JP2000506496A - 内因性酸化窒素の生成又は活性のモデュレーションによる血管機能の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ホストにおいてＮＯ誘発弛緩経路での内在性酸化窒素又は他の中間体のレベルを高める生理的に許容しうる化合物を長期投与することにより、血管の機能と構造が維持又は改善される。また、直接或いは生理的過程で酸化窒素の短期増進を与える他の化合物も組合わせて投与される。前駆アミノ酸をバルーン（１２）の内室（１３）へバルーン管腔（１４）を介して導入することにより再狭窄を予防する壁内法が提供される。膨張中、バルーン（１２）は血管壁（１５）に対向して外に押圧し、該前駆アミノ酸は血管壁（１５）に導入される。

Description

【発明の詳細な説明】 内因性酸化窒素の生成又は活性のモデュレーションによる血管機能の増強 序言 本発明は、補助金1K07HC02660によって合衆国政府から一部助成された。合衆 国政府は、本願の権利を所有する。技術分野 本発明の分野は、血管機能を維持及び改善し、よって血管変性疾患を予防又は 改善するのに適用するＮＯ活性のモデュレーションである。背景 アテローム性動脈硬化症及び血管血栓症は、罹患率や死亡率の主な原因であり 冠動脈疾患、心筋梗塞症及び卒中をまねく。アテローム性動脈硬化症は、血管を 裏打ちする内皮細胞の変化から始まる。内皮細胞の変化により単球の付着が生じ 、内皮細胞の裏打ちを貫通すると共に内皮細胞と血管の平滑筋間の動脈内膜下隙 に滞留を始める。単球は、増加量のコレステロール（主に酸化又は修飾低密度リ ポタンパク質として）を吸収して泡沫細胞を生じる。酸化低密度リポタンパク質 （ＬＤＬ）コレステロールは、内皮細胞を変化させ、下にある泡沫細胞はゆがん でついには内皮細胞によって破壊さえしてしまう。 血小板は、内皮細胞の破壊面に付着し、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含 む多数の増殖因子を放出する。泡沫細胞及び変質内皮細胞によっても放出される ＰＤＧＦは、血管平滑筋細胞の病巣への遊走及び増殖を刺激する。これらの平滑 筋細胞は、細胞外マトリックス（コラーゲン及びエラスチン）を放出し、病巣が 広がり続ける。病巣のマクロファージはプロテアーゼを生成し、生じた細胞損傷 により細胞の破片や脂質で満たされた壊死の中心部がつくられる。病巣はそのと き“複合病巣”と呼ばれる。この病巣の破壊は、血管の血栓や閉塞をまねくこと がある。冠動脈の場合には複合病巣の破壊は心筋梗塞症を引き起し、頸動脈の場 合には卒中が起こる。 心臓病専門医や他の介在者が硬化巣によって狭くなる血管を再開するために用 いる治療法の１つは、バルーン血管形成術である（毎年約３００，０００の冠動 脈及び１００，０００の末梢血管の形成術が行われている）。バルーン血管形成 術は、血管を広げる症例が高い割合で成功しているが、残念ながら内皮細胞を剥 がしその過程で血管を傷つける。この損傷は、血管の平滑筋細胞の損傷面への遊 走及び増殖を引き起こして筋内膜過形成又は再狭窄として知られる病巣を生じる 。この新たな病巣は、血管形成術後３〜６カ月以内にかなりの割合の患者（３０ 〜４０％）に症状の再発をまねく。 アテローム性動脈硬化症、血栓症及び再狭窄症においては、正常な血管機能の 消失があり血管が拡張するよりはむしろ狭窄する傾向がある。過度の血管収縮は 、血管腔を更に狭くし血流量を制限する。これにより狭心症（心臓動脈が関与す る場合）又は一過性脳虚血（即ち、脳血管が関与する場合には“弱い卒中”）の ような症状が引き起こされる。この異常な血管機能（過度の血管狭窄又は血管拡 張不全）も同様に他の病態で起こる。高血圧症（高血圧）は、過度の血管狭窄、 及び血管壁、特に血液循環の細い血管の肥厚に起因する。この過程も同様に肺血 管に影響し、肺動脈（肺）高血圧症を引き起こすことがある。過度の血管狭窄又 は拡張不全と関連があることが知られる他の疾患としては、移植によるアテロー ム性動脈硬化症、鬱血性心不全、妊娠中毒症、レイノー現象、異型狭心症（冠攣 縮）、脳血管攣縮、溶血性尿毒症及びインポテンスが含まれる。 罹患率が高く重篤な結果になるために、アテローム性動脈硬化症、血管血栓症 、再狭窄症、及び血管の機能と構造の異常を特徴とする他の疾患の出現率を減少 させることができる治療法を見出すことは極めて重要である。理想的には、その 治療法は、これらの疾患と関連がある血管の病態過程を抑制し、よって予防し、 変性過程の進行を遅らせ、正常な血管拡張を回復させることである。 上記に簡単に纏めたように、これらの病態過程は非常に複雑であり、特性、組 成及び活性の変化、及び分泌する因子及びアップレギュレート又はダウンレギュ レートするレセプターの種類の変化を受ける様々な異なる細胞に関与している。 内皮細胞によって放出される物質、“内皮細胞由来弛緩因子”（ＥＤＲＦ）は、 これらの病態過程を抑制するのに重要な役割を果たすことができる。ＥＤＲＦは 、現在酸化窒素（ＮＯ）又はＮＯを遊離する不安定なニトロソ化合物であること が 知られている。（本発明のために特にことわらない限り酸化窒素（ＮＯ）は酸化 窒素又はＮＯを遊離する不安定なニトロソ化合物を意味する。）この物質は、血 小板凝集を阻止し、培養した血管平滑筋のマイトジェン形成及び増殖を抑制し、 白血球の付着を阻止する。ＮＯが最も強力な内因性血管拡張物質であるために及 び動脈導管での運動誘発血管拡張に主に関与するために、ＮＯ合成を促進すると 正常な個体及び血管疾患をもつ個体の運動能力が改善される。ＮＯは、血管壁及 び血管の変性疾患と関連がある様々な細胞に直接或いは間接に効果がある。関連文献 Girerdら（1990）Circulation Research 67:1301-1308には、Ｌ−アルギニン を静脈内投与するとコレステロール食餌ウサギの後肢の内皮細胞依存性弛緩が増 強される。著者らは、ＥＤＲＦの合成が高コレステロール血症においてＬ−アル ギニンによって高められると結論している。Rossitchら（1991）J．Clin．Invst ．87:1295-1299には、高コレステロール血症ウサギの基底動脈にＬ−アルギニン を試験管内投与すると内皮細胞依存性血管拡張の悪化が逆転しかつ血管狭窄が減 少することが報告されている。高コレステロール血症の動物の異常な血管応答は 、酸化窒素に対する代謝の細胞内アルギニン利用可能性の可逆的低下によるもの であると結諭している。 Creagerら（1992）J．Clin．Invest．90:1248-1253には、Ｌ−アルギニンを静 脈内投与すると高コレステロール血症患者の内皮細胞由来ＮＯ依存性血管拡張が 改善されることが報告されている。 Cookeら，“高コレステロール血症の内皮細胞機能障害はＬ−アルギニンで修 正される”，Endothelial Mechanisms of Vasomotor Control，eds．Drexler，Z eiher，Bassenge & Just;steinkopff Verlag Darmstadt，1991，pp．173-181に は、以前の参考文献の結果が調べられており、“これらの研究の結果を外挿する 場合には、Ｌ−アルギニン（即ち、補充食として）を外因投与するとアテローム 性動脈硬化症の治療及び／又は予防における治療補助剤が表される ”ことを示 している。 Cooke（1990）Current Opinion in Cardiology 5:637-644には、アテローム性 動脈硬化症及び再狭窄症における内皮細胞の役割、及びこれらの疾患が内皮細胞 機能に対してもつ効果が述べられている。 Cooke（1992）J．Clin．Invest．90:1168-1172には、アテローム性動脈硬化症 に対する高コレステロール血症動物における経口Ｌ−アルギニンの長期投与の効 果が記載されている。これは、経口補充Ｌ−アルギニンが血管壁からのＮＯ遊離 を改善する最初の証明である。血管壁からのＮＯ遊離の増進は、高コレステロー ル血症動物におけるアテローム性動脈硬化症の驚くべき減少と関連があった。こ れは、血管壁によるＮＯ生成増進がアテローム性動脈硬化症の発生を阻止すると いう仮説を支持する最初の証明である。 Cooke & Tsao（1992）Current Opinion in Cardiololgy 7:799-804には、アテ ローム性動脈硬化症の進行のメカニズムが記載されており、酸化窒素の阻害が血 管ホメオスタシスを妨害しかつアテローム形成の原因となることが示されている 。 Cooke & Santosa（1993）Steroid Hormones and Dysfunctional Bleeding，AA AS Pressには、様々な役割のＥＤＲＦの活性が調べられ、内皮細胞機能障害の可 逆性がアテローム性動脈硬化症の段階によって影響されることが示されている。 ＥＤＲＦが強力な血管拡張物質であり、導管及び抵抗血管張力をモジュレートす るのに重要な役割を果たし、細胞増殖及び循環血液細胞と血管壁との相互作用に 重要な影響を与え、ＥＤＲＦ活性の妨害が敗血症性ショック、高血圧症、血管痙 攣、中毒症及びアテローム性動脈硬化症を開始するか又はそれらの原因となると 結諭している。 Fitzpatrickら，American Journal of Physiology 265(Heart Circ． Physi ol．34):H774-H778，1993には、ワイン及び他のブドウ製品が試験管内内皮細胞 依存性血管弛緩活性があることが報告されている。 Wangら（1994）J．Am．Cell．Cardiol．23:452-458には、アルギニンを経口投 与すると高コレステロール血症ウサギの冠動脈におけるアテローム性動脈硬化症 を予防することが報告されている。 Drexlerら（1994）Circulation 89:1615-1623には、冠動脈血管張力に対する 静脈内アルギニンの効果が記載されている。これは、静脈内アルギニンが心臓移 植した患者の冠動脈において正常なＮＯ依存性血管拡張を回復させることができ る最初の証明であり、Tsaoら（1994）Circulation 89:2176-2182には、高コレス テロール血症ウサギにアルギニンを経口投与すると血管壁によって酸化窒素の遊 離が高められかつ単球が血管へ付着することから阻止することが証明されている 。 Tsaoら（1994）J．Arterioscl．Thromb．14:1529-1533には、高コレステロー ル血症ウサギに経口アルギニン投与すると血小板凝集（血液凝固）が阻止される ことが示されている。血小板凝集は、血管変性疾患において血管血栓症を引き起 こすのに重要な役割を果たしている。 Von de Leyenら（1995）PNAS USAには、酸化窒素シンターゼ（ＮＯを生じる酵 素）をコード化する遺伝子がラットの頸動脈に挿入されることが示されている。 これによりラット頸動脈に多くのＮＯを生成させ、よって血管拡張を高めかつバ ルーン血管形成術後の血管壁の肥厚を阻止する。 Noruseら（1994）Arterioscler．Thromb．14:746-752には、ＮＯ生成の拮抗薬 を経口投与すると高コレステロール血症ウサギにおけるアテローム形成が促進さ れることが報告されている。 Cayetteら（1994）Arterioscler．Thromb．14:753-759にもＮＯ生成の拮抗薬 を経口投与すると高コレステロール血症ウサギの硬化巣発生が促進されることが 報告されている。 ＮＯ又はその前駆物質による活性を言及している他の参考文献としては次のも のが含まれる。Pohl & Busse（1989）Circ．Res．65:1798-1803;Radomskiら（19 87）Br．J．Pharmacol．92:181-187;Stamlerら（1989）Circ．Res．65:789-795; 抗血小板活性);Garg & Hassid（1989）J．Clin．Invest．83:1774-1777;weiding erら（1990）Circulation 81:1667-1679;血管平滑筋増殖に関するＮＯ活性);Ros s（1986）N．Engl．J．Med．