JP2000505417A - 単離チロシナーゼ由来ペプチドとその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は異常細胞表面上の、ヒト白血球抗原分子とチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体の同定に関する。この観察の治療及び診断上の効果が本発明の主題である。

Description

【発明の詳細な説明】 単離チロシナーゼ由来ペプチドとその利用方法関連出願 本出願は、１９９２年１２月２２日出願で現在放棄されている同時継続であっ た米国特許出願第９９４，９２８号の一部継続出願である、１９９３年４月２８ 日出願の同時継続米国特許出願第０５４，７１４号の一部継続出願である、１９ ９３年６月２３日出願で現在は米国特許第５，４８７，９７４号となっている同 時継続出願第０８／０８１，６７３号の一部継続出願である、１９９４年２月２ ８日出願の第０８／２０３，０５４号の一部継続出願である、１９９４年４月２ ６日出願で、現在許可されている第０８／２３３，３０５号の一部継続出願であ る。これらすべてが、参考文献として本出願にその内容が合体される。発明の分野 本発明は、チロシナーゼ由来で、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ４４分子によ って提示される単離ペプチドと、その利用方法に関する。更に、本発明は、その 異常細胞がこれらのペプチドとＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ４４との複合体を 提示する細胞異常によって特徴付けられる病気であると診断される個体を同定す る能力と、前記提示されるペプチド、およびその効果とに関する。背景および従来技術 哺乳類の免疫系が外来の又は異質の物質を認識して、それらと反応するプロセ スは複雑なものである。このシステムの重要な局面は、Ｔ細胞応答である。この 応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原(“ＨＬＡ”)、又は、主要組織適合遺伝子複 合体（“ＭＨＣ”）と称される細胞表面分子と、ペプチドとからなる複合体を認 識し、その複合体と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、ＨＬＡ／ ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセシングされるより大きな分子に由来す る。この点に関しては、メール（Male）他,Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company,1987),特にその６−１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体 の相互作用は制限されたものである。即ち、ＨＬＡ分子とペプチドとの特定の組 み合わせに対して特異 的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえその パートナー複合体が存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が 存在していても、それに特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。こ のメカニズムは、異物に対する免疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に 対する応答に関与している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへとプロセ シングされるメカニズムに関して多くの研究がなされてきている。この事につい ては、バリナガ（Barinaga）,Science257:880(1992);フリーモント（Fremont） 他,Science257:919(1992);マツムラ（Matsumura）他,Science257:927(1992);ラ トロン（Latron）他，Science 257:964(1992)を参照。 Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムはガンにも関係している。たとえば、 １９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公表で、参考文献として本 出願にその内容を合体させるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、一 つの遺伝子ファミリーが開示されておりそれらはプロセシングされてペプチドと なり、次に細胞表面に発現され、特異的なＣＴＬによって腫瘍細胞の溶解を引き 起こすことができる。これら遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」即ち“ＴＲＡＰ “分子をコードするものであると言われ、これら分子に由来するペプチドは、「 腫瘍拒絶抗原」即ち”ＴＲＡ”と称される。このファミリーの遺伝子についての 更なる情報に関してはトラヴァーサリ（Traversari）他，Immunogenetics 35:14 5(1992);ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他,Science 254:1643(1 991)を参照。 その開示内容を本出願に参考文献として合体させる米国特許第５，４０５，９ ４０号および第５，４６２，８７１号に於いて、ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノ ナペプチドが教示されている。前記参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定 のペプチドの特異性が判明すれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分子に対 して結合するが、他のＨＬＡ分子に対しては結合しないであろうと推測される、 ということを教示している。これは重要なことである。なぜなら、異なる個体は 異なるＨＬＡ表現型を有するからである。そのため、ある特定のペプチドが、あ る特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであると同定されたことが、診断上およ び治療上の効果を有しているとしても、その効果はその特定のＨＬＡ表現型を有 する個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表 現型に限られる ものではないため、また、標的化療法(targeted therapy)には、問題の異常細胞 の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、この分野に於いて更なる研究 を行う必要がある。 酵素チロシナーゼは、チロシンをジヒドロキシフェニルアラニン、即ち “ＤＯＰＡ”に変換する反応を触媒し、メラノサイトに選択的に発現されるよう に思われる（ミュラー（Muller）他，EMBO J 7:2715(1988))。前記ヒト酵素に対 するｃＤＮＡの初期の報告は、クウォン（Kwon）の米国特許第４，８９８，８１ ４号に見られる。ブチャード（Bouchard）他，J．Exp．Med．169:2029(1989)に よるそれより後の報告では、わずかに異なる配列を示している。それが色素異常 症に関連付けられていることから、この酵素に対する阻害剤を同定することに多 大な労力が投じられてきた。この文献のいくつかの具体例としてジンバウ(Jinbo w),WO9116302;ミシマ（Mishlma）他，米国特許第５，０７７，０５９号、および ナザロポール（Nazzaropor）米国特許第４，８１８，７６８号がある。当業者に は、類似の物質を教示するその他の参考文献も周知であろう。 １９９３年６月２３日出願で、参考文献として本出願にその内容を合体させる 米国特許出願第０８／０８１，６７３号は、チロシナーゼが、外来性の抗原又は ＴＲＡＰ分子と同様に処理され得ることを教示している。