypeptide is disclosed in detail herein. You. This sequence is an open reading frame encoding a polypeptide of 225 amino acids in length. (Open reading frame). Human F shown at position 74 in FIG. The initiation methionine codon for HF-3 is the first ATG codon in reading frame, Good consensus ribosome binding site (GCGCTATGG; Kozak, Nucleic Acids Re s., 15: 8125, 1987) is at this position. The next methionine code in the reading frame Is found 124 codons 3 'to the putative initiation methionine codon. with aFGF As observed with bFGF, the amino terminus of the primary translation product of FHF-3 is Directs cotranslational insertion across the endoplasmic reticulum membrane Does not match the consensus sequence of the signal peptide. The FHF-3 sequence is a potential Lacks an asn-X-ser / thr site for efficient asparagine-linked glycosylation. Preferably Indicates that the human FHF-3 nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1 and the deduced amino acid sequence is Probably SEQ ID NO: 2 (see FIG. 1). The polynucleotide encoding FHF-3 is not only SEQ ID NO: 1 but also SEQ ID NO: 1. And nucleic acid sequences complementary to Complementary sequences include antisense nucleotides obtain. When this sequence is RNA, deoxynucleotide A of SEQ ID NO: 1; G, C and T are replaced by ribonucleotides A, G, C and U respectively Can be A fragment of the above nucleic acid sequence having a chain length of at least 15 bases is also included in the present invention, This chain length of 15 bases allows the fragment to encode the protein of SEQ ID NO: 2 under physiological conditions. Sufficient to allow selective hybridization to the DNA to be loaded. Special In addition, these fragments express the FHF-3 protein under moderately stringent conditions. It should hybridize to the encoding DNA. The most homologous FGF family member to FHF-3 is FGF-9. When FGF-9 is aligned with eight gaps, FGF- 3 and share 30% amino acid identity. Only a small amount of the primary amino acid sequence of FHF-3 Various modifications result in activities substantially equivalent to the FHF-3 polypeptides described herein. A protein having the property is obtained. Such proteins include "essentially sequence Having the amino acid sequence of No. 2 " . Such modifications may be intentional, such as by site-directed mutagenesis. Or spontaneously. Polypeptides produced by these modifications Are included in the present invention as long as the biological activity of FHF-3 is still present. In addition, deletion of one or more amino acids may also preserve its biological activity. Without altering the structure, the structure of the obtained molecule can be modified. This is yo This will lead to the development of small active molecules with broad utility. For example, FHF-3 Amino- or carboxy-terminal amino acids that are not required for the biological activity of Can be excluded. FHF-3 polypep of the invention encoded by the polynucleotide of the invention Tides include the disclosed sequence (SEQ ID NO: 2) and conservative variations thereof. Book As used herein, the term "conservative mutation" refers to the conversion of an amino acid residue into a biological residue. Substitution with another similar amino acid residue. Examples of conservative mutations include Other hydrophobic residues such as leucine, valine, leucine, methionine and other hydrophobic residues Substitution of a polar residue with another polar residue, e.g., Substitution of arginine for lysine, glutamic acid for aspartic acid, For example, substitution of thamin with asparagine. The term "conservative mutation" Also includes using a substituted amino acid in place of the unsubstituted parent amino acid, Antibodies elicited against this substituted polypeptide are immunoreactive with the unsubstituted polypeptide Must. The DNA sequence of the present invention can be obtained by several methods. For example, Isolating DNA using hybridization techniques well known in the art it can. These techniques include: 1) a procedure for detecting homologous nucleotide sequences. Hybridization of lobes with genomic DNA or cDNA libraries 2) a primer using a primer capable of annealing to a target DNA sequence; Polymerase chain reaction (PCR) on nome DNA or cDNA, and 3 2.) Expression libraries for detecting cloned DNA fragments sharing structural features But not limited to these. The FHF-3 polynucleotide of the present invention is preferably derived from a mammal. Yes, those derived from humans are most preferred. By nucleic acid hybridization The screening method is based on the assumption that suitable probes are available. Arbitrarily gene sequences from various organisms. The protein in question Synthesis of oligonucleotide probes corresponding to part of the sequence encoding can do. To do this, the amino acid sequence of the short oligopeptide region is known. Need to be. The DNA sequence encoding the protein is inferred from the genetic code However, the degeneracy of the genetic code must be considered. Array is degenerate When this is done, it is possible to carry out a mixed addition reaction. This is denatured double-stranded DNA A heterogeneous mixture of For such screening, single-stranded DNA or It is preferred to carry out hybridization on the sex double-stranded DNA. C Hybridization involves determining the amount of mRNA sequence associated with the polypeptide of interest. It is particularly useful in detecting cDNA clones from marginal sources. In other words, stringent hybrids designed to avoid non-specific binding By using the redidation conditions, for example, a single probe ( Target DNA), which is a perfect complement of the target DNA) Autoradiographic visualization of more specific cDNA clones is possible (W allace et al., Nucl. Acid Res., 9: 879, 1981; Maniatis et al., Molecular Cloning: A L aboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988). The specific DNA sequence encoding FHF-3 is: 1) Double stranded from genomic DNA Isolation of DNA sequence, 2) DNA sequence providing necessary codon of desired polypeptide By chemical synthesis of rows and 3) reverse transcription of mRNA isolated from eukaryotic donor cells It can also be obtained by in vitro synthesis of a double-stranded DNA sequence. In the latter case, Eventually, a double-stranded DNA complement of the mRNA is formed, which is commonly