314:488-500;Bathら（1991）Arterioscler．Thromb ．11:254-260;Kubesら（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6348-6352;Lefe rら（1990）Endothelium-Derived Contracting Factors．Basel，S．Karger pp. 190-197;白血球付着及び遊走に関するＮＯ活性);Heistadら（1984）Circ．Res． 43:711-718;Rossitchら（1991）J．Clin．Invest．87:1295-1299;Yamamotoら（1 988）同書81:1752-1758;Andrewら（1987）Nature 327:237-239;Tomitaら（1990 ）Circ．Res．66:18-27;Kugiyamaら（1990）Nature 344:160-162;Mitchellら（1 992）J．Vasc．Res．29: 169(abst.);Minorら（1990）J．Clin．Invest．86:2109-2116;高コレステロール 血症に関するＮＯ活性);Tannerら（1990）Circulation 83:2012-2020;Kuoら（19 92）Circ．Res．70:f465-476;Drexlerら（1991）Lancet 338:1546-1550;Schusch keら（1994）Int．J．of Microcircu:Clin．and Exper．14(4):204-211;Yaoら（ 1992）Circulation 86:1302-1309;Higashiら（1995）Hypertension 25(4 Pt 2): 898-902;Kharitonovら（1995）Clin．Sci．88(2):135-139；Smuldersら（1994） Clin．Sci．87(1):37-43;Bode-bogerら（1994）Clin．Sci．87(3):303-310;Bode -Bogerら（1994）Clin．Sci.;Randallら（1994）Clin．Sci．87(1):53-59;Duboi s-Randeら（1992）J．Card．Pharm．20Suppl．12:S211-3;Otsujiら（1995）Am． Heart J．129(6):1094-1100;Nakanishiら（1992）Am．J．of Physi．263(6 Pt 2 ):H1650-8;Kuoら（1992）Circ．Research 70(3):465-476;Tannerら（1991）Circ ulation 83(6):2012-2020;Mengら（1995）J．Am．Col．Card．25(1):269-275;Le fer & Ma（1993）Arteroscl．and Thromb．13(6):771-776;McNamaraら（1993）B iochem．and Biophys．Res．Comm．193(1):291-296;Tarry & Makhoul（1994）Ar ter．and Thromb．14(6):983-943;Daviesら（1994）Surgery 116(3):557-568;Ra ij（1994）Kidney lnstitute 45:775-781． 発明の要約 血管の機能と構造を改善する方法、特に、生理的部位において酸化窒素又は活 性前駆物質のレベルをモジュレートすることにより血管弛緩、細胞接着、浸潤及 び増殖をモジュレートする方法が提供される。本方法は、血管機能の変質、特に 、アテローム性動脈硬化症、再狭窄症、血栓症、高血圧症、インポテンツ、及び 血管拡張低下又は不全を特徴とする他の疾患の発生と関係した血管機能の変質を 予防するのに使用する。生理的部位における内因性酸化窒素又は二次メッセンジ ャー利用可能性を高めると血管弛緩が改善され、よって血流量不全のための症状 （狭心症のような）を免荷し、不適切な血圧の上昇を抑えることができる。内因 性酸化窒素を高めるとアテローム性動脈硬化症、再狭窄症、血管肥大又は過形成 及び血栓症の開始や進行が阻止される。これは、酸化窒素が強力なモジュレータ ーであるばかりでなく血小板及び白血球を血管壁に付着することから阻止すると いう事実によるものである。血管機能低下、特にアテローム性動脈硬化症になり やすいホストにおける予防又は治療として薬剤が有効な用量で長期にわたって投 与される。再狭窄症についてはその病態過程が通常は血管損傷（即ち、血管形成 術又はアテローム切除術）の３〜６カ月後に緩解するので限られた期間薬剤が投 与される。Ｌ−リシン、Ｌ−リシンの前駆物質、例えば、Ｌ−リシンを含むオリ ゴペプチド又はポリペプチド、又は高レベルのＬ−リシンを含むタンパク質をそ れだけで又はＬ−アルギニンと組合わせて、特に補充食として活性剤の有効性を 高めるＧＲＡＳ物質で更に補充して経口投与するとＮＯ生成が増進され、よって アテローム形成の作用が低下する。ＮＯシンターゼの利用可能性の亢進、例えば 、血管壁、特に病変部位におけるＮＯシンターゼの発現増強、ＮＯの血管壁から の遊離又はＮＯ又は二次メッセンジャー、サイクリックグアノシン一リン酸（“ ｃＧＭＰ”）の減少又は分解の結果として、ＮＯ又は二次メッセンジャ一利用可 能性を高めるような他の手法も用いられる。 図面の簡単な説明 図１は、高コレステロール血症ウサギにおけるアテローム性動脈硬化巣に対す るＬ−アルギニンの効果の組織形態測定実験を示す棒グラフである（実施例１を 参照されたい）。 図２は、アデノシン二リン酸によって開始された血小板凝集によって証明され る血小板再活性に対するＬ−アルギニン補充食の効果を示す比濁分析走査である （実施例２を参照されたい）。Ａ）高コレステロール血症ウサギからの血小板の 凝集；Ｂ）Ｌ−アルギニンで治療した高コレステロール血症ウサギからの血小板 の凝集低下；Ｃ）ＬＮＭＭＡによるＮＯシンターゼの拮抗は、Ｌ−アルギニンの 有益な効果を逆転する。 図３は、高コレステロール血症ウサギの大動脈内皮細胞に結合する細胞に対す るＬ−アルギニン補充食の効果を比較する棒グラフである（実施例４を参照され たい）。 図４．全アルギニン治療高コレステロール血症ウサギ（ＡＲＧ、１４〜２３週 間）からの胸部大動脈の病巣表面積は賦形剤投与の高コレステロール血症ウサギ （ＣＨＯＬ、１４〜２３週間）と比べて減少している（実施例５を参照されたい ）。 図５．バルーン損傷の４週間後の腸骨動脈におけるマクロファージの蓄積。（ マクロファージの血管壁への浸潤が硬化巣形成を開始及び促進する）。データは 、マクロファージを含む血管の％として表す。高コレステロール血症ウサギ（Ｃ ＨＯＬ）のバルーン損傷は、正常な食餌のウサギ（ＣＯＮＴ）からの損傷腸骨動 脈と比べて動脈マクロファージの蓄積の著しい増加を生じる。Ｌ−アルギニンを 投与する高コレステロール血症ウサギ（ＡＲＧ）からの腸骨動脈のマクロファー ジ蓄積は、ＣＨＯＬグループに比べて著しく減少する。（^*；ｐ＜０.０１、ＡＲ Ｇ V．ＣＨＯＬ）。この実験から経口アルギニン処理が単球／マクロファージの 血管への浸潤を著しく減少させ、硬化巣形成を阻止するアルギニンの効果を一部 説明することがわかった。（実施例６を参照されたい） 図６．培養した内皮細胞を液流で刺激すると酸化窒素が分泌される。酸化窒素 を液流誘発分泌させると、酸化ＬＤＬコレステロール（ｏｘＬＤＬ；３０μg/ml ）によって誘導された内皮細胞の接着が減少する。ヒト大動脈内皮細胞をｏｘＬ ＤＬに曝露すると対照と比べて単球の生体外結合が増加した。液流に曝露しない 細胞（静置）に比べて、液流に前もって曝露するとｏｘＬＤＬによって誘導され た単球接着が阻止された。これらの液流効果は、ＮＯシンターゼインヒビターで 阻止され、ＮＯ供与体（ＰＡＰＡ−ＮＯ）又はサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ） でよく似た。棒線は平均±ＳＥＭを表す。^*p＜０.０５；^**ｐ＜０.０１。（実施 例８を参照されたい）。 図７は、ＮＯシンターゼの遺伝子を含むプラスミド構築物（ＩＮＪ＋ＮＯＳ） で処理した動物のバルーン血管形成術の２週間後の動脈内膜病巣肥厚の形態測定 を対照ベクター（ＩＮＪ＋ＣＶ）又は未処理損傷血管（ＩＮＪ）と比べて示す棒 グラフである。（実施例１１を参照されたい） 図８は、再狭窄症に対するアルギニンの局所管腔内投与の効果を示すヒストグ ラムである。高コレステロール血症ウサギに、腸骨動脈の血管形成術を施した。 直後数羽のウサギに高局所濃度のアルギニンを血管に加えるように設計されたカ テーテルによって血管に直接アルギニンを注入した。２〜４週間後、ウサギから 血管を切除し、顕微鏡的に調べた。血管壁の肥厚（内部肥厚又は“再狭窄”）は 賦形剤で処理した動物と比べてアルギニンの管腔内注入で処理した動物（ＡＲＧ ） が減少した。（実施例１２参照） 図９は、高コレステロール血症ウサギにおける内皮細胞依存性血管拡張に対す るリシン長期投与の効果を示す一組の用量応答曲線である。リシンを長期経口投 与すると（１０週間）ＮＯ仲介血管拡張を改善した。このＮＯ活性の改善は、硬 化巣面積の顕著な減少と関連があった。リシンを長期投与すると血管の機能と構 造を回復させるのにアルギニンと同程度の効果があった。（実施例１４を参照さ れたい） 図１０は、血液ＬＤＬ−コレステロールのレベルと単球結合間の関係を示す点 図表である。単球を正常レベル又は高コレステロールレベルを有するヒトの血液 から単離した。これらの単球の内皮細胞への培養内結合を測定した。高コレステ ロールレベルを有する個体からの単球は、内皮細胞に対する接着が多い。この生 体内単球−内皮細胞相互作用は、アテローム性動脈硬化巣の発生の最初の段階で ある。（実施例１５を参照されたい） 図１１は、アルギニン（ＮＯ前駆物質）治療前、治療中及び治療後の正常なコ レステロールレベル（ＣＯＮＴ）を有する被検者から得られた単球及び高コレス テロール血症（ＨＣ）ヒトから得られた単球の接着を示す棒グラフである。アル ギニン（Ａｒｇ）又はプラセボ（ｐｌａｃ）治療を開始する前の高コレステロー ル血症個体からの単球は、生体外内皮細胞へ結合する傾向が大きい（ベースライ ン）。アルギニン治療の２週間後、これらの高コレステロール血症個体からの単 球は接着が著しく減少し、正常な被検者からのものと異なる。この時点でアルギ ニン治療を中断し、ウオッシュアウトがあった(4週間）。この時点でアルギニン 治療から離れた以前にアルギニンで治療した患者からの単球は接着が増加した。 （実施例１５を参照されたい） 図１２は、高コレステロールをもつ個体からの単球（ＣＨＯＬ）が内皮細胞に 対する接着が多いことを示す棒グラフである。しかしながら、ナトリウムニトロ プルシドで治療した後（ＣＨＯＬ＋ＳＮＰ）、これらの単球の接着は標準化する 。ＳＮＰはＮＯ供与体である。（実施例１５を参照されたい） 図１３は、高コレステロール血症ヒト（ｈｃ）及びコレステロールレベルが正 常な個体（ｎｃ）において得られた血小板凝集を示す一組のヒストグラムである 。 アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）に応答した生体外血小板凝集は、ｈｃ個体が正常 な個体と比べて増加する。経口Ｌ−アルギニンで治療した２週間後、高コレステ ロール血症個体において血小板凝集が減少し、４週間でより大きな治療効果が見 られる。（実施例１６を参照されたい） 図１４は、移植アテローム性動脈硬化症をもつ患者においてＬ−アルギニン（ ３０ｇ）の静脈内注入の前後のアセチルコリン（ＡＣＨ）の冠動脈内注入に応答 した冠動脈血流量の増加を示す棒グラフである。アセチルコリンは、血管壁から のＮＯの遊離を刺激し、血管拡張及び血流量の増加を引き起こす。Ｌ−アルギニ ン投与後にＮＯ依存性血管拡張が改善される。（実施例１８を参照されたい） 図１５は、膨張状態でＮＯ前駆物質の溶液を含む拡張バルーンを有する血管に 配置した本発明に有用なドラッグデリバリー装置の部分図、特に断面図である。 個々の実施態様の説明 本発明によれば、内在性酸化窒素のレベル又は活性を高めることにより血管機 能が維持され、その劣化が阻止又は遅延する。