即ち、メラノーマ等の ある種の細胞異常に於いて、チロシナーゼがプロセシングされ、それに由来する ペプチドがある種の異常細胞上に於いてＨＬＡ分子と複合体を形成することが判 明したのである。これら複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞（“ＣＴＬ”)によって認 識され、その後、ＣＴＬが提示細胞を溶解することが判った。この驚くべき意外 な現象の効果が記載された。現在、同様にＨＬＡ-Ａ２分子によって提示される 腫瘍拒絶抗原として作用する別のペプチドが発見されている。これらは、１９９ ４年２月２８日出願で参考文献として本出願にその内容を合体させる第０８／２ ０３，０５４号に記載されている。 今回、チロシナーゼ由来のさらに別のペプチドが腫瘍拒絶抗原であることが判 明した。これらペプチドはＭＨＣ分子ＨＬＡ-Ｂ４４によって提示され、細胞溶 解性Ｔ細胞によって溶解される。図面の簡単な説明 図１は、細胞溶解研究をまとめて記載している。具体的には、 図１Ａは細胞ラインＬＢ２４−ＭＥＬの溶解を示す。 図１Ｂは細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬの溶解を示す。 図１Ｃは細胞ラインＬＢ４．ＭＥＬの溶解を示す。 図１Ｄは細胞ラインＳＫ２３．ＭＥＬの溶解を示す。 図１Ｅは細胞ラインＬＥ５１６．ＭＥＬの溶解を示す。 図１ＦはＨＬＡ−Ａ２発現を欠損した細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬ．１．２２ の溶解を示す。 図１ＧはＭＺ２−ＭＥＬの溶解がおこらないことを示す。 図１ＨはＮＫ標的Ｋ５６２に対する溶解研究を示す。 図１Ｉは図１Ｆの欠損変異株(loss variant)にＨＬＡ−Ａ２の遺伝子をトラン スフェクションした後の溶解を示す。 図１Ｊは患者(patient)ＳＫ２９からの自己ＥＢＶトランスフォームＢ細胞の 溶解を示す。 図２はＣＴＬ ＩＶＳＢのＴＮＦ放出の研究を示す。 図３はＣＴＬ２１０／９のＴＮＦ放出の研究を示す。 図４は配列番号２のペプチドが細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ−ＩＶＳＢに よって認識されるが細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９によっては認識され ないことを示す。 図５は配列番号２のペプチドが細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２１０／９ によっては認識されないことを示す。 図６は表面上にＨＬＡ−Ｂ４４を提示する細胞を含む、様々な細胞に対してＴ ＮＦ放出試験を行った際に得られた結果を示す。 図７は本出願に記載されるペプチドを使用した３つの異なる細胞ラインに対す る一連のクロム放出試験をまとめて示すものである。 図７Ａは配列番号４のペプチドを使用した実験を示す。 図７Ｂは配列番号５のペプチドを使用した場合の結果を示す。 図７Ｃは配列番号２を使用して得られた結果を示す。 図７において、記号“〇”は細胞ラインＴ２について用いられ、“■”はＨＬ Ａ−Ａ２を提示しないＭＺ２−ＭＥＬについて用いられ、そして“〇”はＨＬＡ −Ａ２を提示するようにトランスフェクトされたＭＺ２−ＭＥＬについて用いら れている。例１２にこれらの試験について詳述する。 図８Ａと８ＢはＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｂ４４を提示する細胞ラインと、細胞溶解 性Ｔ細胞クローン２２／３１（以下“ＣＴＬ２２／３１”と称する）とを使用し た研究を示す。図８Ａにおいて細胞ライン（“Ｒｏｓｉ ＥＢＶ”）はモノクロ ーナル抗体Ｗ６／３２とプレインキュベーションされ、一方、図８Ｂではプレイ ンキュベーションを行わなかった。 図９Ａと９ＢはＨＬＡ−Ａ２および／またはＨＬＡ−Ｂ４４ＭＨＣ分子を発現 する標的細胞に対してＣＴＬクローン２２／３１およびＩＶＳＢを使用した際に 得られた結果を示す。 図１０はＨＬＡ−Ｂ^★４４０２細胞に特異的なＣＴＬクローン３２９Ｂ／５、 およびＨＬＡ−Ｂ^★４４０３細胞ラインに特異的なＣＴＬ２２／３１を使用した 溶解研究を示す。 図１１はＣＴＬ３２９Ｂ／５を含むアッセイにおけるＴＮＦ放出の刺激に関す る実験結果を示す。これらはＣＴＬクローン３２９Ｂ／５がＨＬＡ−Ｂ^★４４０ ２提示細胞に対して高度に特異的であることを示す。好適実施例の詳細説明 例１ 長年にわたって研究者にとって利用可能であったメラノーマ細胞ライン ＳＫ２９−ＭＥＬ（文献においてはＳＫ ＭＥＬ−２９とも称される）と ＬＢ２４−ＭＥＬとを以下の諸実験において使用した。 単核血液細胞を含むサンプルを、患者ＳＫ２９（ＡＶ）およびＬＢ２４（これ らの患者はそれぞれＳＫ２９−ＭＥＬおよびＬＢ２４−ＭＥＬの供与源でもある ）から採取した。メラノーマ細胞ラインを、単核血液細胞含有サンプルに接触さ せた。これらの混合物について前記メラノーマ細胞ラインの溶解を観察した。こ の溶解は、 前記メラノーマ細胞によって提示されるペプチドと、ＨＬＡ分子とからなる複合 体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞（“ＣＴＬ”）がそのサンプル中に存在し ていたことを示すものである。 使用した溶解アッセイは、参考文献として本出願にその開示内容を合体させる ヘリン（Herin）他，Int．J．Cancer 39:390-396(1987)に依るクロム放出試験で あった。しかし、このアッセイについてここで説明しておく。標的メラノーマ細 胞を、イン・ヴィトロで成長させ、次に、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと３０％ＦＣＳ とを追加したＤＭＥＭ中に１０⁷細胞／ｍｌで再懸濁し、２００μＣｉ／ｍｌの Ｎａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄とともに３７℃で４５分間インキュベートした。標識された 細胞を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを追加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これ らを、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓと１０％ＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁し 、その後、１０³個の細胞を含む１００ｕｌのアリコットを、９６穴マイクロプ レートに分配した。ＰＢＬのサンプルを、同じ培地１００ｕｌ中で添加し、アッ セイを二連で行った。プレートを、１００ｇで４分間遠心分離し、５．５％ＣＯ₂ 雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。 プレートを再び遠心分離にかけ、上清の１００ｕｌのアリコットを、収集し、 カウントした。⁵¹Ｃｒ放出の百分率を以下のように計算した。 ここで、ＥＲは観察された、実験による⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは２００ｕｌの培地 のみの中で１０³個の標識された細胞をインキュベートすることによって測定さ れた自発的放出量、そしてＭＲは１００ｕｌの０．３％Ｔｒiｔｏｎ Ｘ−１０ ０を標的細胞に添加することによって得られる最大放出量である。 高いＣＴＬ活性を示した単核血液サンプルを、拡張し、限界希釈法によってク ローン化し、同じ手法を使用して再度スクリーニングした。 標的Ｋ５６２細胞をテストするのにも同じ手法を使用した。ＥＢＶ−トランス フォームＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を使用した時の唯一の相違点は、ＤＭＥＭ培 地を、 ５％ＦＣＳを追加したハンクス培地(Hank's medium)に置換したことであった。 