referred to as cDNA. Have been. Of the above three methods for obtaining a specific DNA sequence used in the recombination method, Isolation of nome DNA isolates is the least common. This means that introns exist It is desired to obtain microbial expression of a mammalian polypeptide in order to This is especially true. The synthesis of DNA sequences often involves the replacement of all amino acid residues of the desired polypeptide product. This is the best method if the sequence is known. Amino acid residues of the desired polypeptide If the complete sequence of the group is unknown, direct synthesis of the DNA sequence is not possible and The above method is the synthesis of a cDNA sequence. Standard for isolating the cDNA sequence of interest Standard methods are, among other things, abundant in donor cells with high levels of gene expression. Carried on plasmid or phage derived from reverse transcription of existing mRNA Preparation of cDNA library. Polymerase chain reaction technology and combination When used, even rare expression products can be cloned. Polypepti If a significant portion of the amino acid sequence of the Single-stranded or double-stranded labeled DNA or RN that replicates the putative sequence Cloning of cDNA that has been denatured into single-stranded form by preparing A probe sequence Used in DNA / DNA hybridization methods performed on copies. (Jay et al., Nucl. Acid Res., 11: 2325, 1983). Using an antibody specific for FHF-3, F having at least one epitope For the HF-3 peptide, a cDNA expression library such as lambda gt11 was Can be screened directly. Such antibodies are polyclonal It may be induced or monoclonal, and the presence of the FHF-3 cDNA It is used for the detection of an expression product indicating its presence. The DNA sequence encoding FHF-3 is obtained by transfer of the DNA into a suitable host cell. It can be expressed in vitro. "Host cells" can multiply vectors Moreover, it is a cell capable of expressing the DNA. This term refers to the host cell Encompasses all descendants of Because mutations can occur during replication, It should be understood that the offspring of the parent cell may not be identical to the parent cell. But Thus, when the term "host cell" is used, such progeny are also included. Stable Transfer methods (meaning that the foreign DNA is continuously maintained in the host) are described in the art. Known in the art. In the present invention, the FHF-3 polynucleotide sequence is contained in a recombinant expression vector. Inserted. The term "recombinant expression vector" refers to the insertion of the FHF-3 gene sequence. Plasmids, viruses engineered by insertion or integration or known in the art Means other carriers. Such an expression vector is effective for the inserted gene sequence of the host. Contains a promoter sequence that promotes efficient transcription. Expression vectors are typically Origins of replication, promoters, as well as specific ones that allow phenotypic selection of transformed cells Contains genes. Vectors suitable for use in the present invention include those for bacterial expression T7-based expression vectors (Rosenberg et al., Gene, 56: 125, 1987), mammals PMSXND expression vector for cell expression (Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263: 352 1, 1988) and baculovirus-derived vectors for insect cell expression. Not limited to these. The DNA segment is a regulatory element, such as a promoter (eg, T7). , Metallothionein I or polyhedrin promoter) Present in vector in state. Polynucleotide sequences encoding FHF-3 are expressed in prokaryotes or eukaryotes Can be done. Hosts include microorganisms, yeast, insects and mammals. It is. Expression of DNA sequences having eukaryotic or viral sequences in prokaryotes Methods for doing this are known in the art. Capable of expressing and replicating in the host Biologically functional virus and plasmid DNA vectors are available in the art. It is known. This type of vector is used to incorporate the DNA sequence of the present invention. It is. Transformation of a host cell with the recombinant DNA can be accomplished by conventional techniques as known to those skilled in the art. Performed by technology. If the host is a prokaryote such as E. coli, remove the DNA. To prepare competent competent cells, harvest cells after exponential growth. Followed by CaCl 2 using procedures known in the art._TwoProcess by the method. Also, MgCl_Two Alternatively, RbCl may be used. Optionally, after forming a protoplast of the host cell Can also be used for transformation. If the host is eukaryotic, calcium phosphate co-precipitation, microinjection Ordinary mechanical methods such as electroporation and electroporation, encapsulated in liposomes Inserted plasmid or DNA transfections such as viral vectors An alternative method is used. Further, the eukaryotic cell is a DNA encoding the FHF-3 of the present invention. A second foreign DNA molecule encoding a sequence and a selectable phenotype (eg, a simple Herpes virus thymidine kinase gene). Wear. Another method is Simian virus 40 (SV40) or bovine papilloma virus. Transiently infect eukaryotic cells with eukaryotic viral vectors such as It transforms and expresses a protein (for example, Eukaryotic Viral V ectors, Cold Spring Harbor Laboratory, edited by Gluzman, 1982). Provided by the present invention, a polypeptide expressed in a microorganism or a polypeptide thereof Fragment isolation and purification can be accomplished by preparative chromatography, monoclonal or It can be performed by conventional means, including immunological separation using clonal antibodies. Wear. The FHF-3 polypeptides of the present invention can also be epitopic polypeptides of the FHF-3 polypeptide. It is also used to produce antibodies that immunoreact with or bind to the antibody. Epito Antibodies consisting of a pool of monoclonal antibodies with different specificities and distinct A monoclonal antibody preparation is provided. Monoclonal antibodies are our technology From antigen-containing fragments of proteins by known methods (Kohler et al., Natu re, 256: 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., 1 989). The term "antibody" as used in the present invention refers not only to the complete molecule, but also to epitope determination. Fab, F (ab ') capable of binding to