内在性酸化窒素のレベル又は活性 を高めることによりアテローム性動脈硬化症、再狭窄症、高血圧症、血管痙攣、 インポテンツ、狭心症及び血管血栓症のような共通の血管変性疾患が予防的に及 び／又は治療的に治療される。高レベル又は高活性の酸化窒素（そのような高レ ベルを生じる酸化窒素の前駆物質を含むことを意味する）は、酸化窒素の合成経 路での酸化窒素の生成と関連がある成分のいずれかの活性、合成又は濃度をモジ ュレートするか又は酸化窒素、その前駆物質又は弛緩シグナルと関連がある二次 メッセンジャーの分解速度を抑制することにより達成される。高レベル又は高活 性を示すのに“作用”という用語は、２つの状況を包含するために用いられる。 酸化窒素の増強作用は、酸化窒素生成の代謝経路において前駆物質、特にアミノ 酸（例えば、Ｌ−リシン、それだけで又はＬ−アルギニンと組合わせて｛Ｌ−リ シン、それだけ又はＬ−アルギニンとの組合わせは“アミノ酸”又は“ＮＯ前駆 アミノ酸”と呼ばれる｝これらのアミノ酸を含むポリペプチド等）の患者への経 口又は静脈内投与の結果であり、遺伝子を組込む条件下でＮＯシンターゼの遺伝 子を内皮細胞又は他の細胞に導入し遺伝子を発現することにより、又は酸化窒素 の生成と関連がある酵素を直接添加することによりＮＯ、特にＮＯシンターゼに 対する代謝経路において酵素を供給する。高レベルの酸化窒素は、また、酸化剤 、還元剤又はスーパーオキシドジスムターゼのような分解からＮＯを防御する薬 剤の投与から得られる。また、薬剤は、Ｌ−リシン又はＬ−アルギニンのような 主要な活性剤の生体利用可能性又は有効性を高めるためにも働く。薬剤は個別に 又は組合わせて天然タンパク質源として肉又は植物、果物又はそれから誘導され た製品のような天然食品源以外の形で投与される。アミノ酸が薬剤である場合、 薬剤はアミノ酸の標準一日量を高めるために補充食として供給され主要アミノ酸 源として供給されない。一般的には少なくとも２５％増、通常は少なくとも５０ ％増、１００％以上増であってもよく、好ましくは少なくとも約７５％増とする 。 方法は、補充食としてＬ−リシンを個々のアミノ酸として又はＬ−アルギニン と組合わせて、又はＬ−リシンの前駆物質として、例えば、モノマー又はポリペ プチドを用いるものである。アミノ酸は、塩酸塩、グルタミン酸塩のような生理 的に許容しうる塩として投与される。また、ＮＯ前駆物質の血漿レベルを高める ためにペプチド（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−アルギニン、又はその 組合わせ）として投与される。特に問題のオリゴペプチドとしては、少なくとも １０モル％のＬ−リシン、一般的には少なくとも約２５モル％、通常は少なくと も約５０モル％のＬ−リシンを有し、一般的には合計少なくとも約５０モル％の Ｌ−リシンとＬ−アルギニン、好ましくは少なくとも約７５モル％のＬ−リシン とＬ−アルギニン、更に好ましくは少なくとも約９５モル％のＬ−リシンとＬ− アルギニンを有するアミノ酸２〜３０個、通常は２〜２０個、好ましくは２〜１ ０個のオリゴペプチドが含まれる。オリゴペプチドは、消化管からの吸収を促進 することができる、ＮＯ合成又は安定性の増大、例えば、還元剤又は酸化防止剤 を与えることができる等の他の化合物に結合することにより修飾される。 天然に存在する供給源としては、Ｌ−リシン、又は指示したアミノ酸の双方が 多い、例えば、約４０％より多く、好ましくは約５０％より多いタンパク質を含 むプロタミン又は他の天然に存在するＮＯ前駆アミノ酸が含まれる。Ｌ−リシン の量は、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄症と関連がある経路に影響すること が所望される治療用量の少なくとも２５％、通常は少なくとも約５０％を存在さ せる。示されたＬ−リシンは１００％の治療用量であってもよいが好ましくはＬ −リシンとＬ−アルギニンの組合わせが用いられる。 Ｌ−リシン、他の便利なＮＯ前駆物質、又はＮＯ利用可能性を高める他の薬剤 は、所定の用法に従って投与され、少なくとも１週間に１回及び長期間、一般的 には少なくとも１カ月、通常は少なくとも３カ月にわたって投与され、長期治療 として１年又はホストの寿命を含むそれ以上の間続けられる。投与用量は、投与 回数、所望の血液レベル、他の併用治療、症状の程度、治療が予防か治療か、患 者の年齢、患者本来のＮＯレベル等に依存する。好ましくは、ＮＯ前駆アミノ酸 （Ｋ及びＲ）又は生物学的に等価な化合物の使用量は、一般的には約０.１５〜 ３０mMの範囲の血漿レベルを与える。Ｋ及びＲの経口投与は、Ｋ及びＲ、他のＮ Ｏ前駆物質、又はＮＯ強化剤を丸剤、散剤、カプセル、溶液又は分散液、特に水 性液等として供給することにより得られる。ＮＯ前駆物質を処方するのにラクト ース、白陶土、スクロース、ゼラチン、水性媒体、生理的に許容しうる油、例え ば、落花生油等の種々の担体及び賦形剤が用いられる。１日の場合、補充食とし てヒトホストに対するＫ及びＲの投与は１日通常約１〜１２ｇである。アミノ酸 の単独供給源として用いられる場合、投与は１日約５〜２０ｇである。 更に、アミノ酸又はポリペプチドの経口製剤にそれらの吸収を高める及び／又 はＮＯシンターゼの活性を高める他の薬剤、例えば、Ｂ₆（５０〜２５０ｍｇ／ ｄ）、葉酸塩（１日０.４〜１０mg）、Ｂ₁₂（０.５〜１mg/d）又はカルシウム（ １日２５０〜１０００mg）が添加される。更に、ＮＯ前駆アミノ酸又はＮＯ前駆 アミノ酸を含むペプチドの経口又は静脈内製剤にＮＯを分解から防御することが 既知の薬剤、（例えば、システイン又はＮ−アセチルシステイン２００〜１００ ０mg/d）、ビタミンＣ（１日２５０〜２０００mg）、（補酵素Ｑ１日２５〜９０ mg、グノレタチオン１日５０〜２５０mg）、ビタミンＥ(１日２００〜１０００I .U.)、又はβカロチン（１日１０〜２５，０００I.U.)のような酸化防止剤又は トコフェノール、フェノール化合物及びユビキノンのような天然に存在する植物 酸化防止剤が添加される。また、補充食に活性剤が含まれ、他の添加剤としては ビタミン、ＮＯ前駆アミノ酸以外のアミノ酸等が含まれ、本活性剤は活性成分の 少なくとも１０重量％、通常は少なくとも約２５重量％である。 ＮＯ前駆アミノ酸又はＮＯを援助するその生理的等価物の投与は、血管拡張を 亢進しアテローム形成又は再狭窄を阻止するために働く血管機能を改善するため に予防的に、又はアテローム形成が開始された後に治療的に投与される。従って 、例えば、バルーン血管形成術を受けるべき患者は、バルーン血管形成術のかな り前に、好ましくは少なくとも約１週間かそれ以上かなり前にＮＯ前駆アミノ酸 が投与される用法が与えられる。また、患者においては、ＮＯ前駆アミノ酸の投 与はいつでも始められる。便利には、適切な投与量を加工した食品に組込むこと により投与される。食品の種類としては、ゼラチン、アイスクリーム、シリアル 、キャンディ、砂糖代用品、清涼飲料等が含まれる。ヘルスバー、例えば、グラ ノーラ、他の穀類、フルーツバー、例えば、デーツバー、イチジクバー、アプリ コットバー等の補充としてＮＯ前駆アミノ酸が食品に組込まれるものが特に興味 深い。ＮＯ前駆アミノ酸又はその等価物の量は、１用量又はバーあたり約１〜２ ５ｇ、好ましくは約２〜１５ｇである。 血管損傷、特に血管形成術及びアテローム切除術に関する血管損傷と関連があ る病態の治療方法及び装置が提供される。再狭窄症と呼ばれる損傷が特に興味深 く、血管平滑筋細胞の血管の内膜への遊走及び増殖並びにアテローム性動脈硬化 症と関連がある付着に起因する。 ＮＯ前駆アミノ酸の経口投与の代わりに、特に血管系における酸化窒素レベル の急速な宜進が所望される場合に（即ち、重要な血管の急性血栓症とのように） 静脈内投与が用いられ、経口及び非経口投与の組合わせが患者の要求に応じて用 いられる。更に、非経口投与は、粘膜を横切って胃腸管から血管系へ容易に輸送 されない化合物の投与を可能にする。 再狭窄を予防する壁内治療の具体的な適用においては、Ｌ−リシン或いはＬ− アルギニンが個別に又は組合わせて、及び生物学的等価物がそれだけで又は本明 細書に記載される他の非アミノ酸因子と共に用いられる。ＮＯ前駆物質を損傷部 位の血管壁に導入する方法が提供され、損傷部位の細胞においてＮＯ生成の冗進 がもたらされる。血管壁へ注入しかつＮＯ生成の細胞に用いうるＮＯ生成物質を 生じる様々なデリバリーシステムが用いられる。用いられる装置としては、国際 出願第92/11895号、同第95/05866号及び同第96/08286号に示される装置によって 例示されるドラッグ・デリバリー・バルーン、例えば、多孔性、音泳動及びイオ Santoianら，Cath．Cardiov．Diag．(1993)30:348-354;Mullerら，J．Am.Coll． Cardiol．(1992)20:460-466;Ortizら，Circulation（1994）89:1518-1522も参照 されたい。ＮＯ前駆物質は、損傷部位にカテーテルによって輸送するためのデリ バリーバルーンに導入される。次に、バルーンを圧力によって膨張させて薬剤を バルーンから周囲の血管壁へ進める。用いられる薬剤の量は、薬剤の種類、治療 されるべき領域、及び薬剤の領域からのロスによって異なってもよい。薬剤の注 入は、損傷領域における細胞及び細胞外マトリックスが薬剤に暴露されてこれら の細胞によってＮＯの生成を高めることを行わせるのに十分な時間維持される。 脱イオン水、食塩水、リン酸塩緩衝食塩水等である生理的に許容しうる媒体、 通常は水性媒体が用いられる。ＮＯ前駆物質活性剤の量は、用いられる具体的な 薬剤、存在する他の添加剤等によって変動する。Ｌ−アルギニンによって例示さ れるように、一般的には少なくとも約５０mgで約５ｇを超えず、通常は少なくと も約１００mgで約２ｇを超えず、少なくとも約５００mgをよく存在させる。濃度 は広く異なり、一般的には約２０〜５００g/l、通常は約５０〜２５０g/lの範囲 である。 治療時間は、通常は少なくとも約２分で約０.５時間を超えず、一般的には約 ５〜１５分間の範囲である。導入速度は、一般的には約０.０５〜５ml/分の範囲 であり、他の要因の全てに依存する。 本方法は、血管形成術及びアテローム切除術に起因する血管損傷に罹患したホ ストにおいて用いられる。ＮＯ前駆物質の投与時間は広く異なってもよく、損傷 時間に関して比較的短い時間をかけて１回又は多回投与される。治療は、一般的 には損傷前に、損傷と同時に又は損傷後に、前の場合には損傷の通常２週間以内 で約８週間を超えず、通常は約６週間を超えず、好ましくは０〜６週間の範囲で ある（Ｏは前の手術と同時又は直後６時間以内を意味する）。 だいたいにおいて患者は狭くなった血管と関連がある様々な症状、特に高コレ ステロール血症、糖尿病、喫煙及び高血圧症に罹患している。従って、通常は血 管壁の硬化巣の蓄積の結果として種々の程度に狭くなった血管が扱われる。 損傷時に又はその前後に、前に又は直後のＮＯ前駆物質の治療により血管ＮＯ 生成の増進及び動脈内膜肥厚の減少が見られ、再狭窄の可能性がかなり減少する 。 示された様々な送達装置が活性剤の送達に用いられる。図１５は、膨張した状 態で血管壁が参照番号１５によって示される動脈血管内にバルーン１２を含むド ラッグデリバリー装置を示す図である。経皮経管腔冠動脈形成(“ＰＣＴＡ”)手 術中にガイドワイヤ１０がまず選ばれた動脈に狭窄病巣を過ぎる点まで挿入され る。次に、カテーテル本体１１とバルーン１２を含む拡張カテーテルをガイドワ イヤ１０に沿って動脈系の所望の位置まで進めバルーン部分１２が狭窄病巣を横 断又は交差する。次に、ＮＯ前駆物質溶液をバルーン管腔１４を介してバルーン １２の内室１３に導入することによりバルーン１２を膨張させる。膨張でバルー ン１２の外面が血管壁１５の内面に対向して外に押圧して狭窄病巣面の血管を膨 張又は拡張し、よって本方法の血管形成術部分及びＮＯ前駆物質の血管壁への壁 内導入を行う。 多孔性バルーンは、このために用いられる慣用の材料のいずれかから作られる 。これらは、セルロースアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリスルホン、ポリアク リロニトリル、ポリウレタン、天然及び合成エラストマー、ポリオレフィン、ポ リエステル、フルオロポリマー等が含まれる。