これらの実験によって患者ＳＫ２９（ＡＶ）からＣＴＬクローン“ＩＶＳＢ” が、そして患者ＬＢ２４からＣＴＬクローン２１０／９が単離された。 図１のパネルＡ，Ｂ，ＧおよびＩにおいてこれらアッセイの結果を示す。具体 的には両方のＣＴＬが両方のメラノーマ細胞ラインを溶解し、Ｋ５６２およびＥ ＢＶ−Ｂ細胞ラインの溶解は起こらなかったことが理解されるであろう。例２ 前述のＣＴＬについて、それらの標的が他のメラノーマ細胞ラインにも共有さ れているかを判定するために、他のメラノーマ細胞ラインに対してテストした。 例１に記載されてるように、ラインＬＢ４．ＭＥＬ、ＳＫ２３．ＭＥＬ(ＳＫ ＭＥＬ−２３としても知られている)、およびＬＥ５１６．ＭＥＬについて溶解 の研究を行った。図１のパネルＣ，ＤおよびＥは前記クローンがこれらのライン を溶解したことを示す。 テストされたこれらラインはタイプＨＬＡ−Ａ２であることが知られており、 この結果は前記ＣＴＬがペプチドとＨＬＡ−Ａ２とからなる複合体に対して特異 的なものであることを示唆していた。この示唆はＨＬＡ−Ａ２発現を欠損してい る変異株であるＳＫ２９−ＭＥＬについてテストすることによって確かめられた 。図１のパネルＦはこれらの結果を示す。どちらのクローンもこのＨＬＡ−欠損 変異株を溶解しなかった。しかし、この変異株をＳＫ２９−ＭＥＬのＨＬＡ−Ａ ２遺伝子でトランスフェクトし、再テストした場合には溶解が観察された。従っ て、提示分子はＨＬＡ−Ａ２であると結論することができる。例３ 提示ＨＬＡ分子が同定されたので、提示ペプチド源である“腫瘍拒絶抗原前駆 体”即ち、“ＴＲＡＰ”分子と以後称される分子を同定するための研究を行った 。 これを行うために、トータルＲＮＡを、ＳＫ２９−ＭＥＬのサブクローンであ る細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬ．１から単離した。ＲＮＡは、周知の技術に従っ て、オリゴ−ｄＴ結合キットを使用して単離した。トータルＲＮＡを確保した後 、これ を、再び標準手法を使用してｃＤＮＡへと転写した。次に、製造業者の指示に従 って、前記ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩアダプターに結合させ、プラスミドｐｃＤＮ Ａ−Ｉ／ＡｍｐのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。次に、これらの組換えプ ラスミドを、ＪＭ１０１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にエレクトロポーレーションし た(エレクトロポーレーション条件：２５μファラドで１パルス、２５００Ｖ)。 前記トランスフェクトされた細菌を、アンピリシン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜 し、次に、それぞれが２００のクローンからなる７００のプールに分けた。分析 によると、約５０％のプラスミドがインサートを含んでいることが示されたので 、各プールは約１００種類のｃＤＮＡを代表するものであった。各プールを、飽 和するまで増幅し、プラスミドＤＮＡを、マニアティス（Maniatis）他，Molecu lar Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，N.Y.，1982)に従って 、アルカリ法、酢酸カリウム沈殿およびフェノール抽出によって単離した。セシ ウム勾配遠心法は使用しなかった。例４ 次に増幅させたプラスミドを真核細胞にトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細 胞のサンプルを、１０％ウシ胎児血清を追加したダルベッコ修飾イーグル培地 (Dulbecco's modified Eagles Medium)（“ＤＭＥＭ”）中で、組織培養平底マ イクロウェルに、１５，０００細胞／ウェルの割合で播種した。これらの細胞を 、３７℃で一晩インキュベートし、培地を除去し、次にこれを、３０μｌ／ウェ ルの、１０％Ｎｕ血清、４００μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストラン、１００μ Ｍクロロキン、１００ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２、および 、１００ｎｇの前述のｃＤＮＡライブラリーのプールのＤＮＡを含むＤＭＥＭ培 地と交換した。プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２とは、ＳＫ２９−ＭＥ Ｌ由来のＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含むものである。３７℃で４時間のインキュベー ション後、前記培地を除去し、これを、１０％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ５０μ ｌと交換した。この培地を２分後に除去し、これを、１０％のＦＣＳを追加した ＤＭＥＭ２００μｌと交換した。 この培地の交換後、ＣＯＳ細胞を、３７℃で４８時間インキュベートした。次 に、 培地を捨て、１０％のヒトプール血清を含む１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地中で 、２０００細胞の前述のＣＴＬクローンのいずれかを添加した。クローン２１０ ／９を使用した場合は、培地に２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を追加した。上清を２４ 時間後に取り出し、ＴＮＦ含量を、その開示内容を本出願に参考文献として合体 させるトラヴァーサリ（Traversari）他，Immunogenetics 35:145-152(1992)に 記載されている要領で、ＷＥＨＩ細胞に対するアッセイにおいて測定した。 ＩＶＳＢを用いてテストした７００のウェルのうち、６９６は０．６から ４ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ量を示した。残りの４つのウェルは１０から２０ｐｇ／ｍ ｌのＴＮＦを含有していた。ＣＴＬ２１０／９を用いてテストした相同するウェ ルについても、同様に明らかに高い値を示した。図２および図３はそれらのデー タを示す。例５ 高い産生を示すことが同定された前記４つのプールのうち３つ（番号“1２３ ”、“１８１”および“３８４”）を更なる実験のために選択した。具体的には 、細菌をクローン化し、各プールから５７０の細菌についてテストした。それら からプラスミドＤＮＡを抽出し、前述したものと同じ要領で新しいＣＯＳ細胞の サンプルにトランスフェクトし、そしてそれら細胞について再びＣＴＬ２１０／ ９およびＣＴＬ ＩＶＳＢの刺激についてテストした。プール１２３において１ つの陽性クローンが見つかり(“p１２３．Ｂ２”)、プール３８４において１つ の陽性クローンが見つかった(“ｐ３８４．Ｃ６”)。これらトランスフェクトさ れた細胞がＣＴＬによって認識されたという証拠は、ｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２遺 伝子とでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２のみでトランスフ ェクトされたＣＯｓ細胞との比較試験をおこなうことによって証明された。ＣＴ Ｌ上清におけるＴＮＦ放出はＷＥＨＩ細胞に対してテストすることによって測定 した。生き残ったＷＥＨＩ細胞の吸光度をＭＴＴを使用して測定した。結果を表 １に示す： ＷＥＨＩのＯＤ値は、ｃＤＮＡプラスＨＬＡ−Ａ２については２４ｐｇ／ｍｌの ＴＮＦに対応し、それに対してコントロールについては２．３ｐｇ／ｍｌに対応 している。 陽性クローンからプラスミドを取り出し、当業者に周知の技術に従って配列決 定した。シーケンスサーチによるとプラスミドのインサートは、参考文献として その開示内容を本出願に合体させるブチャード（Bouchard）他，J．Exp．Med．1 69:2029(1989)に記載されている、ヒトチロシナーゼに対するｃＤＮＡとほとん ど同一であることが明らかとなった。