a fixed group_Two, Fv, and the like. This These antibody fragments enhance the ability to selectively bind to its antigen or receptor And is defined as follows: (1) Fab, this fragment containing a monovalent antigen-binding fragment of an antibody molecule Digests intact antibodies with the enzyme papain to produce intact light and part of the heavy chain It can be obtained by: (2) Fab ', this fragment of the antibody molecule, is obtained by treating the complete antibody with pepsin After reduction to produce a portion of the intact L and H chains. Antibody 1 Two Fab 'fragments are obtained per molecule. (3) F (ab ')_TwoThis antibody fragment treats the whole antibody with the enzyme pepsin. (No subsequent reduction). F (ab ')_TwoIs two Fab 'flags Is a dimer linked together by two disulfide bonds. (4) Fv, a gene engine comprising an L chain variable region and an H chain variable region expressed as two chains Defined as chemically generated fragments. (5) Single chain antibody (SCA), genetically fused single chain A light chain variable region and a heavy chain linked by an appropriate polypeptide linker as a molecule; It is defined as a genetically engineered molecule containing a variant. Methods for preparing these fragments are known in the art (see, eg, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)). The term "epitope" as used in the present invention refers to the antigen to which the paratope of the antibody binds It means the original antigenic determinant. Epitopic determinants are separated by amino acids or sugar side chains. Specific three-dimensional structure consisting of chemically active surface groupings of the It typically has properties and specific charge properties. Antibodies that bind to the FHF-3 polypeptides of the present invention can be intact polypeptides or Can be prepared using a fragment containing the desired small peptide as an antigen for immunization. You. The polypeptide or peptide used to immunize the animal may be a translated cD NA (see eg, Examples 4 and 6) or optionally to a carrier protein Derived by chemical synthesis that can be coupled. Chemically linked to the peptide Keyhole limpet hemocyanin (KLH), tilog Robulin, bovine serum albumin (BSA), tetanus toxin and the like. Then An animal (eg, mouse, rat, rabbit) is immunized with the combined peptide. If desired, polyclonal or monoclonal antibodies can be used, for example, to elicit antibodies. Bind to the polypeptide or peptide-bound matrix Then, it can be further purified by elution from the matrix. One skilled in the art will be able to purify and / or purify polyclonal and monoclonal antibodies. Will be familiar with various techniques known in the field of immunology for enrichment ( For example, Coligan et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994). Using anti-idiotypic techniques, monoclonal antibodies that mimic the epitope It is also possible to produce. For example, the antibody generated against the first monoclonal antibody Anti-idiotype monoclonal antibody binds to the first monoclonal antibody The hypervariable region will have a binding domain that is the "image" of the epitope being transformed. The term “cell proliferative disorder” is often different in form and genotype from the surrounding tissue. Represents a population of malignant and non-malignant cells. Malignant cells (ie, cancer ) Occur through multiple steps. Antisense molecule FHF-3 polynucleotide Otide is a malignant disease of various organ systems, especially the central nervous system, including nervous tissue, testis, Useful for treating malignant diseases of the cells of the eye. Essentially, alterations in FHF-3 expression Any disease that is etiologically linked to hyperplasia is susceptible to treatment with FHF-3 inhibitors It is considered to be. One such disease is, for example, a malignant cell proliferative disease. You. For the purposes of the present invention, using antibodies or nucleic acid probes specific for FHF-3 FHF-3 polypeptide (using antibodies) or FH in biological fluids or tissues F-3 polynucleotides (using nucleic acid probes) can be detected. Departure For example, an anti-FHF-3 antibody or a nucleic acid probe can be used for FHF-3-related diseases. Contacting the suspected cell and detecting binding to said antibody or nucleic acid probe And a method for detecting a cell proliferative disease of nerve tissue or testis. F Antibodies or nucleic acid probes reactive to HF-3 can detect binding to FHF-3 It is preferable to label the compound with Detectable amount of antigen or polynucleotide Any sample containing otide may be used. A preferred sample of the present invention is CNS, such as nerve tissue or cerebrospinal fluid or eye tissue. Suspected disease The level of FHF-3 in the cells to be treated is compared to that in normal cells. It can be determined whether the examiner has a FHF-3-related cell proliferative disorder. Good Preferably, the subject is a human. If the cell component is a nucleic acid, the nuclear It may be necessary to amplify the acid. Polymerase chain reaction (PCR) It is preferred to use other nucleic acid amplification methods, such as the ligase chain reaction (LC R), ligated activated transcription (LAT) and nucleic acids Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) May be used. The antibody of the present invention can be subjected to in vitro or in vivo immunodiagnosis or immunotherapy. Can be used for any patient where is desired. The antibody of the present invention is, for example, Use in immunoassays where antibodies are used in the liquid phase or attached to a solid support. Suitable to use. In addition, these immunoassays use various antibodies. The method can be detectably labeled. Immunoassays that can utilize the antibodies of the present invention The types of competition are competitive and non-competitive in direct or indirect formats. There is no assay. An example of such an immunoassay is the radioimmunoassay (R IA) and a sandwich (immunometric) assay. Antibodies of the invention Detection of antigens using immunohistochemical assays on physiological samples Immunoassays performed in forward, reverse or simultaneous mode Can be performed. Those skilled in the art will recognize other immunoassay formats. Familiar with the format and can easily use other formats without undue