通常、膜厚は約１０Å〜１μの範 囲であり、適度な孔サイズは約０．０５〜１μである。 また、局所ドラッグ・デリバリー・システムも用いられ、バルーンの外面にあ るチャンネルによって薬剤が送達される。バルーンは、上記のように罹患した血 管分節に配置される。次に、バルーンを通常の方法（食塩水を用い、通常は対比 剤を含む）で膨張させ、チャンネル（バルーンの表面上）を血管壁と接触させて 配置する。次に、ＮＯ前駆物質溶液を圧力によってチャンネルに注入する。チャ ンネル内の穿孔により溶液が血管壁へ圧力によって流出及び噴流する。 また、局所ドラッグ・デリバリー・システムも用いられ、バルーンの外面にあ るチャンネルによって薬剤が送達される。バルーンは、上記のように罹患した血 管分節に配置される。次に、バルーンを通常の方法（食塩水を用い、通常は対比 剤を含む）で膨張させ、チャンネル（バルーンの表面上）を血管壁と接触させて 配置する。次に、ＮＯ前駆物質溶液を圧力によってチャンネルに注入する。チャ ンネル内の穿孔により溶液が血管壁へ圧力によって流出及び噴流する。 経口又は静脈内投与については、ＮＯ前駆アミノ酸がそれだけで又はポリペプ チド中で、又はＮＯを援助する点での生理的等価物が酸化防止剤又は酸素誘導フ リーラジカルの捕捉剤（スルフリル含有化合物等）又は酸素誘導フリーラジカル の生成を防止する化合物（スーパーオキシドジスムターゼ等）と共に、酸素誘導 フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン等）が酸化窒素を不活性化すること ができることが既知であるので供給される。更に、カルシウム又は葉酸塩のよう なＮＯシンターゼ活性に必要とされる補助因子が投与される。これらの併用薬剤 の各々の量は、ＮＯ活性を求める実験断片での分析を用いて経験的に求められる 。 ＮＯ前駆物質と用いられる種々の補助因子の量は、特に経口投与についてはＮ Ｏ前駆物質の量及び補助因子の有効性に関して変動する。一般的には、１日あた り葉酸塩（０.４〜１０mg）、Ｂ₆（５０〜２５０mg）、Ｂ₁₂（０．５〜１mg）及 び／又はカルシウム（２５０〜１０００mg）を供給する量で存在させることがで きる。通常は、ＮＯ前駆物質の量は約２ｇより多く、１日に周期的に投与され、 １日２〜４回投与される。だいたいにおいて補助因子はＧＲＡＳ物質であり、受 容ホストに対する逆効果を及ぼすことなく高用量で用いられる。 本組成物は、だいたいにおいて経口投与され、投薬は様々な剤形を用いること ができる。投薬は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、分散剤、バー、アイ スクリーム、ゼラチン等であり、生理的に許容しうる担体、及び任意により安定 剤、着色剤、香味剤、賦形剤、打錠添加剤等と共に処方される。投与方法によっ ては活性薬剤の量は約２５ｇまでである。補充食としての製剤については、個々 の用量は一般的には約０.５〜５ｇ、通常は約１〜３gのＮＯ前駆物質の範囲であ る。 また、前駆物質を酸化窒素へ高めると共に或いは独立して酸化窒素代謝経路の 成分を増大させることができる。例えば、血管壁、特に病巣部位に存在する酸化 窒素シンターゼの量を増大させることができる。これは、病巣部位への局所投与 又は血管系へ全身系で行われる。シンターゼは、リポソーム、徐放性粒子を用い て、又はデポー剤として、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、生体適合性ゲル 、血管ステント、又は他の手段で投与され、病巣部位のＮＯシンターゼの所望の 濃 度を与える。 問題の生理的部位においてＮＯを増強させる代わりに、酸化窒素の存在の結果 として導入したシグナルの寿命を延ばすことが選ばれる。ｃＧＭＰが酸化窒素誘 発シグナルの結果として細胞内に生成されるので、ｃＧＭＰの生成をもたらす薬 剤を使用すること又はその寿命を延ばすことが用いられる。具体的な薬剤として は、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼインヒビター又はグアニレートシクラーゼの 量を高める薬剤が含まれる。 また、１種以上の遺伝子の構成発現又は誘導発現を与えるように遺伝子操作さ れ、ＮＯシンターゼ、又は細胞外に分泌及び作用する他の酵素及びタンパク質を 発現することにより所望の弛緩応答を与える。従って、適切な遺伝子を含みかつ 宿主細胞に導入された後に高濃度の酸化窒素又は弛緩経路の他の中間体を生じる 発現ベクター（ウイルス又はプラスミド）が調製される。これらの細胞は、病巣 部位又は宿主の他の部位に導入され、発現が弛緩、増殖等について適切な応答を 誘導する。ＮＯシンターゼ又はＮＯシンターゼを発現する細胞は、問題の部位に 封入及び配置することによりデポー剤として存在させることができる。例えば、 酵素を分解又は洗浄から防御するために酵素又は細胞を封入する多孔性ステント が作られる。 培養した細胞は、ＮＯシンターゼ又は他の遺伝子を含む発現ベクターで生体外 トランスフェクトされ、次に、様々な動脈内又は静脈内カテーテル送達系を用い て血管壁に導入される。また、生体内遺伝子移入の技術も用いられ無傷血管内で 血管細胞をトランスフェクトするために用いられる。遺伝子は高構成レベルで発 現されるか又は誘導プロモーター（組織特異性をもつことができる）に結合され て発現を調節することができる。 ＤＮＡ構築物が調製され、適切な遺伝子、例えば、ＮＯシンターゼ遺伝子が適 切なプロモーターに天然の末端領域或いは異なる末端領域と共に結合され、メッ センジャーＲＮＡの安定性が増大する。特に問題の構成プロモーターは、サルウ イルス、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ＨＩＶ、ラウス肉腫ウイルス、サイ トメガロウイルス等のウイルスに由来し、プロモーターは初期又は後期遺伝子、 又は末端反復配列のプロモーターが含まれる。内在性プロモーターとしては、β −アクチンプロモータ−又は細胞型特異的プロモータ−が含まれる。 構築物は、従来の技術によって調製され、種々のＤＮＡ断片が適切なプラスミ ド又はウイルスベクター、通常は細菌及び／又は真核宿主内で複製が可能なベク ターに導入される。通常、ベクターはマーカーを含み、ベクターをもつ細胞、例 えば、抗生物質耐性を選択することができる。ベクターは、通常は、宿主内で機 能する複製起点が含まれる。他の機能性因子もベクター内に存在させることがで きる。 ベクターが一旦調製及び複製されると、宿主細胞に導入するために用いられる 。プラスミドベクター構築物は、トランスフェクションを容易にすることができ 、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えることができるウイルス因子、又 は他の機能性因子に結合することにより修飾される。プラスミドベクター構築物 の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム沈降ＤＮＡ、トランスフェクション、 エレクトロポレーション、融合、リポフェクション、ウイルスキャプシド仲介移 入等によって達成される。また、ウイルスベクターの発現構築物は標準感染技術 によって導入される。体細胞遺伝子治療については自己細胞が一般に用いられる が、異種間細胞又は組換え修飾細胞が用いられる場合がある。一般に、遺伝的修 飾に用いられる細胞は成熟内皮細胞又は血管平滑筋細胞である。遺伝的修飾に用 いられる細胞は始原細胞、特に初期始原細胞である。例えば、筋芽細胞は筋細胞 に用いられ、造血幹細胞又は高増殖性潜在的細胞はリンパ系細胞及び／又は骨髄 単球に用いられる。 細胞の種類によっては、同じか又は異なる細胞の組織に注入され、可動細胞と してのままであるか又は具体的な部位（即ち、病巣）へ帰る場合には血管系に注 入される。ＮＯシンターゼ遺伝子については、投与される細胞の数は、細胞の種 類、ＮＯシンターゼの生成レベル、宿主血管系、病巣部位等におけるＮＯシンタ ーゼの所望レベル、高レベルのＮＯシンターゼが単なる治療か酸化窒素合成経路 の他の成分と共に用いられるか等に依存する。従って、用いられるべき細胞の具 体的な数は、具体的な患者の要求に従って経験的に求められる。 これらの細胞は、また、標準血管移植片材料（即ち、ダクロン又はポリテトラ フルオロエチレン移植片）又は他の合成血管導管又は血管生体人工器官の表面上 でまず増殖することにより循環に導入される。 また、生体内で細胞に感染することができるアデノウイルス又はレトロウイル スのようなウイルスベクターも用いられる。その場合、弛緩経路において含まれ るＮＯシンターゼ遺伝子又は他の遺伝子を含むウイルスベクターが問題の部位に 直接投与され、多数の細胞の中に入り細胞ゲノムに組込まれる。従って、ウイル スを１回以上投与して分泌されるシンターゼ又は生成される他のタンパク質の量 を増加分で増加させることにより分泌される酸化窒素シンターゼ又は発現される 他のタンパク質の所望レベルが力価測定される。 また、ＮＯシンターゼ又は他の遺伝子を含むベクターを血管内投与するための 伝達体として修飾リポソームが用いられる。かかる修飾リポソーム法は、リポソ ームとＮＯシンターゼを含むベクターとを混合することを必要とする。遺伝子発 現構築物含有ベクターがリポソームに一旦組込まれると、リポソームは血管壁に 対するリポソームの親和性を高めるタンパク質で被覆される（例えば、日本の血 球凝集ウイルスのウイルスコートタンパク質）。 ある状態では、ＮＯシンターゼ又は弛緩経路の他の遺伝子は、Ｌ−リシン及び ／又はＬ−アルギニンの細胞内供給原としてタンパク質分解切断に感受性のある ポリペプチドを多く含んだリシン及び／又はアルギニンをコードする人工遺伝子 で同時トランスフェクトされる。ある状態では、ＮＯシンターゼ又は他の遺伝子 は、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子で同時トランスフェクトされて、酸化 窒素の分解を阻害する。 ある状態では、急性治療が含まれ１回又は数回の投与を必要とする。これは、 通常は、酸化窒素前駆物質として作用することができかつ天然に存在する化合物 以外である化合物と関連があり、酸化窒素の生成速度を高めるために天然に存在 する化合物と共に添加される化合物でもある。従って、酸化窒素濃度を高めるた めに制限された時間にわたってＮＯ前駆アミノ酸及びスーパーオシドジスムター ゼが急性投与される。これらの投与は、長期用法と独立して又は併用される。 下記の実施例は、具体的な説明として示され限定するものではない。 実施例 実施例１． 経口アルギニンの抗アテローム形成作用： 実験設計：（上記Cookeら，1992を参照されたい）雄のニュージーランドホワ イト系ウサギ（ｎ＝４９）を３つの処理グループに割り当てた。１０羽は１０週 間正常なウサギ食を与えた(対照);１９羽は１％コレステロールで強化した食餌 を与え(Ｃｈｏｌ);２０羽は飲料水中に２.２５％Ｌ−アルギニン塩酸塩で補った １％コレステロール食餌を与えた（Ａｒｇ）。食餌介入の１０週間後、光で鎮静 し、動脈内血圧測定のために耳の中心動脈にニューレを挿入し、続いて血清化学 及び血漿アルギニンのために血液試料を採取した。引き続いてウサギを犠牲にし 、左主冠動脈と胸部大動脈を血管再反応性と組織形態測定の実験のために回収し た。数羽のウサギにおいては、血小板と単球の再反応性の実験のために血液を採 取した。 結果： 生化学及び生理学的測定。経口Ｌ−アルギニン補充食（Ａｒｇ）で維 持した高コレステロール血症ウサギは、正常食（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又は１％コレ ステロール食（Ｃｈｏｌ）のみのウサギに比べて血漿アルギニンレベルが２倍に 上昇した。血漿アルギニンの上昇は実験過程中維持された。血清コレステロール 測定は、１％コレステロール食を受けた両グループで同様に上昇した[対照（＝ １０）、Ｃｈｏｌ（＝１３）及びＡｒｇ（＝１４）について各々50±5vs．1629 ±422vs．