従って正常に存在する分子（即ち、チロシ ナーゼ）が腫瘍拒絶抗原前駆体として働き、プロセシングされてＨＬＡ−Ａ２と 結合して細胞表面上に提示されるペプチド腫瘍拒絶抗原を形成し、それによって ＣＴＬクローンによる溶解を刺激する可能性があると考えられる。同定された分 子の核酸配列を配列番号１に示す。例６ チョメス（Chomez）他，Immunogenetics 35:241(1992)によって報告された以 前の研究には、抗原性のペプチドをコードする配列を含む小さな遺伝子フラグメ ントがそのペプチドの発現をもたらすということが示されている。その開示内容 全体を本出願に参考文献として合体させるこの研究は、前述のヒトチロシナーゼ ｃＤＮＡおよび配列番号１の小部分をクローニングすることを示唆するものであ った。 例１−５において記載した方法を用いて、前記ｃＤＮＡの様々なフラグメントを ＨＬＡ−Ａ２に対する遺伝子とともにＣＯＳ−７細胞に同時トランスフェクショ ン し、そしてＴＮＦ放出試験を行った。これらの実験により、同時トランスフェク ション実験において使用した時に、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞に対して特異的である ことが示された前述の細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ ＩＶＳＢからのＴＮＦ 放出を引き起こす、約４００塩基対のフラグメントが同定された。使用されたこ の約４００塩基対のフラグメントは配列番号１の塩基７１１から１１５２に対応 する。このフラグメントがコードするアミノ酸配列を推定し、次にこの配列を、 参考文献としてその両方の開示内容全体を本出願に合体させるハント(Hunt)他,S cience 255:1261(1992)およびフォーク（Falk）他，Nature 351:290(1991)によ って提供されている情報と比較した。これらの参考文献はＨＬＡ−Ａ２提示ペプ チドのコンセンサス配列について論じている。具体的には、Huntはノナペプチド について論じており、このノナペプチドにおいて、ＬｅｕまたはＩｌｅが常に第 ２位置に見られ、 Ｌｅｕの方が“優位な残基(dominant residue)”であるとしている。第９残基は 常に脂肪族炭化水素側鎖を有する残基であると記載されている。Ｖａｌがこの位 置における優位な残基である。Huntは第２位置において強いシグナルを示すのは Ｌｅｕであり、中程度のシグナルを示すのはＭｅｔであり、第６位置においては Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＴｈｒのいずれかが、そして第９位置においては ＶａｌまたはＬｅｕ、この場合特にＶａｌが強いシグナルを示すと論じている。 比較に基づいて複数のノナペプチドを合成し、次にそれらがＨＬＡ−Ａ２提示細 胞を感作する(sensitize)ことができるかどうかを調べるためにテストを行った 。これを行うためチロシナーゼ欠損変異株細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬ １．２ １８およびＴ２０２ＬＢを使用した。様々な濃度のテストされるペプチドを細胞 溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ ＩＶＳＢまたは細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ ２１０／９のいずれかとともに前記細胞ラインに添加した。前述の以前の研究で は、前者のクローンはＨＬＡ−Ａ２を提示するチロシナーゼ発現細胞を溶解し、 後者は溶解しないということが証明されていた。 前記チロシナーゼ欠損変異株を、空の(empty)ＨＬＡ−Ａ２分子を安定化させ るために用いる抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１とともに、またはそれなしで、⁵¹ Ｃｒを含有する溶液中で３７℃で１時間インキュベートした。このテストにおい て細胞を４回洗浄し、そして１００μＭから０．０１μＭまでの様々な希釈度の ペプチドと ともにインキュベートした。３０分後、エフェクター細胞をＥ／Ｔ比４０／１で 添加し、そして４時間後上清の１００ｕｌを回収し、放射能をカウントした。 図４はノナペプチド Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val（配列番号２） を用いて得られた結果を示す。 以下配列番号２と称するこのペプチドは、配列番号１に示すチロシナーゼに対 するｃＤＮＡ配列の残基１１２９−１１５５に対応している。ＨＬＡ−Ａ２とこ のペプチドとからなる複合体はＣＴＬクローン ＩＶＳＢによって認識される。 並行して行った実験において、患者ＬＢ２４由来のＣＴＬクローンＣＴＬ２１ ０／９は、それがＨＬＡ−Ａ２とチロシナーゼ由来ペプチドとからなる複合体を 認識するものであったにもかかわらず、ＨＬＡ−Ａ２と配列番号２のペプチドと からなる複合体を認識しないということが示された。従って、チロシナーゼはプ ロセシングされて、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示された時にＣＴＬクローンに 認識される少なくとも１つの他のペプチドを生じる。例７ 続いての実験において、配列番号２のペプチドをコードしない第２の遺伝子フ ラグメントを使用した。このフラグメントは配列番号１の塩基１に始まって塩基 １１０１で終わるものであった(即ち、ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈｅＩフラグメント)。 前述の細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２１０／９について、前述の要領でこの フラグメントをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に対してテストした。ＣＴ Ｌ ＩＶＳＢについてもテストした。これらの結果は、ＣＴＬ２１０／９はこの フラグメントでトランスフェクトされたＨＬＡ−Ａ２発現細胞の表面上の抗原を 認識するが、ＣＴＬ ＩＶＳＢは認識しないということを示すものであった。従 って、第２の腫瘍拒絶抗原ペプチドがチロシナーゼに由来する。例８ ＣＴＬ２１０／９によって認識される腫瘍拒絶抗原をさらに明らかにするため に、以下の実験を行った。 配列番号１の塩基４５１−１１５８に対応する第２のフラグメントをＨＬＡ− Ａ２に対する遺伝子とともにＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、ＴＮＦ放出試験 を行った。この配列はクローンＣＴＬ ＩＶＳＢからのＴＮＦ放出を引き起こし た（２０ｐｇ／ｍｌ）が、ＣＴＬ２１０／９からは引き起こさなかった （３．８ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果は前記２つのＣＴＬクローンが異なるペプ チドを認識し、そしてＬＢ２４−ＣＴＬ２１０／９によって認識されるペプチド は領域１−４５１によってコードされるはずであることを確認するものであった 。例９ ｃＤＮＡフラグメント１−４５１によってコードされるチロシナーゼ由来のペ プチドを、ＨＬＡ−Ａ２に結合することが知られているコンセンサス配列につい て分析した。これらコンセンサス配列に対応するペプチドを合成し、それらのＨ ＬＡ−Ａ２提示細胞を感作する能力についてテストした。これを行うために２種 のチロシナーゼ陰性メラノーマ細胞ラインを使用し(即ち、ＮＡ８−ＭＥＬ、お よびＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクトされたＭＺ２−ＭＥＬ２．２)、そしてサ ルター（Salter）他，Immunogenetics 21:235-246(1985)に記載されている、細 胞ラインＴ２を使用した。 細胞を⁵¹ＣｒとＨＬＡ−Ａ２に対して特異的なモノクローナル抗体ＭＡ２．１ とともに３７℃で５０分間インキュベートし、その後洗浄した(参考文献として その開示内容全体を本出願に合体させる、ボドマー（Bodmer）他，Nature 342:4 43-446(1989)を参照)。