experimentation. I can find out. Antibodies of the invention comprise a polypeptide of the invention bound to a wide variety of carriers. Used to detect the presence of antigen. Examples of known carriers include glass and poly. Styrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amiller Ze, natural and modified cellulose, polyacrylamide, agarose, and magnetic steel. I can do it. The nature of the carrier may be soluble or insoluble in the present invention. No. Those skilled in the art are familiar with other suitable carriers for binding antibodies. Alternatively, such carriers could be identified using routine experimental procedures. Various labels and labeling methods are known to those skilled in the art. Used in the present invention Possible types of labels include enzymes, radioisotopes, fluorescent compounds, colloidal metals, Chemiluminescent compounds, phosphorescent compounds and bioluminescent compounds. Those skilled in the art Familiarize yourself with other labels that are suitable for conjugation or use routine experimentation You will see such a sign. Another technique that can provide higher sensitivity is to convert the antibody to a low molecular weight hapten. Coupling. These haptens are then used as a second means of reaction. It is detected more specifically. For example, biotin reacting with avidin, or specific Dinitrophenyl, pyridoxal, and fluorescein It is common to use haptens like ins. In using the monoclonal antibody of the present invention for in vivo detection of antigen The detectably labeled antibody is administered at a diagnostically effective dose. `` Yes diagnostically The term "efficacy" refers to the amount of a detectably labeled monoclonal antibody of the present invention. An antigen containing a polypeptide (of which a monoclonal antibody is specific) Means that it is administered in an amount sufficient to allow detection of the site having it. The concentration of administration of the detectably labeled monoclonal antibody will Sufficient so that binding to the cells to be detected is detectable relative to the background Should be. Also gives the best target-to-background signal ratio Detectable labeled monoclonal antibodies quickly exit the circulatory system It is desirable to be done. Generally, the dosage of a detectably labeled monoclonal antibody for in vivo diagnostics Will vary depending on factors such as the age, gender, and severity of the disease. example Such dosage may vary depending on whether multiple injections are performed, the antigen burden, It may vary depending on other known factors. For in vivo diagnostic imaging, the type of detection equipment available is It is a major factor in choosing an isotope. The selected radioisotope is It must show a type of decay that can be detected by certain devices. Radio for in vivo diagnosis An even more important factor in selecting an isotope is harmful radiation to the host. Is to minimize it. Ideally, radioisotopes used for in vivo imaging 140-250 keV, which does not generate particles but can be easily detected with a normal gamma camera And a large number of photons are generated within the range. Use radioisotopes directly or with intermediate functional groups for in vivo diagnosis And indirectly to immunoglobulins. Exists as a metal ion Radioisotopes are often used to bind immunoglobulins The intermediate functional group is a bifunctional chelating agent such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DT PA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and similar molecules. The present invention Representative examples of metal ions that can be bound to monoclonal antibodies¹¹¹ In,⁹⁷Ru,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁷²As,⁸⁹Zr and²⁰¹Tl. The monoclonal antibodies of the invention can be used for magnetic resonance imaging (MRI) or electron spinning. Labeling with paramagnetic isotopes for in vivo diagnosis such as resonance (ESR) Can also be. In general, any conventional method for visualizing diagnostic images can be used . Usually, gamma rays and positron-emitting radioisotopes are used for camera imaging. Paramagnetic isotopes are used for MRI. Such technology And particularly useful elements¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵²Cr and⁵⁶Fe Ge Can be The monoclonal antibody or polynucleotide of the present invention can be used for the test subject's FHF-3. Use in vitro and in vivo to monitor the recovery process of related diseases Can be. Thus, for example, cells expressing an antigen comprising a polypeptide of the present invention. Measuring the increase or decrease in the number of vesicles, or the antigen present in various body fluids To reduce FHF-3-related diseases by measuring changes in the concentration of Can determine if a particular treatment plan that defines U. The term “alleviate” refers to a disease associated with FHF-3 in a treated subject. It implies that the adverse effects of the disease are reduced. According to the present invention, a nucleus expressed in an altered manner as compared to expression in normal cells The leotide sequence can be identified and therefore the appropriate It is possible to design therapy or diagnostics. Increased expression level of FHF-3 The nucleic acid isolated from cells suspected of having an FHF-3-related proliferative disease can be detected by the present method. Achieved by hybridizing with an FHF-3 polynucleotide of the invention. You. The expression of FHF-3 is quantified using an analysis such as Northern blot analysis. Other standard nucleic acid detection methods are known to those skilled in the art. For the treatment of FHF-3-related cell proliferative disorders, FHF-3 gene expression and F Modulating HF-3 activity. The term "modulate" refers to FHF- 3 suppresses the expression of FHF-3 when FHF-3 is overexpressed. Indicates that the expression of FHF-3 is enhanced. Cell proliferative disorder is FH Nucleic acids that, when associated with F-3 expression, interfere with FHF-3 expression at the translational level An array is used. This approach can be used, for example, for antisense nucleic acids, ribozymes Or using a triplex (triple helix) drug, specific FHF-3 masking the mRNA with an antisense nucleic acid or a triplex agent, or By cleaving it with a ribozyme, transcription or translation of that mRNA is blocked. Click. An