1852±356mg/dl]。グループ間の血液動態測定に著しい差はなかった。 単離した血管の内腔実験： ＮＯに無関係な応答についてはノルエピネフィリ ン（血管収縮剤）又はニトログリセリン（ニトロ血管拡張剤）に対する最大応答 又は感受性に処理グループ間で差がなかった。対照的に、ＮＯ依存性弛緩は高コ レステロール血症ウサギから回収した血管でアセチルコリンに対する最大応答の 低下と共に低下した。比較として、Ｌ−アルギニン補充を受けた高コレステロー ル血症ウサギから回収した血管はアセチルコリンに対するＮＯ依存性弛緩を改善 した。別の実験において、ＮＯ依存性弛緩を改善する長期アルギニン補充の効果 は、高コレステロール血症ウサギの腹部大動脈で確認された。 組織形態測定実験(ＥＶＧ染色切片の面積測定)： 盲検組織形態測定分析から 胸部大動脈の内側断面積がグループ間で差がないことかわかった。対照的に、Ｌ −アルギニン補充を受けた高コレステロール血症ウサギからの血管の内膜断面積 （即ち、アテローム性動脈硬化巣の量）は、コレステロール食のみを受けたウサ ギと比べて減少した。Ａｒｇウサギにおいては、内膜病巣の減少は上行胸部大動 脈及び左主冠動脈で最も顕著であった。アルギニンを受けた高コレステロール血 症ウサギの左主冠動脈においては、実質的にアテローム性動脈硬化巣は発生しな かった。 病巣表面積の変化： 一連の第２実験においては病巣が含まれる胸部大動脈の 程度を調べた。賦形剤（ｎ＝６）又はＬ−アルギニン補充食（ｎ＝６）を受けた 高コレステロール血症において、処理の１０週間後に胸部大動脈（左鎖骨下動脈 から横隔膜まで）を回収し、縦に二分し、オイルレッド０で染色した。血管の写 真を取り、血管と病巣の表面積を面積測定により求めた。賦形剤を受けた高コレ ステロール血症ウサギからの胸部大動脈においては全面積の約４０％が硬化巣で 覆われたが、アルギニン処理高コレステロール血症ウサギからの胸部大動脈にお いては１０％未満の表面積が硬化巣で覆われた（図１）。 纏めると、アルギニン補充食は血漿アルギニンレベルを上げるが血清コレステ ロールを変化しない。これは、生物分析で判断したＮＯ依存性血管拡張の顕著な 改善と関連がある。更に、ＮＯ依存性血管拡張の改善は高コレステロール血症ウ サギからの血管における病巣の厚さと面積の減少と関連がある。 実施例２． 経口Ｌ−アルギニンによる血小板凝集阻止： 上で詳述したよう に正常食（対照；ｎ＝６）、１％コレステロール食（Ｃｈｏｌ；ｎ＝５）又は経 口アルギニンで補った１％コレステロール食（Ａｒｇ；ｎ＝６）を与えたウサギ において血小板再活性に対するＬ−アルギニン補充の効果を調べた。耳中央動脈 のカニューレ挿入後に得られた動脈血を１３mMクエン酸ナトリウムで凝固を阻止 した。血小板をカルシウムを含まないクレブス・ヘンゼライト液中で洗浄しかつ アルブミンを含むタイロード液に再懸濁することにより、血小板を多く含む懸濁 液を調製した。アデノシンニリン酸を加えて凝集を開始させ、標準比濁分析法で モニターした。Ｃｈｏｌウサギに由来する血小板においては、対照ウサギからの 血小板と比べて凝集速度又は最大程度に差がなかった（Ａの図２）。対照的に、 Ａｒｇウサギからの血小板の凝集は５０％だけ低下した（図２のＢ）。 この血小板凝集の低下は、アルギニン処理ウサギからの凝集血小板におけるＣ ＧＭＰ含量の２倍と関連かあった。血小板再活性の低下は、試験管内でＮ−メチ ルアルギニン（10^-4M）の投与により逆転される（図２のＣ）。従って、長期ア ルギニン経口投与の抗血小板作用は、内在性ＮＯの合成増進に帰すると考えられ る。更に、ＮＯ合成は、血小板と内皮細胞双方で誘発される。 実施例３． 単球付着の阻止： Ａ． 機能性結合分析： 経口ルギニン補充が単球付着に影響するかを求める ために、上記のように正常食（＝６）、１％コレステロール食（＝６）、又はＬ −アルギニンで補った１％コレステロール食（＝６）を与えたウサギからの血液 を採取した。単核細胞をフィコール・パック比重遠心法によって血液から精製し た。これらの予備的実験においては、白血球の形質転換内皮細胞系、ｂＥｎｄ３ （マウス脳由来ポリオーマミドルＴ抗原形質転換内皮細胞）への接着を調べた。 Ｂｅｎｄ３細胞は内皮細胞の形態を示し、類似のヒト内皮細胞はアセチル化低密 度リポタンパク質を取込むことができ、サイトカイン調節方法で接着分子を発現 する。培養した細胞を０．５cm²ラブ・テックチャンバスライド（MilesScientif ic）で集密まで増殖し、対照培地又はＬＰＳ（１mg／ml）又はＴＮＦα（２５U/ ml)で１８時間処理した。培養物を新しい分析バッファー洗浄し、１ウェルあた り低、中又は高濃度の白血球（各々０.７５、１.５又は３×１０⁵セル／ml）を 加えた。ロッキングプラットホーム上で室温において３０分間インキュベートし て結合した後、スライドを逆にし、２％(v/v)グルタルアルデヒドを含有するバ ッファーに浸漬し、非付着細胞を消失させ付着細胞を単層に固定した。付着単核 細胞をビデオ光学顕微鏡を用いて算出した。 高コレステロール血症ウサギ（Ｃｈｏｌ）からの単球は多量の付着を示し、高 コレステロール血症ネコ又はヒトからの単球は培養した内皮細胞に対して多量の 付着を示すという他のものでの所見と一致した。（deGruijterら（1991）Metabo l．Clin．Exp．40:1119-1121；Fanら（1991）Virchows Arch．B CellPathol．61 :19-27）。 賦形剤処理高コレステロール血症ウサギ（Ｃｈｏｌ）に由来する単球と比べて アルギニン処理高コレステロール血症ウサギ（Ａｒｇ）からのものはほとんど付 着しなかった。このデータからアルギニン処理がアテローム形成で観察できる最 初の事象である単球の内皮細胞への付着を阻止することがわかる。 実施例４． Ｌ−アルギニン食が高コレステロール血症における内皮細胞−単 球相互作用の増強を抑制する 高コレステロール血症動物の血管において最初に観察できる異常は、内皮細胞 への単球付着の宜進であり、高コレステロール食の１週間以内に生じる。この事 象は、高コレステロール血症によって誘発される内皮細胞の接着分子と化学走性 タンパク質の表面発現によって仲介されると考えられる。 同時に起こる他の内皮細胞の変化は、Ｌ−アルギニン代謝から誘導される酸化 窒素（即ち、ＮＯ）の活性低下である。上で示したように、Ｌ−アルキニンによ る長期補充食は高コレステロール血症ウサギのＮＯ依存性血管拡張を回復させ、 このＮＯ活性の改善は顕著な抗アテローム形成作用と関連がある。下記の実験で は、アルギニン食の抗アテローム形成作用か単球−内皮細胞相互作用を阻害する 内皮細胞由来ＮＯによって仲介されるという仮説を試験した。 方法． 動物．雄のニュージーランドホワイト系ウサギを一組飼い、２週間次 の食餌を介人させた。正常なウサギ食(Ｃｏｎｔ、ｎ＝７);１％コレステロール で強化したウサギ食(Ｃｈｏｌ、ｎ＝７);又は実験の過程全体で任意の飲料水中 ２.２５％Ｌ−アルキニン塩酸塩で補った１％コレステロール食(Ａｒｇ、ｎ＝７ )。単球−内皮細胞相互作用について内在性ＮＯの役割を探究するように設計さ れた２番目の一連の実験において、別のグループのウサギを一組飼い、賦形剤対 照（Ｎ＝５）或いはＮＯシンターゼ拮抗薬、ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＡ Ｎ１０mg／１００ｍｌ；ｎ＝５）で補った正常なウサギ食を与え、実験の過程全 体で任意の飲料水中で投与した（平均１日投与量１３.５mg／kg／日）。３番目 の一連の実験においては、ウサギに正常食と賦形剤（ｎ＝４）、Ｌ−ＮＡ（１３ .５mg／kg／日；ｎ＝４）、或いはＬ−ＮＡとヒドララジン（ｎ＝４）を飲料水 に加えて２週間与えた。この投与量でヒドララジン（5mg／kg／日）がＬ−ＮＡ によって誘導された血圧の増加を逆転した。犠牲にする１日前に（食餌介入の２ 週間後）ウサギを光で鎮静し、血液試料を採取するために耳の中心動脈にニュー レを挿人した。 単核細胞の培養と単離． マウスモノサイトイド細胞、ＷＥＨＩ78/24細胞を １０％ウシ胎児血清(vol/vol)を補足したダルベッコ変法イーグル培地で増殖し 、 ５％ＣＯ₂／９５％空気の雰囲気下で保持した。結合実験の前に、単核細胞をＴ ＲＩＴＣ（３μg/ml）で蛍光標識した。ＷＥＨＩ細胞を用いて結果を確認するた めにいくつかの実験では同時にウサギ単核細胞を用いて結合実験を行った。犠牲 にする前に対照ウサギの新しい全血から単核細胞を単離した。 大動脈内皮細胞の調製及び結合分析． 食餌介入の２週間後に、胸部大動脈を 切除し、冷却酸素添加食塩水に入れた。胸部大動脈の１５mm分節を左鎖骨下動脈 の末端に接した点から胸部大動脈中央まで切除した。次に、その分節を注意して 縦に開き、ＨＢＳＳ培地を含む培養皿に入れた。大動脈片を２５ゲージ針を用い て培養皿に固定して内皮細胞表面を培地に曝露した。次に、培養皿をロッキング プラットホーム上に室温で載せた。 １０分後、ＨＢＳＳ培地をＷＥＨＩ細胞を含む結合培地と取り替えた。大動脈 片を単核細胞と３０分間インキュベートした。次に、培地を細胞を含まない新し い結合培地と取り替え非付着細胞を除去した。次に、大動脈分節を取り出し、ガ ラススライド上に載せ、各分節の少なくとも３０部位から上方蛍光顕微鏡下で付 着細胞を計数した。 結果． 単球のウサギ大動脈内皮細胞への付着．ＷＥＨＩ78/24細胞を正常ウ サギ大動脈内皮細胞へ曝露すると本生体外接着分析において最少の細胞結合がも たらされる。しかしながら、ＷＥＨＩ細胞を高コレステロール血症ウサギ（Ｃｈ ｏｌ；ｎ＝７）からの大動脈内皮細胞とインキュベートした場合、細胞結合はＣ ｏｎｔ（ｎ＝７）に比べて３倍増大した。高コレステロール血症ウサギの大動脈 内皮細胞によって現れた細胞結合の増加は、Ｌ−アルギニン補充によって著しく 減少した。（図３）３つのグループの各々のＣｏｎｔウサギ（ｎ＝２）から新し く単離した単核細胞で接着分析を同時に行った場合、同様の結果が得られた。 内皮細胞の接着に対する長期ＮＯシンターゼ阻害の影響． 内皮細胞−単球相 互作用をモジュレートするのに内皮細胞由来ＮＯの役割を調べるために、賦形剤 （ｎ＝５）又はＮＯシンターゼインヒビター、Ｌ−ＮＡ（ｎ＝５）で補った正常 食を与えたウサギからの胸部大動脈を用いて更に一連の結合実験を行った。Ｌ− ＮＡウサギからの大動脈内皮細胞とインキュベートした場合に対照内皮細胞と比 べてＷＥＨＩ細胞の付着が著しく増加した。この作用は、ヒドララジンの併用投 与が血圧を正常化したがＬ−ＮＡによって誘導された細胞結合の増加を逆転しな かったのでＬ−ＮＡに起因する高血圧症に寄与されなかった。 別の一連の実験においては、Ｌ−ＮＡ（ＮＯシンターゼのインヒビター）の長 期投与が賦形剤又はアルギニンで処理したウサギからの血管に比べて血管壁から のＮＯの生成及び遊離を著しく阻害した（化学発光で測定した）ことを確認した 。 本実験の顕著な知見は、１）単球の内皮細胞への生体外結合は高コレステロー ル血症ウサギからの血管で増加する；２）この単球結合の増加はＮＯ前駆物質Ｌ −アルギニンで長期処理した高コレステロール血症ウサギで減少する；３）単球 の内皮細胞への結合はＮＯシンターゼ拮抗薬Ｌ−ニトロアルギニンで処理した正 常コレステロール血症ウサギからの血管では増加する；及び４）ＮＯシンターゼ 拮抗のこの作用はヒドララジンを血圧を正常化するのに十分な投与量で投与する ことにより逆転しなかった。これらの知見は、ＮＯが単球−内皮細胞相互作用を 阻害する仮説と一致する。 結論として、高コレステロール血症によって誘発される内皮細胞接着の増加を 実験するために単球結合の生体外モデルが用いられた。内皮細胞の接着がＮＯ前 駆物質Ｌ−アルギニンの経口投与によって減少することが示される。反対に、ニ トロアルギニンの経口投与でＮＯシンターゼ活性を阻害すると生体外単球に対す る内皮細胞の親和性が増大する。データは、内在性抗アテローム形成分子である ＮＯと一致する。 実施例５． 経口アルギニンは高コレステロール血症ウサギにおけるアテロー ム性動脈硬化症の退縮をもたらす： 我々の以前の研究により、経口アルギニンが高コレステロール血症動物の硬化 巣の発生を予防することができることが証明されたが既存の硬化巣がアルギニン 治療によって影響されるかは未知であった。