標的細胞を様々な濃度のペプチドと、そしてＬＢ２４− ＣＴＬクローン２１０／５または２１０／９のいずれかとともにインキュベート した。クロム放出の百分率を４時間のインキュベーション後に測定した。 ペプチドMet Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu（配列番号３）が有効で あることが判明した。 ここに要約する更なる実験において、先に配列番号２を認識することが示され たＣＴＬ−ＩＶＳＢは配列番号３のペプチドを認識しなかった。 結果は以下の表２−４において要約する。 ペプチド 配列番号２ 配列番号３ ＣＴＬ−ＩＶＳＢ ＋ ＋ ＣＴＬ−２１０／５ − ＋ ＣＴＬ−２１０／９ − ＋表 ３ 3/93-LB 24-CTL 210/5と210/9およびSK29-CTL IVSBによるチロシナーゼペプチドで 感作されたMZ2-2.2-A2の溶解 ^* 標的細胞を、Cr51およびモノ-Ab MA2.1（抗-HLA-A2）とともに50分間インキュベートし 、 次に３回洗浄した。 これらを様々な濃度のペプチドとともに30分間インキュベートした。 CTL細胞は、表示した(E:T)比にて添加した。 ％特異的Cr51放出は、４時間のインキュベーション後に測定した。表 ４ LB24-CTL 210/5および210/9またはSK29-CTL IVSBによって認識されるチロシナーゼペプチド のテスト 例１０ ＣＴＬクローン２２／３１を使用して追加の実験を行った。このクローンは以 前に、自己メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬからのサブラインＭＺ２−ＭＥ Ｌ．４３を溶解するが、ＭＺ２−ＭＥＬ３．０およびＭＺ２−ＭＥＬ６１．２等 の他のサブラインや、自己ＥＢＶトランスフォームＢ細胞またはキラー細胞ライ ンＫ５６２を溶解しないことが示されているものであった(ファン・デア・エイ ンデ（Van den Eynde）他，Int．J．Cancer 44:634-640(1989)を参照)。ＭＺ２ −ＭＥＬ．４３によって提示される抗原を抗原Ｃと称する。 本出願の親出願に報告されているものを含む以前の研究において、チロシナー ゼ遺伝子が多くのＨＬＡ−Ａ２を発現するメラノーマ上で自己ＣＴＬによって認 識される抗原をコードすることが判明している。細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬのサ ブラインにおけるこの遺伝子の発現をＰＣＲ増幅によってテストした。クローン ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は陽性であることが判明し、一方ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０ 等の他のＭＺ２−ＭＥＬクローンは陰性であった。チロシナーゼ遺伝子の発現と 抗原ＭＺ２−Ｃとの相関は、ＭＺ２−Ｃがチロシナーゼ由来の腫瘍拒絶抗原であ ってＭＺ２−ＭＥＬによって発現されるＨＬＡ分子によって提示されるというこ とを示唆するものであった。この細胞ラインはＨＬＡ−Ａ２を発現しない。これ はもしチロシナーゼ由来のペプチドがＴＲＡとして提示されるのであれば第２の ＨＬＡ分子が関係しているということを示すものであった。 どのＨＬＡ分子がＣＴＬ２２／３１に対して抗原Ｃを提示しているのかを同定 するための研究を行った。これを判定するために細胞表面上にあることが知られ ているＨＬＡ分子、即ちＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４．０ ２そしてＨＬＡ−Ｃクローン１０、のｃＤＮＡクローンをＭＺ２−ＭＥＬ．４３ ｃＤＮＡライブラリーから単離し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに クローニングした。次に受容ＣＯＳ７細胞を、これらのコンストラクトまたはＨ ＬＡ−Ａ１を含有するコンストラクトのうちの１つと、そしてチロシナーゼをコ ードするｃＤＮＡ（配列番号１）とでトランスフェクトした。この同時トランス フェクションは前述した方法に従って行った。１日後ＣＴＬ２２／３１を添加し 、そして２４時間後、ＴＮＦ放出をTraversari et al，前出、に従ってＷＥＨＩ −１６４−１３ に対する細胞傷害性をテストすることによって測定した。図６はＨＬＡ−Ｂ４４ とチロシナーゼとの両方でトランスフェクトされた細胞の存在下でのみＣＴＬ２ ２／３１によってＴＮＦが放出されることを示す。これから導かれる結論はＨＬ Ａ−Ｂ４４がチロシナーゼ由来腫瘍拒絶抗原を提示するということである。例１１ 前述の諸実験は、とりわけ、配列番号３のデカマーがＨＬＡ−Ａ２提示細胞の 溶解を効果的に引き起こすということを示していた。ＭＨＣ分子はノナペプチド を提示するということが非常によく理解されている。そのため、陽性の結果をも たらした前記デカペプチドに基づく２つのノナマーについてテストする実験を行 った。具体的には第１のまたは第１０のアミノ酸を除いて以下の２つのペプチド を作成した。即ち Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu（配列番号４） Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu（配列番号５） これらのペプチドについて、前述の諸例において示す１０μＭから１ｎＭの範囲 の濃度で前記デカペプチドについてテストしたのと同じ要領でテストした。３種 の提示細胞を使用した。下記の表５に要約されるように“Ｔ２”はミュータント ヒト細胞ラインであり、サルター（Salter），Immunogenetics 21:235(1985)に よって“ＣＥＭＸ７２１．１７４Ｔ２”として記載されている。このラインはＨ ＬＡ−Ａ２を提示する。“Ｇ２．２”は細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬの変異株(var iant)である。この変異株はＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子でトランスフェク トされたものである。略語“Ｇ２．２．５”はＨＬＡ−Ａ２を発現しない変異株 を表す。すべての細胞は細胞溶解性Ｔ細胞クローンと接触させるに先立ってモノ クローナル抗体ＭＡ２．１とともにインキュベートした。この処置はいわゆる“ 空の(empty)”ＭＨＣ分子を安定化させるものであるがこれがおこるメカニズム についてはよく分かっていない。そしてエフェクターＣＴＬ２１０／５と２１０ ／９の両方を使用し た。結果を下記の表５に示す。これらの結果は、１０μＭの濃度において配列番 号４のノナマーはＣＴＬクローン２１０／５を使用した場合２倍有効であり、ク ローン２１０／９を使用した場合４倍有効であるのに対し、配列番号５のノナマ ーは溶解の誘発に関して有効ではなかったということを示す。例１２ さらなる実験において、配列番号４と５、および配列番号２のペプチドを使用 してクロム放出試験を行った。標的細胞は同種異系の(allogeneic)メラノーマ細 胞、即ち、ＭＺ２−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ２で以前にトランスフェクトされたもの 、そしてＨＬＡ−Ａ２を提示するが抗原プロセシングが欠陥しているために外因 性ペプチドを提示する能力が増大している細胞ラインＴ２（チェルンドーロ（Ce rundolo）他，Nature 345:449(1990)）であった。すべての細胞をモノクローナ ル抗体ＭＡ２．１で５０分間前処理した。細胞を選択したペプチドとともに様々 な濃度で３０分間インキュベートした。そしてＣＴＬクローン２１０／９とＩＳ ＶＢのいずれかをエフェクター：標的比６０で添加した。クロム放出を前述の要 領で４時間後に測定した。 この結果を図７、即ち、図７Ａ−７Ｃに示す。配列番号４のペプチドは細胞を ＣＴＬ２１０／９に対して感作し、一方配列番号５は感作しなかった。