example of this type of disease is a neurodegenerative disease. Antisense nucleic acids include DNA or DNA complementary to at least a portion of a particular mRNA molecule. Or RNA molecules (Weintraub, Scientific American, 262: 40, 1990). Fine In the vesicle, the antisense nucleic acid hybridizes to the corresponding mRNA and becomes double-stranded. Form a molecule. Since this cell will not translate double-stranded mRNA, Antisense nucleic acids will interfere with the translation of the mRNA. About 15 nucleotides Antisense oligomers are preferred. Because they can be easily synthesized And, when introduced into target FHF-3 producing cells, Is also less likely to cause problems. Inhibits in vitro translation of genes The use of antisense methods is well known in the art (Marcus-Sakura, Anal. Bio. Chem., 172: 289, 1988). The use of oligonucleotides to stop transcription involves two oligomers. Triplex warfare because it wraps around strand DNA to form a triple helix Known as abbreviation. Therefore, these triplex compounds are Designed to recognize unique sites in genes (Maher et al., Antisence Res. A nd Dev., 1 (3): 227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6 (6): 569, 19 91). Ribozymes are similar to DNA single-stranded RNases in a manner similar to DNA restriction endonucleases. A RNA molecule capable of specifically cleaving A. Encode these RNAs Recognition of specific nucleotide sequences in RNA molecules by modifying nucleotide sequences (Cech, J. Amer. Med. Assn., 26 0: 3030, 1988). The main advantage of this approach is that they are sequence specific The point is that only mRNA having a specific sequence is inactivated. There are two basic types of ribozymes, the tetrahymena type (Hasse lhoff, Nature, 334: 585, 1988) and the "hammerhead" type. Tetrahymena Type ribozymes recognize sequences that are four bases in length, while “hammerhead” type Bozymes recognize sequences of 11-18 bases in length. The longer the recognition sequence, the longer , The sequence is likely to be exclusively present in the target mRNA species. as a result In order to inactivate specific mRNA species, hammerhead ribozymes are more The 18-base recognition sequence is shorter than the Lahimena-type ribozyme, and the recognition sequence is shorter. Preferred over columns. The invention also relates to a cell proliferative disorder mediated by the FHF-3 protein or Gene therapy for treating immune diseases is provided. Such treatments are proliferative Introducing FHF-3 antisense polynucleotide into affected cells. And will have its therapeutic effect. Antisense FHF-3 polynucleotide Delivery can be achieved by recombinant expression vectors such as chimeric viruses or colloidal dispersion systems. Is achieved using Use of targeted liposomes for therapeutic delivery of antisense sequences Is particularly suitable for use. Various viral vectors available for gene therapy as taught herein. The adenovirus, herpes virus, vaccinia, or Alternatively, there are RNA viruses such as retroviruses. Preferably, retro The ills vector is a derivative of the mouse or avian retrovirus. Single outside An example of a retroviral vector into which a foreign gene can be inserted is Moloney murine leukemia virus. Ils (MoMuLV), Harvey mouse sarcoma virus (HaMuSV), mouse Breast cancer virus (MuMTV) and Rous sarcoma virus (RSV) Not limited to these. If the patient is human, gibbon ape (gibbon ape) leukemia It is preferable to use a vector such as ills (GaLV). Numerous additional Retroviral vectors can incorporate multiple genes. These All selectable markers to identify and expand transduced cells. Gene can be incorporated. The FHF-3 sequence of interest is converted to a specific target cell Viral vector with another gene encoding a ligand for the above receptor This vector becomes exactly target specific by insertion into For example, sugar, Targeting retroviral vectors by linking glycolipids or proteins It can be of the opposite sex. Suitable targeting is achieved using antibodies. This is achieved by making the Torovirus vector target specific. A person skilled in the art For example, a retroviral vector containing an FHF-3 antisense polynucleotide Can be inserted into the retroviral genome to enable target-specific delivery of Is familiar with certain polynucleotide sequences that can bind to the viral envelope. Or could be easily confirmed without undue experimentation. Since recombinant retroviruses are defective, they produce infectious vector particles. You need assistance to live. This assistance, for example, under the control of regulatory sequences in the LTR A helper cell line containing a plasmid encoding all the structural genes of the retrovirus Provided by use. These plasmids are enveloped in the packaging machinery The nucleotide sequence that allows recognition of the RNA transcript is deleted. Pa Helper cell lines lacking the packaging signal include, for example, Δ2, P A317 and PA12 include, but are not limited to. These cell lines are genomic Produce hollow virions because they are not packaged. Retrovirus vector ( The packaging signal is intact, but the structural gene is When a transgenic cell is introduced into such a cell, the vector is To produce vector virions. Alternatively, NIH 3T3 or other tissue culture cells can be transferred to a conventional calcium phosphate tra Encodes retroviral structural genes gag, pol and env by transfection It can also be directly transfected with a plasmid. Next, these cells Is transfected with a plasmid containing the gene of interest. The resulting cells Release the retroviral vector into the medium. Another targeted delivery system for FHF-3 antisense polynucleotides is a colloidal dispersion system. It is. Macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads Lipid-based systems, including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles and Posomes can be mentioned. The preferred colloidal dispersion system of the present invention is a liposome. is there. Liposomes are useful as vehicles for in vitro and in vivo delivery Artificial vesicles. Large unilamellar vesicles (LUV) with a size of 0.2-4.0 μm Encapsulates a sufficient proportion of aqueous buffers containing large macromolecules it can. Encapsulating RNA, DNA and intact virions in an aqueous interior, Can be delivered to cells in a biologically active form (Fraley