アルギニンがヒトにおいて既存のア テローム性動脈硬化巣の治療に有効であるかは臨床上重要である。従って、ニュ ージーランドホワイト系ウサギ（ｎ＝８５）に正常食又は０.５％コレステロー ル食を１０週間投与した。引き続いて、高コレステロール血症ウサギの１／２に 飲料水中２.２５％(W/V)Ｌ−アルギニンを投与した。１０、１４、１８又は２３ 週目に胸部大動脈を回収した。大動脈の環を用いてアセチルコリン（ＡＣｈ）に 対 するＮＯ依存性血管拡張を評価した。賦形剤（ＣＨＯＬ）を投与した高コレステ ロール血症ウサギにおけるＡＣｈに対する最大弛緩は、５３．４％（１０週目） から１７.４％（２３週までに）に次第に減少した。ＣＨＯＬウサギからの大動 脈の管腔表面の面積測定から胸部大動脈の全表面の３０.３％（１０週目）から ５６.５％（２３週までに）に硬化巣面積の漸増がわかった。対照的に、アルギ ニン（ＡＲＧ）を投与した高コレステロール血症ウサギは、１４と１８週目に硬 化巣面積の減少と関連のある内皮細胞依存性弛緩の改善を示した。アルギニン処 理高コレステロール血症ウサギ全ての病巣表面積（１４〜２３週）は賦形剤処理 高コレステロール血症ウサギに比べて著しく減少した（図４）。内皮細胞依存性 弛緩のアルギニンによる改善は、血管ＮＯの生成増進及び血管スーパーオキシド アニオンの生成低下と関連があった。２３週までに７羽のＡＲＧウサギのうち３ 羽がＮＯ依存性血管拡張の改善を持続し、５.４％まで硬化巣面積の減少を更に 示した。 結論： 高コレステロール血症は、進行性内膜病巣形成と関連があるＮＯ依存 性血管拡張の進行性消失を誘導する。Ｌ−アルギニンを既存の内膜病巣をもつウ サギヘ投与すると血管ＮＯ生成を増進し、スーパーオキシドアニオン生成を低下 させ、硬化巣面積の減少と関連する。これは、ＮＯ活性の回復が既存の内膜病巣 の退縮を誘導することができる最初の証明であり、Ｌ−アルギニン治療が潜在的 な臨床上の利点を有することを証明する。 実施例６． 経口アルギニン投与は血管ＮＯ活性を回復させ、高コレステロー ル血症ウサギにおけるバルーン損傷後の筋内膜過形成を阻止する． 目的． 本実験の目的は、高コレステロール血症ウサギにおいてバルーン血管 形成術後の血管の機能と構造の変化が内在性酸化窒素（ＮＯ）活性の回復によっ て阻止されるかを求めることであった。 方法． ２８羽のニュージーランドホワイト系ウサギを無作為に３つの食餌ク ループに分け、正常なウサキ食、０.５％コレステロール食或いは飲料水中０.５ ％コレステロール食＋Ｌ−アルギニン塩酸塩（２.２５％W/V)を与えた。食餌介 入の６週間後、各ウサギの左腸骨動脈をバルーン血管形成術に供した。４週間後 、血管再活性実験及び免疫組織化学のために腸骨動脈を回収した。 結果． 生物分析実験から、内皮細胞由来ＮＯ活性か正常コレステロール血症 ウサギに比べて高コレステロール血症ウサギにおいて阻害されたことが示された 。アルギニンを投与すると内皮細胞由来ＮＯ活性が部分的に回復した。バルーン 血管形成術は、主に血管平滑筋細胞と細胞外マトリックスから構成される内膜肥 厚を誘導した。高コレステロール血症の硬化において、血管損傷は脂質満載マク ロファージの蓄積によって増加される高度増殖筋内膜病巣を誘導した。Ｌ−アル ギニンを投与すると病巣の定量的及び定性的変化か誘導された。アルギニン食は 、高コレステロール血症ウサギの損傷血管における内膜肥厚を減少させ、病巣に おけるマクロファージの蓄積を実質的に阻害した（図５）。 結論． 我々は、高コレステロール血症ウサギにおいてバルーン血管形成術に より誘導された病巣がアルギニンの経口投与により著しく減少することを報告す る。更に、病巣を含むマクロファージの割合の著しい減少によって病巣の性質を 変えることがわかる。高コレステロール血症は、アルギニンの長期経口投与によ り可逆的であるウサギ腸骨動脈における内皮細胞血管拡張機能障害を誘発する。 実施例７． 酸化窒素は単球化学走性タンパク質−１を調節する． 我々の以 前の実験から経口アルギニン投与が血管ＮＯ合成を増進させることが確立した。 この血管ＮＯ合成の増進は、血管壁での単球付着及び蓄積の阻止と関連があった （よって硬化巣の進行を遅らせ、退縮さえも誘導する）。“血管酸化窒素がどの ように血管壁での単球付着及び蓄積を阻止するか？”という疑問は依然として残 った。 単球化学走性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球の主要な化学走性因子で あると考えられる７６アミノ酸ケモカインである（化学走性因子は白血球を引き つけるタンパク質である）。我々は、ＮＯの抗アテローム形成作用が一部ＭＣＰ −１発現の阻止によるものであると仮定した。 方法及び結果． 平滑筋細胞（ＳＭＣ）を移植法によって正常なウサギ大動脈 から単離した。次に、細胞を酸化ＬＤＬ(３０μg/ml)(ＭＣＰ−１を合成するた めに血管細胞を誘導することが知られている)に曝露した。ＳＭＣ中のＭＣＰ− １の発現は、ＳＭＣによるスーパーオキシドアニオンの生成増進及び転写単離Ｎ ＦκＢの活性増大と関連がある。酸化ＬＤＬコレステロールのこれらの作用は全 てＳＭＣをＮＯ供与体ＤＥＴＡ−ＮＯＮＯａｔｅ(１００μＭ)へ予め曝露する ことにより低下した（ｐ＜０．０５)。ＮＯが転写レベルでその作用を及ぼすか を求めるために、ＳＭＣとＣＯＳ細胞を４００ｂｐ断片のＭＣＰ−１プロモータ ーでトランスフェクトした。ｏｘＬＤＬによるプロモーター活性増大がＤＥＴＡ −ＮＯによって阻害された。 ＭＣＰ−１の生体内調節における内在性ＮＯの役割を調べるために、ＮＺＷウ サギに正常食、正常食＋ニトロ−Ｌ−アルギニン(Ｌ−ＮＡ)(血管のNO合成を阻 害する ために）、高コレステロール食（Ｃｈｏｌ）又はＬ−アルギニンで補った 高コレステロール食(Ａｒｇ)(ＮＯ合成を増進するために)を与えた。２週間後、 胸部大動脈を回収し、全ＲＮＡを単離した。ノーザン分析により、ＣｈｏｌとＬ −ＮＡの大動脈中のＭＣＰ−１の発現増強か証明された。この発現はＡｒｇウサ ギからの大動脈では減少した。これらの実験は、ＮＯの抗アテローム形成作用が ＭＣＰ−１発現阻害によって一部仲介されることを意味する。ＮＯは血管細胞に よるスーパーオキシドアニオンの生成を抑制し、よってＭＣＰ−１発現を活性化 する酸化剤応答転写経路（即ち、ＮＦκＢ仲介転写）を止める。 実施例８． 酸化窒素はアテローム性動脈硬化症に関与することか知られてい る内皮細胞接着分子の発現を阻害する． 血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）は、単球を結合する内皮細胞接着分子であ る。この分子は、高コレステロール血症動物の内皮細胞によって発現し、動物及 びヒトにおいて硬化巣の上にある内皮細胞によって発現する。この接着分子は、 硬化巣の発生中血管壁での単球付着と蓄積に関与すると考えられる。他の研究者 らは、この分子の発現が転写因子ＮＦκＢによって仲介される酸化剤応答転写経 路によって調節されることを示した。酸化ＬＤＬコレステロール（又はＴＮＦ− αのようなサイトカイン）に曝露した内皮細胞は、スーパーオキシドアニオンを 生成し始める。スーパーオキシドアニオンは、酸化剤応答転写を起こさせ、ＶＣ ＡＭ−１及びＭＣＰ−１（及びおそらくアテローム性動脈硬化症に関与する他の 遺伝子）の発現をまねく。我々のデータは、ＮＯがスーパーオキシドアニオンの 生成を抑制し、よってこれらの酸化剤応答転写経路を止めることを意味する。 方法及び結果： ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の集密的単層を静置又は液 流条件に４時間曝露した（液流は内在性酸化窒素の生成を促進する）。次に、培 地を取り替え、細胞を天然ＬＤＬ（５０μg/ml）、酸化ＬＤＬ(３０μg/ml);又 はＬＰＳ（１０ng/ml）＋ＴＮＦ−α（10U/ml）と更に４時間インキュベートし た。次に、ＴＨＰ−１単球を使用する機能性結合分析を行った。ＨＡＥＣによる スーパーオキシド生成をルシゲニン化学発光によりモニターし、接着分子ＶＣＡ Ｍ−１及びＩＣＡＭ−１の発現をフローサイトメトリーで定量した。天然ＬＤＬ はほとんど効果がなかったが、ｏｘＬＤＬ或いはＬＰＳ／ＴＮＦとのインキュベ ーションはスーパーオキシド生成、ＮＦ−κＢ活性、ＶＣＡＭ−１発現及び単球 の内皮細胞付着を著しく高めた。液流に予め曝露すると単球の内皮細胞付着（図 ６）及びサイトカイン又は酸化リポタンパク質への曝露のその他の続発症が阻止 された。液流の作用は、Ｌ−ニトロアルギニンとの同時インキュベーションがこ れらの液流の作用を完全に無効にするので酸化窒素の剪断による遊離によるもの であった。更に、ＮＯ供与体ＰＡＰＡ−ＮＯＮＯａｔｅは液流の作用に似ていた 。 結論． 液流に予め曝露するとサイトカイン又はリポタンパク質刺激内皮細胞 スーパーオキシド生成、ＶＣＡＭ−１発現及び単球結合が減少した。液流の作用 は少なくとも一部酸化窒素によるものである。NOはスーパーオキシドアニオンの 内皮細胞生成の調節に関与し、よってアテローム形成に関与する遺伝子（即ち、 ＶＣＡＭ−１及びＭＣＰ−１）の酸化剤応答転写を阻害する。 実施例９． ＮＯシンターゼをコード化する遺伝子をトランスフェクとすると ＮＯ生成が増進されかつ単球付着が阻止される． 下記の実施例は、ＮＯシンターゼ(ＮＯを生成する酵素）をコードする遺伝子 の移入が酸化窒素の生成を増進し、よって単球の付着を阻止するかを求めるため に行った。培養した内皮細胞（ｂＥｎｄ−３；マウス内皮細胞系）をリポフェク タミンリポソーム法を用いてＮＯシンターゼ遺伝子をコード化するプラスミド構 築物でトランスフェクトした。４８時間後、化学発光を用いて酸化窒素の生成を 測定した。酸化窒素の生成は、ＮＯシンターゼ構築物でトランスフェクトした細 胞では２倍に増加した（対照構築物でトランスフェクトした細胞では増加しなか つた）。同時にマウスモノサイトイド細胞系を用いて結合分析を行った。モノサ イトイドの内皮細胞への結合は、ＮＯシンターゼ構築物でトランスフェクトした 細胞では３０％だけ減少した。 結論： ＮＯシンターゼ遺伝子を含むプラスミド構築物でトランスフェクトし た内皮細胞は、より多くの酸化窒素を生成することができた。酸化窒素の生成増 進は、内皮細胞への単球結合の阻害と関連があった。 実施例１０． 血管平滑筋細胞の増殖に対するＮＯシンターゼ発現の影響： 集密的静止状態の条件下で培養したラット大動脈血管平滑筋細胞を実験した。効 率のよいウイルスコートタンパク質仲介ＤＮＡ移入法を用いてβ−アクチンプロ モーターとＣＭＶエンハンサーによって進行するＮＯシンターゼ遺伝子で細胞を トランスフェクトした。これにより、対照ベクタートランスフェクト細胞と比べ てＮＯシンターゼ活性の増大（アルギニン→シトルリン変換分析で測定した）が 得られた。ＮＯシンターゼ遺伝子をトランスフェクトすると対照ベクタートラン スフェクションと比べて血清促進ＤＮＡ合成が完全に消失した。これらの結果は 、ＮＯシンターゼの発現増強（ＮＯ生成増進と関連かある）が血管平滑筋細胞の 過度の増殖を抑制することを示した。この抑制作用は、アテローム性動脈硬化症 及び再狭窄症の治療と相関することができる。 実施例１１． ＮＯシンターゼｃＤＮＡを用いる遺伝子治療は再狭窄症を予防 する． 上記の実験は、ＮＯが血管平滑筋細胞の増殖を抑制することを示した。アテロ ーム性動脈硬化症及び再狭窄症においては、血管平滑筋細胞の過度の増殖は病巣 形成の原因となる。アテローム性動脈硬化症及びカテーテル介入後の内皮細胞に 対する損傷は、ＮＯの健康的な影響を低下又は除去することは明らかである。下 記の実験は、ＮＯシンターゼの遺伝子の血管壁への送達か病巣形成を阻止するこ とを示すものである。 内皮細胞型ＮＯシンターゼ（ＥＣ−ＮＯＳ）のｃＤＮＡをコード化するプラス ミド構築物を合成した。ＥＣ−ＮＯＳをコード化する全長ｃＤＮＡをｐＵＣｃａ ｇｇｓ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。