配列番号 ２は、先の諸例に示したように、細胞をＣＴＬ ＩＶＳＢに対して感作した。 例１３ 次に例１０に示した実験について詳細に調べる研究を行った。ここでＨＬＡ− Ｂ４４に提示される抗原ペプチドを明らかにすることが試みられた。これを行う ためチロシナーゼｃＤＮＡ配列のフラグメントに対応するｃＤＮＡ配列を、ＨＬ Ａ−Ｂ４４をコードする遺伝子とともにＣＯＳ−７細胞に同時トランスフェクト した。プロトコールは本質的に前述の例６に記載したものであった。前述の細胞 溶解性Ｔ細胞クローン２２／３１を使用した。ＴＮＦ放出を測定した。２つのフ ラグメント、即ち塩基フラグメント１−６６１、および４２７−１１３４がＴＮ Ｆ放出を誘発した。これは提示されるペプチドはこれらが重複する領域にあるこ とを示唆していた。この観察の結果、より短いフラグメントについてテストした 。ヌクレオチド５７４−８３１および３８５−６１２に対応するフラグメントが ＴＮＦ放出を誘発可能であった。これらのデータはヌクレオチド５７４−６１２ に対応するフラグメントが問題に関連したペプチドをコードするものであったと いうことを示唆している。その結果、ヌクレオチド５７４−６１２によってコー ドされる１３アミノ酸のペプチドを合成した。このペプチドを次にそれがＣＴＬ ２２／３１による溶解を引き起こすか否かを判定するための実験に使用した。以 下の表６は、この１３−マーがＨＬＡ−Ｂ４４を発現する２つのＥＢＶトランス フェクション細胞ラインを溶解に対して感受性にしたことを示す。それに対して、ノナマー： Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala（配列番号８） は認識されなかった。以下の表７はこれらの結果を要約しており、これらの結果 はまた、図８にも示されている。 ＨＬＡ−Ｂ４４によって結合されることが報告されている唯一の他のペプチド は Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe（配列番号９） であり、これはBurrows et al.，J．Virol 64:3974(1990)によって報告されてい るものである。先に記載されたデータは、第２位置のGluと第９位置のPheが ＨＬＡ−Ｂ４４に対するアンカー残基であることを表している可能性があること を示唆している。 例１４ 前述の例５において報告されたように、ＳＫ２９−ＭＥＬから単離されたチロ シナーゼに対するｃＤＮＡは、以前に同定されたチロシナーゼｃＤＮＡとほとん ど同一であった。全部で３つの違いがあり、そのうちの１つは配列番号７のＮ− 末端のセリンに対応するコドンにおけるものであった。具体的には、ＳＫ２９− ＭＥＬチロシナーゼは位置５３７−５３９はＡＴＧ、位置５７５−５７７はＴＣ Ｔ、そして位置１２０７においてはＣＡＡからなる。Kwon et alは、５７５−５ ７７においてＴＡＴを示し、一方、ブチャード（Bouchard）他は、これら記載さ れた位置においてＡＴＣ、ＴＡＴ、そしてＣＧＡを示すという点において異なっ ている。この変化によって前記Ｎ−末端がセリンではなくチロシンになっている 。このため、配列番号１０、即ち Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe を用いてテストを行った。ギーベル（Giebel）他,Nucl.Acids Res.18:3103(1990 )およびジョンストン（Johnston）他，Nucl．Acids Res．20:143(1992)によると 、この対立遺伝子はコーカソイド人口の約５０％において存在する。配列番号１ ０がＣＴＬを感作できるか否かを判定することは重要であった。 配列番号１０のペプチドを前述の例１２および例１３に記載したのと同じ要領 で、ＣＴＬ２２／３１を用いてテストした。ＣＴＬ２２／３１による最大の溶解 の５０％を引き起こすのに必要な配列番号１０の量は配列番号７について要求さ れる量とほぼ同じであることが判明した。これらのデータのいくらかを表す図９ Ａおよび９Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ４４を同時に発現する標的細胞 に対してＣＴＬ２２／３１およびＣＴＬ ＩＶＳＢを使用した際に得られた結果 を示す。ラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３はＨＬＡ−Ｂ４４を発現するがＨＬＡ−Ａ ２は発現しない。ラインＳＫ２９−ＭＥＬ．１はテストによるとＨＬＡ−Ｂ４４ とＨＬＡ−Ａ２の両方について陽性である。“ＭＺ２−ＭＥＬ．４３＋ＨＬＡ− Ａ２”と称されるラインはＨＬＡ−Ａ^★０２０１をコードするＤＮＡでトランス フェクトされたＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞である。 これらの結果の１つの興味深い特徴はＣＴＬ２２／３１がＳＫ２９−ＭＥＬ． １ 刺激細胞を認識せず、一方ＣＴＬ ＩＶＳＢは認識した（そしてＭＺ２−ＭＥＬ ．４３を認識しなかった）という事実である。この観察により次の実験を行うこ とにした。例１５ 前述の２つのＣＴＬクローンとは多少異なるようにではあったが、さらに別の ＣＴＬクローン、即ちＣＴＬクローン３２９Ｂ／５も引き出された。 ＣＴＬクローン３２９Ｂ／５を引き出すために、健康な、ＨＬＡ−Ｂ^★４４０ ２陽性の個体の末梢単核細胞（自己マクロファージおよび樹状細胞）からの粘着 細胞を、１０％ウシ胎児血清(“ＦＣＳ”)、ＩＬ−４(５０Ｕ／ｍｌ)、およびＧ Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を追加したＲＰＭＩ培地中で１週間生長させた 。これら細胞を次に前述の配列番号７のペプチド（５０μＭ）でβ２ミクログロ ブリン（２．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下で４時間パルスした(pulsed)。これら粘着 細胞を照射し、２００万のＣＤ８⁺分類されたＴリンパ球を、最終容積２ｍｌの 、１０％ヒト血清、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−６および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ ２を追加したＩｓｃｏｖｅ培地中にて添加した。反応細胞を７日目、１４日目に 予め配列番号７でパルスした粘着細胞で、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ ／ｍｌのＩＬ−７を追加した培地中にて刺激した。２１日目に反応リンパ球を、 予め配列番号８（１μＭ）でパルスしたＨＬＡ−Ｂ４４陽性の照射されたＬＢ３ ３−ＭＥＬ．Ａ細胞（マイクロウェル当たり１０⁴細胞）と、支持細胞として働 く２ｘ１０⁴の照射されたＬＧ２−ＥＢＶリンパ芽球細胞とを含有するマイクロ ウェル中で限界希釈法によってクローン化した。 ミクロ培養を７日ごとに同じ手順に従って刺激した。 ５週間後、ＣＴＬクローン３２９Ｂ／５が２４のウェルに生育しており、これ を毎週、予め配列番号７でパルスした２ｘ１０⁵の照射されたＬＢ３３−ＭＥＬ ．Ａ細胞と、１０⁶の照射されたＬＧ２−ＥＢＶ細胞とで、ＩＬ−２（５０Ｕ／ ｍｌ）とＩＬ−４（５Ｕ／ｍｌ）とを追加した培地中にて刺激した。 ＣＴＬクローン３２９Ｂ／５を以下に示す諸実験において使用した。例１６ 例１４における結果に対する１つの可能性のある理由はＨＬＡサブタイプの違 いであった。ＨＬＡ−Ｂ４４について２つの主要なサブタイプ、即ち、ＨＬＡ− Ｂ^★４４０２とＨＬＡ−Ｂ^★４４０３とがあることが知られている。メラノーマ 細胞ラインＳＫ２９−ＭＥＬはＨＬＡ−Ｂ^★４４０２を発現し、一方、ＭＺ２− ＭＥＬはＨＬＡ−Ｂ^★４４０３を発現するものであった。 この可能性を調べるために、３つの異なる患者（ＬＢ１７，ＬＢ３３，そして Ｂ１２）から採取し、そしてエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によってト ランスフォームされたリンパ芽球細胞ラインを使用し、両方のサブタイプを配列 番号７でパルスし、そしてまた前述のようにＣＴＬ２２／３１による溶解に対す る感応性についてテストした。