et al., Trends Biochem. . Sci., 6:77, 1981). In addition to mammalian cells, in plant, yeast and bacterial cells Liposomes have also been used to deliver polynucleotides. Liposome To be an efficient gene transfer vehicle, the following characteristics must be present: . That is, (1) Although the target gene is encapsulated with high efficiency, its biological Does not impair activity; (2) preferentially and tightly binds to target cells compared to non-target cells (3) delivering the aqueous contents of the vesicles to the cytoplasm of target cells with high efficiency; And (4) accurate and efficient expression of genetic information (Mann ino et al., Biotechniques, 6: 682, 1988). Liposome composition is usually combined with steroids (especially cholesterol) , And phospholipids (particularly phospholipids having a high phase transition temperature). Other phospholipids Or other lipids may be used. The physical characteristics of liposomes are pH, ionic strength and And the presence of divalent cations. Examples of lipids useful for preparing liposomes include phosphatidyl compounds, for example, Phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, Phosphatidylethanolamine, sphingolipid, cerebroside and gang And liosides. Particularly useful is diacylphosphatidylglycerol Wherein the lipid component contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated It is something that is. Examples of phospholipids include egg phosphatidylcholine, dipalmitoy Contains luphosphatidylcholine and distearoylphosphatidylcholine . Liposome targeting is based on anatomical and mechanical factors Can be classified. Anatomical classification is based on the level of selectivity, e.g., organ specificity, It is based on the level of vesicle-specific and organelle-specific. machine Targeting distinguishes based on whether it is passive or active be able to. Passive targeting involves organs containing liposomes containing sinusoidal capillaries Of the reticuloendothelial system (RES) of cells . On the other hand, active targeting allows liposomes to bind to specific ligands (eg, Clonal antibodies, sugars, glycolipids or proteins), or Or targeting to organs or cell types other than the naturally occurring localized sites Liposomes by changing the composition or size of the liposomes to achieve Includes changes. The surface of the targeted delivery system may be modified in various ways. Liposome targeted delivery system In this case, the targeting ligand is stably linked to the liposome bilayer. Lipid groups can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome to maintain Wear. Various linking groups to attach lipid chains to targeting ligands Can be used. This is because FHF-3 is expressed in testis, eye and brain, or neural tissue. The polypeptides, polynucleotides and antibodies of the present invention related to these tissues There are various uses to use. Such uses include those organizations and other There are treatments for cell proliferative and immune disorders involving tissues. In addition, FHF-3 Can also be useful in various gene therapy methods. Because FHF-3 is expressed at high levels in the testis, the present invention relates to this tissue. A wide range of uses for polypeptides, polynucleotides, and antibodies . Such uses include cell proliferative disorders associated with FHF-3 expression in the testis. Treatment included. Apply FHF-3 to various testicular dysplasias or acquired diseases It is possible. These diseases include viral infections (eg, viral Colitis, autoimmune disease, sperm production or dysfunction, trauma, and testicular tumors But not limited to these. The presence of high levels of FHF-3 in testis indicates that FH Increasing or reducing male fertility using F-3 or FHF-3 analogs Suggest that it can be done. The identification of new members of the FGF family has led to the diagnosis, prognosis and diagnosis of FHF-3-mediated diseases. And useful tools for treatment strategies. FH using anti-FHF-3 antibody Measuring F-3 levels can be used in cancer, stroke, neurodegenerative diseases (eg, Parkinso Disease, Alzheimer's disease), retinal disease (eg, retinitis pigmentosa) or virus Useful for monitoring the progression or recovery of diseases of the nervous system, including encephalitis. The presence of high levels of FHF-3 in the central nervous system has been observed in many peripheral tissues. Low levels of FHF-3 are associated with FHF-3 in the peripheral nerve and dorsal root ganglia Use anti-FHF-3 antibody to reflect presence in sensory neurons in ganglia This suggests that measurement of FHF-3 levels may be useful in diagnosing peripheral nerve disease. Spirit The presence of high levels of FHF-3 in the nest was due to FHF-antibody using anti-FHF-3 antibody. This suggests that three levels of measurement are useful for diagnosing testicular cancer. Like other members of the FGF family, FHF-3 has mitogenic activity and And / or seems to have cell viability activity and therefore FHF-3 or FHF- Analogues that mimic three actions can be used to promote tissue repair or replacement right. The presence of FHF-3 in the CNS indicates that stroke, neurodegenerative diseases (eg, -Nervous system diseases including Kinson's disease and Alzheimer's disease, retinal degenerative diseases (eg Such as retinitis pigmentosa or macular degeneration) or peripheral nerve disease Suggestive role. Conversely, anti-FHF-3 antibodies or FHF-3 antagonists Blocking the action of FHF-3 by using is caused by excessive cell proliferation It may delay or alleviate the disease, most obviously cancer. The following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention. No. They are representative of the procedures that can be used and substitute other procedures known to those skilled in the art Can be used. Example 1 Identification of a new member of the FGF family, FHF-3 To identify novel gene products expressed in the human retina, Partially sequence a random segment of the loan and subdivide the resulting subsequence into public Compared to sequences available in the database. Specifically, an adult retinal cDNA library constructed with lambda gt10 (Nathans et al., Science, 232: 193, 1986), and insert the cDNA insert by cleavage with EcoRI. Excised in large quantities and purified by agarose gel electrophoresis to remove the vector. This After heat