スプラグ・ダウレイラットの 頸動脈のバルーン血管形成術を行い、ＥＣ−ＮＯＳｃＤＮＡをコード化するプラ スミドを含むＨＶＪ−リポソームを注入するか又はＥＣ−ＮＯＳを欠くプラスミ ド（対照ベクター）を注入した。４日〜２週間後、ラットを犠牲にし、１）組織 形態測定；２）ＤＮＡ合成の測定；及び３）生物分析及び化学発光によるＮＯ合 成と遊離の生体外定量のために頸動脈を回収した。 結果． 損傷の２週間後の形態測定から、対照ベクター処理（Ｉｎｊ＋ＣＶ） 又は未処理（Ｉｎｊ）損傷血管と比べてＥＣ−ＮＯＳ処理（Ｉｎｊ＋ＮＯＳ）の 内膜病巣の厚さの著しい（６８％）減少がわかった。ブロモデオキシウリジンを 用いる損傷の４日後にＤＮＡ合成の測定を行った。ＥＣ−ＮＯＣトランスフェク ションは、対照ベクター処理又は未処理損傷血管と比べてブロモデオキシウリジ ンの取込みを著しく制限した（２５％だけ）。血管分節をＮＯ遊離の生物分析に 対する器官チャンバ法を用いて生体外で実験した。カルシウムイオノホアは細胞 内カルシウムを増加させ、ＮＯシンターゼを活性化してＮＯを生成する。カルシ ウムイオノホアは、対照ベクターでトランスフェクトした損傷頸動脈の弛緩を非 損傷血管のわずか１５％誘導した。ＥＣ−ＮＯＳでトランスフェクトした損傷動 脈は、かなりの程度まで非損傷血管に見られるものの約５０％まで弛緩した。培 地へ遊離したＮＯの直接測定（化学発光で）により、損傷組織で遊離したＮＯ（ 対照ベクターでトランスフェクトした）は正常な非損傷組織で遊離したもののわ ずか２０％であることがわかった。対照的に、ＥＣ−ＮＯＳでトランスフェクト した損傷組織は多くのＮＯを遊離した（正常の約７５％）。 結論として、ラット頸動脈のバルーン血管形成術はＮＯの内皮細胞源を除去し 、過度の血管平滑筋ＤＮＡ合成と増殖を誘導し、内膜の病巣を生じる（再狭窄症 ）。バルーン損傷時に血管をＥＣ−ＮＯＳでトランスフェクトすると血管による ＮＯ生成が部分的に回復し、これはＤＮＡ合成の低下と関連があり、よって病巣 形成を減少させる。これらの結果は、ＮＯが内在性抗アテローム形成分子である 結論と一致する。 実施例１２． Ｌ−アルギニンの血管壁への局所適用は筋内膜過形成を阻止す る： 以前の実験からアルギニンを経口投与すると血管ＮＯ活性か増大しかつ高コレ ステロール食及び／又は血管損傷（バルーン血管形成術による）で誘発した病巣 形成か阻止されることがわかった。バルーン血管形成術時に血管璧にアルギニン を管腔内適用すると病巣形成が阻止されるかを求めるために下記の実験を行った 。 ウサギ（ｎ＝７）に１％コレステロール食を与えた。１週間後、腸骨動脈の血管 形成術を行った。１本の腸骨動脈の血管形成後、局所注入カテーテルを用いて損 傷面を高濃度のアルギニン（6mM）に曝露した。その他の腸骨動脈をバルーン血 管形成術に供したが局所注入で処理しなかった。４週間後、血管を回収し、動脈 の分節を組織形態測定用に処理した。アルギニン処理血管の最初の肥厚は、著し く減少した（図８）。本実験は、高投与量のアルギニンの管腔内局所適用すると 血管損傷後の筋内膜過形成が減少されることを意味する。 実施例１３． 測定結果の原因となる高窒素又はカロリーバランスの影響の排 除． これらの結果の原因として窒素又はカロリーバランスに対するＬ−アルギニン の影讐を排除するために、６匹の動物にメチオニン食を６倍増加するようにメチ オニンで補充した１％コレステロール食餌を与えた。１０週間後、血小板及び血 管再活性、及び組織形態測定の実験用に動物を犠牲にした。内皮細胞依存性弛緩 、血小板凝集及び動脈内膜肥厚は、１％コレステロール食餌のみを与えた動物と 差かなかった。これらの結果から、他のアミノ酸、メチオニン（ＮＯの前駆物質 ではない）がアミノ酸Ｌ−アルギニンの作用と似ていないことが示される。従っ て、Ｌ−アルギニンの作用はアミノ酸投与の他の作用（即ち、窒素又はカロリー バランスの変化）よりもむしろ酸化窒素に対する代謝によると思われる。 実施例１４． Ｌ−リシンはＮＯ活性を増大しかつアテローム形成を阻止する ． Ｌ−リシンは、Ｌ−アルキニンのような塩基性アミノ酸であるが、ＮＯに対す るＮＯシンターゼによって代謝されることは不明である。従って、下記の結果は 予想されなかった。ニュージーランドホワイト系ウサギに正常食又は高コレステ ロール食を与えた）ｎ＝１８）。コレステロール食のウサギの１／２に経口Ｌ− リシンを投与した。１０週間後、胸部大動脈を回収し、血管ＮＯ合成を生物分析 し、病巣形成を評価する組織形態測定を上記のように行った。Ｌ−リシンの投与 は、内皮細胞依存性血管弛緩によって評価される高コレステロール血症ウサギの 血管ＮＯ活性を増大させるＬ−アルギニンと同じ位に有効であった。（図９）血 管ＮＯ活性の改善は、血管病巣形成の著しい減少と関連があった。 本実験から、Ｌ−リシンが血管ＮＯ活性を増大しかつアテローム性動脈硬化症 を阻止することができるという予想できない結果が示された。 実施例１５． 経口Ｌ−アルギニンは高コレステロール血症ヒトの単球接着を 正常化する 単球の内皮細胞への付着は、アテローム性動脈硬化症の発生の最初に観察でき る事象である。我々は、Ｌ−アルギニンを高コレステロール血症ヒトヘ長期経口 投与すると内皮細胞由来ＮＯの生成が増進され、よって単球と内皮細胞との相互 作用が阻害されると仮定した。この実験において、我々は、ヒト単球の培養した 内皮細胞への結合の再現性のある分析を開発し、この相互作用に対する高コレス テロール血症及びＬ−アルギニン処理の影響を調べた。 本実験の対照被検者集団としては、平均年齢３７±２歳の１２人の正常な志願 者が含まれた。正常は、入念な病歴、物理的試験及び実験分析によって求めて血 液、腎又は肝の機能障害又は臨床上明らかなアテローム性動脈硬化症をもつ個体 を排除した。２４０mg/dlより大きい総血漿コレステロール及び１６０mg/dlより 大きいＬＤＬコレステロールレベルによって定義された高コレステロール血症を もつ患者は２０人（男性１０人、女性１０人）であった。これらの個体は平均年 齢５１±２歳であった。被検者は全貢、利尿剤、血管作動性薬剤、抗血小板又は 低脂血症性薬剤を用いていなかった。本実験は、スタンフォード大学メディカル リサーチのヒト被検者に関する管理団によって承認され、各被検者は実験に人る 前にインフォームド・コンセントの書類を作成した。空腹状態の各被検者から血 液を採取した。 我々は、クエン酸塩加静脈血からヒト単球を単離した。その血液を遠心分離し 、軟層を除去し、ＨＢＳＳで再懸濁した。次に、その懸濁液を１.０６８−ｄヒ ストパックのクッションに注意深く加層し、遠心分離した。遠心分離した後、単 球を吸引した。 我々は、形質転換内皮細胞（ＥＣ）系、ｂＥｎｄ３を用いて単球−内皮細胞生 体外結合を調べた。ｂＥｎｄ３細胞は、内皮細胞接着分子を発現し、ヒト臍帯血 内皮細胞で見られるものと同様の速度論でサイトカン誘導方法で単球を結合する 。内皮細胞単層を含む血管壁に単球を加えて最終細胞数３×１０⁶/mlに達した。 ある実験では、結合分析前に単球をナトリウムニトロプルシッド（ＮＯ供与体） に ３０分間試験管内で曝露した。 ６ウェルプレートをロッキングプラットホームに移し、室温で３０分間揺すっ た。３０分後、細胞懸濁液を各ウェルから吸引し、次に、ウェルを結合バッファ ーで洗浄して非付着単球を除去した。付着細胞のビデオ顕微鏡計数を、画像分析 装置を備えたコンピュータを用いて行った。 結果． Ｌ−アルギニン（１日７ｇ２週間）を高コレステロール血症ヒトに経 口投与すると血漿アルギニン値が６０％だけ高くなる（７９±１０mMから１２８ ±１２mMまで；ｎ＝７）が、プラセボ処理（ｎ＝３）及び正常コレステロール血 症（ｎ＝６）のグループのＬ−アルギニン値は変わらなかった。経口Ｌ−アルギ ニンを投与すると生化学又は血液学パラメーターのいずれも影響を及ぼさず、十 分に許容した。経口Ｌ−アルギニンは、総コレステロール又はＬＤＬコレステロ ールを下げなかった。２人の患者を実験から除いた。１人は丸剤を服用したくな いためであり、１人は実験中口腔ヘルペスの再活性化のためである。 付着分析の結果は、非常に再現性のあるものであった。高コレステロール血症 個体由来の単球により、正常な個体からの細胞に比べて結合細胞/hpfの５０±８ ％の増加が証明された（ｐ＜０.０００１）。付着程度は、ＬＤＬコレステロー ルの血漿レベルと相関があった（Ｒ＝０.７、ｎ＝３３；ｐ＜０.０００１；図１ ０）。 オープン標識実験においては、３人の高コレステロール血症個体を経口Ｌ−ア ルギニン補充で２週間処理した。アルギニン治療により単球付着の３８％減少が もたらされた。 このＬ−アルギニン治療の効果を確認するために及び実験の偏りを抑えるため に、二重盲検、プラセボ対照、無作為実験を行った。１０人の高コレステロール 血症被検者をプラセボ又はＬ−アルギニン治療に対して無作為化した（１：２） 。同時に６人の正常コレステロール血症個体を結合分析の経時変化の対照に対し て実験した。ベースラインでは双方の高コレステロール血症グループからの単球 の付着は、正常コレステロール血症個体に比べて増加した（ｐ＜０.００１）。 Ｌ−アルキニン投与の２週間後、単球結合が５３％絶対減少した(ｎ＝７、ｐ＜ ０.００５、ベースラインvs２週間)(図１１)。対照的にプラセボで治療した高コ レステロール血症個体から単離した単球の接着の著しい変化はなかった。Ｌ− アルギニン治療の中断の２週間後、高コレステロール血症個体から単離した単球 の接着は正常コレステロール血症個体に比べて著しく増加し（結合細胞/hpfの増 加３４±９％；ｐ＜０.０５)、Ｌ−アルギニン治療の２週間後に得られた結合に 比べても著しく増加した（３０±９％の増加、ｐ＜０.０５）。プラセボ治療高 コレステロール血症個体からの単球の接着は、ウオッシュアウト時間で著しい変 化はなかった。 ある実験では、単球をナトリウムニトロプルシッド又は賦形剤対照に試験管内 で３０分曝露した。高コレステロール血症個体からの細胞をＮＯ供与体ナトリウ ムニトロプルシッド(１０^-5M)と前インキュベートすると結合が著しく減少した （１６４±９％vs９８±７％賦形剤vsナトリウムニトロプルシッド；ｎ＝７、ｐ ＜０.０００５；数値は賦形剤に曝露した正常コレステロール血症対照の％とし て表した；図１２）。 結諭として、本実験の顕著な知見は、１）高コレステロール血症は内皮細胞に 対する単球の接着を亢進する、２）経口アルキニン補充は高コレステロール血症 個体からの単球の接着の増加を逆転する、及び３）経口アルギニンの効果は試験 管内で高コレステロール血症個体からの単球をナトリウムニトロプルシッド、Ｎ Ｏ供与体に曝露することにより似ているというものである。 実施例１６．高コレステロール血症ヒトにおける血小板高凝集性： 経口Ｌ− アルギニンによる逆転 本実験においては、我々は長期Ｌ−アルギニン補充が高コレステロール血症ヒ トの血小板再活性を阻害するという仮定を試験した。多血小板血漿の単離及び凝 集測定のために正常（ＮＣ；ｎ＝１１）及び高コレステロール血症（ＨＣ；ｎ＝ ２２）志願者から静脈血を採取した。HCグループの１／２にＬ−アルギニン(７g /d)を２週間与え、処理の２週間前後にコラーゲン（５mg/ml）を用いて凝集測定 を行った。 結果： ＨＣ血小板は高凝集性であった。２週間のＬ−アルキニン後、ＨＣ血 小板の凝集性は低下した（図１３）。これらの実験は、Ｌ−アルギニンの経口投 与が血小板再活性を阻害するという動物における我々の以前の所見と一致した。 実施例１７．Ｌ−アルギニンの静脈内投与は高コレステロール血症ヒトにおけ る内皮細胞依存性血管拡張を改善する： 高リポタンパク血症は、アテローム性動脈硬化症の発生の前でさえ内皮細胞依 存性血管拡張を損傷する。我々は、Ｌ−アルギニンの投与がＮＯ合成を増進し、 よって高コレステロール血症の内皮細胞依存性血管拡張を改善すると仮定した。 実際に、コレステロール食ウサギで行った我々の前の実験はこの概念を支持して いる。下記のデータは、Ｌ−アルギニンが前腕抵抗血管の内皮細胞依存性血管拡 張を増大させることを証明するものである。 本実験における対照被検者集団は、（男性１０人及び女性１人）を含む１１人 の正常な志願者が含まれた。年齢の範囲は３１〜４９歳であり、平均３９±２歳 であった。高コレステロール血症をもつ患者は１４人であった。