例１５に記載したＣＴＬクローン３２９Ｂ／５も 使用した。 図１０はこれらの実験の結果を示す。すべてのＨＬＡ−Ｂ^★４４０３陽性細胞 はＣＴＬ２２／３１によって非常によく溶解されたのに対し、ＣＴＬ２２／３１ を使用した場合、ＨＬＡ−Ｂ^★４４０２ラインについては、あったとしてもわず かの溶解しか観察されなかった。結論は、ＣＴＬはＨＬＡサブタイプ間の区別を することができ、そしてＨＬＡサブタイプに限定されるというものである。例１７ ＨＬＡ−Ｂ^★４４０３と複合体を形成してＣＴＬを刺激することが示された配 列番号７が、ＨＬＡ−Ｂ^★４４０２細胞によっても提示され得るかどうかを判定 するためにさらに実験を行った。 クーリ（Coulie）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:7976-7980(1995)はペ プチドGlu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe（配列番号１１）をＨＬＡ−Ｂ^★ ４４０２分子に結合するものとして記載している。配列番号１０のペプチドは配 列番号１１に効果的に競合したので、それが実際にＨＬＡ−Ｂ^★４４０２分子に 結合することが示された。例１８ ＣＴＬクローン３２９Ｂ／５を、前述のタイプの溶解アッセイにおいてテスト し た。２つのＨＬＡ−Ｂ^★４４０３陽性細胞ライン(ＭＺ２−ＭＥＬ．４３および ＬＧ２-ＭＥＬ)、そして３つのＨＬＡ−Ｂ^★４４０２陽性細胞ライン（ＳＫ２９ −ＭＥＬ、ＬＢ４９４-ＭＥＬ、そしてＬＢ３３-ＭＥＬ．Ｂ）をＴＮＦ放出試験 においてテストした。すべての細胞ラインはチロシナーゼを発現した。結果を図 １１に示す。ＴＮＦ放出の刺激はＨＬＡ−Ｂ^★４４０２メラノーマ細胞ラインの 方がかなり高かったということに注目されたい。例１９ 配列番号７および配列番号１０が両方ともＨＬＡ−Ｂ４４分子に結合し、ＣＴ Ｌによる溶解を引き起こすという事実は、Ｎ−末端がＨＬＡ−Ｂ４４に対する結 合に関する重要な残基ではないということを示唆するものであった。他の残基が 重要であるかどうかを判定するためさらなる研究を行った。 これらの実験において、配列番号７の９つの位置のいずれかのアミノ酸の１つ をアラニンで置換したペプチドを合成した。次に、ＣＩＲ−Ｂ４４０３細胞を３ ７℃で１時間、抗−ＭＨＣクラスＩ抗体６／３２の存在下（３０％ｖ／ｖハイブ リドーマ細胞の培地）でクロム標識し、そして洗浄した。標識された細胞(ウェ ル当たり１０００)を様々な濃度のペプチドとともに３０分間２０℃でインキュ ベートした。次にＣＴＬ２２／３１をＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比１０：１ で添加した。クロム放出は４時間後に測定した。 以下の結果は相対抗原性活性として表示されている。これは、最大の５０％の 溶解を得るために必要とされる非置換ペプチド濃度を、最大の５０％の溶解を得 るために必要とされるバリアントペプチドの濃度で割ったものとして計算されて いる。非置換ペプチド、配列番号８について、最大の５０％の溶解は３ｎＭで得 られた。 この結果は、前記ペプチドの位置１以外のすべてのアミノ酸が認識のために必 要とされるということを示している。前述の諸実験はチロシナーゼが腫瘍拒絶抗原前駆体としてプロセシングされ、そ の結果生じる腫瘍拒絶抗原と、例えばＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ４４表現型 を有するメラノーマ細胞などの少なくともいくらかの異常細胞上分子とからなる 複合体の形成を導くということを明らかにするものである。これらの腫瘍拒絶抗 原は式Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列番号１２）によって表すこ とができる。ここにおいてXaaはいずれのアミノ酸であってもよい。Xaaがセリン であるような抗原は親出願に開示されているので、ここにクレームされる本発明 の一部ではない。XaaがTyrまたはAlaである特定の抗原は、本出願に具体的に開 示されている。前記複合体はＣＴＬによって認識されることができ、そして提示 細胞は溶解される。この観察は本発明の特徴である治療上および診断上の効果を 有する。治療法に関していえば、前述の複合体を提示する異常細胞に対して特異 的なＣＴＬが作られるという観察は、様々な治療上のアプローチを示唆するもの である。そのようなアプローチの一つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者 (subject)に、前記複合体に対して特異的なＣＴＬを投与することである。その ようなＣＴＬをイン・ヴィトロで開発することは当業者の技術の範囲内に含まれ る。具体的には、血液細胞のような、細胞のサンプルを、前記複合体を提示する 細胞に接触させると、特異的なＣＴＬの増殖を引き起こすことができる。標的細 胞は、前述のタイプのＣＯＳ細胞のような、 トランスフェクタントとすることができる。その表面に所望の複合体を提示する トランスフェクタントは、問題のＣＴＬと結合すると、その（ＣＴＬの）増殖を 刺激する。当業者がそれらのＣＴＬを作ることができるように、問題の遺伝子を 含有するベクター、即ち、ｐｃＤＮＡ−１／Ａｍｐ１（ＨＬＡ−Ａ２）および ｐ１２３．Ｂ２（ヒトチロシナーゼ）をブダペスト条約に従ってパスツール研究 所(Institut Pasteur)にそれぞれ受託番号Ｉ１２７５およびＩ１２７６として寄 託した。ここで用いたようなＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細胞と同様に、広く 入手可能である。 養子移入（養子免疫細胞移入）と呼ばれる治療上の方法を詳述すると、（グリ ーンバーグ（Greenberg），J．Immunol．136(5):1917(1986);レッデル（Reddel ）他，Science 257:238(7-10-92);リンチ（Lynch）他，Eur.J.Immunol.21:1403- 1410(1991);カスト（Kast）他，Cell 59:603-614(11-17-89)）所望の複合体を提 示する細胞を、ＣＴＬと結合させると、その結果、それに対して特異的なＣＴＬ が増殖する。増殖したＣＴＬは、次に、特定の複合体を提示するいくらかの異常 細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与される。すると、前記 ＣＴＬが異常細胞を溶解し、それによって所望の治療目的が達成される。 前述の療法は、少なくともいくらかの患者の異常細胞が、１以上のＨＬＡ／チ ロシナーゼ由来ペプチド複合体を提示することを仮定している。このことは非常 に簡単に判定できる。例えばＣＴＬは前述のトランスフェクタントを使用して同 定され、いったん単離されると、患者の異常細胞のサンプルとともに、イン・ヴ ィトロで溶解を判定するのに使用することができる。もしも溶解が観察されれば 、そのような療法に於いて特異的ＣＴＬを使用することによって、前記異常細胞 に関連する病気を軽減することができる。より簡単な方法は、標準的アッセイを 使用して、ＨＬＡ表現型について異常細胞を調べ、たとえばＰＣＲを使用して増 幅によってチロシナーゼ発現を判定するというものである。複数の異なるＨＬＡ 分子がチロシナーゼ由来のＴＲＡを提示するという事実により、ここに記載した 治療法が適切である患者である個体数が増えることになる。 養子移入（養子免疫細胞移入）のみが本発明に従って利用できる唯一の治療形 態であるわけではない。ＣＴＬを、数々のアプローチを利用して、イン・ヴィヴ ォで 誘発することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前記複合体を発現する非 増殖性の細胞の利用方法については先に詳述した。このアプローチに於いて用い られる細胞は、照射を受けたメラノーマ細胞、または、前記複合体を提示するの に必要な一方又は両方の遺伝子をトランスフェクトされた細胞のような、通常前 記複合体を発現する細胞であってよい。