denaturation of the purified cDNA insert, it has an EcoRI site at the 5 'end. A synthetic oligonucleotide containing 6 random nucleotides at the 3 'end (5' GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN) (SEQ ID NO: 3) Two consecutive rounds of DNA synthesis were performed in the presence of the Klenow fragment of Enterobacter DNA polymerase. Was. Amplification of the resulting double-stranded molecule was performed using a primer corresponding to the unique 5 'flanking sequence. Using a primer (5 'CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAATTCTACTCG) (SEQ ID NO: 4) This was performed using the limase chain reaction (PCR). Of the original cDNA insert These PCR products, which correspond to random sampling, are cleaved with EcoRI and collected. Size-separated by agarose gel electrophoresis And cloned into lambda gt10. Derived from this derivative library 3000 single plaques were placed in a 96-well tray, and from these clones, The insert is amplified by PCR using After sequencing using the dideoxy method and automated fluorescence detection (Applied Biosystems). Was. Once read from one end of each insert, three open reading frames (ready Frame), all of which were conceptually translated on both chains and the resulting six Duplicate-free GenBank data using the BLASTX test algorithm using amino acid sequences The homology was checked in the protein database. Statistical significance for previously described FGF family members One partial cDNA sequence showing the same sex was found. Probe this partial cDNA Including the entire reading frame (open reading frame) 2 A large number of independent cDNA clones, including one from a human retinal cDNA library And the complete nucleotide sequence of the two was determined. This array is F Encodes new and highly divergent members of the GF superfamily, It has been named fibroblast growth factor homologous factor-1 (FHF-1). Then, 2 The second closely related sequence (FHF-2) has similarity to its FHF-1 sequence (SEQ ID NOs: 6-9, FIGS. 7a and 7b). Statistically significant similarities using FHF-1 and FHF-2 amino acid sequences Of a DNA sequence (DBEST) conceptually translated for an amino acid sequence having The available Genbank database was screened. Human genomic DNA The short region (DBEST accession number 76387) shows that FHF-1 and FHF-2 Found to have a translated sequence with significant homology to about 25% of the amino acid sequence did. This genome segment was used to search for breast cancer susceptibility genes on chromosome 17. It was one of many genomic segments used as landmarks. Using synthetic DNA primers based on sequence 76387, human genomic DNA and This region was amplified from cDNA derived from human retina. Then these PCR products The product is used as a probe, and full length cDN is obtained from the human retinal cDNA library. A clone was isolated. Example 2 Putative primary structure of FHF-3 Deduced from nucleotide sequences of two independent human retinal cDNA clones The sequence of human FHF-3 is shown in FIG. The primary translation product of human FHF-3 has a length of 2 Expected to be 25 amino acids. Human FHF-3 initiation shown at position 74 in FIG. The methionine codon is the first ATG codon in reading frame. Good in this position Good consensus ribosome binding site (GCGCTATGG (SEQ ID NO: 5); Kozak, Nuclei c Acids Res., 15: 8125, 1987). The next methionine in the reading frame The don is found 124 codons 3 'to the putative initiation methionine codon. aFGF and b The amino terminus of the primary translation product of FHF-3, as observed for FGF Is a connector for directing cotranslational insertion of a signal peptide across the endoplasmic reticulum membrane. Does not match the sussus sequence. The FHF-3 sequence is a variant of asparagine-linked glycosylation. Lacks potential asn-X-ser / thr sites for. FHF-3 is shown in FIG. 2 along with other known members of the FGF family, FIG. 3 shows a dendrogram showing the similarity of amino acids. The most homologous FGF file Millie members had 30% of FHF-3 when aligned with eight gaps. FGF-9 in which the amino acids are identical. In the central region of each polypeptide, F All FGF family members, including HF-3, are about 50% amino acid identical Note that they share gender. Example 3 Chromosome localization of FHF-3 24 humans each containing a different human chromosome (Oncor, Gaithersburg, MD) -Digested with restriction enzymes derived from a panel of -mouse and human-hamster cell lines Chromosomes of FHF-3 by probing Southern blots containing The position was determined. As shown in FIG. 4, a human FHF-3 probe and a human, Differs due to hybridization with mouse and hamster genomic DNA. A size of the hybridized fragment is generated. Human out of hybrid panel The specific hybridization pattern was determined for hybrids carrying human chromosome 17. Only seen in lanes corresponding to cell lines. Example 4 Tissue distribution of FHF-3 mRNA To determine the tissue distribution of FHF-3 mRNA, mouse brain, eye, heart, Total RNA from kidney, liver, lung, spleen and testis and yeast tRNA negative RNase protection analysis was performed on controls. The probe used was Hybridization with full-length human FHF-3 cDNA results in mouse eye cD Derived from a segment of the mouse FHF-3 gene isolated from the NA library It is a thing. As shown in FIG. 5, FHF-3 expression was highest in the brain and eyes. Is also at a high level. In lungs and testes, autoradiograms are exposed longer. And the expression level of FHF-3 was low. Example 5 Figure 6: Produced in transiently transfected human embryonic kidney cells (cell line 293) 2 shows an immunoblot of FHF-3. Carboki to complete FHF-3 protein A fusion tag containing a gene 10 protein from bacteriophage T7 linked at the Anti-FHF-3 antibodies were induced against proteins (Studier and Moffatt, J. Mo. lec. Biol.189: 113, 1986). The obtained fusion protein is separated by polyacrylamide Purified by midgel electrophoresis and injected into rabbits. Expression of FHF-3 in human cells Complete reading frame (open reading frame) for eukaryotic cells Inserted into the expression vector pCIS (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech.,Two: 3, 1990 ). To improve translation efficiency, a region immediately 5 'to the initiation methionine codon The appropriate ribosomal DNA by PCR