高コレステロー ル血症は、パーセンチル７５より大きい血清ＬＤＬコレステロールレベルとして 定義した。これらの個体は男性１１人及び女性３人が含まれ、年齢２２〜４８歳 で平均３８±２歳であった。 局所麻酔及び滅菌条件下で、血圧測定及び薬剤注入のために各被検者の上腕動 脈にポリエチレンカテーテルを挿入した。Ｌ−アルギニン注入のために肘前静脈 に別のポリエチレンカテーテルを挿入した。目盛の付いたシラスチック中水銀ひ ずみゲージを用いて静脈閉塞ひずみゲージプレチスモグラフィによって左右の前 腕血流量を求め、ml／１分あたりの組織１０Ｏmlとして表した。 ＮＯ依存性血管拡張を評価するために、上腕動脈によって塩化メタコリン（内 皮細胞を誘発してＮＯを遊離する）を投与した。濃度０.３、３及び10μg/分の 塩化メタコリンの注入中に各３分間前腕血流量を測定した。 塩化メタコリン注入の完了後、正常な被検者全員及び高コレステロール血症を もつ１０人の個体にＬ−アルギニンを３０分かけて静脈内投与し、次に、メタコ リン注入を繰り返した。Ｄ−アルギニン、Ｌ−アルギニンのエナンチオマーはＮ Ｏの前駆物質ではない。従って、Ｌ−アルギニンの測定効果がＮＯ合成の寄与の ためであり物理化学的性質に比べて二次的なものでないことを確かめるために高 コレステロール血症をもつ５人の個体にＤ−アルギニンを静脈内投与した。 結果． ベースライン血圧、心拍数及び前腕血流量は、正常及び高コレステロ ール血症被検者間で差がなかった。塩化メタコリンの動脈内注入は、前腕血流量 の用量依存性増加を引き起こした。しかしながら、高コレステロール血症被検者 においては、コリン作動性血管拡張が正常な被検者より少なかった（ｐ＜０.０ ５）。正常な被検者でのメタコリンに対する最大前腕血流量応答は、１９.０± １.９ml／組織１００ml／１分であり、高コレステロール血症被検者では１３.７ ±１.７ml／組織１００ml／１分であった（ｐ＜０.０５）。 正常な被検者においては、Ｌ−アルギニンは塩化メタコリンの投与中に生じる 血管拡張を増強しなかった。しかしながら、高コレステロール血症被検者におい ては、Ｌ−アルギニン注入は塩化メタコリンに対する血管拡張を２５％だけ増大 した（ｐ＜０.０５）。合併症又はＬ−アルギニン注入の副作用はなかった。 本実験における重要な知見は次のことである。（ａ）内皮細胞依存性血管拡張 （ＮＯ遊離による）は高コレステロール血症ヒトの前腕抵抗血管では減少する； （ｂ）Ｌ−アルギニンの静脈内投与はこれらの個体において内皮細胞依存性血管 拡張を改善する。高コレステロール血症ヒトにおいて、ＮＯは血管拡張をもたら すだけでなく血小板凝集を阻止しかつ単球付着を抑制する。 実施例１８． 静脈内Ｌ−アルギニンの投与は心臓移植ホストにおける冠動脈 内皮細胞機能を改善する 冠動脈ＮＯ依存性血管拡張の低下は、心臓移植ホストに起こり、移植アテロー ム性動脈硬化症の発生の初期マーカーを表すことができる。アセチルコリンに応 答したＮＯ依存性血管拡張の低下は、内皮細胞機能障害の指標であり、内皮細胞 由来酸化窒素の合成低下又は分解促進によるものであった。我々は、冠動脈同種 移植アテローム性動脈硬化症の初期段階の心外膜冠動脈の内皮細胞機能障害がＬ −アルギニンによって逆転されると仮定した。本実験は、Ｌ−アルギニン、内皮 細胞由来ＮＯの前駆物質を投与すると冠動脈導管及び抵抗血管の内皮細胞血管拡 張機能が改善されるという仮説を試験した。 スタンフォード大学病院の一年の選択的冠動脈造影法に予定された心臓移植ホ ストについて実験における参加の可能性を選別した。実験プロトコールは、メデ ィカルリサーチ内のヒト被検者に関するストンフォード大学委員会によつて承認 された。患者は全員インフォームド・コンセントの書類を作成した。１〜１３歳 の以前に心臓移植した８人の患者を実験した。 実験の少なくとも１２時間前に血管作動性薬剤を中断した。診断用血管造影が 肉眼で明白な冠動脈狭窄症を示さなかった後に、ガイド用カテーテルを用いて左 主冠動脈にカニューレを挿入した。次に、注入カテーテルをドップラー流動速度 ガイドワイヤを用いてアセチルコリン（内皮細胞を剌激してＮＯを遊離する）の 注入のために冠動脈の非分枝節に進めた。ベースライン血管造影法を行った後、 増加量のアセチルコリンを３分間かけて連続注入した。最大投与量（１０^-4モル /l）に達するまで又は全冠動脈閉塞が生じるまでアセチルコリンの注入を続けた 。次に、Ｌ−アルギニンの静脈内注入（１５分間かけて３０ｇ）を行った。その 後、アセチルコリンの冠動脈内注入を繰り返した。冠動脈血管造影及びドップラ ー流動速度の記録を、Ｌ−アルギニン注入の終わりに及び各濃度のアセチルコリ ンの注入後に行った。 結果． これらの移植ホストの心外膜冠動脈において、アセチルコリンが血管 収縮を引き起こした。アセチルコリンによって引き起こされた心外膜冠動脈血管 収縮は、Ｌ−アルギニンの注入(１０^-4モル/l、−６.８％vs−２.８％；ｐ＜０. 1)によって減少した。冠動脈抵抗血管においては、アセチルコリンによる血管拡 張は血流量の増加によって反映した。冠動脈血流量の増加は、Ｌ−アルギニンで 著しく増強された（ｐ＜０.００２；図１４）。合併症又はＬ−アルギニン注入 の副作用はなかった。 心臓移植ホストの冠動脈血管系は、ＮＯ依存性血管拡張の普遍的低下を示す。 Ｌ−アルギニンは、冠動脈微小血管系と心外膜冠状動脈双方の内皮細胞由来ＮＯ 依存性血管拡張を改善する。 上記の結果から、酸化窒素経路における酸化窒素前駆化合物又は他の化合物に よって血管変性疾患をもつ患者にかなりの利点が生じることは明らかである。こ の治療は、正常な血管張力を回復させ（過度の血管収縮及び血圧の上昇を予防し ；心臓、脳及び他の重要な組織への血流量を改善し、よって運動許容量を高めか つ狭心症又は脳虚血のような症状を免荷する）；アテローム性動脈硬化巣及び再 狭窄の形成を減少させる（単球及び血小板の付着を阻止し、血管平滑筋細胞の増 殖を低下させることによる）。ＮＯは運動仲介血管拡張に決定的に関係し、ＮＯ 合成の増進が正常な個体でさえ血流量及び運動能力を改善することができること か ら正常な個体にも利点が生じる。 所定の用法に基づいてホストに投与するか、又はホストの特に治療すべき部位 に穏やかな上昇レベルの酸化窒素を維持するように酸化窒素の生成の合成経路の 一成分の供給をホストに与えることによって硬化巣形成の出現率がかなり減少す る。これは種々の方法：酸化窒素生成と関連がある種々の化合物、例えば、Ｌ− アルギニン及び／又はＬ−リシンの所定の用法に従って経口投与することにより ;酸化窒素を直接又は内在性化合物、例えば、酵素の生理的作用の結果として生 成することができる化合物の所定の用法で部位に投与することにより；化合物の 組合わせを用いて、それらの作用によって酸化窒素の生成を生じることにより等 で達成される。これらの個々の投与は、独立して又は酸化窒素の生成と関連があ る他の化合物の用法と共に行われる。 また、酸化窒素の生成の合成経路の成分と関連がある遺伝子を導入するために 遺伝子操作が用いられ、かかる化合物の生成増進が酸化窒素の生成増進に対して 平衡にする効果がある。従って、本発明は、酸化窒素の合成又は作用を増強し、 酸化窒素の分解を低下させる複数の経路を提供し、よって血管病巣の形成を予防 しかつ再狭窄を阻止するために内在性酸化窒素の効果を高める。 本明細書に引用した全ての文献及び特許出願の記載は、各々の文献又は特許出 願の記載が具体的に及び個別に含まれるかのように本願明細書に含まれるものと する。 理解を明確にするために具体的な説明及び実施例によって上記発明を詳細に記 載してきたが、下記の請求の範囲の真意又は範囲を逸脱することなくある種の変 更及び修正が行われることは本発明の教示を考慮すれば当業者に容易に明らかで あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 ジャウ ヴィクター ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94022 ロス アルトス ヒルズ ドーン レーン 12101 (72)発明者 ギボンス ゲアリー エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94303 パロ アルト モーリス ドライ ヴ 3212 (72)発明者 シュワーザチャー スヴェリン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94025 メンロ パーク クリーランド プレイス ８ (72)発明者 リム タイ ティー シンガポール シンガポール ギルマン ハイツ ナンバー 16−43 ブロック １ イー (72)発明者 イェーウン アレン シー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94010 ヒルズボロー シュガー ヒル ドライヴ 85

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ヒトホストの血管系の機能と構造を改善する方法において使用するための組 成物であって、前記方法が 血管系における内在性ＮＯのレベルを高めるために自然食品源以外のものと して及び補充食としてＬ−リシン源の予防投与量を所定の用法に従って前記ホ ストに経口投与して血管機能を改善する段階 を含む、前記組成物。 2. 前記投与が、少なくとも１０重量％のＬ−リシン、及び合計重量で少なくと も５０％のＬ−リシンとＬ−アルギニンのアミノ酸、前記アミノ酸を少なくと も約４０モル％含むポリペプチド、又はその生理的に許容しうる塩を含む、請 求項１記載の組成物。 3. 前記ポリペプチドがＬ−アルギニンとＬ−リシンのオリゴペプチドである、 請求項２記載の組成物。 4. 前記投与がＬ−アルギニンを含む、請求項２記載の組成物。 5. 前記投与が１日０.５〜２５ｇの範囲の１日量で投与される、請求項４記載 の組成物。 6. 前記投与がカルシウム、アミノ酸吸収促進化合物、ＮＯシンターゼ活性の補 助因子、又は酸化防止剤の少なくとも１種を前記Ｌ−リシンの予防作用を増強 するのに十分な量で含む、請求項１記載の組成物。 7. 前記投与が錠剤、カプセル剤又は散剤として投与される、請求項１〜６のい ずれかに記載の組成物。 8. 前記投与が加工した固形食晶、補充食又は液体として投与される、請求項１ 〜６のいずれかに記載の組成物。 9. Ｌ−リシンが少なくとも１０重量％であるＬ−リシンとＬ−アルギニン、又 はその生理的に許容しうる塩を約０.５〜２５g、及びカルシウム、葉酸塩、Ｂ ₆又はＢ₁₂の少なくとも１種をヒトホストにおいてＮＯ量を増大させるときに 前記Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン又はその生理的に許容しうる塩の作用を増強 させるのに十分な量で含む生理的に許容しうる製剤。 10．血管系の損傷部位における血管平滑筋細胞の増殖を抑制する方法において使 用するための組成物であって、前記方法が 有効量のＬ−アルギニン、Ｌ−リシン又はその生理的に許容しうる塩の少な くとも１種、及び１０重量％以上の量のＬ−リシン又はその生理的に許容しう る塩を前記部位に投与してＮＯの生成を促進させる段階 を含み、よって血管平滑筋細胞の増殖が抑制される、前記組成物。 11．前記損傷が血管形成術の結果としてのものである、請求項10記載の組成物。 12．血管形成術又はアテローム切除術による損傷に起因する再狭窄の確率を低下 させる方法において使用するための組成物であって、前記方法が 酸化窒素前駆物質を、前記損傷の近位細胞の酸化窒素生成の量を増大させる ときに及びそのような量で前記損傷の部位の近位壁内に導入する段階 を含み、よって再狭窄の出現率低下が生じる、前記組成物。 13．前記酸化窒素前駆物質が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン又はＬ−アルギニン 及びＬ−リシンの少なくとも１種を含むオリゴペプチドの少なくとも１種であ る、請求項12記載の組成物。 14．前記時間が前記損傷のときでありかつ４週間後より遅くないときである、請 求項12記載の方法。