チェン（Chen）他，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 88:110-114（１９９１年１月）は、治療法(therapeutic regime)にお ける、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクション細胞の利用を示して おり、このアプローチを例証している。様々な細胞タイプが利用可能である。同 様に、問題の遺伝子の一方又は両方を坦持するベクターが利用可能である。ウィ ルス性の又は細菌性のベクターが特に好ましい。これらのシステムに於いて、問 題の遺伝子は、たとえば、ワクシニアウィルス又は細菌ＢＣＧによって伝えられ 、この物質は、事実上、宿主細胞に“感染”する。その結果得られた細胞は問題 の複合体を提示し、自己ＣＴＬによって認識され、そしてそのＣＴＬは増殖する 。ＨＬＡ−Ａ２提示細胞への取り込みを容易にするために、チロシナーゼ自身を 、アジュバントと組み合わせることによって、同様の効果を達成することができ る。そしてこの酵素はプロセシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生 じる。 前記記載は“異常細胞”および“細胞異常”について言及している。これらの 用語は広い解釈において用いられ、問題となる細胞がその特定のタイプの正常細 胞と異なることを示す少なくとの１つの特徴を示すすべての状況を指す。異常な 特徴の例には形態学的、および生化学的な変化、例えばメラノーマ、自己免疫疾 患、等のような腫瘍を含む細胞異常が含まれる。 本発明はまた、ＣＴＬ標的となる前駆体の同定方法も提供する。これら前駆体 は標的細胞が腫瘍である場合には腫瘍拒絶抗原と称されるが、異常によって特徴 づけられる細胞が腫瘍ではない場合、これら分子を腫瘍拒絶抗原と称すると多少 の誤解が生じる可能性があることを指摘しておかなければならない。本質的に、 この方法は前述のタイプの細胞溶解性Ｔ細胞の標的である細胞の同定を含む。い ったんそのような細胞が同定されると、トータルＲＮＡをｃＤＮＡライブラリー へと変換し、そしてそれを関連するＨＬＡ分子と複合体を形成する抗原を提示す ることができる細胞サンプルにトランスフェクトする。そのトランスフェクタン トを前述のＣＴＬ と接触させ、そして再びＣＴＬによる標的化(targeting)を観察する(溶解および ／またはＴＮＦ産生)。溶解されるトランスフェクタントを次にｃＤＮＡを取り 出すように処理し、そして配列決定する。そしてこのような要領で、腫瘍拒絶抗 原前駆体のような、異常状態についての前駆体を同定することができる。 本発明の他の態様は、当業者にとって明らかであり、ここで繰り返す必要はな い。 ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用された ものであり、従って、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示およ び記載された特徴構成又はその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本 発明の枠内で様々な改変が可能であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 33/53 Ｙ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/53 Ａ６１Ｋ 37/54 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ファン・ペル，アリーネ ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 ブーン―ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユーシー エル 7459 (72)発明者 ヴォルフェル，トーマス ドイツ連邦共和国 デー―6500 マインツ ランゲンベックシュトラーセ １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＬＡ−Ｂ４４分子と式、Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列 番号１２）ここでXaaはセリンを除くいずれのアミノ酸でもよいペプチドとから なる複合体に対して特異的な治療薬での治療の候補を同定する方法であって、 （ｉ）患者からの異常細胞サンプルを前記複合体に対して特異的な細胞溶解性 Ｔ細胞と接触させる工程、および、 （ｉｉ）前記異常細胞サンプルの少なくとも一部の溶解を、前記治療に対する 候補であるかの指標として測定する工程、 とを有する治療の候補を同定する方法。 ２． 前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ｂ４^★4４０２である、請求項１の方法。 ３． 前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ｂ^★４４０３である、請求項１の方法。 ４． 細胞異常を有する患者を治療する方法であって、前記患者にＨＬＡ−Ｂ４ ４分子と式、Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列番号１２）ここでXaa はセリンを除くいずれのアミノ酸でもよいペプチドとからなる複合体をその表面 に提示する細胞に対して細胞溶解性Ｔ細胞応答を引き起こす薬剤を、前記複合体 をその表面上に提示する異常細胞に対する応答を引き起こすのに十分な量投与す ることからなる、細胞異常を有する患者を治療する方法。 ５． 前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ｂ^★４４０２である、請求項４の方法。 ６． 前記ＭＨＣ分子がＨＬＡ−Ｂ^★４４０３である、請求項４の方法。 ７． 前記薬剤がヒトチロシナーゼをコードするベクターを含む、請求項４の方 法。 ８． 前記薬剤がさらにＨＬＡ−Ｂ４４分子をコードする第２のベクターを含む 、 請求項７の方法。 ９． 前記ベクターがＨＬＡ−Ｂ４４分子もコードする、請求項７の方法。 １０．前記薬剤がその表面上に前記複合体を提示する非−増殖性の細胞のサンプ ルである、請求項４の方法。 １１．細胞異常を治療する方法であって、ＨＬＡ−Ｂ４４分子と式、Xaa Glu Il e Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列番号１２）ここでXaaはセリンを除くいずれの アミノ酸でもよいぺプチドとからなる複合体の異常細胞の表面上での提示によっ て特徴づけられる細胞異常を有する患者に、前記複合体に対して特異的な細胞溶 解性Ｔ細胞を前記異常細胞を溶解するのに十分な量投与する工程を有する、細胞 異常を治療する方法。 １２．前記細胞溶解性Ｔ細胞が自己のものである、請求項１１の方法。 １３．ＨＬＡ−Ｂ４４分子と式、Xaa Glu Ile Trp Art Asp Ile Asp Phe（配列 番号１２）ここでXaaはセリンを除くいずれのアミノ酸でもよいペプチドとから なる複合体に対して特異的な単離細胞溶解性Ｔ細胞。 １４．ＨＬＡ−Ｂ４４分子と式、Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列 番号１２）ここでXaaはセリンを除くいずれのアミノ酸でもよいペプチドとから なる複合体をその表面上に提示する異常細胞を同定する方法であって、異常細胞 のサンプルを、前記複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞に接触させる工程 と、前記複合体を提示する細胞の判定として前記異常細胞の溶解を測定する工程 とを有する、異常細胞を同定する方法。 １５．式、Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe（配列番号１２）の単離ペプ チドであって、Xaaはセリンを除くいずれのアミノ酸でもよい、単離ペプチド。 １６．XaaがTyrである、請求項１５の単離ペプチド。 １７．XaaがAlaである、請求項１５の単離ペプチド。