amplification using primers carrying the desired sequence Site (CCACCATGG). This expression construct and Simian virus 4 0 (SV40) Large T antigen expressing plasmid (pRSV-TAg; Gorman et al., DNA Protei n Eng. Tech.,Two: 3, 1990) 24 hours after transfection of human embryonic kidney cells Later, the cells were harvested and the proteins were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and 1: Immunoblot was performed using a rabbit anti-FHF-3 antiserum at a dilution of 5000. As shown in FIG. As shown, cells transfected with FHF-3 (right lane) An immunoreactive polypeptide with a 30 kD yield is synthesized. This immunoreactive polypeptide Is transfected with a related FGF family member (FHF-2). Sfected cells (middle lane) or mock transfected cells (left lane) N) cannot be seen. Appearance of pre-stained protein size preparation The molecular weight (kD) is shown on the left. The apparent molecular weight of recombinant FHF-3 is 5 kD more than the predicted molecular weight of the product (25 kD), this discrepancy probably indicates that this protein Reflects the high isoelectric point (10.275). While the present invention has been described in terms of the presently preferred embodiments, departures from the scope of the invention. It should be understood that various modifications can be made without having to do so. Accordingly Accordingly, the invention is limited only by the claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 48/00 48/00 49/00 49/00 Ａ 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/50 Ｃ０７Ｋ 14/50 16/22 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｂ 21/08 15/00 ＣＡ６１Ｋ 49/02 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スモールウッド，フィリップ，エム. アメリカ合衆国 21797―9621 メリーランド州，ウッドバイン，ウッドバインロード 5022 (72)発明者トング，パトリックアメリカ合衆国 21210―1522 メリーランド州，ボルティモア，ハムレットヒルロード 111，1209番──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 35/76 A61K 35/76 48/00 48/00 49/00 49/00 A 51/00 C07K 14 / 50 C07K 14/50 16/22 16/22 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/02 C 5/10 21/08 15/02 C12N 5/00 A C12P 21/02 B 21/08 15/00 C A61K 49/02 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW) , SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, M , RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB , GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, N Z, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Smallwood, Philip, M. USA 21797- 9621 Woodbine Road, Woodbine, Maryland 5022 (72) Inventor Tong, Patrick United States 21210-1522 Hamlet Hill Road 111, 1209, Baltimore, Maryland

Claims

[Claims] 1. Substantially pure fibroblast growth factor homologue factor-3 (FHF-3) polypeptide De. 2. a. A molecular weight of about 30 kD as measured by reducing SDS-PAGE, b. Coded by polynucleotide with chromosomal location on chromosome 17 Be done The polypeptide according to claim 1, characterized in that: 3. The polypep according to claim 2, which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Fig. 1). Chid. 4. An isolated polynucleic acid encoding the FHF-3 polypeptide of claim 1. Reotide sequence. 5. The FHF-3 nucleotide sequence a. SEQ ID NO: 1 (FIG. 1) (where T may be U); b. A nucleic acid sequence complementary to SEQ ID NO: 1; c. Moderate stringency conditions with a chain length of at least 15 bases Below, the DNA encoding the FHF-3 protein of SEQ ID NO: 2 (FIG. 1) A fragment of a or b that selectively hybridizes; The polynucleotide according to claim 4, which is selected from the group consisting of: 6. 5. The polynucleotide of claim 4, wherein said polynucleotide is isolated from a mammalian cell. The described polynucleotide sequence. 7. The polynucleotide according to claim 6, wherein the mammalian cell is a human cell. 8. An expression vector comprising the polynucleotide according to claim 4. 9. 9. The vector according to claim 8, wherein said vector is a plasmid. Ten. 9. The vector according to claim 8, wherein said vector is a virus. 11． A host cell stably transformed with the vector of claim 8. 12． 12. The host cell according to claim 11, wherein said cell is a prokaryotic cell. 13. 12. The host cell according to claim 11, wherein said cell is a eukaryotic cell. 14. Antibodies that bind to FHF-3 polypeptide or immunoreactive fragments thereof . 15． 15. The anti-cancer of claim 14, wherein said antibody is polyclonal. 16． 15. The antibody according to claim 14, wherein said antibody is monoclonal. 17． A sample of a subject suspected of having an FHF-3-related cell proliferative disorder was combined with FHF-3. Contacting the combined agent and detecting binding of the agent to FHF-3. A method for detecting a cell proliferative disease. 18． The cell may be selected from the group consisting of brain, testis, lung or eye cells. 17. The method according to 17. 19. 18. The method of claim 17, wherein said agent is an antibody that binds to FHF-3. 20. The agent is a polynucleotide encoding a FHF-3 polypeptide or a polynucleotide thereof. 18. The method of claim 17, which is a fragment of twenty one. 18. The method according to claim 17, wherein said detecting is performed in vivo. twenty two. 18. The method of claim 17, wherein said detecting is performed in vitro. twenty three. 21. The method of claim 19 or 20, wherein the agent is detectably labeled. twenty four. Detectable labels include radioisotopes, fluorescent compounds, bioluminescent compounds and chemicals 24. The method of claim 23, wherein the method is selected from the group consisting of a luminescent compound. twenty five. Has or is suspected of having a cell proliferative disorder associated with the expression of FHF-3 Contacting the cell to be treated with an agent that inhibits FHF-3 activity. , A method for treating an FHF-3-related cell proliferative disorder. 26. 26. The method of claim 25, wherein said agent is an anti-FHF-3 antibody. 27. 26. The method of claim 25, wherein said agent is a FHF-3 antisense sequence. 28. 26. The method of claim 25, wherein said cells are testis, brain, lung, or eye cells. 29. Claims: An agent that suppresses FHF-3 activity is introduced into a cell using a vector. Item 26. The method according to Item 25. 30. 30. The method of claim 29, wherein said vector is a colloidal dispersion. 31. 30. The method of claim 29, wherein said vector is a virus. 32. 32. The method of claim 31, wherein said RNA virus is a retrovirus.